Système musculosquelettique
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Effet de l’exercice de nage sur les cellules souches musculaires de truite arc en ciel.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Marquées avec des perles de couleur, soumises deux fois par jour pendant un mois à un courant de 50 cm/s, puis injectées de puromycine et tuées vingt-cinq minutes plus tard : 60 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exercice de nage à l'activité des cellules à l'origine des fibres musculaires, avec des recommandations attendues pour les pisciculteurs sur la gestion du débit d'eau en élevage. La description des atteintes ramène l'effort à un courant intense de dix minutes, quand le protocole annonce deux séances quotidiennes sur un mois. Les truites sont tuées pour prélever muscle et foie, et le porteur précise que des échantillons de ces mêmes individus alimenteront un autre projet.
Objectifs
L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer chez les poissons les effets de l’exercice physique sur les cellules à l'origine des fibres musculaires— en termes d’activité et de nombre — et de les relier aux variations de taille et de nombre des fibres musculaires. Nous pourrons également déterminer dans quelle mesure l'activité physique chez la truite altère l'activité respiratoire des cellules et la production des protéines, et étudier le lien entre ces deux processus.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, il sera possible de déterminer si l’exercice appliqué durant la phase exponentielle de croissance influence l’activité des cellules nécessaires à la formation des fibres musculaires, lesquelles jouent un rôle déterminant dans le potentiel de croissance ultérieur des animaux. Par ailleurs, les connaissances acquises permettront d’élaborer des recommandations à destination des pisciculteurs concernant la gestion du débit d’eau dans les systèmes d’élevage, dans le but d’optimiser la croissance musculaire et la qualité des produits.
Procédures
Après un marquage externe à l'aide de perles de couleur, 20 animaux seront soumis à un courant d'eau de 50 cm/s, 2 fois par jour, pendant 1 mois. Ensuite les animaux seront injectés avec de la puromycine puis euthanasiés 25 min plus tard pour réaliser des prélèvements de tissus (foie et muscle).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un courant intense (50cm/s) pendant 10 minutes, ce qui peut induire un stress transitoire. Bien que cet effort soit intense, il est de courte durée, et les animaux devraient s'habituer à ce changement soudain de courant.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puisque nous devons prélever des échantillons de muscle et de foie pour des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
L'objectif du projet étant de déterminer l'impact des de l'exercice sur la plasticité des cellules nécessaires à la formation in vivo de fibres musculaires, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons construit un couloir de nage de petite taille pour maintenir une densité optimale et un effectif de 30 poissons/bac pour éviter les comportements agressifs. Avec cette quantité, nous pouvons prélever 20 poissons à chaque prélèvement ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l'étude et détecter des différences de plasticité des cellules souches musculaires. Par ailleurs, des échantillons de ces mêmes animaux seront utilisés dans le cadre d'un autre projet, évitant ainsi l'utilisation d'animaux additionnels.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, pH) seront également régulièrement contrôlés. L’ensemble des transferts et manipulations sera réalisé dans les plus brefs délais afin de limiter au maximum la durée d’émersion et le stress induit par la capture. Le marquage des animaux et les injections seront réalisés sous anesthésie. Les dispositifs expérimentaux seront installés à proximité immédiate des bassins d’élevage afin de réduire les temps de transfert. Une grille d'évaluation du bien-être animal a été mise en place et des points limites adaptés ont été définis.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g car c'est durant cette période que la croissance est exponentielle et avec la plus grande plasticité.
Explorer l’exercice physique pour la santé cérébrale et le bien-être
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une administration quotidienne de corticostérone pendant quatre semaines provoque perte de poids, baisse d'appétit, altération du pelage et apathie, avant six semaines de course sur tapis roulant cinq jours par semaine, au risque de lésions plantaires. Un test de force de préhension, un open field et des tests d'endurance de vingt à trente-cinq minutes complètent un protocole présenté comme une exploration de l'exercice physique "pour la santé cérébrale et le bien-être". Sur le choix de la souris, le porteur avance sa taille, sa compatibilité avec le tapis roulant, un entretien "plus rentable" que celui des animaux plus gros, et le fait que les souris soient "souvent considérées comme un choix plus acceptable sur le plan éthique".
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment un stress prolongé influence le cerveau, le muscle et le métabolisme, et à déterminer dans quelle mesure différentes formes d’exercice physique peuvent limiter ou modifier ces effets. Nous analyserons : la capacité du cerveau à s’adapter, les capacités de récupération et de fonctionnement du muscle, le fonctionnement énergétique des cellules, et les réactions inflammatoires du corps. L’objectif est d’identifier comment le stress chronique et l’exercice physique interagissent, et si l’exercice volontaire (roue) et l’exercice imposé (tapis roulant) produisent des effets différents sur ces processus. Le protocole permettra d’établir un lien entre les comportements (anxiété, activité spontanée, endurance, force), les changements cellulaires et les marqueurs sanguins. Nous faisons l’hypothèse que : l’exercice volontaire agit surtout sur l’équilibre émotionnel et l’adaptation du cerveau, tandis que l’exercice imposé agit surtout sur les capacités énergétiques et structurelles des muscles. Les résultats aideront à mieux comprendre comment le stress chronique, la douleur et l’activité physique interagissent et influencent l’adaptation globale de l’organisme.
Bénéfices attendus
Le projet cherche à mieux comprendre comment le stress chronique et l’activité physique agissent ensemble sur la santé mentale. Il repose sur l’idée que certaines personnes deviennent plus sensibles au stress alors que d’autres arrivent mieux à y faire face. Pour répondre à cette question, nous utilisons un modèle animal qui permet d’étudier précisément les effets d’un stress prolongé ainsi que deux formes d’exercice, l’une choisie librement et l’autre imposée. Ce projet vise à repérer ce qui, dans le cerveau, les muscles et le fonctionnement général du corps, explique la fragilité ou au contraire la résistance face au stress. Nous nous intéressons notamment à la capacité du cerveau à s’adapter, au fonctionnement et à la récupération du muscle, ainsi qu’à la manière dont le corps produit et utilise son énergie. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre comment l’activité physique peut protéger le corps et l’esprit lorsqu’une personne est exposée au stress pendant longtemps. Ils aideront aussi à identifier des indicateurs biologiques utiles pour suivre les effets de programmes d’activité physique utilisés comme alternatives ou compléments aux traitements. Enfin, le projet apportera des connaissances essentielles pour prévenir les troubles de l’humeur, l’anxiété ou le déclin des capacités intellectuelles qui peuvent être liés au stress et au manque d’activité.
Procédures
1-Habituation au tapis roulant • Durée : 1 semaine • Fréquence : 1 session par jour • Description : Les animaux sont progressivement exposés au tapis roulant afin de réduire le stress et de garantir une familiarisation suffisante avec l’appareil avant les premiers tests. 2-Traitement expérimental d'une durée de 4 semaines • Administration quotidienne selon le protocole expérimental. 3-Évaluation des capacités physiques – Tests pré-entraînement • Durée d’une session : 20 à 35 minutes par animal • Description : Test d’endurance, test d’exercice progressif ou autre mesure selon le protocole, afin d’établir le niveau physique basal avant l’entraînement. 4-Programme d’entraînement physique a) Entraînement sur tapis roulant • Durée totale : 6 semaines • Fréquence : 5 jours par semaine • Durée d’une séance : variable (progressive selon intensité et protocole) • Description : Sessions structurées d’endurance visant à induire des adaptations musculaires et physiologiques. b) Activité spontanée en roue • Durée : 6 semaines en parallèle de l’entraînement • Accès libre à la roue pendant les périodes prévues selon le protocole. 5-Évaluation des capacités physiques – Tests post-entraînement • Durée d’une session : 20 à 35 minutes par animal • Description : Tests identiques ou équivalents aux mesures pré-entraînement, afin d’évaluer les effets de l’entraînement et/ou du traitement. 6-Test d’activité spontanée • Durée : 30 minutes • Description : Analyse du comportement locomoteur et de l’activité libre. 7-Mise à mort et prélèvements • Réalisés conformément aux procédures réglementaires . • Un prélèvement sanguin terminal est effectué juste avant l’euthanasie.
Impact sur les animaux
Pour l’exercice : lésions plantaires, fatigue musculaire, stress lié à la manipulation ; Pour la Corticosterone: perte de poids, diminution de l’appétit, altération du pelage, apathie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.
Remplacement
Pour comprendre comment le cerveau, les muscles et l’énergie du corps fonctionnent ensemble, il faut étudier le corps dans son ensemble, car tous ces systèmes interagissent. Le cerveau peut s’adapter et changer, le corps transforme l’énergie pour fonctionner, les muscles et les nerfs travaillent ensemble, et tout cela est régulé par un système qui contrôle le stress et des signaux venant du reste du corps. Pour vraiment comprendre comment tout cela fonctionne, il faut observer le corps dans son ensemble.
Réduction
Dans ce projet , nous avons cherché à utiliser le moins d’animaux possible dès la conception de l’étude. Pour déterminer combien de souris étaient nécessaires, nous avons utilisé un logiciel spécialisé qui nous aide à prévoir combien d’animaux suffisent pour obtenir des résultats fiables. Nous avons estimé qu’avec 15 souris par groupe (soit 90 souris au total pour 6 groupes), nous pourrions détecter des effets importants du stress et de l’exercice sur la santé des souris, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Chaque souris suivra un protocole standardisé permettant de réaliser de nombreuses analyses différentes (biochimie, molécules, comportement), ce qui maximise les informations obtenues à partir de chaque animal.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées à la procédure réalisée afin de limiter au minimum la souffrance animale. Une habituation est réalisée au cours de la phase d’acclimatation pour limiter le stress généré. Les animaux seront regroupés dans des cages (6 animaux par cage). L’isolement des animaux est évité. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne est effectuée. Si le comportement d'un animal est altéré, il est pesé avec un point limite de perte de poids. Si d'autres points limites sont observés lors du suivi, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire. A l’issue de l’exercice sur tapis roulant, si l’animal semble fatigué, de l’alimentation sous forme de granullé mouillé est fournie, voire il est réalisée une injection de NaCl 0,9% . Des soins locaux sont prévus en cas d'irritation des pattes au cours des séances d'entrainement. Les animaux pour lesquels une habituation est impossible (< 1/15 en moyenne) sont retirés de l'expérimentation, afin que l'exercice ne soit pas associé à un stress douloureux. Ces animaux seront décomptés du total d'animaux utilisés. Mise à disposition des animaux, si besoin, de poches d’eau gélifiée et/ou croquettes humides.
Choix des espèces
Taille et facilité de manipulation pendant l’exercice physique sur tapis roulant animal. Les souris sont souvent considérées comme un choix plus acceptable sur le plan éthique pour la recherche que les animaux plus gros. Leur petite taille et leur capacité à être logés en groupe facilitent la prestation de soins appropriés et minimisent les souffrances. L’entretien et le logement des souris sont généralement plus rentables que les animaux plus gros, car ils nécessitent moins d’espace, de nourriture et de ressources. Compatible avec le tapis roulant,roue d'activité spontonés, grip strength (mesurer la force de préhension) et Open field (permet d’évaluer l’activité et certains aspects du comportement de la souris) de notre laboratoire. Animaux jeunes adultes 8 semaines. Age pour lequel l'entrainement physique en aérobie aura le plus d'effet sur le système musculaire.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 7000
660 000 souris et rats sont élevés pour être livrés aux laboratoires porteurs de la mutation voulue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 535 000 d'entre eux et modéré pour 125 000. Chacun peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue pour vérifier son génotype, jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour et une injection d'hormone destinée à activer sa mutation. Une partie part vers d'autres établissements, le reste est mis à mort, ces animaux appartenant au scientifique et ne pouvant, selon le porteur, être replacés. Il annonce une hausse d'environ 10 % des effectifs et indique que les scientifiques s'engagent par écrit à l'absence de solution de remplacement, l'objectif affiché étant de leur livrer le "modèle parfaitement adapté" à leurs expérimentations.
Objectifs
Ce projet consiste à maintenir des lignées de rongeurs dont certains gènes ont été modifiés. Ces modifications peuvent provoquer chez les animaux des changements visibles ou des symptômes particuliers, appelés phénotypes. L’objectif est d’observer ces animaux, de comprendre si la mutation génétique a un impact sur leur santé et leur bienêtre, et d’ajuster la manière dont ils sont suivis et soignés en fonction de ces observations. Ces animaux sont utilisés comme modèles dans la recherche scientifique, par exemple pour mieux comprendre des maladies génétiques comme la mucoviscidose, l’hémophilie ou certaines myopathies, et contribuer au développement de nouveaux médicaments. Pour savoir si un animal porte réellement la mutation recherchée, on effectue une biopsie, généralement en prélevant un morceau d’oreille. Ce prélèvement sert à extraire l’ADN et à vérifier si la mutation est présente. Cela est indispensable, car dans une même portée, tous les animaux ne sont pas forcément porteurs, et il faut pouvoir identifier précisément ceux qui seront utiles pour les recherches et garantir la fiabilité des résultats. Lorsqu’une nouvelle lignée génétiquement modifiée arrive ou est créée, et que l’on ne connaît pas encore les effets de la mutation, une phase d’observation détaillée est mise en place pour comprendre comment celleci influence l’animal et s’assurer que son bienêtre est préservé. Lorsque les effets de la mutation sont déjà connus, le suivi et les soins sont adaptés directement, en surveillant les éventuels signes cliniques et en mettant en place des mesures de prévention ou de traitement si nécessaire. Pour certaines lignées, la mutation ne s’exprime que lorsque l’animal reçoit une substance déclenchante, par exemple une hormone, ce que l’on appelle un ligand. Une administration peut donc être réalisée afin d’activer la mutation et de permettre à l’animal de manifester les caractéristiques liées à cette modification génétique. Dans l’ensemble du projet, environ 660 000 animaux sont concernés, avec une augmentation d’environ 10 % liée à une utilisation croissante de ces modèles. Ils sont répartis dans 500 à 600 projets de recherche différents. Parmi ces projets, environ 35 % portent sur des lignées génétiquement modifiées, pour lesquelles les animaux font l’objet d’une attention particulière en matière de suivi et d’évaluation des phénotypes, afin d’anticiper et de limiter au maximum l’impact potentiel de la mutation sur leur bienêtre.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait dû être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptées à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le modèle parfaitement adapté pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis (par animal) : à 1 à 2 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique : un prélèvement par animal à la queue maximum) (maximum 4 biopsies sur validation par l’équipe vétérinaire), acte d’une durée maximale de 2sec par biopsie. à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de max 3sec. à une injection d’un ligand, acte d’une durée maximale de 10sec par injection. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite).
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité innatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dus à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergés et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur génétiquement altéré quand il est accouplé avec des animaux non génétiquement altéréesafin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, n’est utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypage. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européennes (au moins 7 animaux de chaque sexe et génotype, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés au suivi vétérinaire des animaux. Pour les lignées à phénotype dommageable, des observations cliniques plus fréquentes et spécifiques, avec des points limites, peuvent être mises en place. Pour limiter la douleur, une euthanasie pourrait être demandée à un point limite ou âge précis pour éviter l’expression du phénotype. Cela est évalué lors de la caractérisation du phénotype, en lien avec le scientifique et les vétérinaires. Les observations sont facilitées par des outils internes comme des grilles de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype, des points d’intervention sont adoptés pour un suivi précis et des soins adaptés (soutien nutritionnel…). Si des signes cliniques peuvent être atténués ou guéris par traitement, avec accord du scientifique, le traitement est mis en place. Les animaux présentant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final pour assurer leur réception et utilisation selon les normes éthiques et de bien-être animal.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement altérés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5 jours après la fécondation.
Utilisation d’un microARN inhibiteur pour le traitement de l’Ostéogénèse Imparfaite [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
190 souris porteuses de la mutation de l'ostéogenèse imparfaite vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. À sept jours, un fragment d'oreille est prélevé pour les génotyper, puis chaque souris retenue reçoit huit injections intraveineuses hebdomadaires sous anesthésie, chacune suivie d'une radiographie au scanner. Le porteur qualifie ces mesures de non invasives et sans douleur, tout en indiquant que ces souris subissent en moyenne dix fractures spontanées à dix-huit semaines. 186 sont tuées pour analyser os, sang et organes, quatre gardées vivantes pour de futurs projets, et le porteur conclut que les études in vivo restent "indispensables" malgré les résultats déjà obtenus sur cellules osseuses.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement potentiel pour une maladie rare appelée l'ostéogenèse imparfaite (OI), communément connue sous le nom de "maladie des os de verre". Cette maladie héréditaire rend les os très fragiles et sujets à des fractures, même avec des traumatismes mineurs, et cause des déformations du squelette. Elle est due à une mutation génétique qui affecte la production de collagène de type 1, une protéine essentielle à la solidité des os. Il n’existe actuellement aucun traitement ayant fait solidement preuve de son efficacité sur la réduction du risque de fracture. Le traitement que nous testons utilise un inhibiteur de microARN, appelé AntagomiR, qui est administré par injection dans la veine. Les microARNs sont de petites molécules qui régulent l'activité des gènes, et dans le cas de l'OI, ils sont dérégulés, contribuant à l'aggravation des symptômes de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé que cet inhibiteur stimule la production de collagène et d'autres composants importants pour la formation des os par les cellules osseuses. Cette étude se déroule sur des souris qui présentent les mêmes mutations génétiques que les personnes atteintes de la maladie des os de verre et des fractures sur faible traumatisme tout comme les patients atteints. L'objectif est de voir si ce traitement peut renforcer les os et réduire les déformations squelettiques et fractures. Nous espérons développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de cette maladie, ou améliorer les traitements existants, qui sont actuellement très limités, surtout chez les enfants.
Bénéfices attendus
Bénéfices Scientifiques : Compréhension des mécanismes de la maladie : Cette étude vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un microARN, qui influence la formation et le remodelage des os. En étudiant comment ce microARN agit, nous pourrions découvrir des mécanismes fondamentaux liés à la fragilité des os chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite et mieux comprendre la complexité des interactions biologiques impliquées dans cette maladie. . Identification de nouvelles cibles pour les traitements : Si cette recherche démontre que le traitement à base d'un AntagomiR est efficace, cela pourrait confirmer que le microARN est une cible valable pour de futurs médicaments. Le mécanisme étudié pourrait être applicable pour un futur traitement pharmaceutique. Cette étude mènerait à la mise en place de nouveaux traitements pour la maladie des os de verre, mais aussi pour d'autres maladies où les os sont anormalement fragiles. Progrès technologiques : En menant cette étude, nous allons également perfectionner des techniques avancées pour administrer des traitements basés sur les microARNs, comme cet AntagomiR, directement dans les organismes vivants. Bénéfices Cliniques : Amélioration des traitements disponibles : Si le traitement avec cet AntagomiR s’avère efficace, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie des os de verre, une maladie pour laquelle les traitements actuels sont limités. Un tel traitement pourrait non seulement renforcer les os et réduire les fractures, mais aussi améliorer de manière significative la qualité de vie des patients en diminuant les risques liés aux dommages osseux et des autres tissus comprenant du collagène. Réduction des effets secondaires : Comparé aux traitements existants, comme les bisphosphonates, qui peuvent entraîner des effets secondaires parfois difficiles à gérer, surtout chez les enfants, cet AntagomiR pourrait offrir une alternative mieux tolérée
Procédures
[Modif. du 22/12/2025 : A 7j les souriceaux sont sélectionnés par analyse d’ADN sur une biopsie de 1mm d’un bout d’oreille au cours d’une anesthésie gazeuse courte] Les injections seront hebdomadaires pendant 8 semaines dans chaque procédure et réalisées au cours de l'anesthésies gazeuse des radiographies. Pour connaitre l’efficacité du traitement, les souris sont anesthésiées pour une durée de 15 minutes pour avoir une injection intraveineuse du traitement suivie d’une radiographie par scanner afin d’évaluer la qualité osseuse et le nombre de fractures. Ces mesures sont non-invasives, ce qui signifie qu'elles ne causeront pas de douleur ou de dommage aux animaux. Cette intervention permet : > la surveillance de l'apparence et de la santé générale : Chaque semaine, nous examinerons les souris pour suivre leur croissance, si leur poids change et si elles subissent des fractures. > radiographies hebdomadaires et recherche de fracture. > Une analyse détaillée des os par imagerie : permet de voir l’aspect 3D des os et de mesurer plusieurs éléments importants, comme la densité des os, le volume osseux par rapport au volume total, l'épaisseur des petites structures osseuses (trabécules), leur nombre, et l'espace entre elles. Cette intervention sera donc répétée 8 fois par souris pour une durée estimée de 15 minutes par souris.
Impact sur les animaux
[Modif. du 22/12/2025 : La biopsie d’oreille peut entrainer une douleur légère chez le souriceau (7-10 jours) avec administration d’antalgiques. Elle est précédée d’une désinfection et elle est suivie d’une compression douce d’un retour au nid immédiat et d’une surveillance rapprochée pour limiter le risque d’infection, de saignement, de stress et de complication respectivement] Au cours de cette étude, les souris pourraient éprouver certains inconforts en raison des manipulations fréquentes et des injections répétées du traitement ou des fractures. Les effets possibles incluent une perte de poids, une diminution de l'appétit, et des difficultés à se déplacer. En raison de leur mutation génétique spécifique, les souris sont également plus susceptibles de subir des fractures osseuses spontanées, ce qui peut causer de la douleur. Les souris présentent des fractures spontanées sur de faible traumatisme, en moyenne 10 fractures à 18 semaines, sans mortalité associée. Les signes de douleur ou de stress que nous pourrions observer chez les souris incluent un frottement ou un léchage excessif, une agressivité ou prostration inhabituelle, ou une posture anormale. Elles pourraient également montrer un malaise général, une réduction de leur activité, et un pelage qui semble mal entretenu. Conformément à la littérature scientifique, il n’existe pas d’effet attendu du traitement sur le plan de la tolérance viscérale ou comportementale au-delà de l’effet thérapeutique recherché.
Devenir
[Modif. du 22/12/2025 A l’issue de la procédure de croisement les souriceaux sont sélectionnés pour la procédure d’élevage pour être orientés vers la phase expérimentale lorsqu’ils sont porteurs de deux copies de la mutation invalidante ou pour être gardés comme animaux reproducteurs lorsqu’ils sont porteurs d’une seule copie de la mutation. Les souris qui ne sont pas gardées pour ces procédures (d’élevage ou d’expérimentation) sont retirés du projet de manière indolore par injection de produit euthanasiant sous anesthésie générale. 4 souris disposant d’une seule copie de la mutation seront maintenues en vie à l’issue du projet en animalerie sécurisé en vu de futurs projets à moyen terme (
Remplacement
Pour trouver de nouvelles solutions de traitement pour la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite, OI), il est crucial de mener des études sur des souris. Ces études sont nécessaires car elles permettent de recréer un environnement qui se rapproche le plus possible de celui des patients atteints d’OI. Les souris utilisées dans ces expériences présentent des altérations génétiques et physiques similaires à celles des personnes atteintes par la maladie, c’est-à-dire une mutation du collagène qui se traduit par une fragilité osseuse et des fractures. Ceci rend les résultats plus pertinents pour le développement de nouveaux traitements. Ces projets sont basés sur les résultats obtenus par nos études cliniques chez l’homme qui montrent que de petites séquences d’ARN (miRNAs) excrétés des tissus, notamment du tissu osseux sont dérégulés chez les patients. Avant de passer à ces études in vivo, nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules osseuses de souris, montrant que l'inhibiteur de l’un de ces miRNAs, appelé AntagomiR, a des effets bénéfiques sur la fragilité osseuse. Ces tests nous ont permis d'affiner notre approche et de nous préparer pour les essais plus complexes sur des souris. Bien que nous ayons déjà effectué des tests en laboratoire sur des cellules osseuses, ces modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire toutes les interactions complexes présentes chez la souris notamment en termes de tolérance et efficacité phénotypique. Par conséquent, les études in vivo sur des souris restent indispensables pour obtenir des données cliniquement pertinentes. Les souris OIM constituent le modèle le moins sensible reproduisant le plus fidèlement sur le plan physiopathologique et sur le plan clinique l’atteinte humaine.
Réduction
[Modif. du 22/12/2025 Concernant l’étape de reproduction, nous constituerons 2 trios à partir de souris d’un élevage agréé. L’orientation précoce des souris est assurée par un génotypage réalisé à j7–j10 ce qui évite d’élever inutilement des animaux non inclus. Les reproducteurs ne présentent pas de phénotype dommageable]. Les protocoles d'injection seront optimisés au cours d’une première étape pilote sur 10 animaux avec 5 régimes d’injection différents, garantissant que le rythme d'injection le mieux toléré et le plus efficace sera utilisé dans les étapes suivantes. L’innocuité et la durée du traitement seront précisés par absence d’effets secondaires et le rythme d’injection le mieux toléré par les souris, sera déterminé en observant la réaction des animaux à l’issue de la première administration et les signes pertinents de mal être. L’efficacité du traitement sera également prise en compte par le jugement du critère principal d’amélioration fonctionnelle, c’est-à-dire une diminution de la fragilité osseuse et du nombre de fractures, en fin de procédure. Cela permettra de minimiser les variations et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires par la suite, avec l’injection chez 10 souris de l’antagomiR et 10 souris de l’antagomiR-contrôle. Enfin dans une dernière phase, en cas d’échec de la phase 2, l’utilisation de 10 souris avec cette fois l’injection unique d’un antagoniste du microARN sous forme de particules lentivirales qui conduirait à une antagonisation stable et continue du microARN. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats statistiquement significatifs, nous avons défini des critères précis de réduction basés sur l'incidence des fractures. Nous anticipons une diminution de 30% des fractures par rapport au groupe contrôle. Cette estimation nous conduit à un échantillon de 10 souris par groupe expérimental. L'utilisation de cette approche statistique rigoureuse permet de minimiser le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus. La collecte de données longitudinales sur les mêmes animaux à différents points de temps maximisera les informations recueillies et réduira le besoin d'augmenter la taille des groupes pour les analyses de fin d'étude.
Raffinement
Pour leur confort, les souris bénéficieront d’un environnement enrichi avec des matériaux de nidification et des structures souples pour limiter le stress et les traumatismes, particulièrement chez les souris à fragilité osseuse accrue. Les manipulations seront effectuées à l’aide de tunnels pour éviter les traumatismes et réduire le stress, toute manipulation autre que par main en coupe étant proscrite. Le personnel recevra une formation continue sur les meilleures pratiques de soins et de manipulation. Les conditions d’hébergement seront adaptées : les souris seront logées en groupes réduits pour minimiser les risques d’agressivité et bénéficier d’un suivi qualitatif renforcé. Les cages seront équipées de matériaux non abrasifs et d’une litière épaisse, avec de la nourriture et de l’eau gélifiée disposées au fond pour faciliter l’accès, même en cas de douleur ou de boiterie. Une évaluation du bien-être et de la douleur de manière standardisée permettra une intervention rapide. Des anti-douleurs seront mis dans l’eau de boisson pour la gestion autonome des douleurs, et en cas de douleur ou de fracture, de l'anti-inflammatoire ou un anti-douleur plus puissant sera administré. Si un animal atteint un état de stress important ou un point limite de bien-être, il sera euthanasié après une sédation gazeuse pour une fin de vie sans douleur. Tous les équipements ou fournitures entrant en contact avec les souris seront stérilisés pour éviter toute contamination. Les expérimentations auront lieu dans un environnement confiné et sécurisé. En cas de plaies mineures, une crème apaisante sera appliquée pour faciliter la cicatrisation. [Modif. du 22/12/2025 Les effets indésirables du prélèvement d’oreille du souriceau sont minimisés par la rapidité du geste réalisées sous anesthésie gazeuse avec compression du tissu et remise immédiate de l’animal dans le nid. Pour les procédures d’élevage et d’expérimentation l’ensemble des souris, y compris celles qui ne présentent pas de signe clinique de la maladie et qui ne sont donc pas exposes aux procédures expérimentales bénéficient des mêmes conditions de raffinement en élevage.]
Choix des espèces
L'utilisation de souris dans cette étude est justifiée par leur capacité à mimer la maladie humaine, en particulier les souris oim+/+, qui présentent un phénotype très proche de celui observé chez les patients atteints d’ostéogenèse imparfaite (OI). Âge des Souris : 6 Semaines à J0 : Développement Osseux Critique : À 6 semaines, les souris sont en pleine croissance rapide, ce qui est essentiel pour étudier l'effet des traitements sur le développement osseux et la fragilité liée à l'OI. Les manifestations de l'OI, telles que les fractures et les dommages osseux, sont déjà présentes à cet âge, permettant une évaluation claire des effets thérapeutiques. Homogénéité et Comparabilité : Utiliser des souris du même âge assure une cohérence dans les données, réduisant les variations dues à des différences de développement entre individus. Cette approche soigneusement planifiée permet d'assurer que les résultats obtenus seront significatifs et utiles pour envisager des interventions thérapeutiques chez les patients humains souffrant d'OI.
Caractérisation du potentiel thérapeutique de sucres complexes dans la régénération de la jonction neuromusculaire
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les rats utilisés portent la mutation de la dystrophie musculaire de Duchenne, maladie qui détruit progressivement leurs muscles. 74 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Le protocole le plus lourd prévoit vingt-quatre injections dans les muscles des pattes arrière, une par patte et par semaine pendant douze semaines, précédées de douze injections d'antalgique, puis un test de réponse nerf-muscle sous anesthésie. Le porteur indique que les animaux sont tués au plus tard à seize semaines, avant les symptômes les plus graves de la maladie, et détaille la répartition de 60 rats, alors que 74 sont déclarés dans le projet.
Objectifs
Les troubles générant une instabilité de la synapse, ou jonction neurone-muscle (NMJ), sont fréquents dans plusieurs maladies neuromusculaires. Ces troubles amplifient un déclin moteur, quand ils n’en sont pas directement la cause. Cette relation est confirmée par des expériences qui montrent qu’en réduisant la fragmentation des NMJ, on améliore la force motrice dans un modèle animal de Myopathie de Duchenne (DMD). L'identification des mécanismes de stabilisation de la NMJ est donc cruciale pour la découverte de traitements innovants contre des maladies neuromusculaires dévastatrices et actuellement incurables. Des sucres complexes particuliers appelés héparanes sulfates pourraient intervenir comme mécanisme stabilisateur des NMJ. Ces sucres complexes ainsi que les enzymes à l’origine de leur production diminuent de manière parallèle à la fragmentation de la NMJ chez les DMD. Cette corrélation temporelle est conforme au rôle stabilisateur des synapses de ces molécules et suggère que ce rôle est perdu dans la DMD. Notre but est de rétablir ce rôle chez les animaux DMD en réexprimant ces molécules de surface modifiées afin de stabiliser la NMJ et de promouvoir la récupération fonctionnelle des muscles. Trois objectifs seront poursuivis : 1) augmenter l'expression des enzymes responsables de l’expression de ces molécules de surface modifiées, 2) étudier l'impact de peptides inhibiteurs de ces molécules sur l'intégrité des NMJ in vivo, et 3) tester l'efficacité de l’utilisation in vivo de mimétiques des molécules de surface modifiées sur la stabilisation des NMJ dans la DMD.
Bénéfices attendus
La NMJ est au centre d’un spectre de maladies neuromusculaires, en comprendre la dérégulation permet d’adresser de nouvelles avenues thérapeutiques pour des maladies rares. Notre recherche explore la manière dont des héparanes sulfates (HS) spécifiques régulent la stabilisation de la NMJ dans la DMD. En élucidant le rôle de motifs sulfatés spécifiques dans les HS, nous souhaitons améliorer la compréhension de la fonction musculaire et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux traitements pour les maladies musculaires.
Procédures
Dans ce projet, le traitement sera administré par injections dans un muscle de chacune des pattes arrières, soit 2 injections par animal à chaque fois. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement injectés avec un médicament contre la douleur, injection qui pourra être répétée toutes les 12 heures pendant 2 à 3 jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un test fonctionnel pour évaluer la réponse nerf-muscle sera réalisé sur des animaux endormis complètement (anesthésiés au moyen d’une injection). Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute. Au total 60 animaux, desquels : - 24 recevant : 1 injection d’un médicament contre la douleur, 2 injections du traitement (une dans chaque patte), et 1 injection pour l’anesthésie. - 16 recevant : 4 injections d’un médicament contre la douleur, 8 injections du traitement (une dans chaque patte, une fois par semaine pendant 4 semaines), et 1 injection pour l’anesthésie. - 20 recevant : 12 injections d’un médicament contre la douleur, 24 injections du traitement (une dans chaque patte, une fois par semaine pendant 12 semaines), et 1 injection pour l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Des études antérieures réalisées avec ce type de molécules sur d’autres modèles animaux n’ont révélé ni toxicité ni effets secondaires. Sur cette base, aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans le cadre de ce projet. Les injections seront réalisées directement dans un muscle de chaque patte, ce qui peut provoquer une légère douleur locale. Ces injections seront effectuées chez des animaux âgés de 4 - 16 semaines, à un stade de la maladie où les muscles sont encore peu affectés de sortes que l’injection ne devrait avoir qu’un faible impact négatif. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge maximal de 16 semaines, puis mis à mort avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie, afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie. L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser au maximum les nuisances pour les animaux, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques essentielles à l’évaluation de cette approche thérapeutique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des trois procédures pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps d’une structure multipartite requérant l’interaction entre de nombreux types cellulaires (fibre musculaires, motoneurones, cellules de Schwann, kranocytes). De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Préalablement aux essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité des thérapies testées a été démontrée sur des cultures de cellules musculaires. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans connaissance d'un mécanisme biologique robuste, préalablement établi in vitro. La stratégie proposée ici consiste à cibler spécifiquement le muscle plutôt que tout autre organe, permettant de réduire la dose administrée et la toxicité virale sur certains organes tels que le foie. Les stratégies passant par l’utilisation des molecules spécifiques proposés dans ce projet ont déjà été validées sur des animaux de plus petite taille. Le présent projet est la dernière étape chez l'animal visant à confirmer son efficacité en condition réelle, c'est-à-dire sur un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie que le traitement vise à corriger, y compris dans la complexité de la réponse de l'organisme à l'administration du traitement.
Réduction
Le projet a été optimisé pour utiliser un nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre une significativité scientifique et statistique adéquate. La taille d’échantillon a été calculée, recommandant l’utilisation optimale de 10 animaux par groupe. Ce chiffre a été validé par d’autres projets achevés présentant des caractéristiques similaires en termes d’état de développement, de stratégie et de paramètres évalués. Les résultats seront analysés par des tests statistiques qui permettront de confirmer ou infirmer des différences entre plusieurs groupes de variables. Chaque animal sera exploité de manière optimale, en recueillant un maximum de données (analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles) à partir des mêmes animaux, prélèvements et échantillons. Ainsi, nous garantissons que les objectifs scientifiques du projet pourront être atteints tout en réduisant le nombre d'animaux enrôlés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des portoirs équipés de cages ventilées, situés dans des locaux où la température et l’hygrométrie sont rigoureusement contrôlées. Pour leur bien-être, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 par cage à l’âge d’un mois. Puis nous réduisons ce nombre jusqu’à atteindre 3 animaux par cage pour les animaux de plus de 600 grammes. L’isolement n’existe jamais. Afin de favoriser leur bien-être et de limiter les comportements stéréotypés, ils bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant un contact hebdomadaire alterné avec différents éléments tels que du coton aggloméré, des bâtonnets de bois, du papier kraft plié en accordéon, des rouleaux de carton et un hamac. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les injections, grâce à l’utilisation de molécules contre la douleur ou pour induire le sommeil. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur. Afin de réduire le stress lié aux manipulations expérimentales, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement. De plus, ils seront familiarisés avec l’expérimentateur pendant 2-3 jours avant le début des procédures, ce qui permettra de diminuer leur réponse au stress et d’assurer des conditions expérimentales plus harmonieuses.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi dans ce projet présente un système neuromusculaire soumis aux mêmes phases de développement pathologique que chez l’humain et qu’on ne retrouve pas chez d’autres modèles animaux. Ce modèle de rat DMD présente les iso-enzymes médiant la sulfatation des HS, conservées chez l’humain, d’où sa pertinence pour la compréhension physiologique et son intérêt pour les maladies neuromusculaires humaines. Les animaux seront injectés à 4 semaines. La fragmentation des NMJ est perceptible dès 2 mois et est déjà maximale à 7 mois. Les traitements visent à prévenir sur la période 1-4 mois l’apparition de la fragmentation de la NMJ au moment où elle s’installe et s’amplifie. .
Etude du muscle squelettique chez les rongeurs par Imagerie et Spectroscopie par Résonance Magnétique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
595 souris mâles vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à douze examens d'imagerie par résonance magnétique de trois heures sous anesthésie gazeuse, espacés de quinze jours au minimum. 315 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 280 un niveau léger, et toutes sont tuées pour prélever les muscles des membres postérieurs. Des lésions musculaires leur sont infligées par injection de notexine ou par électroporation, et un agent de contraste est injecté pendant l'examen. Le porteur présente la résonance magnétique comme relevant du premier principe des 3R, remplacer, parce qu'elle évite des prélèvements invasifs, et conclut par ailleurs que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le muscle.
Objectifs
Le phénomène de résonance magnétique nucléaire (RMN), a permis de développer les techniques d’imagerie médicale non invasive depuis plusieurs décennies. Les nombreuses innovations qu'a connues la RMN, en imagerie (IRM) et aussi en spectroscopie (SRM), laissent entrevoir de nouvelles applications. Les techniques d’IRM et de SRM sont des outils puissants dans le domaine des pathologies neuromusculaires et cardiaques (suivi de l’infiltration graisseuse, de l’inflammation, de l’œdème, des atteintes métaboliques…) et sont sans cesse en développement. Le projet soumis ici a pour but de développer dans la durée de nouvelles méthodes d’imagerie et de spectroscopie RMN pour améliorer l’évaluation du muscle squelettique et cardiaque chez les rongeurs. Ces outils pourront ensuite être utilisés en routine dans les projets en expérimentation animale ou transposés en clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - D’un point de vue cognitif, il va permettre d’améliorer notre connaissance sur le tissu musculaire, sa structure et son fonctionnement. - D’un point de vue recherche préclinique, il va permettre la mise en place d’outils d’évaluation du muscle et le développement de nouveaux biomarqueurs du tissu musculaire. Ces nouveaux outils et biomarqueurs pourront ensuite être transposés en recherche clinique.
Procédures
L’ensemble des examens par résonance magnétique nucléaire (RMN), ainsi que l’induction des lésions musculaires localisées, seront réalisés sous anesthésie gazeuse. La durée maximale des examens RMN sera de 3 heures. Chaque animal pourra être soumis à un maximum de 12 examens RMN, espacés d’un intervalle minimal de 15 jours. L’induction des lésions musculaires sera brève, ne dépassant pas 15 minutes. Une analgésie préalable à la lésion sera effectuée par injection d’un analgésique. Les injections d’agent de contraste seront effectuées sur animal sédaté pendant l’examen RMN et le volume d’agent de contraste sera calculé de façon à avoir une concentration adaptée au poids corporel. À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés après sédation, afin de permettre le recueil des échantillons musculaires.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances qui sont attendues sont liés aux anesthésies mise en œuvre dans ce projet pouvant induire une détresse respiratoire, si une fréquence respiratoire inférieure à 60 cycles/minute persiste, et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut. Dans le cadre du développement des méthodes d’imagerie, l’utilisation d’un agent de contraste sera nécessaire. Cette injection n’induit pas d’effets secondaires sauf une légère irritation au moment de l’injection en qui s’accompagne d’une augmentation transitoire de la fréquence respiratoire (quelques secondes). Enfin les modèles utilisés pour la validation des méthodes d’imagerie sont des modèles de dégénérescence/régénération musculaire peu traumatiques. Les lésions musculaires mises en œuvre n’induisent pas de phénotype dommageable ni perte de fonction mais pourrait réduire transitoirement un inconfort et une réduction de la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure expérimentale, afin de permettre le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
La résonance magnétique nucléaire (RMN) s’inscrit dans le premier principe des 3R, Remplacer, en permettant d’évaluer in vivo un grand nombre de paramètres du tissu musculaire, réduisant ainsi le recours aux techniques invasives telles que l’histologie ou la biochimie, qui nécessitent souvent l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement d’échantillons. Toutefois, à ce jour, aucun modèle in vitro ne reproduit fidèlement la complexité architecturale ni le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. L’utilisation de modèles animaux demeure donc indispensable à l’étude de ces tissus. Divers modèles animaux de pathologies neuromusculaires sont disponibles, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement répandus en recherche fondamentale et préclinique en raison de leur facilité de manipulation liée à leur petite taille, ainsi que de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques phénotypiques des pathologies humaines, telles que la fibrose, les cycles de dégénérescence/régénération musculaire et les processus inflammatoires.
Réduction
La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiples à partir d’un même animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie RMN, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effets nocifs pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Le nombre total d’individus est de 595 individus. Les sous-groupes d’animaux sont au minimum de 10 individus. Ce nombre a été estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques standards.
Raffinement
La résonance magnétique nucléaire (RMN) répond également au troisième principe des 3R, Raffinement, grâce à l’évolution continue des outils méthodologiques et aux avancées technologiques en électronique, qui permettent aujourd’hui d’atteindre, en préclinique, des résolutions environ 3000 fois supérieures à celles obtenues avec les dispositifs cliniques les plus performants. Le raffinement s’applique également aux conditions d’hébergement des animaux, maintenus en groupes dans des cages à usage unique placées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement de l’environnement (tubes en carton, copeaux pour la nidification). Toutes les procédures RMN seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité des animaux et de minimiser leur stress. Les modèles lésionnels seront mis en œuvre par du personnel qualifié, notamment pour les injections de notexine, de peptides et pour l’électroporation, réalisée sous anesthésie. La température corporelle sera maintenue à 38 degrés Celsius grâce à un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire suivie en continu à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. L’état de santé des animaux fera l’objet d’une surveillance quotidienne, conformément à la législation en vigueur, et leur poids sera systématiquement contrôlé avant chaque expérimentation afin de détecter toute perte anormale. Des points limites liés à l’état général de l’animal, la réalisation des lésions et la réalisation des examens RMN ont été définis.
Choix des espèces
En raison de leur petite taille et des conditions d’hébergement relativement simples qu’elles requièrent, les souris constituent un modèle animal aisément manipulable et largement utilisé en recherche biomédicale. L’ensemble des procédures sera réalisé chez des animaux ayant atteint l’âge adulte, compris entre 2 et 15 mois. Ce choix vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’affecter la qualité des mesures, notamment en termes de répétabilité et de reproductibilité. Le développement méthodologique prévu dans ce projet nécessitera, dans une première phase, le recours à des animaux issus d’élevages commerciaux, avant une application ultérieure à des modèles pathologiques bien caractérisés. Les modèles lésionnels induits permettent d’étudier les mécanismes impliqués dans le développement de pathologies humaines. Dans le cadre de cette demande d’autorisation, qui concerne exclusivement un développement méthodologique, le choix a été fait de restreindre l’étude à des animaux de sexe mâle.
Etude du rôle de la métalloprotéinase matricielle -3 (MMP3) dans la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
840 souris subissent une injection intramusculaire qui leur lèse le muscle, sans recevoir le moindre anti-douleur. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées, entre trois heures et vingt-huit jours après la lésion, pour prélever leur muscle et leur tissu adipeux. Le porteur explique écarter tout anti-inflammatoire et tout antalgique parce qu'ils perturberaient la réponse qu'il veut mesurer, et annonce une mobilité réduite dans les six heures qui suivent, prolongée de quelques jours chez les souris âgées de 18 à 20 mois. Il indique par ailleurs qu'un autre projet du laboratoire développera des puces multi-organes à partir de prélèvements humains pour modéliser ces échanges sans animaux.
Objectifs
La taille de la population âgée dans le monde croît très rapidement. De ce fait, l'un des principaux défis consiste à s'assurer que les années supplémentaires de vie soient des années de qualité, on parle alors de vieillissement en bonne santé. La sarcopénie - une perte de masse et de fonction des muscles squelettiques liée à l'âge- représente aujourd’hui le risque majeur de dépendance des personnes âgées. Cette sarcopénie demeure un trouble dont les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement connus et pour laquelle il n'existe pas de traitement efficace autre que l'activité physique qui, souvent, ne peut pas être proposée à tous les patients. Le muscle squelettique possède une extraordinaire capacité de régénération qui est fortement affectée par le processus de vieillissement. Notre équipe a démontré que le tissu adipeux (plus communément appelé « la masse grasse ») abrite une population cellulaire dotée d'un fort potentiel régénératif. En outre, nous avons montré pour la première fois chez l’individu jeune que le tissu adipeux libère des cellules souches spéciales en réponse à une lésion musculaire et qu’elles infiltrent le muscle pour soutenir la régénération. La présence de ces cellules souches dans le muscle aprés une lésion est requise pour obtenir une régénération efficace et ainsi restaurer la fonction musculaire. De manière très intéressante, nos travaux les plus récents montrent que la migration de ces cellules souches en dehors du tissu adipeux est dépendante de la présence d’un acteur protéique, une métalloprotéase matricielle absente chez l’individu âgé, ce qui pourrait expliquer la perte du potentiel de régénération avec l’âge et la faiblesse musculaire associée. Dans ce contexte, l’objectif principal de notre projet est d’évaluer l'importance de ce facteur protéique dans la migration des cellules souches infiltrant le muscle après la lésion chez la souris. Nous proposons de restaurer l’expression de cet acteur chez des souris âgées et d’évaluer l’impact sur l’infiltration musculaire des cellules souches modifiées et in fine si cette stratégie est suffisante pour restaurer une régénération musculaire et ainsi prévenir le déclin musculaire lié à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet est susceptible de mettre en évidence pour la première fois un mécanisme régulateur de l’infiltration de cellules souches du tissu adipeux vers le muscle après une lésion. En effet, si nous démontrons que restaurer la protéine identifiée chez des individus jeunes chez la souris âgée améliore la régénération musculaire, il sera tentant de spéculer que cet acteur pourrait représenter une cible pour prévenir le déclin musculaire lié à l’avancement en âge. Avec le vieillissement de la population à un rythme sans précédent, il est crucial d'identifier des interventions efficaces pour ralentir ou inverser la fonte musculaire chez les personnes âgées et améliorer leur santé et leur bien-être général. Ainsi, les bénéfices attendus du projet seront à court/moyen terme de mieux comprendre comment les cellules souches du tissu adipeux soutiennent le processus de régénération musculaire. À plus long terme, nous anticipons que ces travaux pourraient avoir des répercussions en santé humaine, sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, en ciblant l’acteur que nous avons identifié. Ce projet pourrait notament participer au développement de nouvelles options thérapeutiques pour la sarcopénie pouvant être utilisées chez les personnes âgées qui ne peuvent pas être physiquement actives en raison de problèmes de mobilité.
Procédures
Intervention 1 : Injection sur animal révéillé: tous les animaux (480) recevront deux injections consécutives sur un intervalle de 24h d’une molécule pharmacologique ciblant la protéine candidate. Durée de la contention et de l’injection : moins d’1 minute. Intervention 2 : Injection sous-cutané (sous la peau) sous anesthésie générale gazeuse : tous les animaux (360) recevront une injection sous-cutanée de cellules souches sous anésthésie générale gazeuse. Durée de l’anesthésie et de l’injection : moins de 2 minutes. Intervention 3 : Injection intramusculaire sous anesthésie générale gazeuse : tous les animaux (840) recevront une injection intramusculaire d’un agent neutre ou provoquant une lésion musculaire. Durée de l’anesthésie et de l’injection : moins de 3 minutes. L’ensemble des animaux recevront les interventions 1 et 3, ou les interventions 2 et 3, consécutivement. L’injection intramusculaire sera réalisée 2h après la seconde injection de la molécule pharmacologique, ou une semaine après l’injection sous-cutané, respectivement. Suite à l’injection intramusculaire, il n’y aura pas d’autre geste technique et les animaux seront euthanasiés à des temps précoces (3, 14 et 24h après la lésion, dans le but d'évaluer l'infiltration msuculaire des cellules souches dans le muscle) ou à des temps plus tardifs (7, 14 et 28 jours pour évaluer l’avancement du processus de régénération musculaire).
Impact sur les animaux
La contention des animaux effectuée pour l’injection peut causer un léger stress, sur une durée inférieure à une minute. L’injection de cellules par voie sous-cutanée peut entraîner une réaction inflammatoire locale légère pouvant durer quelques heures post-injection (jusqu’ 6h). Un inconfort voire de la douleur peut être constaté(e) au réveil des animaux ayant reçu une lésion musculaire du côté de la patte lésée. Dans les 6 heures suivant la réalisation de la lésion, une mobilité réduite pourra être observée. Cette mobilité réduite temporaire n’entrave pas la prise alimentaire chez les animaux âgés cependant, la durée de l’inconfort pourrait être allongée à quelques jours, nécéssitant une surveillance plus accrue. L’anésthésie générale gazeuse des animaux peut induire une léthargie post-anesthésie se résolvant en quelques minutes.
Devenir
Afin de caractériser l’effet de la réexpression de notre protéine candidate sur l’infiltration des cellules souches du tissu adipeux dans le muscle et la régénération associée après lésion, tous les animaux impliquées dans le projet seront euthanasié pour réaliser des prélevements d’organes (tissu adipeux et muscle). Les différents tissus seront utilisés pour des analyses cellulaires et morphologiques.
Remplacement
Des expériences préliminaires sur des cultures primaires de cellules murines ont déja été réalisées et ont démontré l’importance de notre protéine candidate dans la migration de ces cellules et ont également permis de mettre au point des doses et des modalités pharmacologiques pour une application chez la souris. Pour mettre en évidence le rôle de cette protéine sur l’infiltration des cellules souches du tissu adipeux dans le muscle lésé et étudier les échanges inter-organes, nous devons nécessairement passer à un modèle intégré, qui rassemble les différents organes impliqués et les structures anatomiques qui les relient. L’utilisation d’animaux vivants est ainsi nécessaire pour atteindre les objectifs du projet car il n’existe pas de modèles ex vivo récapitulant le dialogue inter-organe entre tissu adipeux et muscle en contexte physiologique et en contexte lésionnel. Toutefois, un projet qui sera prochainement initié dans le laboratoire visera à développer à terme des puces multi-organes contenant des organoïdes de tissu adipeux et de muscle obtenus à partir de prélevements humains dans le but de modéliser ce dialogue ex vivo sans utiliser d'animaux.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant, nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées ainsi que sur les nombreuses expériences (passées et publiées) de lésion musculaire que nous avons réalisées au laboratoire. Ainsi, il en ressort que 15 animaux par groupe seront nécéssaires. Toutefois, dans le but de réduire l’utilisation d'animaux âgés, nous n’effectuerons des explorations qu’à deux temps de prélèvement pour ces animaux au lieu de 6, ceci permet ainsi de réduire considérablement le nombre d’animaux. De plus, pour les animaux jeunes des groupes contrôles, seulement 4 temps de prélévements des tissus seront effectués au lieu de 6. Ensuite, une étude rétrospective sera réalisée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d’animaux. D’autre part, nous optimiserons l’utilisation de tous les animaux par un partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies qui ne sont pas strictement nécessaires au projet.
Raffinement
Prévention des animaux isolés : selon les cinétiques de prélévement des tissus, les mises à mort des animaux seront echelonnées, ainsi nous veillerons à ce qu’un minimum de 2 souris soient laissées par cage. Tout au long de la vie de la souris, celle-ci aura accés à de l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois, sizzle-nest ou igloo dans les cages. Concernant les procédures expérimentales implicant des lésions musculaires, tout traitement anti-inflammatoire ou anti-douleur n’est pas compatible avec notre étude car nous savons qu’ils perturberaient la réponse immunitaire et inflammatoire ainsi que l’infiltration de cellules d’intérêt depuis le tissu adipeux sous-cutané (données publiées) nécessaire au procéssus de régénération musculaire. Ainsi, nous proposons de mettre en place certaines actions dans le but de réduire les effets indésirables causés par l’anésthésie et la lésion musculaire : un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel occulo-protecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le déssechement occulaire. Des mesures de raffinement spécifiques aux procédures seront mises en place. En effet, pour les animaux âgés, quelques croquettes seront ajoutées en fond de cage pour faciliter la prise alimentaire et une surveillance plus soutenue sera effectuée les jours suivants la lésion. La lésion musculaire peut entraîner des signes cliniques tels que : gonflement de la patte droite lésée et un léger boitement. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d’amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.
Choix des espèces
Les processus du vieillissement musculaire et de régénération étudiés dans ce projet sont très bien caractérisés chez la souris. L’espèce, mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Plus spécifiquement, le processus de régénération musculaire, largement étudié dans ce projet, fait intervenir des populations cellulaires et des cinétiques d’évenements similaires chez l’Homme et la souris. De plus, les outils d’analyse nécessaires à la mise en oeuvre de cette étude sont tous disponibles et validés chez la souris. Pour l’ensemble de ces raisons, l’espèce murine paraît pertinente pour la réalisation de cette étude. Les animaux de ce projet seront soit des souris mâles jeunes adultes de 10 semaines soit des souris mâles âgés de 18-20 mois. Ces stades de développement ont été retenus car ils assurent un développement musculaire complet chez les souris âgées de 10 semaines, à l’inverse les souris âgées de 18 à 20 mois présentent un déclin de la masse et de la fonction musculaire (sarcopénie). Pour la cohérence de nos études nous préférons nous focaliser dans un premier temps sur des souris mâles et ainsi diminuer la variabilité inter-individuelle. En effet, nos précédents travaux sur la régénération et la santé musculaire ont été réalisé sur des souris mâles. Un dimorphisme sexuel du système musculo-squelettique a été largement décrit dans la littérature. Néamoins, l'analyse de cohortes de femelles fera l'objet d'une nouvelle demande d'autorisation de projet ou d’un amendement de ce projet après l’obtention des résultats expérimentaux.
AhR-HIF1a dans la fatigue engendrée par l’effort prolongé : rôle de l’inflammation et impact sur la fonction mitochondriale
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Poussés sur un tapis de course motorisé pendant environ deux heures, sans entraînement préalable, jusqu'à l'épuisement, 64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit d'abord une injection dans le ventre, puis une microincision de la queue pour un prélèvement de sang, l'écoulement étant arrêté par compression avec une compresse hémostatique. Le porteur ne retient de cet exercice forcé jusqu'à l'épuisement qu'un "stress léger", et n'attribue au protocole aucune autre atteinte. Tous les rats sont ensuite tués pour prélever leur cœur et leurs muscles squelettiques.
Objectifs
La fatigue induite par l’effort est un symptôme complexe multidimensionnel entrainant un stress du système immunitaire et un déséquilibre du métabolisme énergétique. Néanmoins, les interactions entre ces deux processus restent inexplorées. le but de ce projet est d'étudier le rôle et les potentielles interactions entre deux facteurs régulant l'expression de familles de gènes impliqués dans la réponse au stress des cellules dans de possibles modifications de l'inflammation et du métabolisme énergétique dans le muscle squelettique stressé par un exercice prolongé épuisant. L’objectif de l’étude est donc, à partir d’un modèle de rat pratiquant un seul exercice prolongé épuisant sans pré-entrainement, d’évaluer le rôle de ces facteurs dans l'apparition de dysfonctions cellulaires associées à la fatigue musculaire. Cette étude permettra de documenter les mécanismes impliqués dans la survenue de fatigue musculaire, notamment induite par l’effort.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer le rôle de deux nouveaux facteurs potentiels des troubles inflammatoires et les désordres du métabolisme énergétique dans l’apparition d'une fatigue musculaire lors d'un seul exercice physique épuisant. Ce projet permettra potentiellement de mieux comprendre le phénomène de fatigue musculaire et plus généralement de la fatigue cellulaire.
Procédures
Les animaux seront traités avec un composé par injection (2 min pour la contention et l'injection) puis soumis à un seul exercice épuisant sur tapis de course motorisé (environ 2h00). Enfin, un microprélèvement de sang sera réalisé au niveau de la queue des animaux à partir d'une microincision (3 min pour la contention, la microincision et le prélèvement). L’écoulement de sang à la fin du prélèvement sera stoppé en réalisant un point de compression au niveau de la queue avec une compresse hémostatique.
Impact sur les animaux
L'exercice épuisant engendrera un stress léger chez les animaux. L'injection intrapéritonéale ainsi que les prélèvements sanguins pourront aussi être à l'origine de stress.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et des muscles squelettiques.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus investigués et leur localisation complexe (tissus et sang) nécessite une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas de modèle de substitution in vitro. Néanmoins, l’objectif global de ce projet sera également couplé à des expérimentations au laboratoire in vitro afin de disséquer la fonctionnalité des mécanismes investigués afin de remplacer dans la mesure du possible certaines analyses in vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre les objectifs scientifiques du projet. L’étude extensive de la bibliographie nous a déjà permis d’élaborer et d’affiner nos protocoles afin d’utiliser le moins d’animaux possible pour les mises au point. Le calcul d’effectif minimum sera réalisé à l’aide de formule statistique adapté à ce type d’expérimentation. Enfin, les tissus investigués permettront de collecter une grande quantité de matériel biologique afin de réaliser différentes expérimentations.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum (à volonté), enrichissement, stabulation en groupe). Afin de respecter leur instinct grégaire, les rats seront stabulées par petits groupes de 3 individus dans des cages dont l’environnement est enrichi en laine de bois, tunnels, balles creuses et balles qui est un enrichissement est adapté à la phase pré- et post-expérimentale. Les animaux seront hébergés dans des grandes cages (cages 1500U : 480x375x210mm). Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie musculaire et cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme et permet des analyses fonctionnelles plus facilement que le modèle souris. Le modèle rat a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. Par ailleurs, la quantité de tissus disponible chez le rat permet la réalisation, à partir d'un même prélèvement, d'un grand nombre d'analyses. Les animaux utilisés seront à un stade jeune adulte (rats 8-10 semaines) afin de ne pas inclure des facteurs de complications liés à l’âge.
Évaluation des effets bénéfiques d’un anticorps anti-X dans deux modèles murins de maladie rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
Deux chirurgies rénales à une semaine d'intervalle pour 80 souris, un régime enrichi en adénine pendant sept semaines pour 48 autres, et pour 32 d'entre elles une ration quotidienne calquée sur ce que mange le groupe témoin pendant quatre semaines. 160 souris sont utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale après anesthésie. S'y ajoutent une perforation de l'oreille, quatre injections hebdomadaires, un jeûne de six heures et le port d'un capteur pendant une heure sur animal vigile. L'anticorps testé a été développé par un laboratoire pharmaceutique contre la dénutrition dans un autre domaine, et le porteur justifie le passage par l'animal en invoquant la réglementation, qui "impose de disposer de résultats précliniques solides avant d'autoriser un essai chez l'Homme".
Objectifs
La maladie rénale chronique (MRC) est un problème de santé publique. Elle touche environ 10 % de la population mondiale et près de 6 millions de personnes en France. Elle correspond à une perte progressive et irréversible du fonctionnement des reins et s’accompagne de nombreuses complications cardiovasculaires, métaboliques et nutritionnelles (perte de poids et notamment de muscles). Des analyses récentes ont montré que plus la MRC est sévère, plus le taux dans le sang d’une certaine protéine (appelée ici X) est élevé. Dans un autre domaine de recherche que la MRC, un laboratoire pharmaceutique a développé un anticorps contre cette protéine pour lutter contre la dénutrition et la perte de muscles. Grâce à une collaboration avec ce laboratoire, nous souhaitons tester si cet anticorps peut aussi prévenir la dénutrition et la perte de muscles dans deux modèles de MRC chez la souris : • Le modèle adénine où un régime alimentaire spécifique entraîne la formation de cristaux dans les reins provoquant des lésions. • Le modèle chirurgical où une partie du rein est retirée. La partie restante doit alors travailler beaucoup plus ce qui finit par l’abîmer. Nous testerons deux façons d’utiliser l’anticorps : 1. Traitement précoce : l’anticorps est donné en même temps que l’induction de la MRC. 2. Traitement curatif : l’anticorps est donné après que la MRC a commencé à se développer, avec ou sans un régime pauvre en protéines. Ce type de régime est souvent utilisé pour ralentir la progression de la maladie, mais il peut augmenter le risque de dénutrition. Nous vérifierons donc si l’association anticorps + régime pauvre en protéines apporte un bénéfice supplémentaire par rapport à chaque stratégie prise séparément. Comme l’anticorps pourrait aussi augmenter naturellement l’appétit, nous utiliserons une méthode appelée pair-feeding. Cela signifie qu’un groupe de souris traitées recevra exactement la même quantité de nourriture qu’un groupe non traité. Cela permettra de savoir si les effets observés viennent vraiment de l’anticorps et non simplement d’une augmentation des apports alimentaires. Objectif principal : déterminer si l’anticorps peut améliorer les problèmes majeurs liés à la MRC — baisse de la fonction rénale, dénutrition et perte de muscles —, qui sont également des complications importantes chez les patients humains.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet servira à vérifier si un traitement avec l’anticorps anti-X, donné dans à stade précoce de la maladie ou pour soigner quand la maladie est déjà installée, peut améliorer le fonctionnement des reins et réduire les complications de la maladie rénale chronique (perte de poids et de muscles). Pour l’instant, on ne sait pas encore quels sont les effets de cet anticorps dans cette situation. Si les résultats sont bons, ils représenteront une étape importante vers la préparation d’une étude clinique chez l’Homme. À plus long terme, ces recherches pourraient permettre de développer une nouvelle façon de traiter la maladie rénale chronique, afin d’améliorer le fonctionnement des reins, l’état nutritionnel et la qualité de vie des patients.
Procédures
Les 160 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle adénine) : 48 souris recevront une alimentation enrichie en adénine, quotidiennement (sauf week-ends) pendant 7 semaines. – 2nde étude (modèle chirurgical) : 96 souris recevront 4 injections anesthésiantes (1 anesthésie générale + 1 locale à chaque chirurgie,
Impact sur les animaux
L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Le régime alimentaire riche en adénine, utilisé pour provoquer la maladie rénale, réduit l’appétit et ralentit la prise de poids des animaux. Cela peut entraîner un inconfort. La méthode qui consiste à donner une quantité précise de nourriture à un groupe pour qu’il mange autant que le groupe contrôle peut créer une frustration, de la fatigue ou du stress, car les animaux ne peuvent pas manger autant qu’ils le souhaitent. De même, un régime pauvre en protéines peut entraîner une perte de poids. Les pesées régulières représentent un petit stress momentané. Les injections, que ce soit pour administrer l’anticorps, un placebo ou des produits d’anesthésie/analgésie, provoquent un stress court et une douleur légère. Aucune nuisance n'est attendue suite à l'injection de l'anticorps anti-X. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.
Devenir
Les 160 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le traitement par l’anticorps anti-X doit d’abord être testé chez l’animal avant d’être donné à l’être humain. Cette étape est nécessaire pour vérifier s’il est efficace et pour repérer d’éventuels effets indésirables. La réglementation impose de disposer de résultats précliniques solides avant d’autoriser un essai chez l’Homme. Les tests chez l’animal sont donc indispensables pour justifier l’utilisation de ce traitement chez les patients atteints de maladie rénale chronique.
Réduction
Le traitement par l’anticorps anti-X n’a encore jamais été testé dans la maladie rénale. En revanche, il a déjà été utilisé chez la souris pour d’autres maladies, ce qui nous laisse penser qu’il pourrait avoir un effet et limite le risque d’utiliser des animaux sans raison valable. Le nombre de souris nécessaires dans chaque groupe a été déterminé grâce à un calcul statistique. Ce calcul s’appuie sur nos résultats obtenus dans des études précédentes chez des souris avec une maladie rénale. Selon ce calcul, 16 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence réelle. Nous avons également choisi des méthodes non invasives (analyse de la composition corporelle et mesure de la fonction rénale) qui peuvent être faites deux fois sur les mêmes animaux : avant et après le traitement. Cela permet de réduire le nombre total d’animaux. Enfin, un maximum de tissus sera collecté au moment de la mise à mort et conservé. Ces échantillons permettront de répondre à d’autres questions scientifiques ou d’être utilisés dans des collaborations, évitant ainsi de refaire des expériences et de réutiliser des animaux inutilement.
Raffinement
Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés cinq fois par semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée deux fois par semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Pour la composition corporelle, les animaux seront préalablement habitués au tube de mesure (un entraînement à l’entrée dans le tube une semaine avant la mesure), ce qui réduira le stress durant la séance. Dans le cadre de la restriction alimentaire, plusieurs mesures limiteront le stress : rations ajustées tous les deux jours selon la consommation du groupe contrôle, distribution à horaire fixe, nourriture répartie en plusieurs points, et enrichissement supplémentaire des cages. L’alimentation enrichie en adénine sera interrompue chaque week-end pour limiter la perte de poids sans compromettre l’induction de la maladie. Les croquettes seront préparées avec du cacao pour maintenir une bonne appétence. Les volumes d’injection (anticorps, placebo, anesthésiques, analgésiques) seront réduits au minimum nécessaire. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour étudier la maladie rénale chronique. Les deux méthodes utilisées pour induire la maladie entraînent une forme modérée qui reproduit les principales atteintes observées chez l’Homme. Ces modèles sont bien connus et largement utilisés. Le choix de cette espèce permet aussi de comparer nos résultats avec nos travaux précédents menés chez la souris avec un régime pauvre en protéines. Par ailleurs, l’anticorps anti-X a déjà montré une efficacité dans d’autres modèles murins, ce qui renforce la probabilité d’obtenir un effet dans les modèles utilisés ici. Des souris âgées de 10 semaines seront utilisées. À cet âge, elles ont terminé leur croissance, ce qui assure des réponses plus homogènes. Le régime enrichi en adénine est bien toléré et les deux chirurgies sont correctement supportées. La maladie rénale induite à cet âge est bien caractérisée et reproductible.
Évaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des modèles murins de maladies articulaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Une perte de poids trop importante ou une immobilité totale suffit à arrêter l'expérience, un score clinique supérieur à 8 pouvant y mettre fin. 4 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite est provoquée par injection, puis des composés sont administrés jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire ou intradermique, avec des prélèvements sanguins allant jusqu'à 12 % du volume sanguin total. Le porteur décrit œdèmes, difficultés locomotrices, posture prostrée et douleur, et précise que la fréquence des prélèvements relève de "l'appréciation du client".
Objectifs
Plus de 200 maladies rhumatismales sont recensées et se manifestent sous différentes formes avec des atteintes au niveau des os et des articulations, des ligaments, des cartilages, des muscles et des tendons des membres inférieurs et supérieurs. On distingue quatre principaux types de rhumatismes : les rhumatismes inflammatoires (arthrite rhumatoïde, spondylarthropathies...), les rhumatismes dégénératifs (arthrose...), les affections des parties molles (fibromyalgie...) et les affections osseuses (ostéoporose...). Parmi les rhumatismes inflammatoires, l’arthrite rhumatoïde (AR) fait partie des maladies articulaires inflammatoires chroniques de l'adulte les plus fréquentes. En effet, elle concerne plus de 300 000 personnes en France et peut réduire l’espérance de vie des personnes atteintes. Bien que l’AR puisse se manifester à tout âge, elle apparaît généralement à l’âge adulte entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans et une incidence deux à trois fois plus élevée chez les femmes. Les répercutions psychologiques, fonctionnelles, professionnelles et sociales, de la pathologie sont importantes et en font un enjeu économique de santé majeur. En effet, la douleur est souvent le symptôme le plus contraignant pour les patients car elle peut persister malgré la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. Ainsi, bien que certains traitements soient proposés aux patients, ils n’en restent pas moins uniquement symptomatiques et parfois peu efficaces sur l’évolution de la pathologie et la gestion de la douleur. A ce jour, il est donc impératif de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Depuis ces dernières années, le développement de traitements pour les maladies articulaires a permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Même si certaines de ces stratégies s’avèrent efficaces dans l’amélioration des symptômes et permettent parfois une rémission complète et prolongée, le pronostic d’évolution de la pathologie reste mauvais pour de nombreux patients. En effet, les déformations articulaires ainsi que la destruction des tendons contraignent parfois les médecins à avoir recours à la chirurgie orthopédique. Par ailleurs, de part leurs comorbidités, certains traitements ne peuvent être proposés à certains patients. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un suivi plus personnalisé et d’aboutir à une rémission complète de tous les patients. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement…) de différents candidats médicaments dans les maladies articulaires.
Procédures
1) Induction de la pathologie : les animaux pourront être soumis à une ou plusieurs injections afin de mettre en place le modèle (1 minute maximum). Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale (5min) ou non selon le mode d’injection décrit dans la procédure. 2) Administrations répétées de composés client (2 fois par jour au maximum): les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client (maximum 2 fois par semaine pour des petits prélèvements inférieurs à 8% du volume sanguin total, 1 fois pour ceux supérieurs à 8%), un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées à la pathologie pourront être observées sur les animaux telles que : - Perte de poids - Posture prostrée - Absence d’hygiène corporelle : poil hérissé - Difficultés locomotrices - Douleur - Œdèmes et atteintes des articulations - Stress lié à l’isolation des animaux en cages individuelles pendant 24 à 60h (activmètre) - Stress et douleur liés à l'utilisatuon d'un test de douleur. De plus, l’injection de certains inducteur de la maladie peut provoquer une inflammation au niveau de la queue. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.
Remplacement
Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être évitée. En effet, comme vu précédemment, les maladies articulaires telles que l’arthrite rhumatoïde présentent des origines diverses (facteurs immunologiques, environnementaux, hormonaux, génétiques). Les modifications physiopathologiques liées à ces pathologies sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Il s’agit de maladies évolutives qui, une fois déclenchées, s’aggravent progressivement et s’étendent à d’autres articulations. La douleur est un problème majeur chez les patients car elle persiste bien après la prise en charge thérapeutique par des anti-inflammatoires par exemple. Il est donc inévitable d’utiliser les modèles animaux dans l’étude de l’efficacité de nouvelles thérapies qui doivent impérativement prendre en compte le paramètre de la douleur. Par ailleurs, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux minimum seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63 en unités individuelles ventilées avec enrichissement de l’environnement (igloo et carrés de ouate). L'état de santé des animaux sera évalué selon des critères en accord avec le comité́ de suivi du bien - être animal de notre établissement. L’expérimentateur sera alors prévenu et une dégradation trop importante de l'état de santé (au-delà d'un score de 8 selon les critères détaillés dans les procédures, score 1) pourra entrainer l'arrêt immédiat de l'expérimentation. Par ailleurs, dès lors que la pathologie sera induite, les expérimentateurs procéderont à un suivi quotidien des animaux (le suivi du week-end sera effectué par le personnel de la zone d'expérimentation) afin d’identifier les atteintes spécifiques à la pathologie (grilles de score spécifiques permettant de définir les points limites). Certains critères suffiront à eux seuls pour acter l'arrêt de l'expérience, tels qu'une perte de poids trop importante ou une immobilité totale. Par ailleurs, dès lors qu’une inflammation d’une articulation et/ou une difficulté de mobilité seront observées, de la nourriture humidifiée et de l’eau gélifiée seront ajoutés dans la cage.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement d’arthrite rhumatoïde compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la réponse inflammatoire. L’ensemble des modèles décrits dans ce projet nécessite l’utilisation de souris adultes car l’arthrite rhumatoïde apparaît généralement entre 30 et 50 ans avec un pic à 45 ans. Le modèle de développement de l’arthrite rhumatoïde nécessite l’utilisation d’animaux âgés de 6 semaines, c’est-à-dire un âge auquel la sensibilité au développement de la pathologie est optimale. Le modèle d’induction de l’arthrite rhumatoïde par transfert de sérum nécessite d’une part, des souris présentant les premiers signes de développement de la pathologie à partir de 8 semaines et permettant de fournir le sérum nécessaire à l’injection et, d’autre part, des souris âgées de 6 à 10 semaines qui recevront le sérum. Les autres modes d’induction nécessiteront l’utilisation d’animaux âgés de 6 à 10 semaines.
Étude du remodelage de la chromatine au cours de la régénération musculaire – Modification
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Quatre injections intrapéritonéales sur animal vigile et une injection dans le muscle releveur de la patte sous anesthésie : 138 souris transgéniques vont être utilisées, 108 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 30 un niveau léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles. L'objet est d'identifier la fonction d'une protéine liant l'ADN au cours de la réparation musculaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut se substituer à ce modèle et que ces résultats n'auraient pas pu être obtenus sur lignées cellulaires. La lésion musculaire, qui fonde tout le protocole, n'apparaît pas dans la liste des procédures et le produit injecté pour la provoquer n'est pas nommé.
Objectifs
Les muscles squelettiques composent près de la moitié de la masse totale d’un individu et permettent la motricité du corps. Ils sont principalement composés de fibres musculaires, de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu conjonctif. Suite à une blessure, les cellules souches résidentes du tissu musculaire s’activent, prolifèrent et réparent le tissu musculaire lésé. Ce processus implique une communication avec les cellules voisines afin de reconstruire les fibres musculaires de façon optimale. Le projet de recherche consiste à étudier le contrôle de la réparation musculaire en identifiant les fonctions d'une protéine se liant à l'ADN dans différents types cellulaires musculaires au cours de la régénération. Nous développerons deux approches, la première consistera à isoler et étudier des cellules primaires d’animaux modèles aux différents types cellulaires. La deuxième approche nous permettra d’évaluer la régénération du tissu musculaire, mais cette fois-ci in vivo, à partir de ces mêmes modèles de souris. Dans le contexte de la régénération musculaire, ce projet de recherche nous permettra d’identifier les voies de communication entre cellules qui sont essentielles à la réparation musculaire.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats du projet permettront de comprendre précisément comment la régulation d'acteurs interagissant avec l'ADN se fait dans différents types cellulaires, et contrôle le processus de régénération musculaire. En plus d’augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules qui participent à la réparation du muscle squelettique, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative.
Procédures
4 injections intrapéritonéales sur animaux vigiles non anesthésiés (138 animaux). Chaque injection prend moins de 3 secondes. Une injection intramusculaire dans le muscle releveur de la patte sur animaux anesthésiés (108 animaux). Cette intervention dure moins de 5 secondes. Les animaux sont mis en contentions lors des injection de tamoxifène et d'anesthésique.
Impact sur les animaux
Les trois modèles de souris transgéniques, qui seront utilisés dans le projet, ne présentent pas de phénotype dommageable à l’état basal. Les injections intrapéritonéales de tamoxifène n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal, aux doses et fréquences utilisées. L’utilisation d’analgésique et d'anesthésique au cours de la lésion musculaire garantit l’absence de douleur chez l'animal. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu’elles ne montrent pas de signes de douleur pendant les jours suivants.
Devenir
Les animaux sont mis à mort et les muscles sont prélevés.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour l’étude de la régénération du muscle via l’activation des cellules souches musculaires. Ce processus repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Ces résultats n'auraient pas pu être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ce qui justifie la poursuite de notre projet utilisant des modèles transgéniques murins
Réduction
L'utilisation des animaux sera réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales et contrôlé à l'aide d’analyses statistiques adaptées. Le nombre d'animaux a été déterminé afin d'obtenir un échantillon réduisant le nombre d'animaux au maximum tout prenant en compte la variabilité biologique des individus ainsi que la variabilité des individus à répondre au traitement effectué. Cela permet d'obtenir des groupes qui vont pouvoir être comparés les uns par rapport aux autres via des données qui vont permettre d'apporter des informations sur la significativité de ces différences.
Raffinement
Avant le début de chaque experimentation, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront pesés deux fois par semaine jusqu’à leur mise à mort. Anesthésiques et analgésiques sont utilisés afin de prévenir au maximum le stress et la souffrance des animaux. En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés 2 fois par semaine afin de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d’interaction sociale, tout changement pourrait refléter souffrance, douleur ou stress, même minime, chez l’animal. Si ces changements sont relevés pendant plus de 24h, des mesures adéquates seront prises en accord avec le personnel animalier afin d’améliorer les conditions de vie de l’animal et d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l’Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l’analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. De plus, la souris permet l'utilisation de modèles transgéniques permettant la délétion d’un gène d’intérêt dans un type cellulaire et à un temps donné. Les expériences menées sur ces modèles ont permis d’obtenir des résultats fondamentaux et novateurs qui n'auraient clairement pas pu être établis à l'aide de lignées cellulaires. Les expériences seront principalement réalisées sur des souris âgées de 8 semaines. L'âge choisi est le plus adapté à l'étude de la régénération du muscle squelettique. Plus jeune, le tissu est encore en croissance. Plus âgé, une fibrose peut se développer et perturber le processus de régénération.
Mécanismes régulateurs du développement des articulations des membres chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Tuées vingt-quatre heures après une administration unique, pour que leurs embryons soient prélevés au stade où se forment les articulations des doigts. 228 souris femelles gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dont 12 dans une phase pilote destinée à choisir entre l'injection et le gavage. Aucun embryon ne survit aux analyses, et le porteur ne retient qu'un seul embryon par portée, uniquement s'il présente les caractéristiques attendues. Il présente le choix de femelles de un à trois mois, plus fertiles et moins sujettes aux complications, comme garantissant une reproduction efficace et conforme au bien-être des animaux non-humains.
Objectifs
Même si l’on connaît de mieux en mieux comment se forment les membres au début du développement, la manière dont les articulations apparaissent reste encore difficile à comprendre. L’objectif de ce projet est donc d’étudier en détail comment les articulations se forment, en observant les cellules et les molécules qui participent à ce processus. Pour cela, nous utiliserons un modèle bien établi en recherche biomédicale : la souris. Mieux connaître ces mécanismes est essentiel pour imaginer, dans le futur, des thérapies capables de réparer ou de régénérer des articulations abîmées par des maladies. Dans ce projet, nous comparerons le développement des articulations chez des embryons de souris normaux et chez d’autres présentant des anomalies. Plus précisément, notre objectif est d'examiner plusieurs aspects clés à différents moments du développement : comment les cellules qui constituent les articulations se déplacent, se divisent, communiquent entre elles et s’organisent pour former des structures fonctionnelles comme le cartilage ou la capsule articulaire. En parallèle, nous chercherons à comprendre quels gènes et quelles molécules contrôlent ces comportements cellulaires. Pour cela, nous combinerons les informations déjà publiées dans la littérature scientifique avec nos propres observations expérimentales. En réunissant toutes ces données, notre ambition est d’obtenir une vision complète des différentes étapes qui permettent à une articulation de se former correctement.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension de la façon dont les articulations se mettent en place pendant les premières étapes de la vie. En observant de très près leur formation, il sera possible de mieux comprendre pourquoi, parfois, elles ne se développent pas correctement ou s’abîment avec le temps. Ces nouvelles connaissances pourront servir de base pour imaginer, à l’avenir, de nouvelles méthodes pour prévenir, diagnostiquer ou traiter certaines maladies des articulations, qu’elles apparaissent à la naissance ou plus tard. Elles pourraient également aider à trouver des approches innovantes pour réparer ou régénérer les articulations abîmées à la suite d’une blessure ou d’une maladie. Le projet contribuera aussi à enrichir les connaissances générales en biologie et à renforcer les collaborations entre chercheurs spécialisés dans différents domaines. Il offrira des opportunités de formation pour les étudiants de master, les doctorants et les jeunes chercheurs, qui apprendront à utiliser des méthodes de pointe pour étudier le développement et la santé des tissus. En résumé, les résultats attendus auront un impact positif à la fois sur la recherche fondamentale et, à plus long terme, sur les applications médicales, au bénéfice de la santé articulaire de tous.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, une seule procédure sera réalisée. Un composé sera administré à des femelles en gestation afin de permettre la mise en évidence de certaines cellules présentes au niveau des articulations des embryons. L’administration de ce composé pourra être réalisée soit par injection, soit par voie orale. Chaque manipulation sera de très courte durée, ne prendra que quelques minutes. Chaque femelle gestante ne recevra qu’une seule administration. Vingt-quatre heures après cette administration, les femelles seront mises à mort afin de permettre le prélèvement des embryons.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce protocole consistent à administrer un produit aux souris gestantes soit à l’aide d’une piqûre au niveau de l’abdomen, soit par l’introduction contrôlée d’un petit tube dans la bouche afin qu’ils avalent le produit. Ces interventions sont de courte durée et peuvent occasionner un léger inconfort ou un stress temporaire liés à la contention et à la manipulation au moment de l’administration. Aucune nuisance supplémentaire n’est attendue après l’administration du produit. Aux doses utilisées, le composé ne présente pas de toxicité aiguë ni d’effets délétères différés pour les femelles gestantes. Aucun effet indésirable a posteriori n’est anticipé, notamment en termes de douleur prolongée, d’altération de l’état général, de comportement anormal ou de risque d’avortement, durant la période précédant la mise à mort. Vingt-quatre heures après l’administration, les femelles gestantes sont mises à mort afin de procéder au prélèvement des embryons.
Devenir
Cette étude porte exclusivement sur les embryons. Tous les embryons seront prélevés pour les analyses prévues, ce qui ne permet pas leur survie. La mise à mort des femelles gestantes est nécessaire au moment du prélèvement embryonnaire.
Remplacement
À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet d’étudier de manière fiable la formation des articulations sans recourir à des animaux. Des modèles développés in vitro à partir de cellules (cultures 2 dimensions ou organoïdes) permettent de reproduire certaines étapes précoces du développement du membre. Toutefois, ces modèles ne permettent pas de reproduire les phases plus avancées du développement embryonnaire, au cours desquelles s’opère la formation des articulations. Ces étapes reposent sur des interactions spatio-temporelles complexes entre plusieurs tissus (cartilage, tissu conjonctif, muscle, innervation, vascularisation), ainsi que sur des contraintes mécaniques spécifiques. En particulier, les processus de segmentation articulaire, de cavitation et de maturation des articulations nécessitent un contexte tridimensionnel intégré et dynamique qui ne peut actuellement être reproduit de manière fidèle par des modèles cellulaires isolés, comme cela est décrit dans la littérature. Ces limites ne permettent donc pas d’obtenir les informations nécessaires pour répondre aux objectifs de cette étude. Ce projet ayant pour objectif de comprendre comment les articulations se forment naturellement au cours du développement embryonnaire in vivo, l’utilisation d’animaux demeure indispensable pour mener cette recherche de façon rigoureuse.
Réduction
Le nombre de souris gestantes a été défini de façon à n’utiliser que le strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et répondre aux objectifs du projet. Cette estimation tient compte des limites pratiques (temps d’observation au microscope, disponibilité des équipements) ainsi que des variations naturelles entre embryons. Le prélèvement des embryons destinés à l’imagerie sera organisé selon un plan permettant de réduire les biais : un seul embryon sera sélectionné par portée, uniquement lorsqu’il présente les caractéristiques attendues, et à différents moments du développement afin de couvrir les étapes clés d’intérêt. Avant de commencer l’étude principale, une courte phase de test sera réalisée afin de choisir la meilleure façon d’administrer le produit aux femelles gestantes, en s’assurant qu’elle soit efficace et bien tolérée. Cette étape évitera de répéter des expériences inutiles. Douze femelles seront utilisées pour cette phase : six pour tester une administration par injection, et six pour tester une administration par voie orale. Une fois la méthode choisie, le protocole sera appliqué de manière rigoureuse afin d’assurer des résultats comparables entre les différentes souris et de limiter les variations individuelles. Pour l’étude principale, 72 femelles gestantes seront utilisées dans chacune des trois conditions testées (développement normal et deux modèles présentant des anomalies chez les embryons), soit au total 216 femelles. Ce nombre a été sélectionné sur la base de travaux antérieurs réalisés dans notre laboratoire, dans lesquels des stratégies expérimentales similaires ont été utilisées. Le plan expérimental est identique entre les groupes pour permettre des comparaisons directes et limiter le nombre total d’animaux. Enfin, lorsque cela sera possible, des outils d’analyse informatique seront employés afin d’éviter d’avoir recours à de nouveaux prélèvements.
Raffinement
Pour limiter au maximum l’inconfort des animaux, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place. En ce qui concerne l'administration du produit, l’utilisation de volumes appropriés, de solutions tièdes, d’aiguilles fines et d’une manipulation douce contribue à limiter l’inconfort. Après chaque administration, les animaux seront attentivement observés afin de détecter tout signe de malaise. Comme les animaux seront mis à mort 24 heures après l’administration pour permettre le prélèvement des embryons, il est peu probable qu’ils subissent des effets indésirables affectant leur bien-être. Cette affirmation repose sur le fait que le composé administré est utilisé à des doses ne présentant pas de toxicité aiguë chez la souris gestante, telles que décrites dans la littérature. De plus, la courte durée d’exposition ne permet pas l’apparition d’effets différés ou chroniques. Aucun signe d’altération de l’état général (perte de poids, modification du comportement, douleur persistante) n’est attendu dans l’intervalle séparant l’administration du produit de la mise à mort. Par ailleurs, le raffinement prévoit un enrichissement environnemental renforcé (y compris matériau de nidification abondant, igloo en papier, etc.), visant à soutenir leur confort et à limiter le stress associé à l’administration du produit et à la gestation.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour étudier le développement des organes, car son organisation du corps et ses gènes sont très proches de ceux de l’être humain. Son squelette et ses articulations se forment de façon semblable à celle des autres mammifères, ce qui permet de mieux comprendre les étapes normales de ce processus et les causes possibles de certaines malformations. De plus, la souris est un petit animal facile à élever, qui se reproduit rapidement et pour lequel il existe de nombreux outils scientifiques permettant d’observer et de suivre le développement de manière précise. Les connaissances obtenues chez la souris aident ainsi à mieux comprendre le développement des articulations chez l’homme et à préparer des recherches futures sur certaines maladies ou anomalies articulaires. Des femelles âgées de 1 à 3 mois seront utilisées pour la procédure expérimentale. À cet âge, elles présentent une activité ovarienne régulière, une réceptivité utérine élevée et un faible risque de complications gestationnelles, ce qui permet d’obtenir des portées régulières et viables. Au-delà de cette tranche d’âge, la fertilité tend à diminuer et la variabilité des résultats augmente. Ce choix garantit donc une reproduction efficace, fiable et conforme au bien-être des animaux. En ce qui concerne les embryons, les stades étudiés correspondront aux jours embryonnaires 11.5 à 14.5, soit l’intervalle de formation des articulations des doigts.