Organes sensoriels

1 140 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ 855 conservés comme reproducteurs et les autres tués faute de porter la modification génétique recherchée. Les adultes subissent une coupure de nageoire pour vérifier leur génotype, leurs embryons servant à modéliser des maladies génétiques humaines rares. Le porteur décrit l'imagerie sur embryon comme non invasive. Il affirme que la souris ou le xénope ne permettent pas de modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet.

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et physiologiques gouvernant le développement de ribosomopathies (pathologies génétiques humaines) en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours de l'établissement de ces pathologies, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt et la synthèse des ribosomes dans des tissus cibles. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent les événements précoces de ces ribosomopathies qui interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 11 Lignées pour ce projet : (A) 5 lignées transgéniques : 4 lignées transgéniques ciblant spécifiquement 4 tissus : Tg(crêtes neurales::CRE) ,Tg(sang::CRE), Tg(lignée germinale::CRE) et Tg(système neural::CRE) pour visualiser les étapes précoces de la mise en place des pathologies dans ces tissus, 1 lignée transgénique permettant de quantifier la synthèse des ribosomes in vivo : Tg(ribo:Tag) et (B) 6 lignées mutantes des génes humains et candidats impliqués dans les ribosomopathies: tsr2, rpsa, rpn1, hspa, et deux nouveaux génes (ribo1, ribo2) pour modéliser et analyser le rôle possible de ces gènes candidats dans le développement des ribosomopathies.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour modéliser les ribosomopathies qui ne sont pas modélisables chez d'autres modèles vertébrés comme la souris ou le xénope. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle de ces gènes dans différents processus physiologiques.

Procédures

Afin de valider leur génotype les animaux subiront un coupure de la nageoire au stade adulte. Les animaux générés par la suite seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

A ce jour, nos expériences n'indiquent pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques à l'état hétérozygote et homozygote. Enfin, le génotypage des adultes pourrait induire un stress qui sera surveillé attentivement.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs (1140 X3)/4 = 855 animaux. Les autres qui ne portent pas l'événement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et à l'observation ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation et observation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRISPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour modéliser les ribosomopathies.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes modélisant les ribosomopathies humaines affectant le développement cranio-facial et l’hématopoïèse. Une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques. Cependant, les modèles murins ne sont pas adaptés pour modéliser ces pathologies alors que le poisson zèbre le permet. Il présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse et la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ses embryons facilement pour observer le développement précoce de ces pathologies (impossible chez un mammifère) et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.

400 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, environ trois quarts conservés comme reproducteurs et le reste tué faute de porter la mutation recherchée. Le porteur crée six lignées transgéniques et mutantes pour étudier la formation du système olfactif à partir des embryons, prélevés avant cinq jours de développement. Il indique que les formes homozygotes peuvent provoquer stérilité, stress et agressivité, et prévoit de ne maintenir que des adultes hétérozygotes pour éviter ces atteintes. Sur le remplacement, il décrit des modèles mathématiques en développement mais conclut qu'une approche in vivo sur un vertébré reste "nécessaire".

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes génétiques et morphométriques gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio Rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 6 Lignées pour ce projet : A. 2 lignées transgéniques : Tg(fa2h::eGFP) et Tg(8.4neurog1::nls-EOS) pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et B. 4 lignées mutantes : pitx3 , f11r.1, fa2h et oclna pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir des lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons pour mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. Ces outils seront alors largement accessibles à la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, des enzymes et pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques (maladie de Parkinson et développement du cristallin).

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour les expérimentations.

Impact sur les animaux

Nous ne prévoyons pas d'effets indésirables pour les lignées transgéniques et mutantes à l'état hétérozygote. Cependant, nous pouvons anticiper que pour les lignées mutantes le développement des placodes craniales antérieures (cristallin, adénohypophyse et olfaction) soit perturbé. Les données bibliographiques de mutants qui perturbent le développement de l'adénohypophyse, du cristallin et de l'olfaction peuvent indiquer des effets indésirables chez les adultes homozygotes : risques de stérilité, de stress et d’agressivité. Il est important de noter que chez le poisson zèbre, ces pathologies se développent lorsque la mutation est présente à l'état homozygote et que nous maintiendrons les lignées avec des adultes hétérozygotes dans ce projet.

Devenir

Idéalement, nous aimerions conserver la totalité des animaux mais tous les adultes ne seront pas porteurs de la mutation et nous choisirons les allèles mutants les plus facilement identifiables et les lignées transgéniques les plus robustes pour ne conserver en moyenne les 3/4 des animaux reproducteurs. Les autres qui ne portent pas l'évébement génétique requis seront mis à mort.

Remplacement

Nous développons actuellement des modèles théoriques mathématiques pour simuler numériquement les expérimentations et ne tester biologiquement que les expériences ayant un intérêt pré-validé.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse grâce au développement de protocoles utilisant le système CRIPR/Cas9, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement dans notre projet des méthodes d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendte la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif. La perturbation de ces processus peut conduire chez l’homme à de nombreuses pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré, comme le poisson zèbre est donc nécessaire à la compréhension de ces processus dynamiques et complexes. Dans ce projet, nous générerons des poissons zèbres transgéniques ou mutants qui seront utilisés adultes à des fins reproductives.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

2700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est d'abord induit chez des souris NOD SCID, puis les mêmes animaux servent à un modèle de cicatrisation cutanée, avec des prélèvements sanguins répétés et une biopsie de peau. Le porteur indique que la biopsie cutanée provoque des douleurs inflammatoires. Les animaux sont tués en fin de protocole pour prélever la peau des plaies et analyser l'effet de molécules candidates.

Objectifs

Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques (délai de cicatrisation allongé, au delà de 4 semaines). En France, plus de 20.000 patients diabétiques porteurs de plaies, sont hospitalisées chaque année et près de 8.000 seront amputées d’un membre inférieur. L’objectif de ce projet est d’étudier de nouvelles molécules susceptibles d’accélérer la cicatrisation des plaies chez des souris contrôles non diabétiques en comparaison avec des souris diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète qui sont couteuses sur le plan humain et économique.

Bénéfices attendus

Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques. La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur qui est une étape essentielle dans le développement de médicaments à visée thérapeutique. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules sur le processus de cicatrisation (molécules aux propriétés cicatrisantes, réparatrices ou agissant sur le remodelage tissulaire ou la migration cellulaire) chez des souris diabétiques en comparaison avec des souris non diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète.

Procédures

Prélèvements au jour 0, 5, 10, 15 et 20 au niveau de la veine caudale ou submandibulaire (20μL; durée du prélèvement 5-10 secondes) afin de suivre l'évolution de la glycémie durant 20 jours environ chez les souirs NOD SCID (Procédure 1). Prélèvements de sang rétro orbital (500μL; durée du prélèvement 30 secondes) sous isoflurane (2%) juste avant la mise à mort (Procédure 2)

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées à la biopsie cutanée. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation.

Devenir

Les animaux de la Procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" sont tous réutilisés dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation". Tous les animaux de la Procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" sont mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de prélever la peau au niveau des plaies pour effectuer une analyse histologique, des dosages de cytokines, qPCR. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées.

Remplacement

Remplacement : le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de l’inflammation et de la cicatrisation ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Le système vasculaire et de nombreux types cellulaires, cytokines et médiateurs sont impliqués dans ce processus. Les modèles animaux de cicatrisation sont indispensables pour la compréhension de la physiopathologie de la maladie et la validation préclinique des composés. Des études préliminaires in vitro peuvent être réalisées sur des kératinocytes afin de sélectionner des candidats médicaments mais dans ce projet l'animal est indispensable pour relier cicatrisation et diabète.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons : - Si les échantillons suivent une loi Normale : l’ANOVA de rang suivi d’un post test de Bonferroni sera effectué. - Si les échantillons ne suivent pas une distribution normale : le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns de comparaison multiple sera utilisé.

Raffinement

Les plaies seront effectuées sous anesthésie générale xylazine/kétamine et une injection de lidocaine sera effectuée quelques minutes avant la réalisation des plaies. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être des animaux et pour détecter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux montrent des signes de souffrance (point limite décrit dans la Procédure), de la buprénorphine ou le la Tolfédine pourront être administrées (si score cumulé de 2 atteint) ou ils seront mis à mort (si score cumulé atteint 4 ou si un des scores atteint 2 pour un même critère). Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 ou BALB/c est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Ces souches sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les souris BALB/c offrent une réponse immunitaire exacerbée ce qui permet une meilleure quantification des molécules exprimées lors de cette réponse. De plus nous utiliserons des souris NOD SCID rendues diabétiques car il a été démontré l'impact de ce paramètre sur la cicatrisation dans plusieurs articles. Cette lignée immunodéficiente n'a pas de phénotype dommageable autre que le diabète développé après induction au STZ. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation. Les animaux de la procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" pourront être utilisés à partir de 5 semaines pour bénéficier d'animaux qui auront minimum 7 semaines dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation".

3 880 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés pour porter des mutations liées à des malformations humaines du visage et du cœur, ils subissent un prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et le porteur indique que les lignées peuvent présenter des malformations du squelette et de la tête. Des tests comportementaux de nage en réponse à des stimuli sonores et lumineux sont réalisés sur les larves. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" car les études in vitro ne rendent pas compte du développement en trois dimensions du cœur ou des mâchoires.

Objectifs

Les malformations congénitales, diagnostiquées dans 2-3% des naissances sont un enjeu majeur de Santé Publique. Les malformations du visage et du cœur sont une composante fréquente des syndromes de malformations congénitales humaines et sont donc d'une importance clinique majeure. Les deux impliquent généralement une lourde charge médicale et chirurgicale. De plus, parmi les malformations congénitales humaines, les malformations affectant la forme du visage sont peut-être les plus frappantes en raison des attentes culturelles et des conséquences psychologiques. La majorité des alterations du visage et du coeur sont la conséquence d’un défaut de développement de l’embryon qui est provoqué par la mutation d’un gène. L’objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires et développementaux qui causent des malformations grâce à l’analyse de poissons zèbres qui portent des mutations dans certains gènes.

Bénéfices attendus

L'étude des poissons zèbres qui portent des mutations dans des gènes récemment identifiés dans des pathologies humaines devrait fournir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables de ces maladies rares et sur le développement normal du visage, du cœur et du cerveau.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour l’analyse de l’ADN. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte jusqu’à absence de réflexe au toucher (environ 3 minutes) puis un segment de 3mm de la nageoire caudale est coupé. Le poisson est ensuite placé à nouveau dans l’eau et il se réveille au bout de 1-2 minutes. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Cette procédure sera nécessaire pour chaque animal génétiquement modifié et sera effectuée une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées pourront présenter des malformations du squelette, de la tête (diminution de la taille de la mâchoire, aplatissement de la face) ou des altérations des paramètres de la nage témoignant de problèmes moteurs ou de nutrition (amaigrissement).

Devenir

Procédure 1 : Tous les poissons génétiquement modifiés et âgés entre 20-24 mois (âge à partir duquel ils n’arrivent plus à se reproduire) ou toujours en vie à la fin du projet, seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 2 : À la fin de la procédure qui a pour but l'étude post-mortem de l’ensemble des caractères visibles de poissons mutants, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 3 : À la fin de la procédure, qui a pour but l'observation, sur une brève période, du comportement de nage des larves en réponse à des stimuli sonores et lumineux, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique.

Remplacement

Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et développementaux qui sous-tendent certaines malformations du visage et du cœur et la déficience intellectuel. Le recours à des modèles animaux est indispensable pour réaliser ces études car les études in vitro ne peuvent pas complètement rendre compte de la complexité des processus mis en jeu, par exemple, le développement complexe en 3 dimensions du coeur ou les interactions entre des populations de cellules qui donneront lieu aux mâchoires.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Nous générerons uniquement le nombre d’animaux nécessaires à nos projets. La fécondité élevée chez cette espèce est un avantage, car elle permet d’obtenir beaucoup d’embryons, à partir d’une population restreinte de reproducteurs adultes.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance journalière, avec un dénombrement des poissons affectés par symptôme. Compte-tenu des gènes impliqués, des malformations du squelette de la tête ou de la capacité de nager sont attendues parmi les phénotypes spécifiques. De ce fait, ces altérations ne seront pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion) ou comportementaux (fort amaigrissement, immobilité) seront suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis seront euthanasiés. La procédure de prélèvement d’un fragment de la nageoire caudale (pour l’analyse de l’ADN) sera réalisée sous anesthésie générale. De plus, un enrichissement du milieu sera effectué par la constitution de groupes sociaux, la mise en reproduction régulière et l’ajout de nourriture vivante.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette de la tête et de la mise en place de l’orientation du cœur car ces processus chez le poisson zèbre sont similaires à ceux des mammifères. Le poisson permet du fait de la transparence des embryons et des larves, une observation non invasive des organes et cellules in vivo. Il permet d’établir des lignées génétiquement modifiées. -Pour la sélection des nouvelles lignées, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale pour l’analyse d’ADN sera réalisé sur poisson adulte, car prélever ce tissu aux stades plus jeunes serait trop endommageant. -L'analyse d'orientation du cœur sera réalisée sur des embryons âgés de moins de 5 jours post fertilisation, car l'orientation du cœur est déjà établie avant ce stade. -Les analyses du développement du squelette seront réalisées à trois stades clefs du développement : formation du squelette de la mâchoire à 5-7 jours post fertilisation ; début de la formation du crâne à 4 semaines post fertilisation ; squelette entièrement formé à 3 mois de vie. -L’observation de la taille sera réalisée sur des poissons à trois stades clefs de la croissance du poisson : à 18 jours post fertilisation, un stade larvaire ; à 28 jours post fertilisation, un stade juvénile, lorsque la plupart des caractéristiques adultes ont été acquises, sans maturité sexuelle ; à 11 semaines post fertilisation, un stade adulte. -Les tests comportementaux seront réalisés sur des poissons âgés de 10 jours post fertilisation, une étape à laquelle le développement neurologique est suffisamment mature pour pouvoir tester le comportement en réponse à des stimuli.