Formation professionnelle
Traitement anticancéreux Activé par Rayonnements Ionisants appliqué aux Tumeurs Solides
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau ou directement dans le pancréas au cours d'une opération de quarante-cinq minutes, puis elles passent des séances d'IRM d'une heure et de TEP sous anesthésie avant d'être irradiées. Le porteur décrit une tumeur pancréatique qui peut gêner la prise alimentaire, une tumeur sous-cutanée qui peut se nécroser et entraver la marche, et annonce une preuve de concept transférable en clinique. Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort immédiatement, et les tumeurs sous-cutanées sont mesurées au pied à coulisse deux fois par semaine pour surveiller le volume à partir duquel l'animal sera tué.
Objectifs
L’un des objectifs majeurs de la recherche en cancérologie est l’amélioration de l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette amélioration combine un meilleur ciblage de la tumeur avec une meilleure efficacité tout en limitant les dommages qu’ils peuvent causer au tissu sain (effets secondaires). Un des axes de recherche développé dans cet objectif est la fabrication de composés théranostiques (qui provient de la contraction des mots thérapie et diagnostic). Ces composés moléculaires permettent la cartographie des cellules cancéreuses dans le corps et leur traitement de façon ciblée. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des composés chimiques en cours de validation in vitro (toxicité, activation par les radiations ionisantes). Les composés les plus prometteurs, une fois injectés, sont détectés par des techniques d’imagerie (cartographie de la tumeur) puis activés par radiothérapie de façon à induire les effets thérapeutiques souhaités, tels que la destruction des cellules cancéreuses, l’activation du système immunitaire, etc ... L’action thérapeutique est donc contrôlée de façon à limiter l’impact sur les tissus sains et les effets secondaires associés à une chimiothérapie classique. Dans ce projet nous nous intéresserons particulièrement à des tumeurs solides du pancréas dont les traitements actuels sont peu efficaces. L’objectif de ce projet est donc d’étudier la biodistribution de nos composés théranostiques les plus prometteurs, de déterminer l’efficacité de leur effet thérapeutique sous radiothérapie dans des modèles de cancers du pancréas chez la souris avec pour finalité une utilisation dans le domaine clinique.
Bénéfices attendus
La grande majorité des composés activables par stimulations externes actuellement décrits dans la littérature ne permettent pas une application dans le domaine clinique. Notre projet vise à combler ce manque en caractérisant des composés théranostiques développés pour une application clinique. Ces composés représentent un outil innovant dans la recherche en cancérologie, car ils permettent à la fois une visualisation de la tumeur et une amélioration de l’efficacité de la radiothérapie. Si la preuve de concept se fera sur des tumeurs du pancréas, la non-spécificité de nos molécules pour un type de cancer donné ouvre la perspective d’une application à d’autres types de tumeurs solides. A court terme, ce projet permettra de valider ce concept innovant de traitement qui pourra par la suite être transféré en clinique.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales pancréatiques seront injectées en sous-cutané (durée du geste inf à 10 sec) ou dans le pancréas de souris placés sous anesthésie générale, analgésiques et antalgiques (durée du geste 45 min). La croissance des tumeurs est observée via des imageries de bioluminescence réalisées au maximum toutes les semaines (durée de l’acquisition d’image : 1 min, avec les animaux sous anesthésie générale gazeuse). Dans un second lot d’animaux sains, la toxicité des composés sera étudiée. Plusieurs formulations de composés à différentes concentrations seront injectées aux souris saines par plusieurs voies d’administrations (durée des injections inférieur à 1 min par animal, réalisé une seule fois). Dans un troisième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, des imageries seront réalisés (IRM : réalisé une seule fois, durée d’une heure par animal sous anesthésie générale gazeuse ; TEP : réalisé plusieurs fois si nécessaire avec un délai minimal de 15 jours entre chaque imagerie, durée de 10min par animal sous anesthésie générale gazeuse) afin de visualiser l’anatomie de la tumeur et caractériser son activité métabolique. Ensuite, nous ferons de prélèvements d’organes afin de doser la quantité de composé accumulée dans les organes vitaux. Dans un quatrième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, plusieurs doses d’irradiation seront testées sur différents animaux afin de vérifier la dose la plus appropriée pour nos futurs traitements (durée d’irradiation de 15 min maximum par animal, sous anesthésie générale gazeuse). Dans un cinquième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, les composés seront injectés (la formulation, la concentration et la voie d’administration seront choisies en fonction des résultats obtenus sur le 2ème lot d’animaux, la durée des injections reste inférieur à 1 min par animal) puis un traitement par radiothérapie sera réalisé (la dose d’irradiation sera choisie en fonction des résultats obtenus sur le 3ème lot d’animaux, avec une durée d’irradiation de 15 min maximum par animal). Nous étudierons ainsi l’efficacité de nos composés sur les tumeurs pancréatiques.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales comprenant des implantations tumorales peuvent occasionner des douleurs. Le développement tumoral dans le pancréas peut engendrer des difficultés dans la prise alimentaire ou encore une perte de poids. Le développement tumoral sous-cutané peut engendrer de la nécrose ou une gêne lors de certains mouvements, notamment pour la locomotion. Lors des tests de toxicité, une perte de poids peut être observée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour les analyses post-mortem
Remplacement
Avant toute étude chez l’animal, les composés théranostiques (famille appelée radioswitch) ont subi de nombreux tests préliminaires in vitro., notamment pour valider leur capacité à se fixer sur leurs cibles présentes à la surface des cellules tumorales. Ces travaux ont montré des résultats très concluants in vitro, qui nécessitent à présent d’être confirmés in vivo. En effet, il s’agit d’étudier la capacité de ces composés à se fixer sur leurs cibles lorsque les cellules tumorales sont présentes dans un organisme et également à délivrer après activation un signal conduisant à la mort de la cellule (directement ou bien grâce à l’intervention du système immunitaire)
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un test logrank sur logiciel G*power.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Pour limiter la souffrance des animaux, la procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec recours aux anesthésiques locaux et aux analgésiques. Les animaux sont également observés après les greffes afin de détecter tout signe de souffrance ou de mal être. Les animaux sont observés quotidiennement et pesés 5 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant les chirurgies. Puis, les animaux sont observés et pesés 3 fois par semaine afin de détecter tout signe de mal être ou de détérioration de leur état durant le développement des tumeurs. Si une souris présente une perte de poids de 20% par rapport à son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Les tumeurs en sous-cutanée, sont mesurées au pied à coulisse au minimum 2 fois par semaine afin de suivre leur vitesse de pousse. Nous serons particulièrement attentifs à l’atteinte du point limite éthique lié au volume de la tumeur selon le site d’implantation. Pour les tests de toxicité, les animaux sont observés et pesés 7 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant l’injection des composés, puis ils sont pesés 3 fois par semaine. Si les animaux présentent des effets secondaires suite à l’injection des composés, les symptômes seront identifiés et traités de façon adéquat. Les irradiations ne sont pas douloureuses et sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements de l’animal. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Nous serons attentifs à tout signe de mal-être tel que décrit dans la grille de score et prendrons les mesures adéquates pour arrêter la souffrance de l’animal notamment la mise en place de soins de support. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de biodistribution / biopharmacocinétique et de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique largement utilisé pour les études impliquant des molécules et/ou de la radiothérapie ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes car les tumeurs du pancréas chez l’homme touchent quasi exclusivement l’adulte.. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7/8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats Des animaux adultes et ayant fini leur développement sont nécessaires auquel cas, lors des implantations, les tumeurs pourraient migrer et nos études seraient alors inexploitable.
Imagerie exploratrice in vivo : mise en place, validation, optimisation de protocoles et caractérisation de nouveaux radiotraceurs et produits de contrastes chez le rongeur sain (rat et souris).
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Rats : 105
Recrutés de préférence parmi les animaux déjà passés par d'autres protocoles de la plateforme, 105 souris et 105 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chacun peut subir jusqu'à dix anesthésies gazeuses, de quinze minutes à trois heures, avec pose d'un cathéter veineux caudal ou intrapéritonéal pour injecter les produits de contraste ou les radiotraceurs. Il s'agit de valider in vivo des protocoles d'imagerie déjà mis au point sur des mannequins, pour "améliorer l'offre de prestation" de la plateforme aux équipes de recherche et aux entreprises. Une fois les mises au point terminées, les animaux sont encore utilisés pour des séances de tutorat à la pose de cathéter, puis soumis à une anesthésie terminale qui sert elle aussi au maintien des compétences des agents.
Objectifs
Pour améliorer son offre de prestation aux équipes de recherche et aux entreprises, notre plateforme est amenée à développer (en collaboration avec les équipes support et utilisatrices) de nouvelles méthodes et de nouveaux protocoles d’imagerie. Ces développements méthodologiques sont réalisés et validés sur animaux factices dans un premier temps. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de les valider in-vivo cette fois-ci, sur un nombre limité d'animaux.
Bénéfices attendus
Chaque développement sera fait en réponse à la demande d’un utilisateur. L’optimisation des différents protocoles d’imagerie sera ensuite mise à disposition de tous les utilisateurs de la plateforme, ce qui permettra d’améliorer la qualité des résultats obtenus et de diminuer la quantité d’animaux nécessaires à la réalisation d’un projet.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies gazeuses (maximum 10 anesthésies de 15 minutes à 3h00). En fonction des protocoles, il peut être nécessaire de poser un cathéter veineux caudal (5 minutes), ou un cathéter intra péritonéal (5 minutes) pour l’injection de produits de contraste ou de radiotraceur.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies à l’isoflurane, ce qui peut provoquer un stress lors de l’induction. Ils pourront ressentir une légère douleur au niveau du point d’injection des produits de contraste ou du radiotraceur.
Devenir
A la fin de la procédureLorsque la mise au point sera terminée, soit directement en sortie d’imagerie, soit minimum 48h après la dernière imagerie, les animaux auront une application de crème à la lidocaïne sur la queue pour permettre une session de tutorat / maintien des compétences à la pose de cathéter intra veineux caudal pour les différents agents de la plateformeles animaux seront soumis à une anesthésie terminale pour permettre une session de tutorat / maintien des compétences pour les différents agents de la plateforme.
Remplacement
Les développements méthodologiques sont réalisés et validés dans un premier temps sur des animaux facticesobjets test. Il est néanmoins nécessaire de valider in vivo ces nouvelles méthodes et protocoles sur un nombre limité d’animaux vivants, afin de les tester en conditions expérimentales réelles (configuration matérielle nécessaire, position de l’animal, suivi physiologique spécifique, synchronisation aux mouvements respiratoires ou cardiaques…).
Réduction
Dans la mesure du possible, les animaux utilisés seront préférentiellement des animaux issus de procédures légères à modérées d’autres protocoles de la plateforme. Les effectifs prévus représentent un maximum. En effet, les mises au point étant réalisées séquentiellement, la procédure sera arrêtée dès que l’objectif sera atteint.
Raffinement
Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des examens. Lors de l’induction, une lampe infrarouge sera systématiquement utilisée pour réchauffer la boite d’induction et limiter la perte de température corporelle lors de cette étape. Le seul acte invasif sera la pose éventuelle d’un cathéter veineux ou intra péritonéal. La température et la respiration des animaux seront surveillées en permanence par un système de monitorage afin d’être le plus précis sur les doses d’anesthésique utilisés. Du gel ophtalmique sera utilisé pour prévenir la sécheresse oculaire. Après la session d’imagerie, les animaux seront placés sous une lampe chauffante pendant leur phase de réveil avant de retourner dans leur pièce de stabulation. Chaque examen aura une durée maximale de 3h00 et nous prévoyons un temps de repos minimal de 48h entre deux imageries. Des points limites génériques seront utilisés pendant l'hébergement pour détecter tout signe de mal être le plus précocément possible et des points limites spécifiques (fréquence respiratoire et température) seront utilisés prendant les imageries.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont des animaux largement utilisés en recherche, notamment en neuroscience. Ce sont des animaux de référence pour l’imagerie préclinique. Le besoin méthodologique va porter sur ces deux espèces, en fonction des projets des chercheurs. Les animaux pourront être jeunes adultes à adultes. Un poids maximal de 600g pour les rats sera respecté pour correspondre aux contraintes d’encombrement dans les imageurs.
Ateliers de travaux pratiques de formations pratiques et formations réglementaires et techniques peu invasive et invasives sous anesthésie
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 250
Lapins : 75
Chiens : 40
Cochons : 5
Former des vétérinaires et des personnels d'animalerie aux gestes réglementaires : 620 animaux non-humains sont mobilisés, 250 souris, 250 rats, 75 lapins, 40 chiens et 5 cochons. 105 d'entre eux sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les 515 autres subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rongeurs reçoivent deux gavages, quatre injections sous-cutanées, deux injections intrapéritonéales et jusqu'à six ponctions veineuses, le nombre de piqûres pouvant augmenter si l'animal est maintenu sous anesthésie avec surdosage final. 315 animaux sont gardés vivants pour être réutilisés d'une session à l'autre, les chiens formant un "troupeau permanent" que le porteur réutilise après un temps de repos.
Objectifs
Ce projet regroupe les formations à destination des personnes qui interviennent en médecine vétérinaire et en recherche animale, qu’il s’agisse des étudiants vétérinaires ou des soigneurs, techniciens et concepteurs qui utilisent des animaux à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Les formations obligatoires demandées par le Ministère ont pour but de former les nouveaux concepteurs, applicateur, etc... Elles permettent de s'assurer que les exigences réglementaires sont respectées, de renforcer les compétences techniques, d'améliorer la qualité et la fiabilité des projets, et de favoriser une meilleure collaboration grâce à des pratiques harmonisées.
Procédures
Rongeur (souris et rat) : 2 administrations orales, 4 injections sous-cutanée, 2 injections intrapéritonéale, 2 prélèvements sanguins ou injections intraveineuses à la veine cave crâniale (sur animal anesthésié), 4 prélèvements sanguins ou injections intraveineuses à la veine caudale (avec analgésie locale), une anesthésie générale. Le nombre de sites et le nombre de piqures peut être augmenté si l’animal est maintenu sous anesthésie avec surdosage final. De plus les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthesie avec surdosage final. Lapin : 2 administrations orales, 2 injections sous-cutanée, 2 injections intrapéritonéale, 3 prélèvements sanguins ou injections intraveineuses par oreille (avec analgésie locale). Le nombre de sites et le nombre de piqures peut être augmenté si l’animal est maintenu sous anesthésie avec surdosage final. Chien : 2 administrations orales, 4 injections sous-cutanée, 2 prélèvements sanguins ou pose de cathéter à la veine céphalique sur une seule patte, 2 prélèvements sanguins à la veine jugulaire sur une seule veine, une anesthésie générale. Porc : anesthésie par injection intamusculaire avec surdosage final. La durée totale de la formation dépendra du nombre d'étudiants, mais ne dépassera pas 2 à 5 minutes par acte technique.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont celles qui sont inhérentes à chaque acte technique auquel les animaux sont soumis, mais avec, potentiellement, un peu plus de stress, de douleur ou d’angoisse si la personne en formation est moins habile ou moins rapide.
Devenir
Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire, prenant en compte un temps de repos suffisant ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation. Les animaux qui devront être euthanasiés à l'issue de leur procédure seront valorisés pour la formation initiale et continue.
Remplacement
Des méthodes alternatives sont utilisées dans les enseignements en préalable aux travaux pratique, en particulier les vidéos et les ateliers de simulation. Cependant, pour la mise en œuvre pratique et pour atteindre un niveau de performance suffisant, le recours à l’animal vivant peut-être nécessaire pour maitriser le geste. L’acquisition d’une première expérience pratique, ou même d’une maitrise pratique, selon les objectifs de formation, permet à moyen terme de réduire les animaux utilisés en recherche en évitant les erreurs de manipulation pendant les projets et permet une meilleure manipulation des animaux en médecine vétérinaire
Réduction
Utilisation nombre nécessaire d’animaux pour chaque session. Ils sont commandés en fonction du nombre de stagiaires et de leur besoin de formation. Nous comptons 1 rongeur pour deux stagiaires pour une formation à des gestes techniques. On peut utiliser un nombre plus réduit, comme 1 rongeur pour 3 ou 4 stagiaires si la formation n’est pas invasive. Si des rongeurs ou des lapins sont présents en stabulation à Biovivo au moment de la formation, ils peuvent être utilisés en formation après avis de la SBEA. Les chiens font partie d’un troupeau permanent et sont réutilisés d’une formation à l’autre en respectant des temps de repos adaptés à la formation prévue.
Raffinement
Seules les méthodes les plus récentes sont montrées aux stagiaires. Les encadrants sont expérimentés et leur dextérité est régulièrement revue au cours de formation internes à Biovivo par exemple. Des analgésiques sont utilisés si une souffrance ou une douleur intervenait suite à une erreur de manipulation. Des points limites ont été définis, et mermettent de retirer les animaux en cas de souffrance ou douleur qui ne rétrocède pas au traitement.
Choix des espèces
Les souris, rats, lapins et porcs sont parmi les espèces les plus utilisés en expérimentation animale d’où l’importance d’effectuer les formations « soigneur », « applicateur », « concepteur » sur ces espèces. Les chiens sont utilisés à la fois en expérimentation animale et en médecine vétérinaire pour des séances de TP non invasives ou des TP d'échographie au cours des quels ils sont tranquillisés. Jeunes adultes car il s’agit du stade de développement le plus couramment utilisé en expérimentation animale. Des animaux plus âgés peuvent être utilisés dans le cadre de réutilisations.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Formation concepteur – Rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 150
Former jusqu'à vingt-quatre étudiants par an à la contention, aux injections et à la mise à mort des rongeurs : 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chaque participant manipule un seul animal par séance, une séance avec des rats et une avec des souris. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intramusculaires et intraveineuses ainsi que les gavages volontaire et imposé se font sans anesthésie, sur une dizaine de minutes, les prélèvements de sang étant eux réalisés sous anesthésie. La mise à mort fait partie du programme et se prolonge par des prélèvements d'organes, le porteur écrivant qu'après un apprentissage sur maquettes, modèles en silicone et peluches, il reste "incontournable" de réaliser quelques gestes de base sur souris vigiles.
Objectifs
La formation sera conposée de séances de travaux pratiques intégrées au modules d'enseignements. Leurs objectifs seront dans un 1er temps de bien connaître les bonnes pratiques de manipulation des rongeurs, incluant l’enrichissement de leurs milieux d’hébergement. Les participants seront initiés aux principaux gestes techniques réalisés sur rats et souris (différentes méthodes de préhension et de contention dans le cadre de socialisation, pesée...). Les séances viseront également à apprendre les techniques d’administrations et de prélèvements sur animaux vigiles les mieux adaptées. La gestion de la souffrance (reconnaissance des signes) et de la douleur grâce à l’emploi adapté d’analgésiques et d’anesthésiques. Ensuite, les participants apprendront les meilleures techniques de mise à mort des animaux et à effectuer des prélèvements d’organes post-mortem. Pour ces séances, nous avons estimé qu’il serait suffisant de faire deux séances dans lesquelles chaque participant manipulera un seul animal : une séance avec rats et une séance avec souris. Etant donné l’objectif de ce projet, les tests statistiques ne sont pas nécessaires. Au cours de ce projet 24 étudiants au maximum seront formés par an.
Bénéfices attendus
Les travaux pratiques permettront l'acquisition des principaux gestes techniques dans le respect de la régle des 3 R, aux participants de notre formation concepteur de procédures expérimentales chez le rongeur.
Procédures
Toutes les administrations seront effectuées sans anesthésie (ou sur animaux vigiles), à savoir : les administrations intrapéritonéales, sous -cutanées, intra-musculaires, et intraveineuses, ainsi que les gestes de gavages volontaire et imposé (les volumes de solution de NaCl injectés lors de ces travaux pratiques seront réduits au minimum). L'ensemble dure 10 minutes. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie : le prélèvement de sang au niveau de la veine caudale chez le rat (5 minutes) et le prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire chez la souris (5 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances seront liées à l'apprentissage de la contention des animaux et de l’administration par voie orale par les apprenants pratiquant pour la premier fois ce geste avec un animal vigile. Les injections et prélevements sanguins pourront être à l’origine de douleurs légères et de courtes durées.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. De plus cela permettra de faire des prélèvements post mortem afin de compléter l’apprentissage.
Remplacement
Nous avons mis en place des méthodes alternatives pour l’anatomie (utilisation de maquette et de table numérique Anatomage), les gestes basiques (modèles en silicone, peluches pour l'apprentissage des injections et prélèvements…). Ce projet a été ainsi conçu avec le minimum possible d’animaux. Cependant, il apparaît incontournable de réaliser quelques gestes de bases sur souris vigiles dans ce contexte de formation.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux pour la formation, les apprenants auront 1 animal par TP. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes : 3 mâles et 2 femelles souris et rats; et 2 mâles et 3 femelles souris et rats par session de TP.
Raffinement
Les animaux sont hébergées par lot dans des cages dont la taille est règlementaire, avec enrichissement modifiable (tubes, feuilles de papier ouaté, dômes…). Cet hébergement sera réalisé dans une animalerie en conditions contrôlées. Un suivi de soin journalier sera effectué durant toute la période d'hébergement. Les format.eurs.rices sont des experts en expérimentation animale, maitrisant tous les gestes basiques sur souris et les rats. Tous les gestes techniques seront appris et répétés sur des mannequins, ce qui limitera le risque de nuissance sur animaux vivant lors des séances. Le gavage sera réalisé avec des sondes souples, limitant toute nuisance. Par ailleurs les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La Formation concepteur (Rongeurs ) demandée ici est liée à la « Formation à l’utilisation des rongeurs à des fins scientifiques – Conception et Réalisation des Procédures » que nous proposont concernent l'utilisation des rongeurs (rats et souris) majoritairement utilisés dans les laboratoires de recherche. Notre agrément de formation concernera uniquement ces 2 espèces. Les animaux seront tous adultes pour faciliter l'apprentissage des gestes techniques.
Formation aux différentes voies d’administrations et aux prélèvements sanguins chez la souris.
- Formation professionnelle
Chaque souris est tuée puis autopsiée après l'apprentissage d'un seul geste, pour valider la maîtrise technique du participant qui l'a manipulée. 300 souris vont être utilisées dans ce projet de formation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections sous la peau, dans le péritoine ou dans la veine de la queue, jusqu'à huit fois sur un mois pour cette dernière, un gavage d'eau, ou une prise de sang à la joue ou à la patte, sur animal vigile immobilisé dans un tube. Le porteur indique qu'une sonde de gavage mal introduite peut provoquer une détresse respiratoire et que l'animal sera alors tué immédiatement s'il s'étouffe, et présente le recours à des souris transgéniques "de réforme", déjà destinées à la mise à mort, comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.
Objectifs
Ce projet concerne la réalisation du tutorat au sein de l’établissement pour contrôler les compétences ou la formation du personnel et des utilisateurs, selon une méthodologie définie et finalisée par une validation de la maitrise du geste technique. Il concerne les techniques d’administration par injections sous-cutanées, dans le péritoine, dans la veine de la queue, ou par gavage, et de prélèvements sanguins dans la veine de la patte ou en veine submandibulaire, chez la souris. Dans le cadre de l’expérimentation animale, l’administration de substances, peut se réaliser selon différentes voies choisies selon les volumes et le produit à administrer. Les prélèvements sanguins permettent de suivre différents paramètres physiologiques. Afin de limiter son impact sur l’animal, des recommandations quant au volume à prélever et la fréquence de ces prélèvements doivent être suivies. Ces techniques doivent être maitrisées pour être correctement réalisées, en respectant le bien-être des animaux, et limiter le stress de l’animal et de l’expérimentateur. Conformément à la règlementation, les personnes amenées à expérimenter sur des animaux doivent justifier de la maitrise des gestes techniques qu’ils doivent réaliser dans le cadre d’un projet. Ainsi, ce tutorat sera destiné uniquement aux personnes sélectionnées selon leur besoin de maîtriser un de ces techniques requis spécifiquement dans le cadre d’un projet ayant obtenu une autorisation. La formation sera adaptée à chaque participant et ne concerna que les gestes techniques requis et non réalisables systématiquement par un autre personnel de l’établissement. La supervision par le tuteur se fera jusqu’à l’autonomie de l’expérimentateur en formation et observation du geste sur les premiers animaux du projet. La formation devra être réalisée juste en amont du démarrage du projet. Ces formations seront progressives et encadrées par du personnel qualifié référent identifié au sein de l’établissement. Les compétences validées lors de cette formation répondent à un certain nombre de critères définis à chaque étape de la formation. Si les gestes ne sont pas acquis à une étape, le tuteur peut exiger la reprise du geste dès la première étape sur animal simulateur ou sur un animal mort. Après validation, la formation sera inscrite dans leur livret de compétences. Ainsi, les participants pourront réaliser leurs travaux de recherche selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale et en accord avec la règlementation.
Bénéfices attendus
Cette formation s’adresse aux personnels sélectionnés selon leur besoin de maîtriser une ou plusieurs gestes techniques dans le cadre de la réalisation de projets ayant obtenu une autorisation. Elle permettra de s’assurer de la bonne réalisation de gestes techniques fréquemment utilisés en expérimentation animale pour l’administration de substances/cellules et les prélèvements sanguins, selon les bonnes pratiques d’expérimentation animale (raffinement), afin d’assurer le bien-être des animaux et de répondre aux exigences réglementaires. De plus, les souris de réforme, qui sont des souris systématiquement mises à mort car elles sont non utilisables dans les projets et non re-plaçables (souris transgéniques), seront utilisées dans le cadre éducatif, permettant la réduction du nombre d’animaux à produire pour l’apprentissage de ces gestes.
Procédures
Une souris sera soumise à un seul des gestes techniques enseigné, c’est-à-dire soit des injections sous la peau, soit dans le péritoine, soit dans la circulation sanguine via la veine de la queue, soit une administration d’eau par gavage, soit des prélèvements de sang (en veine submandibulaire ou en saphène au niveau de la patte postérieure). Toutes les injections se feront avec des solutions injectables type sérum physiologique stérile avec des volumes bien inférieurs aux recommandations et aux lignes directives en vigueur. Les administrations réalisées qu’une seule fois, à l’exception des injections dans la veine de la queue. En effet, cette technique nécessite un apprentissage plus long, et le geste sera répété au maximum 8 fois espacés d’une semaine, sur une durée totale de 1 mois. Les volumes de prélèvement de sang seront adaptés en fonction du poids de l'animal, en respectant la physiologie de la souris mais aussi les recommandations. Le prélèvement sanguin sera effectué une seule fois pour chaque animal. L’apprentissage se fera sur animal simulateur et sur cadavre quand c’est possible ou sinon si ça n’est pas possible sur animal anesthésié ; puis, une fois les gestes maitrisés, ils seront effectués sur des animaux vigiles, immobilisés par une contention ou dans un tube à contention adapté à la taille de la souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis, selon le geste effectué, au stress de l’anesthésie ou de l’immobilisation par contention. L’injection d’une solution de sérum physiologique par voie sous-cutanée, ou dans le péritoine ou intraveineuse ne devrait induire qu’une légère douleur due à la piqure. Le gavage de la souris pourra induire un inconfort, voire une irritation due à la sonde. Si la sonde n’a pas été introduite correctement, l’animal peut montrer des signes de détresse respiratoire ; dans ce cas, elle sera ressortie très délicatement et l’animal sera surveillé jusqu’à un retour à un état normal ou mis à mort immédiatement par le tuteur si l’animal s’étouffe. En effet, si un animal montre des signes de souffrance, présente des difficultés respiratoires ou une modification motrice/de posture qui perdure lors de la procédure, il sera mis à mort. Le prélèvement sanguin en veine submandibulaire pourra induire une douleur légère lors de la piqure si la zone est mal anesthésiée. Il est possible d’observer un saignement à l’oreille ou au nez si la piqure est mal réalisée. Le prélèvement sanguin en veine saphène ou l’injection en intraveineuse entrainera en plus de la douleur légère induite par la piqure, un inconfort de la souris quand le geste technique sera réalisé sur la souris vigile et immobilisée dans un tube de contention.
Devenir
Les animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent pour les études, sans pathologie, non utilisables en protocole et non replaçables, et qui sont systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. Chaque animal est mis à mort après chaque apprentissage d’un geste pour réaliser ensuite une autopsie afin de valider la formation du geste et vérifier que la souris n’a subi aucune autre atteinte non souhaitée.
Remplacement
La formation des expérimentateurs sert à valider sur animaux vigiles la réalisation de gestes techniques de prélèvement et d’injection afin de les réaliser ensuite de façon autonome et en respectant les bonnes pratiques et le bien-être animal. Même si une partie de l’apprentissage sera d’abord réalisée sur des modèles d’imitation de la souris (Simulateur Mimicky souris) et des cadavres (pour l’administration par voie sous cutanée et intrapéritonéale), il est nécessaire de valider l’ensemble de ces gestes techniques sur des souris vigiles, avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des groupes plus importants d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé en tenant compte de l’expérience relative à la validation des compétences de l’établissement. La validation des compétences d’un utilisateur expérimenté ne peut nécessiter qu’un animal sur les trois prévus dans un apprentissage complet. De plus, les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris ou sur une souris décédée afin d’utiliser le moins possible d’animaux vivants. Enfin, un geste maitrisé par un utilisateur représente un raffinement pour la réalisation des projets, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux analysés par groupe. Il est aussi important de préciser que la totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent pour les études et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet de tutorat. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour l’apprentissage des gestes techniques. Ainsi, le nombre d’animaux vivants a été limité à 3 souris maximum par geste technique par participant.
Raffinement
Les animaux seront manipulés régulièrement par des personnes compétentes avant le début du projet afin qu’ils soient habitués avant leur premier contact avec les participants de la formation. Une attention particulière sera portée à l’apprentissage initial la préhension et contention de l’animal avant l’apprentissage et la réalisation de tous les gestes enseignés. La présence du tuteur lors de la réalisation du geste garantira la qualité de l’apprentissage de manière individuelle pour chaque participant. Les gestes techniques seront réalisés d’abord sur des modèles imitant une souris et sur une souris mises à mort, avant de valider le geste sur un animal vigile, afin de générer le moins de stress possible. Enfin, un seul geste technique ne sera réalisé par animal, ce qui justifie le nombre de procédures.
Choix des espèces
Lorsqu’il n’y a pas de méthodes de remplacement permettant de répondre à une question scientifique sans recours à l’animal, notre établissement utilise principalement des souris transgéniques pour ses projets scientifiques. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en reproduisant la physiologie de l’homme, et en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyses disponibles. Les souris seront âgées au minimum de 8 semaines pour afin d’assurer l’apprentissage sur des animaux de taille adulte, avec un poids minimal de 25g.
Apprentissage des gestes de base sur modèle murin dans le cadre de la formation à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques niveau concepteur.
- Formation professionnelle
Réformées par l'éleveur ou le fournisseur et déjà destinées à être tuées, 900 souris vont être utilisées pour la formation réglementaire des personnes qui concevront des expériences sur des animaux non-humains. Chaque stagiaire dispose d'un animal : il lui injecte un anesthésique alors qu'elle est éveillée, lui injecte ensuite une solution saline sous anesthésie, puis la met à mort sans réveil. Les nuisances déclarées se limitent au stress de la contention et à la douleur de la piqûre. Le porteur indique que la partie théorique s'appuie sur des vidéos et une peluche, ce qui réduirait le nombre d'animaux, chaque stagiaire en utilisant tout de même un.
Objectifs
La mise en œuvre de la réglementation portant sur l’expérimentation animale inscrite dans le droit français depuis février 2013 précise les obligations réglementaires de formations pour les chercheurs/ingénieurs/techniciens qui souhaitent concevoir et réaliser des expériences utilisant des rongeurs à des fins scientifiques. Dans ce contexte, une «Formation spécifique destinée aux personnes concevant et appliquant des procédures expérimentales » avec un module « rongeurs » a été mise en place. Ce projet s’inscrit dans le cadre des travaux pratiques de cette formation. L’objectif de ce projet est de permettre aux personnes suivant cette formation d’acquérir d’un point de vue théorique et pratique les gestes techniques de base nécessaires à la manipulation des souris dans le cadre de procédures expérimentales, conformément aux exigences réglementaires et aux principes éthiques encadrant l’expérimentation animale. Afin de garantir une maîtrise progressive et éthique de ces manipulations, ce projet s’appuie d’une part sur les cours délivrés dans le cadre de la formation « concepteur » et d’autre part sur une progression pédagogique rigoureusement encadrée dans ce projet s’organisant en deux temps : 1- un enseignement théorique portant sur les gestes de bases en mettant en avant les notions essentielles de bien-être animal, de réduction du stress, de raffinement et de responsabilité de l’expérimentateur, 2- une phase d’exercices pratiques réalisés, dans un premier temps, sur des modèles inertes (peluches) afin de permettre une appropriation des gestes techniques dans un cadre sécurisé avant d’intervenir sur l’animal vivant dans un second temps. Lors de cette phase pratique, le taux d’encadrement est d’un encadrant pour quatre apprenants. Ce dispositif vise à garantir l’acquisition des bonnes pratiques dès le départ, en assurant un haut niveau de compétence technique et éthique avant toute implication dans un projet utilisant des souris.
Bénéfices attendus
Cette formation pratique permet aux participants une initiation aux gestes de base dans le respect des bonnes pratiques. Ces gestes devront être répétés dans l’EU d’affectation pour garantir leur bonne mise en œuvre.
Procédures
les animaux vigiles seront soumis à une injection pour l'administration d’anesthésique (durée de l'injection: 1 minute max) puis, après anesthésie, à une injection de solution saline (durée de l'injection: 1 minute max)
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. L’injection de l’anesthésique entraînent une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issue de la procédure, la formation intègre une méthode de mise à mort réglementairement autorisée.
Remplacement
La partie théorique qui précède la partie pratique utilise différents supports et méthodes alternatives à notre disposition (vidéos, peluche) afin que les stagiaires appréhendent et visualisent au mieux les manipulations et étapes des différents gestes présentés avant de débuter la pratique sur l’animal. Ces apprentissages dans un cadre propice, dirigé et à la veille des évolutions et raffinement techniques assurent une formation initiale de qualité indispensable pour stimuler l’esprit critique et s’assurer que l’acquisition, dans leurs structures, de leurs futures compétences techniques soit l’occasion d’identifier les pratiques inadaptées et de les améliorer.
Réduction
La totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme destinés à être mis à mort. Afin de limiter au maximum l'utilisation d'animaux tout en permettant l’acquisition des différents gestes, chaque stagiaire dispose d’un animal pour l’ensemble des gestes. Le nombre d’animaux est réduit au maximum grâce à la partie théorique de la formation qui précède la partie pratique et utilise différents supports et méthodes alternatives et grâce à la mise en pratique sur peluche qui permet aux stagiaires d’appréhender au mieux les gestes avant de débuter la manipulation sur animaux.
Raffinement
La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Détermination du point limite : Les animaux seront observés quotidiennement dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur afin de rechercher toute modification comportementale pouvant refléter un mal-être. Si un changement de comportement est observé chez un individu, l’avis du responsable de la mise en œuvre du projet, de la SBEA ou du vétérinaire sera demandé et les mesures adéquates seront prises. Lors de l’anesthésie La souris est observée le temps de sa mise en place puis la profondeur de l’anesthésie est contrôlée tout le long de la procédure.
Choix des espèces
La souris est une des espèces les plus utilisées dans les laboratoires de recherche et de nombreux modèles de pathologies et modèles transgéniques existent chez la souris d'où la nécessité d'être formé et d'acquérir les techniques de contention / manipulation de base sur cette espèce. Pour ce projet de formation, les souris seront utilisées à un stade adulte afin de faciliter l’apprentissage des gestes techniques (organogenèse terminée, taille adulte) et de pouvoir utiliser des animaux de réforme initialement destinés à être mis à mort chez l’éleveur ou le fournisseur.
Raffinement des méthodes d’administration, de prélèvement et des techniques chirurgicales chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 3303
Cochons d'Inde : 1353
Former et entretenir les gestes techniques du personnel d'un laboratoire conduit à utiliser 3 499 souris, 3 303 rats et 1 353 cochons d'Inde, soit 8 155 animaux. 1 499 sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 5 862 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 794 un niveau sévère. 1 950 sont réutilisés, selon un barème où une procédure modérée vaut quatre points et où le cumul s'arrête à huit, ce qui autorise deux passages avant la mise à mort. Le porteur indique avoir envisagé les mannequins, la 3D et l'entraînement sur animal mort, avant de conclure que le geste sur animal vivant "reste un passage obligatoire", parce qu'il faut vérifier la réussite de la technique sur l'animal réveillé.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’assurer la formation et le maintien des compétences du personnel, en conformité avec les articles 5, 23 et 24 de la Directive 2010/63/UE du Parlement Européen et du conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, afin de garantir la qualité des procédures expérimentales et le respect des principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement). Cette formation régulière est essentielle pour maîtriser les techniques expérimentales (administrations, prélèvements, interventions chirurgicales) et réduire les impacts sur les animaux. Elle repose sur l’utilisation d’un nombre limité d’animaux, conformément aux exigences réglementaires, et contribue directement à diminuer les erreurs, à raffiner les méthodes et à limiter l’utilisation d’animaux dans les phases principales des études. En parallèle, ce projet intègre une démarche continue de raffinement des procédures expérimentales, en veillant à améliorer les pratiques déjà mises en place. Ces améliorations sont basées sur une veille scientifique constante et visent à minimiser le stress et la douleur des animaux, tout en augmentant la fiabilité des résultats obtenus. Ce projet répond aux exigences des agences réglementaires (OCDE, EMA, ANSM) et s’inscrit pleinement dans le cadre légal européen visant à protéger les animaux utilisés à des fins scientifiques. Il garantit que chaque intervention soit effectuée par un personnel formé, compétent et conscient des enjeux éthiques. Ce projet associe formation obligatoire, maintien des compétences et amélioration des pratiques expérimentales, tout en répondant aux attentes réglementaires et en renforçant le bien-être animal dans les travaux de recherche préclinique
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont en lien avec l'amélioration du confort des animaux, la limitation des potentielles souffrances induites par les techniques mises en oeuvre (administrations, prélèvements, chirurgies) et la réduction du nombre global d'animaux utilisés en recherche grâce à l'application de ces techniques par un personnel maitrisant les gestes et formés à raffiner au quotidien leurs pratiques. Un technicien formé qui réalise des administrations de manière précise et avec plus de confiance qu'un technicien peu expérimenté, contribuera à diminuer les possibles erreurs et augmentera la qualité des administrations lors des études réalisées au sein du laboratoire. A la suite de ce projet, il en découlera une diminution du nombre d’animaux, un stress moindre ainsi qu'une baisse du niveau de douleur pour l’animal dans l'ensemble des projets appliqués dans l'établissement utilisateur. La formation du personnel est indispensable pour maîtriser les actes techniques, éviter la souffrance animale, limiter le risque d'erreur dans les procédures et l'utilisation d'animaux. Ainsi, une bonne maîtrise de l'acte permet le respect de la règle des 3R.
Procédures
Les techniques chirurgicales sont réalisées exclusivement sous anesthésie associée à un ou des composés antalgiques/analgésiques. La durée moyenne d'un acte chirurgical est comprise entre 5 et 90 minutes. Un seul acte chirurgical sera dispensé par animal. Les prélèvements de fluides pourront être effectués sur animal vigile ou sur un animal anesthésié selon la technique utilisée qui durera entre 1 et 10 minutes par animal. Le raffinement des techniques et la formation aux administrations sont effectués principalement sur animaux vigiles ou bien anesthésiés. Aussi bien pour les prélèvements que les administrations, chaque animal ne recevra pas plus de 8 actes classés Léger, ou 2 actes classés en modéré. A la suite de certaines techniques chirurgicales des observations comportementales peuvent être réalisées à une seule occasion, de 1 à 4 semaines après la chirurgie, sur une durée de 60 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les administrations, les prélèvements et les techniques chirurgicales entraînent un stress temporaire chez l'animal. Cet inconfort peut apparaitre lors des répétitions de prélèvements. Dans le cas des procédures chirurgicales, la technique réalisée entraine une sensibilité voire une douleur au niveau du site d'implantation, du site de lésion ou sur le trajet du cathéter, malgré la prise en charge péri-opératoire.
Devenir
Un suivi de l’utilisation des animaux est mis en place au sein de l’entreprise, et un score est établi afin d’empêcher une réutilisation excessive, notamment dans des procédures de sévérité modérée. A la suite des procédures modérées précitées, les scores de réutilisation s’incrémentent à chaque procédure appliquée à l’animal (procédure modérée : 4 points). La réutilisation est possible tant que le score cumulé est inférieur à 8 points (une procédure sévère est représentée par un score de 8 points) et que l'animal ne présente aucun signe de mal-être. La décision de la réutilisation revient aux vétérinaires. Au-delà, les animaux sont mis à mort. Les animaux soumis à des actes classifiés sans réveil (notamment car nécessitant une euthanasie de l'animal pour vérifier des repères anatomiques) ou à des chirurgies lourdes ayant un impact sur leur maintien en vie dans de bonnes conditions seront euthanasiés sous anesthésie sans retour à l'état conscient. Les animaux ayant subi une procédure de catégorie sévère sont euthanasiés, car leur maintien en vie dans de bonnes conditions n'est pas possible.
Remplacement
L'ensemble des projets du laboratoire rend incontournable le recours à l'utilisation d'animaux utiles à des fins scientifiques. Toutes les mesures de remplacement ont été envisagées dans le cadre de la formation (mannequins, 3D, bibliographie scientifique, geste technique approché sur animal mort issu d'une procédure expérimentale antérieure) qui reste un passage obligatoire. La mise en œuvre d'une administration, d'un prélèvement ou d’une technique chirurgicale passe nécessairement par une étape sur animal vivant (par exemple la formation aux prélèvements sanguins exige de vérifier la capacité à prélever sans hémolyse ; la formation à la chirurgie touchant aux vaisseaux exige l'entraînement sur animaux vivants pour apprendre le geste sur des vaisseaux non collapsés et vérifier la réussite de la technique sur l'animal réveillé).
Réduction
L'utilisation d'animaux n'aura lieu qu'en cas de nécessité (formation de nouveaux techniciens, reformation après une longue période sans réalisation de la technique). Par ailleurs, la formation utilisera dès que possible des animaux ayant déjà été soumis à une procédure légère ou modérée dans le cadre d'un autre projet scientifique (de façon à réduire l'utilisation d'animaux naïfs). Le nombre d'animaux sélectionnés sera déterminé afin de garantir une performance permettant de raffiner de manière globale les procédures mises en oeuvre sur les animaux dans l'EU, tous projets confondus. Ce projet s'inscrit dans un objectif de réduction du nombre total d'animaux utilisés dans l'ensemble des projets de l'établissement utilisateur, via une formation adéquate, un raffinement permettant de répondre aux questions en utilisant moins d'animaux et une réflexion sur les volumes minimum pertinents pour les analyses. Dans le cas des méthodes nouvelles, la faisabilité et l'impact seront évalués dès les premiers animaux au regard de l'attendu bibliographique.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en une veille constante de la littérature permettant de s'assurer de la qualité de nos méthodes grâce aux connaissances scientifiques acquises en continu. Par ailleurs, un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à chaque procédure permet de stopper l'étude et/ou de décider la mise à mort de façon précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, une observation clinique quotidienne, un avis vétérinaire spécifique si nécessaire). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux. Celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou d'air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/postopératoires complets.
Choix des espèces
Ces espèces sont les espèces cibles des premières études précliniques. Elles sont requises par les principes fondamentaux de l'ICH (M3(R2) Études de sécurité non clinique pour la conduite des essais cliniques chez l'homme et l'autorisation de mise sur le marché des produits pharmaceutiques) et la nécessité scientifique/physiologique. La pertinence du choix des espèces animales est basée sur des caractéristiques anatomiques, physiologiques, ou pathophysiologiques et chaque espèce a ses avantages et inconvénients. Le choix final est basé sur un examen critique des données disponibles et des considérations éthiques. 90% des méthodes s’appliquent à l'animal adulte entre 6 semaines et 20 semaines de vie. Certaines méthodes s'appliquent à l'animal âgé ou jeune en raison de la taille de ces animaux pour être le plus représentatifs possibles des situations rencontrées en recherche animale (certains modèles nécessitant des études sur animaux de la période péri-natale jusqu'à un âge avancé).
Mesures métaboliques (test de sensibilité à l’insuline et dosages lipidiques) chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Une souris par binôme et par procédure, pour quarante étudiants de master : le projet est un travail pratique de physiologie animale. 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Les étudiants apprennent le prélèvement de sang à la queue sur animal vigile et l'injection intrapéritonéale d'insuline, qui expose les souris à un risque d'hypoglycémie. Le porteur affirme que le remplacement est impossible parce que l'objectif du travail pratique est justement de confronter les étudiants "à la manipulation d'animal vigile", et juge essentiel de les sensibiliser tôt aux 3R.
Objectifs
L'objectif du projet est de réaliser un TP dans le cadre d'enseignement de physiologie animale. Ce TP comportent différets tests métaboliques qui sont 1_ la mesure de sensibilité à l'insuline sur échantillons sanguins et 2_ des dosages lipidiques plasmatiques. Il s’agit d’un TP dans le cadre d’un module obligatoire d'ateliers pratiques où la pratique en laboratoire est développée. Comme ce TP s'adresse à des niveaux Master 1, cette expérience pratique peut influencer positivement leurs choix ultérieurs de cursus et de stage en Master 2.
Bénéfices attendus
Les étudiants seront formés au prélèvement sanguin caudal, aux prélèvements tissulaires ainsi qu'à l'analyse de résultats expérimentaux autour du métabolisme des lipides chez la souris. D'autre part, les étudiants seront sensibilisés à l'expérimentation animale et à l'intérêt du bien être et du respect de l'animal dans ces conditions. Etant donné qu'il s'agit d'étudiants intégrés dans un cursus de physiologie animale, il semble essentiel de les confronter très tôt aux notions des 3R.
Procédures
prélèvement de sang caudal sur animal vigile pour les deux procédures. Injection intrapéritonéale d'insuline.
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les animaux peut être le stress lié à la manipulation et à l'injection d'insuline. Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible dans l'ITT.
Devenir
Quelle que soit la procédure, tous les animaux sont mis à mort pour prélèvements d'organes
Remplacement
l’objectif du TP est d'étudier une grande fonction physiologique de l'organisme et de confronter les étudiants à la manipulation d’animal vigile. On ne peut par conséquent pas le remplacer par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour un groupe de TP (40 étudiants) nous envisageons 1 souris par binome et par procédure.
Raffinement
Peu de manipulation seront réalisées sur les animaux. Seules les injections d’insuline et la mise à mort peuvent induire du stress lors de la contention. Il est donc nécessaire que l’ensemble de ces deux gestes soit réalisé par un manipulateur expérimenté. Les prélèvements de sang ne nécessitent pas de contention. Les étudiants vont apprendre en procédure 1 un geste de prélevement de sang caudale qui va leur servir en procédure 2. D'autre part afin d'éviter toute souffrance inutile de l'animal, nous appliquerons un antalgique local au bout de la queue 10 min avant incision.
Choix des espèces
Les paramètres métaboliques mesurés par les étudiants seront confrontés à des données bibliographiques issus d'études réalisées sur des souris adultes. Ainsi il est nécessaire de réaliser ces mesures sur ce modèle animal. Les souris utilisées seront des souris de 3 à 6 mois.
Etudier l’efficacité d’un traitement combiné avec des cellules immunitaires modifiés dans le glioblastome après la résection chirurgicale
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales leur sont injectées dans le cerveau, une partie subit trois semaines plus tard l'ouverture du crâne pour retirer la tumeur, reçoit dans la cavité des cellules immunitaires modifiées ou un implant, et donne deux prises de sang par semaine. Le porteur annonce une perte de poids pouvant dépasser 20 %, une tête inclinée et une perte progressive d'équilibre, et écrit que le retrait de la tumeur ne provoque pas de douleur puisque le cerveau n'a pas de terminaisons nerveuses. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier une chirurgie associée à une immunothérapie, ce qui selon lui "justifie l'utilisation du modèle animal", le projet étant mené avec un groupe pharmaceutique.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive chez l'adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire la taille de la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie, la survie moyenne des patients est inférieure à 15 mois, en raison de la survenue quasi systématique de récidives. Le principal facteur explicatif de ces récidives est la repousse de cellules très invasives qui se sont propagées à partir de la masse tumorale et qui ne sont donc pas éliminées par la résection chirurgicale. Sur la base de ces données, il est urgent d'élaborer de nouvelles stratégies de traitement. Si l'immunothérapie (utilisation des cellules immunitaires contre le cancer) s'est révélée prometteuse dans de nombreux types de cancer, notamment le mélanome, le cancer de la prostate, le cancer du poumon non à petites cellules et le carcinome rénal, elle n'a pas pu concurrencer les autres traitements dans le cas du GBM, en raison du niveau anti-inflammatoire élevé de la tumeur. Il est donc essentiel de comprendre comment nous pouvons stimuler le système immunitaire pour surmonter cet échec et améliorer son efficacité. Sur la base de ces données et en collaboration avec un groupe pharmaceutique, qui dispose déjà de données préliminaires sur la pertinence de l'utilisation de cellules immunitaires contre le cancer, nous voulons étudier l'utilisation de cellules immunitaires pour augmenter la stimulation de la réponse immunitaire anti-tumorale Dans l'ensemble, cette étude vise à explorer l'utilisation de cellules immunitaires modifiées pour cibler les cellules tumorales après la résection par chirurgie, dans le but d'améliorer la survie et de contrôler la croissance de la tumeur. En injectant ces cellules immunitaires modifiées dans la cavité chirurgicale, nous espérons améliorer leur efficacité à tuer les cellules tumorales et à stimuler l’ensemble du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l'adulte et l'un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements intensifs tels que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, la récidive est presque inévitable (90 %). Avec ce projet, notre objectif principal est d'acquérir des connaissances importantes qui peuvent être appliquées dans des contextes cliniques pour le traitement du GBM. Les options thérapeutiques pour ces tumeurs solides ont été relativement jusqu'à présent peu efficace .
Procédures
Dans cette étude, les animaux subiront plusieurs interventions afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement basé sur des cellules immunitaires modifiées contre le glioblastome. Tout d’abord, une première intervention consistera en l’injection de cellules tumorales directement dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale. Cette procédure, réalisée une seule fois par animal, durera environ 10 à 15 minutes. Trois semaines après l’injection des cellules tumorales, certains animaux subiront une résection chirurgicale de la tumeur, toujours sous anesthésie générale. Cette intervention, qui vise à mimer la prise en charge clinique du glioblastome chez l’humain, durera environ 30 à 45 minutes. Dans le cadre du traitement expérimental, des cellules immunitaires modifiées seront injectées soit directement dans la tumeur, soit dans la cavité laissée par la résection. Cette injection, réalisée une seule fois sous anesthésie brève, durera environ 5 minutes. Chez certains animaux, un implant biodégradable sera placé dans la cavité tumorale au moment de la résection. Cet implant permettra une libération contrôlée des cellules immunitaires et/ou de médicaments anti-inflammatoires pour améliorer l’efficacité du traitement. Parallèlement, des prélèvements sanguins seront effectués deux fois par semaine afin de mesurer l’évolution de la tumeur. Chaque prélèvement, réalisé en quelques secondes sur une veine de la queue, permettra de limiter le stress des animaux. Enfin les animaux seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort pour remplacer le sang par une solution de fixation (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.
Impact sur les animaux
Pendant l'injection des cellules tumorales :Suite à l’injection des cellules tumorales, les animaux peuvent présenter une douleur localisée au site d’injection apparaissant immédiatement après la procédure et pouvant persister jusqu’à 24 heures ; cette douleur sera contrôlée par l’administration d’analgésiques. Des troubles transitoires de l’équilibre et une légère diminution de l’activité motrice peuvent également être observés durant les premières 24 heures. Avec le développement de la tumeur cérébrale, attendu dans les 1 à 2 semaines suivant l’inoculation, une perte progressive de l’équilibre, une réduction de la mobilité, une inclinaison anormale de la tête et un amaigrissement peuvent apparaître. Ces signes tendent à s’aggraver avec la croissance tumorale et seront surveillés quotidiennement afin d’identifier le moment approprié pour appliquer les critères d’arrêt. Pendant la résection : l'os du crâne étant mal innervé, la craniotomie provoque une douleur modérée. Alors que l'incision de la peau provoque une douleur modérée, la résection de la tumeur elle-même ne provoque pas de douleur puisque le cerveau n'a pas de terminaisons nerveuses. À la suite de cette opération, l'animal peut présenter une réduction de ses mouvements et de sa mobilité, ainsi qu'une perte de coordination dans les heures qui suivent l'intervention. Une perte de poids peut également être observée dans les jours qui suivent l'opération. Injection de monocytes modifiés: À la suite de l’injection de ces cellules immunes modifées, une perte progressive de poids supérieure à 20 % et un pelage hirsute, notamment au niveau du museau, peuvent être observés. D’autres signes incluent une réduction de la mobilité et une posture anormale (par exemple tête inclinée), comme rapporté dans des modèles similaires dans la littérature. Ces signes traduisent une dégradation de l’état général et entraîneront l’euthanasie conformément aux critères d’arrêt afin d’éviter toute souffrance. Nous prévoyons un stress et une douleur minimes lors des injections intracrâniennes, La douleur associée aux prélèvements sanguins répétés sera équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille et pourront provoquer un stress chez la souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les résultats préliminaires obtenus en laboratoire et les données de la littérature nous amènent à penser que les changements de comportement des cellules tumorales après une intervention chirurgicale sont intimement dépendants de leur environnement. Cependant, le microenvironnement tumoral (toutes les cellules non tumorales autour de la masse tumorale) est un système complexe avec un nombre extrêmement élevé de paramètres, dont la plupart sont inconnus : il est actuellement impossible de recréer complètement cet environnement ex vivo. C'est pourquoi des études animales sont nécessaires. Notre hypothèse est que l'administration d'une thérapie par CAR-monocytes (cellules immunitaires modifiées) en utilisant la cavité chirurgicale renforcera la capacité du système immunitaire à combattre la tumeur et fournira une meilleure réponse au traitement standard par radiothérapie et chimiothérapie. Cette approche ne peut pas être étudiée de manière fiable par des modèles in vitro, car aucun ne permet de reproduire l'interaction complexe entre la cavité chirurgicale, le microenvironnement tumoral et la thérapie immunitaire. Cela justifie l’utilisation du modèle animal.. En outre, nos collaborateurs ont déjà utilisé des monocytes modifiés in vitro en co-culture 2D, testé avec des cellules GBM ce qui a permis de sélectionner les meilleurs candidats et de prouver leur efficacité contre les cellules tumorales. De plus, nous souhaitons évaluer l'effet d'une résection chirurgicale combinée à une immunothérapie utilisant des monocytes modifiés. A notre connaissance, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier cette procédure sans utiliser d'animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons procédé à une analyse documentaire approfondie. En outre, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d'animaux. Plus précisément : 1. Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur de taille correcte. Nous n’aurons donc pas besoin de reproduire ces expériences 2. Nous avons appris à réséquer la tumeur, cette technique étant déjà pratiquée et maîtrisée dans notre laboratoire depuis plusieurs années. 3. Pour les traitements par CAR-Monocytes (cellules immunitaires modifiées), nous avons réalisé de nombreuses expériences in vitro avec l'aide de nos collaborateurs, ce qui nous a permis de déterminer les doses et le moment du traitement, réduisant ainsi de manière significative le nombre d'animaux utilisés. 4. Le suivi régulier de la progression de la tumeur par la mesure d'un marqueur sanguin nous permet de savoir quand réséquer la tumeur, réduisant ainsi également le nombre d'animaux utilisés. 5. Les analyses nécessitent une faible quantité de matériel, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. 6. Pour ce projet, le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Le nombre de souris par groupe est donc réduit au strict minimum, en fonction du type d’expérience tout en garantissant que les résultats soient statistiquement solides.
Raffinement
Conformément aux recommandations internationales, notamment dans le domaine de l'oncologie, les animaux sont suivis individuellement plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin de s'assurer de leur bien-être. Celui-ci sera évalué à l'aide d'une grille de cotation. Les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux reçoivent systématiquement des traitements analgésiques appropriés pendant et après les opérations. Les interventions chirurgicales sont réalisées dans des conditions de stérilité maximale par un personnel spécialement formé. Les animaux bénéficient d'une prise en charge standardisée de la douleur et sont régulièrement suivis après l'opération. Après injection du traitement, les animaux seront suivis 2 à 3 fois par semaine pendant les deux premières semaines, puis une surveillance quotidienne sera mise en place dès le développement de la tumeur. Cette surveillance quotidienne sera assurée y compris les week-ends et les jours fériés. L’objectif est de détecter précocement toute perte de poids ou signe de souffrance. En cas de perte de poids détectée, une surveillance rapprochée avec pesées quotidiennes et soins complémentaires (hydratation, compléments alimentaires) sera assurée. Après injections du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement (jours ouvrés donc 5j/semaine) afin d’évaluer la perte de poils, et pesés plusieurs fois par semaine. Si une perte de poids est détectée, l’animal sera alors surveillé de manière plus rapprochée avec une pesée quotidienne et des soins complémentaires effectués (hydratation, compléments alimentaires). Nous travaillons avec un personnel expérimenté dans l’observation et la gestion des souris, capable de reconnaître rapidement les signes de douleur ou de détresse. Le suivi est effectué de manière objective en s'appuyant sur la grille d'évaluation spécifique au projet. Si nécessaire, des soins supplémentaires, tels que des analgésiques ou réhydratation, compléments alimentaires seront apportés. Si aucun soulagement n’est possible, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous mènerons nos expériences en utilisant des souris, espèce de choix pour les études de cancérogenèse et les expériences menées en thérapeutique du cancer. Elles ont depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que leur physiologie est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes, qui permettent l'implantation de cellules humaines sans rejet et offrent un modèle pertinent pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements anticancéreux in vivo. Adultes de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale. De plus, les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie
Formations aux procédures peu ou faiblement invasives en recherche animale.
- Formation professionnelle
Rats : 200
Cochons d'Inde : 30
Hamsters dorés : 30
Lapins : 75
Chats : 10
Chiens : 30
Cochons : 5
Moutons : 10
Jusqu'à huit tentatives de ponction veineuse sur un chien ou un chat, deux ponctions par site, la bouche ouverte pour le geste d'examen. 590 animaux non-humains de neuf espèces vont être utilisés, dont 200 souris, 200 rats, 75 lapins, 30 chiens, 10 chats, 5 porcs et 10 brebis, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, sans finalité de connaissance et pour la seule formation du personnel de la plateforme. Le titre du projet qualifie ces procédures de peu ou faiblement invasives, et le porteur reconnaît que les nuisances augmentent quand la personne en formation est moins habile ou moins rapide. Tous ces animaux viennent déjà d'autres projets et seront gardés en vie pour être réutilisés, avec sept jours de repos entre deux séances sans anesthésie et quinze avec.
Objectifs
Notre établissement utilisateur est une plateforme expérimentale qui dispose d’un agrément pour un grand nombre d’espèces animales qui sont incluses dans des protocoles expérimentaux en fonction des autorisations de projets obtenues pour des équipes de recherche de notre institution ou d’institutions partenaires. Il arrive qu’une espèce animale pour laquelle nous disposons de l’agrément ne soit pas utilisée pendant une période d’un ou deux ans. Afin de réaliser au mieux les procédures expérimentales demandées, et l’application des procédures en limitant le stress et la douleur des animaux, tout en obtenant des résultats scientifiques fiables, il peut être nécessaire de faire appel à des séances de formation interne pour notre personnel. D’autre part, lors de l’embaûche d’un nouveau membre de notre équipe, une période de tutorat est mise en place pour l’acquisition ou la validation des compétences techniques. Dans ce cas, s'il n’est pas possible que ceci soit fait lors d’études en cours, nous organisons des séances de travaux pratiques avec ces personnes et les membres de l’équipe qui ont aussi besoin d’être formées, qualifiées ou re-qualifiées. La décision est prise par la personne en charge de l’organisation et la plannification interne, en accord avec la personne responsable du suivi des compétences, mais elle est soumise à l’avis de la Struture Chargée du Bien-Etre Animal de l’établissement.
Bénéfices attendus
Nous attendons des séances de formations pratiques en interne qu’elles donnent suffisamment de dextérité et d’assurance aux personnels pour que les procéures expérimentales exigées par les projets autorisés soient menées avec succès et en limitant le stress, l’angoisse et la douleur des animaux inclus.
Procédures
Rongeurs (souris, rat…) : 3 essais des actes différentes tel qu’une administration sous-cutanée ou une administration intra-musculaire ou intra-péritonéale, pendant l’anesthésie. Lapins : une injection sous-cutanée/ intra-musculaire et une prise de sang/pose de cathéter sous anesthésie général ou sur animal vigile avec anesthésie local, avec un maximum 2 ponctions par site. Chiens/chats : geste de l’ouverture de la bouche ainsi qu’un prélèvement sanguin, à raison d’un maximum de 8 essais de ponctions veineuses, mais au maximum 2 ponctions par site. Ceci est un maximum qui est rarement atteint, en général 2 à 3 essais sont suffisants. Porc : le prélèvement sanguin à la veine sous-clavière et la pose de cathéter à l’oreille sous anesthésie et pas plus de deux ponctions par veine et par séance (auriculaire et sous clavière). La durée de ces actes est estimée de quelques secondes à 2 minutes. De plus, les techniques propédeutiques seront également pratiquées, avec une durée maximale de 15 minutes. Brebis : le prélèvement sanguin et la pose de cathéter à la veine jugulaire sur un animal vigile ou anesthésié et pas plus de deux ponctions par veine et par séance. La durée de ces actes est estimée de quelques secondes à 2 minutes. De plus, les techniques propédeutiques seront également pratiquées, avec une durée maximale de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, il s’agit principalement de permettre aux nouveaux arrivants d'apprendre les gestes techniques comme : le prélèvement sanguin / la pose de cathéter ou l'injection sous-cutanée / intramusculaire / intra-péritonéale, ou le geste d'ouverture de la bouche. Les nuisances sont celles qui sont inhérentes à chaque acte technique auquel les animaux sont soumis, mais avec, potentiellement, un peu plus de stress, de douleur ou d’angoisse si la personne en formation est moins habile ou moins rapide. À titre d’exemple, pour une séance de travaux pratiques, un rat peut subir deux ou trois injections par voie sous cutanée ou intraveineuse qui normalement dure moins d’une minute. Ici la durée sera un peu plus long.
Devenir
Dans ce projet, la grande majorité des actes techniques à mettre en place sont peu invasives. Ainsi, la plupart des animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.
Remplacement
La progression pédagogique pour l’acquisition des actes techniques passe par la formation théorique. Elle inclut un cours ou l’étude des documents qualité, le visionnage de photos et de vidéos, l’utilisation de cadavres ainsi que de modèles inertes de simulation présents dans notre institution. Tout au long du déroulement du projet, nous enrichirons notre banque d’images et de vidéos pour améliorer la qualité des cours. Ces éléments sont toujours à disposition de l’équipe de l’établissement pour un visionnage à volonté. Il est également possible de former les nouveaux arrivants au cours des études, ce qui est déjà le cas. Cependant, dans certains cas, il est nécessaire de pratiquer les gestes techniques sur des animaux vivants pour garantir la qualité des résultats d’étude. Il n’est pas toujours possible de remplacer l’animal dans le cadre des formations.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans une séance est limité au minimum et nous utilisons principalement des animaux qui ont déjà participé à un autre projet et qui n’ont pas de problème clinique suite à cette inclusion. L’acquisition d’un geste technique sur un rongeur ne nécessite pas plus de 3 répétitions bien réalisées par la personne formée. Pour les prélèvements et/ou administrations chez le rongeur : deux à trois animaux par personne et par séance sont donc suffisants. En revanche, chez les porcs, les brebis, les chiens et les chats, un animal peut être utilisé par plusieurs personnes successivement et anesthésié si besoin, ce qui peut mener à utiliser par exemple un porc pour former 2 à 3 personnes aux prises de sang. De plus, nous privilégions la formation des nouveaux arrivants pendant les études.
Raffinement
Les techniques utilisées sont les mêmes que celles que nous mettons en œuvre pour nos projets. Deux principales mesures de raffinement sont utilisées. La première est la limitation du nombre d’actes par animal et par séances. Deux à huit répétitions de geste par animal et par séance. Si ce nombre devait être dépassé, la séance se passe sous anesthésie générale. Les volumes administrés ou prélevés sont minimes (< 1 ml). Largement inférieurs aux recommandations d’usage en recherche, puisque ce qui compte est que le geste soit bien réalisé. L’autre est un enregistrement précis des utilisations et réutilisations de chaque animal en respectant un temps de repos de 7 jours entre deux séances sans anesthésie et 15 jours entre deux séances avec anesthésie. Toute blessure au cours de la séance est prise en charge et prolonge le temps de repos de l’animal. De plus, les conditions hébergement des animaux seront adaptées à chaque espèce, ainsi que leurs soins quotidiens. Seuls les animaux en bonne santé participent à ces séances de formation. Les séances sont interrompues si les animaux montrent un signe de mal-être ou de stress trop important.
Choix des espèces
Globalement, nous pouvons être amenés à organiser des TP sur toutes les espèces animales qui sont utilisées dans nos procédures de recherche. Les séances de formation sont organisées pour les nouveaux arrivants ou pour des rappels aux personnes déjà en place. Elles concernent les gestes techniques sur rongeurs, lapins, porcs, chiens ou volailles. Exceptionnellement et beaucoup plus raprement pour d’autres espèces, les formations se font par tutorat pendant les procédures. Les animaux sont des animaux réutilisés d’autres projets qui généralement font appel à de jeunes adultes
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Poissons zèbres : 140
Autres poissons : 60
Anciens reproducteurs ou individus écartés parce qu'ils ne répondent pas aux standards commerciaux, les carpes koï utilisées ici étaient de toute façon promises à la mise à mort. 16 xénopes, 140 poissons zèbres et 60 autres poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les xénopes femelles reçoivent une injection d'hormone gonadotropine puis, le lendemain, un massage abdominal de deux minutes pour prélever leurs ovocytes, les poissons zèbres subissent un prélèvement de gamètes et une biopsie de nageoire caudale sous anesthésie, les carpes koï une anesthésie de dix minutes. Les xénopes restent en vie et sont réutilisées d'une année sur l'autre dans la limite de six ponctions par individu, 70 poissons peuvent être adoptés et les autres sont tués, tout cela pour satisfaire l'obligation de formation pratique fixée par l'arrêté du 1er février 2013.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de ces séances, les expérimentateurs maîtriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie. Les carpes koï seront soumises à une anesthésie n’excédant pas 10min.
Impact sur les animaux
La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie par balnéation limitant les sources d’inconfort pour les animaux. Le seul effet indésirable potentiel pourrait apparaître suite à la biopsie de la nageoire caudale. Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, il présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement. Les animaux seront manipulés à l’aide d’une épuisette, pouvant présenter une légère source de stress lors des transferts de bac à bac.
Devenir
Poisson-zèbre et carpe koï : En fin de procédure les animaux seront mis-à-mort ou adopté si leur état de santé le permet. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (Cellules souches pluripotentes induites IPS, organöides, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs ou individus ne présentant pas les standards commerciaux (carpes-koï), dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années, dans la limite de 6 prélèvements d’ovocytes par individu.
Raffinement
Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie, l'application d'un analgésique sera systématique afin de minimiser toute douleur potentielle. Des éléments d'enrichissement environnemental seront installés dans les aquariums / bac de stabulation / sur les paillasses (ex : image de cailloux, tubes, fausses plantes) et de l'enrichissement alimentaire (proies vivantes, nourriture congelée plus appétente) sera proposé.
Choix des espèces
Poisson-zèbre et xénope sont les principales espèces utilisées à des fins scientifiques. Leurs facilités d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font des modèles de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'oeufs, température, etc.) de ces 2 espèces permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en oeuvre dans les projets de recherche. Les poissons étant un groupe paraphylétique composé d'une immense diversité d’espèces, il est important de pouvoir effectuer les manipulations sur un modèle différent. Cette formation est ouverte à une large communauté scientifique, travaillant sur un éventail d’animaux très varié. La carpe koï, poisson téléostéen d’eau froide, présente des caractéristiques complémentaires au poisson- zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie, elle permettra de mettre en évidence des aspects spécifiques à prendre en considération notamment lors des anesthésies. Xenopes et poissons-zèbre : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures, d'autre part l'induction de pontes par injection d'hormone ne peut s'effectuer que sur des femelles xénopes adultes. Carpe koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés.