Formation professionnelle

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Issus d'autres études quand c'est possible, 3 500 rongeurs et lapins vont être utilisés pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques : 1 500 souris, 1 500 rats, 300 cobayes, 100 lapins, 50 hamsters dorés et 50 gerbilles. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 360 individus seront réutilisés dans un autre projet et les autres seront tués, notamment lorsque le volume prélevé ne permet pas leur survie. Ils subissent des administrations par six voies différentes, dont l'intrathécale, jusqu'à trois prélèvements sanguins par semaine dans la limite de 7,5 % du volume sanguin total, une pose de cathéter de quarante-cinq minutes et une ponction de liquide céphalorachidien. Le porteur indique que certains gestes s'apprennent sur peaux et animaux artificiels, mais que l'évaluation des critères de réussite "impose que l'animal soit vivant".

Objectifs

Le but du projet est de permettre à une personne en formation (zootechnicien, technicien de laboratoire, directeur d’étude) de se former à la réalisation de gestes techniques. Ce projet résume un certain nombre de gestes techniques que doivent acquérir les expérimentateurs pour pouvoir réaliser des expériences sur l'animal de laboratoire. Il s'inscrit dans le cadre de l'acquisition de la compétence des expérimentateurs (arrêté du 1er février 2013, Bonnes pratiques de laboratoire, AAALAC).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la maitrise de gestes techniques. La formation initiale des personnes doit être complétée par une formation spécifique en fonction des études qu'elles seront amenées à faire pour maitriser les gestes en toute sécurité.

Procédures

Dans ce projet, les animaux vigiles seront administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse et intrathécale) avec -2 min par administration. Des administrations sur l'animal transitoirement anesthésié pourront également être faites : intradermique, oro-pharyngée, intraveineuse et intratrachéale - environ 5 minutes par administration. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement) ou sur l'animal anesthésié (environ 5 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 0.05 à 2 mL, avec un maximum de 3 prélèvements par semaine et dans la limite de 7.5% du volume sanguin total en adaptant la période de récupération. Une implantation de cathéter pourra être faite sur l'animal anesthésié environ 45 minutes de chirurgie 1 seule fois. Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (1 seul prélèvement) sera réalisé sur animal anesthésié avec un volume maximal de 0,1 ml prélevé

Impact sur les animaux

Les gestes techniques enseignés ne doivent pas affecter la bonne santé / l'état général des animaux utilisés. En fonction du geste et de ses conséquences sur l’animal, un échange se fera avec les responsables du Bien-Etre Animal pour adapter les outils d'observation des animaux en cas de réalisation imparfaite du geste concerné et d'impact négatif sur l'animal. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, administrer le produit et pour les prélèvements peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux de ce projet pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale, intradermique, intraveineuse ou intrathécale ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Avant tout début de formation, la formation débute par une partie théorique avec une personne expérimentée et certains gestes pourront être réalisés sans animaux grâce notamment à des méthodes alternatives (peaux artificielles, animaux artificiels). Les gestes à acquérir, par du personnel déjà formé aux techniques de base de l'expérimentation animale, imposent que l’animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Dans la mesure du possible, les animaux seront issus d'études et seront utilisés, après avis du vétérinaire, pour plusieurs gestes techniques de ce projet. Une supervision étroite garantira une utilisation des animaux en minimisant le risque d'erreur.

Raffinement

Les procédures seront réalisées par du personnel compétent déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais devant acquérir une expertise supplémentaire. Ce personnel de formation sera sous la supervision d'une personne experte. Le raffinement sera obtenu par • La mise au point de procédures rigoureuses, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques et des points limites, •Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie adaptés et maîtrisés, un suivi de l'état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés pour permettre une bonne récupération, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages. • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Les espèces (rongeurs et lapin) qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles autorisées pour l’établissement utilisateur, que les personnes en formation auront à manipuler au cours des expérimentations. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

80 souris, 40 rats et 40 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des séances de travaux pratiques impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est contenu vigile, examiné, gavé pour les rongeurs, puis anesthésié pour subir deux à quatre prélèvements veineux et une à deux injections par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse et intradermique ou sous-cutanée, les lapins recevant en plus un cathéter à l'oreille et un tatouage. Le porteur compte un animal par participant pour les souris, un pour deux participants pour les rats et les lapins, et signale l'accident anesthésique comme effet indésirable le plus fréquent. Les rats et les lapins tués servent ensuite à une séance de dissection anatomique.

Objectifs

La licence professionnelle dont le présent projet décrit la partie pratique sur animaux de laboratoire est un diplôme inter-universitaire de niveau bac+3. Il s’agit d’une formation spécifique destinée aux personnes appliquant les procédures expérimentales sur animaux vivants.Elle vise à former des spécialistes sensibilisés à l’éthique en lien avec l’utilisation des animaux à des fins scientifiques . D’un volume total de 550 heures, cette formation comporte une partie d’un volume de 150 heures portant sur les aspects liés à l’animal parmi lesquelles 50 heures environ sont consacrées à des travaux pratiques.

Bénéfices attendus

Dans le cadre des formations obligatoires des personnes appelées à intervenir dans des projets de recherche impliquant des animaux, il est indispensable que les apprenants pratiquent sur des animaux vivants les actes techniques autorisés par cette formation les plus courants. Depuis le début de 2016, une séance de travaux pratiques sur des modèles inertes (mannequins de rats, modèles d'oreilles de lapins, ...) est organisée préalablement aux séances de travaux pratiques sur animaux vivants objets de la présente demande d'autorisation de projet. Cette séance permet d’acquérir la maitrise technique des gestes avant de les pratiquer sur des animaux vivants et de réduire ainsi le risque d’infliger une douleur, un stress ou une lésion à un animal (Raffinement). Il demeure que la réalisation ou l'observation d'actes pratiqués sur l'animal vivant est une partie essentielle à la qualité de la formation des personnels ayant à les réaliser dans leur activité professionnelle, garantissant ainsi des gestes en conditions réelles techniquement mieux réalisés, plus sereinement, cela au bénéfice de l’animal, de l’expérimentateur et de l’expérimentation. Ces séances sont animées par un nombre conséquent d’encadrants (un encadrant pour six participants) très expérimentés, motivés par la transmission de leurs savoir-faire et très attentifs au bien-être des animaux.

Procédures

Les animaux, vigiles, sont soumis à la contention, un examen général, pour les souris et les rats à un gavage (5 min) et une injection pour l'induction de l'anesthésie générale (environ 20 min), puis sous anesthésie générale à 2 ou 4 prélèvements veineux (10 min), la réalisation de 1 à 2 injections de chacune de ces voies (intra-musculaire, intra-péritonéale, intraveineuse et intra-dermique ou sous cutanée, 20-30 min environ), et pour les lapins à la mise en place d'un cathéter à l'oreille (5 min) et la réalisation d'un tatouage (5 min).

Impact sur les animaux

La contention des animaux et la réalisation des premiers gestes avant anesthésie induisent un stress des animaux. L'administration de l'analgésique et de l'anesthésique peut engendrer une douleur légère au moment de la piqûre. L’effet indésirable le plus fréquent est un accident anesthésique chez un rat, une souris ou un lapin.

Devenir

Les rongeurs et les lapins sont mis à mort à l’issue de la séance car aucune utilisation ni aucun replacement ne peut être envisagé pour ce nombre d’animaux, après réalisation de plusieurs gestes dont des prélèvements rétro-orbitaires et après rupture de leur statut sanitaire lors de cette séance. Les rats et les lapins mis à mort sont ensuite utilisés pour une séance de dissection.

Remplacement

Il en va du bien-être des animaux ultérieurement manipulés par nos participants dans leur exercice professionnel qu'ils aient pratiqué ou au minimum vu pratiquer la plupart des gestes courants et peu invasifs pouvant être utiles à la réalisation de projets de recherche. Pour cette raison, les animaux vivants ne peuvent être remplacés intégralement par des modèles inertes. Toutefois, nos participants commencent toujours par pratiquer les mêmes gestes sur des modèles en silicone.

Réduction

Ce projet nécessite pour 5 ans l’utilisation d’un total de 80 souris,40 rats et 40 lapins au maximum. Le nombre d'animaux utilisés correspond à une souris par participant, un rat et un lapin pour 2 participants, ce qui est le minimum pour que la qualité de l'apprentissage soit suffisante. Par ailleurs, les rats et les lapins mis à mort lors du TP d’administrations et prélèvements sont ensuite utilisés lors de la séance de dissection pour l’anatomie.

Raffinement

La douleur, le stress et le risque de lésion sont réduits au maximum grâce un entrainement des participants sur modèles inertes, à un encadrement nombreux et de qualité, tourné vers l’accompagnement des participants et le respect des animaux, et au fait que les gestes les plus douloureux ou stressants sont réalisés sous anesthésie générale. Les protocoles d’analgésie et d’anesthésie sont optimisés pour les gestes réalisés. L’accent est mis tout au long des travaux pratiques sur le respect des animaux et la réalisation des gestes dans les meilleures conditions possibles. L’objectif est clairement énoncé aux participants que ces travaux pratiques doivent leur servir à réaliser par la suite l’ensemble de ces gestes nécessaires dans les meilleures conditions possibles pour le respect de l’animal et la pertinence des résultats scientifiques. Des points limites précoces sont mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Le rat, la souris et le lapin sont les modèles les plus pertinents pour le module rongeurs-lapin, de par la fréquence de leur utilisation et leur différence de taille qui permet d’appréhender la variation des gestes techniques. Les animaux commandés sont des souris d’environ 16 semaines (environ 30 g) ,des rats de 6-7 semaines (250-300 g), et des lapins. Les animaux sont choisis pour leur couleur blanche qui facilite la détection des veines caudales, leur calme et leur taille adaptée aux manipulations. Adultes pour les souris (16 semaines), jeunes adultes pour les rats (6-7 semaines), jeunes adultes pour les lapins (environ 4 à 6 mois). Les animaux sont ainsi de taille suffisante sans être trop gras (ce qui rendrait l’anesthésie plus difficile et donc dangereuse), avec une bonne homogénéité des lots pour faciliter la gestion anesthésique.

480 souris et 80 rats vont servir à entraîner le personnel aux gestes techniques de l'expérimentation, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal peut recevoir jusqu'à quinze injections ou gavages et subir cinq prélèvements sanguins, à raison de deux gestes différents par jour. Les animaux mobilisés sont d'abord des surnuméraires et des réformés d'autres études, auxquels s'ajoutent des commandes spécifiques, y compris des souris immunodéprimées. La dernière étape de la formation porte sur la mise à mort elle-même, que le porteur qualifie d'"essentielle", et qui met fin au parcours de chaque animal.

Objectifs

Ce projet encadre l’utilisation d’animaux pour la formation et l’habilitation du personnel sur les différents gestes techniques, invasifs ou non, effectués sur rongeurs au sein de l’établissement et vise à réutiliser au maximum les animaux surnuméraires non-utilisés ou non-randomisés dans des études, dans un souci de réduction tout en tenant compte du bien être animal. L’objectif de ce projet est de fournir les connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Cette formation est obligatoire et permet d’acquérir les compétences nécessaires pour effectuer des gestes techniques auprès de personnes déjà formées (formation par des pairs) et permet de s’assurer que le geste est toujours acquis. Seules des personnes formées et évaluées compétentes pour réaliser les procédures et instructions expérimentales reçoivent l’habilitation pour effectuer ces gestes en autonomie. Pour chaque geste technique enseigné, une session de validation devra confirmer que le tutoré est apte à réaliser le geste technique en autonomie. La formation et les évaluations sont tracées dans le livret de compétence de la personne formée. Le personnel est régulièrement évalué pour s’assurer qu’il maitrise le geste technique. La fréquence des évaluations dépend de la complexité du geste. Ces formations et entraînements s’appliquent aussi bien à une technique existante qu’à une nouvelle technique. La bonne maîtrise des procédures expérimentales non-invasives et faiblement-invasives appliquées sur les rongeurs permettra d’améliorer le bien-être des animaux et d’obtenir des résultats scientifiques fiables et reproductibles. L’utilisation d’animaux n’est réalisée que s’il n’est pas possible d’effectuer la formation par des méthodes alternatives. Par exemple, les techniques d’administrations et de prélèvements, l’anesthésie et l’euthanasie. Ce projet vise à réutiliser au maximum les animaux surnuméraires non-utilisés ou non-randomisés ou réformés dans des études, dans un souci de réduction tout en tenant compte du bien être animal. Cependant, certains animaux pourront être commandés en fonction des besoins (par exemple, dans le cas de la mise au point de nouvelles techniques ou si différentes souches/espèces sont nécessaires à la formation et non présentes sur site…). Lorsque le geste technique est susceptible d’engendrer une douleur ou une souffrance, des anesthésiques et/ou des analgésiques seront administrés.

Bénéfices attendus

Le tutorat pour chaque compétence (instruction), et la validation du tutorat (habilitation), sont indispensables pour la bonne réalisation de procédures expérimentales. Ils permettent de diminuer le temps de manipulation des animaux, de diminuer le stress/souffrance de l’animal, d’éviter les dérives techniques dans le temps, de prendre connaissance des évolutions techniques, d’améliorer la fiabilité des résultats, d’éviter de recommencer des études suite à un biais initié par une mauvaise manipulation technique... Ce projet permet à notre établissement utilisateur de se conformer à la réglementation et de valider les compétences de son personnel impliqué en expérimentation animale tout en réutilisant au maximum les animaux surnuméraires non-utilisés ou non-randomisés dans des études (dans la mesure du possible). De plus, la formation continue des expérimentateurs nous permet de maintenir un niveau de qualité des gestes techniques et également la mise en place de nouvelles procédures/techniques dans le but d’un raffinement.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à des injections intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées, intradermiques, des gavages et des prélèvements sanguins sous anesthésie ou en vigile. Le nombre d’actions est limité à : • 2 gestes différents maximum par jour • 15 administrations ou utilisations autres (tonte, mesures physiologiques, poinçonnage auriculaire…) • 5 Prélèvements au maximum (quels que soient les volumes prélevés). Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus ou en cas d’atteinte des points limites (grille de score détaillée). Les gestes d’administrations ou de prélèvements pourront durer jusqu’à une dizaine de minutes, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes le plus rapidement possible. Si la technique le permet, le tutoré commencera sa formation sur les animaux anesthésiés avant de passer sur animaux vigiles à l’appréciation de son tuteur.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, mesures tumorales, contention, anesthésie... # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors des injections (intraveineuses, sous-cutanées, intradermiques, intra-péritonéales), et des prélèvements sanguins (veine faciale ou caudale)... #La réalisation de procédures expérimentales en cours de formation peut induire une augmentation du stress, une angoisse et/ou une douleur.

Devenir

La formation à la mise à mort étant essentielle, cette dernière sera effectuée selon la méthode requise à l'issue de toutes les autres formations selon les conditions exposées en 5.10.3. Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, ainsi que l’ensemble des animaux à l’issue de la procédure, seront donc euthanasiés, soit dans le cadre du bien-être animal, soit dans celui de la formation tutorée.

Remplacement

Avant toute manipulation d’animaux, une formation théorique avec des modes opératoires et des vidéos, permettront de limiter l’utilisation des animaux. Pour certaines formations, des supports non vivants pourront être utilisés afin de mimer un animal (par exemple, modèles en silicone pour les voies d’injection ou animal précédament mis à mort pour s’entrainer aux gestes techniques…). L’utilisation de support non vivant dans les premières étapes d’apprentissage d’un geste technique permet d’étendre la période d’apprentissage tout en limitant le nombre d’animaux vivant utilisés et une éventuelle souffrance liée à l’application d’un geste encore mal maitrisé.

Réduction

Pour former le personnel, les animaux de réforme des études de gravité légère ou modérée, ou des animaux surnuméraires seront prioritairement utilisés. Plusieurs procédures faiblement invasives, telles que injections et prélèvements, seront réalisées sur les mêmes animaux dans les limites éthiques prédéfinies (Voir 5.6.1). Le nombre d’animaux nécessaire à la formation est défini par le niveau de connaissance initial et par la technicité du geste à acquérir. Ce nombre est défini par le formateur / la Structure Bien-Etre Animal (SBEA) / le vétérinaire. Le formateur est une personne compétente maîtrisant le geste technique et ayant les capacités de transmettre ses connaissances. Afin de réduire le nombre d’animaux et la souffrance, dans un premier temps, la personne en formation pourra être amenée à observer son formateur et/ou à s’entraîner, si applicable, sur des animaux anesthésiés ou morts. Pour les gestes faiblement invasifs, le formateur / la SBEA / le véterinaire décidera de la possibilité de garder l’animal pour l’acquisition d’un autre geste. Aucune approche statistique n’a été réalisée mais les besoins ont été estimés sur la base de notre l'expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux (cinq souris, deux rats), dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et enrichissement de l’environnement. Dans le cas de l’utilisation d’animaux dédiés, les animaux seront acclimatés pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Dans le cas d’utilisation d’animaux surnuméraires ou de réforme, seuls les animaux en bon état général seront utilisés. L’état des animaux sera régulièrement évalué par le vétérinaire, le formateur, les personnels formés, les zootechniciens. Les procédures réalisées sur chaque animal seront enregistrées. Le nombre de gestes techniques est limité à 15 injections et 5 prélèvements au total pour chaque animal, avec un temps de repos entre chaque acte invasif d’au moins 24h. Dans les heures qui suivent la formation, les animaux seront observés par le tutoré et/ou le tuteur préalablement formés à reconnaître les signes de souffrance d’un animal. En cas de procédure entraînant des effets indésirables inattendus ou une souffrance pouvant perdurer, le vétérinaire, le tuteur ou la Structure Bien-Etre Animal (SBEA), pourront prendre la décision d’euthanasier l’animal. Cet évènement sera alors tracé dans le fichier des déviations BEA et transmis au vétérinaire et la SBEA. Les administrations seront effectuées avec du sérum physiologique (éventuellement colorant). Les prélèvements sanguins respecteront la règlementation en vigueur. Pour les gestes réalisables sur animaux vigiles, une anesthésie gazeuse pourra être privilégiée lors de la réalisation des premiers gestes. Pour les procédures à réaliser sous anesthésie et analgésie, les documents de référence des précédentes demandes d’autorisation de projet seront appliqués. Des anesthésies générales seront pratiquées en fonction des gestes et des attentes et des analgésiques pourront être utilisés en fonction de la gravité du geste. Des grilles de score, spécifiques aux différentes formations, suffisamment prédictives et adaptées aux gestes de la formation, permettront d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Enfin, un système de surveillance est mis en place avec l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les jours suivants, y compris le week-end et jours fériés.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont des espèces couramment utilisées dans la recherche et pour la réalisation d’expériences précliniques. Il s’agit de modèles animaux utilisés au sein de notre établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifiques. Ainsi, l’apprentissage des bonnes pratiques permettra aux utilisateurs de réduire la souffrance et les dommages subis par les animaux au cours de la réalisation de ces expériences, tout en permettant la bonne réalisation des procédures expérimentales pour obtenir un résultat fiable en utilisant le moins d’animaux possible. Animaux adultes, à partir de 7 à 8 semaines. L’objectif de formation est d’apprendre la réalisation de ces procédures sur des animaux adultes, les mêmes que ceux utilisés dans le cadre des expériences précliniques. Des animaux immunodéprimés (donc aux phénotypes dommageables) pourront être utilisés lors des formations. Une expérimentation dans un environnement approprié (sans pathogènes spécifiques ni opportunistes) et sous poste de sécurité microbiologique, permettra à ces phénotypes immunodéprimés de ne pas être dommageable dans ces conditions d’expérimentation.

Vingt-quatre gavages et trente-deux prélèvements sanguins en six mois, ou trente-deux injections intrapéritonéales et douze poses de cathéter : c'est ce que peut subir un même animal dans ce projet. 950 souris et 250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour que le personnel s'entraîne aux gestes techniques et entretienne ses compétences. Le porteur présente cette utilisation comme un raffinement, au motif qu'un geste maîtrisé réduira le stress des animaux impliqués dans les autres projets, et signale par ailleurs qu'un gavage mal exécuté peut irriter les voies aérodigestives. Les animaux sont tués parce que le personnel ne peut pas être formé sur des animaux trop vieux, leurs organes étant ensuite "valorisés" dans des études ex vivo.

Objectifs

Dans une démarche de raffinement des expérimentations, nous souhaitons consacrer des animaux à la formation du personnel aux divers gestes techniques que nous pratiquons en routine. La thématique du laboratoire est notamment axée vers la recherche thérapeutique et diagnostique dans la lutte contre le cancer. Une fois les essais préliminaires in vitro validés, nos recherches nous mènent le plus souvent à des essais in vivo, les études sur cellules ne pouvant pas se substituer aux études sur un organisme entier afin d'évaluer les effets potentiellement indésirables d’une molécule diagnostique ou thérapeutique. Dans un objectif de raffinement des diverses méthodes mais également de réduction du nombre d’animaux utilisé pour une étude donnée, nous souhaitons travailler de manière continue sur un petit nombre d’animaux à la formation du personnel sur les divers modes d’administration (intraveineux, intra péritonéal, sous cutanée, intra articulaire, gavage) et de prélèvements sanguins. Nous avons régulièrement de nouveaux personnels (étudiants, temporaires ou statutaires) et nous devons également assurer le maintien des compétences techniques de chacun. Nous devons ainsi mettre en place des programmes de formation et maintien des compétences pour l’ensemble des acteurs des différents projets aux nouvelles approches dans le but d’être plus affin dans nos études.

Bénéfices attendus

Ces formations permettront au personnel d’être formé et de maintenir leurs compétences techniques sur les gestes qu’ils devront appliquer vis-à-vis de leurs différents projets. Ainsi, avec un geste maitrisé et plus précis, les expérimentateurs pourront diminuer le stress des animaux inclus dans les différents projets et raffiner la technique pour des résultats plus reproductibles.

Procédures

En fonction des gestes techniques, un animal pourra subir sur 6 mois soit : (i)24 gavages au maximum à raison de 2 gavages maximum par semaine d’une durée de 1 à 2 minutes et 32 prélèvements de sang dans la veine caudale à raison de 2 fois par semaine maximum avec alternance de la veine caudale et contention d’une durée de quelques secondes à 1 minute. Soit (ii)12 poses de cathéter en intraveineuse maximum 1 fois par semaine en alternance veine caudale sur animaux anesthésiés pour une durée inférieur à 1 minute et 32 injections intrapéritonéales maximum 2 fois par semaine avec alternance droite gauche sur animaux vigiles en contention pince dos d’une durée inférieur à 1 minute. Soit (iii)4 Injections intra articulaire par patte, maximum 1 fois par semaine, sous anesthésie gazeuse d’une durée inférieur à 2 minutes et 30 injections sous cutanées sur animal vigile d’une durée inférieure à 20 secondes. Soit (iv)6 Injections dans la masse graisseuse entourant la glande mammaire (1 par glande mammaire) sur animal anesthésié, maximum 1 injection par semaine, pour une durée de 1 à 2 minutes et 30 injections intraveineuses, maximum 2 fois par semaine en alternant les 2 veine caudale pour une intervention inférieur à 1 minute. Soit (v)2 prélèvements submandibullaires au maximum 2 par semaine avec alternance droite gauche sur animaux anesthésié pour une durée de 1 à 2 minutes et 50 injections sous cutanées sous anesthésie maximum 2 fois par semaine pour une durée inférieur à 1 minute. Soit (vi) 30 injections intraveineuses 2 fois par semaine maximum, avec alternance veine caudale droite et gauche et sur animaux vigiles dans appareil de contention, durée de l’intervention inférieur à 1 minutes et 50 injections sous cutanées sur animal anesthésié maximum 2 fois par semaine pour une durée inférieur à 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress modéré lors des diverses injections (intrapéritonéales, intraveineuses, sous cutanées), prélèvements (veine caudale) ou gavage réalisés en vigile sous contention. Toutefois il est à noter qu’une procédure de gavage mal exécutée peut entrainer une irritation des voies aérodigestives supérieures. Pour l’administration intra-articulaire, lorsque celle-ci est réalisée avec du sérum physiologique aucune douleur, ni effet indésirable n’est attendu. Concernant l’injection ou le prélèvement via un cathéter placé dans la veine caudale, la réalisation du geste sous anesthésie permet de prévenir le stress de l’animal lié à une contention plus longue le temps de la pose du cathéter. Dans tous les cas, un suivi régulier des animaux permettra de réagir rapidement en cas d’apparition d’une souffrance pour l’animal. L’arbre décisionnel viendra orienter les actions à mener jusqu’à l’atteinte de points limites.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures car nous ne pouvons former le personnel sur des animaux trop vieux. Dans le cadre de raffinement et de réduction, ces animaux seront valorisés post mortem par l’utilisation de leurs organes dans des expérimentations de mise au point d’études ex vivo ou en tant que contrôle pour certaines études.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostiques et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. Ainsi, il est nécessaire de former le personnel aux différentes voies d’administration et de prélèvements pour ces études. Pour les injections et prélèvements dans la veine de la queue, nous avons mis en place un système artificiel qui permet dans un premier temps de maitriser le positionnement du geste sans utilisation d’un animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant un entrainement régulier et pertinent des expérimentateurs. Nous prévoyons au plus performant de notre activité 950 souris et 250 rats. Il s’agit ici d’un nombre maximal sur 5 ans.

Raffinement

Les formations du personnel constituent un raffinement à part entière car elles permettront une formation et un maintien de compétence du personnel avec une meilleure qualité des gestes techniques pratiqués tant pour le bien-être animal que pour la pertinence et la reproductibilité des résultats. Pour l’ensemble des gestes décrit dans les procédures, nous avons réalisé une vidéo tutoriel. Chaque geste est rattaché à un formateur qui dispense la formation théorique accompagnée de la vidéo sus mentionnée. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane dans chacune des cages.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. Différentes souches de souris et rat pourront être utilisées en fonction des besoins au regard de leur différence de carnation. Souris adultes âgées d’au minimum 6 semaines et rats de 200 à 450g. L’âge des animaux a été déterminé en fonction de l’âge moyen des animaux utilisés dans les diverses études en oncologie.

Tués pour analyse des tissus dans les études d'efficacité, ou réutilisés après retrait des points de suture pour la moitié des animaux utilisés dans la formation du personnel, 500 lapins et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La paupière d'un œil leur est cousue sous anesthésie générale pendant une vingtaine de minutes, opération qui peut irriter la cornée, déformer ou faire saillir la membrane nictitante, et dont les points peuvent s'arracher au grattage, les griffes étant coupées pour l'éviter. L'objet déclaré est d'améliorer l'absorption de traitements oculaires en empêchant le clignement, une partie des animaux ne servant qu'à entraîner du personnel à ce geste. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de mimer l'œil dans sa globalité fonctionnelle.

Objectifs

La blépharorraphie est une intervention chirurgicale courante en ophtalmologie vétérinaire pour des multiples indications thérapeutiques, notamment : le soin des ulcères de la cornée ou de plaies/érosions cornéennes, le soin des œdèmes cornéens, le soin des kératites. Le but de projet sera donc celui d'effectuer cette pratique chirurgicale dans le cas où cela améliorerait l'absorption de certains traitements oculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'optimiser l'efficacité de certains traitements en utilisant la blépharorraphie, qui permettra une meilleure libération de certains principes actifs en contrant le clignement des yeux.

Procédures

La seule intervention effectuée sera la suture de la paupière (blépharorraphie) d'un seul œil (sauf dans le cas particulier d’études pharmacocinétiques à temps courts si les animaux restent endormis) effectuée sous anesthésie générale avec administration d’anti-douleurs. L'intervention aura lieu une seule fois dans chaque étude et dure environ une vingtaine de minutes. Des prélèvements de sang pourront être effectuée en cours d'étude sur animaux vigiles, en suivant les recommandations scientifiques qui détaillent le volume maximum prélevable selon le poids de l'animal suivant un temps de repos adapté.

Impact sur les animaux

La blépharorraphie est une pratique chirurgicale couramment utilisée en ophtalmologie vétérinaire et humaine, sans difficultés techniques majeures et avec d'excellents résultats. Mis à part les manipulations lors des pesées des animaux et la contention des animaux pour les observations journalières ainsi que la piqûre pour l'injection des produits anesthésiants, cette technique pourrait induire : -irritation de la cornée par contact avec les fils de suture -déformation du cartilage de la membrane nictitante -protrusion de la membrane nictitante (souvent réversible) - infection à la suite de la chirurgie (risque très faible mais présent avec tout acte chirurgical). Ces phénomènes restent rares, réversibles et indolores. La douleur de l'acte chirurgical sera soulagée par injection d'un analgésique en plus de l'anesthésie. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant (lapin) ou d'armoires chauffantes (rats) selon les espèces. Les points de suture peuvent s’enlever (grattage de l’animal, par exemple) au bout de quelques jours, mais il sera possible de les refaire sous anesthésie et sans douleur. Afin d’éviter que les animaux s’arrachent des points de suture lors d’un éventuel grattage, une coupe des griffes sera effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour analyse des tissus dans le cas des études d'efficacité des traitements. Pour la formation du personnel, la moitié des animaux seront euthanasiés pour analyse des tissus en histologie et l'autre moitié sera reutilisée une fois le retrait des points de suture effectué.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples suivant le choix du test (paramétrique ou non paramétrique). Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien- être. Les animaux auront des enrichissements adaptés. Aucun examen invasif ne sera réalisée sur les animaux à la suite de la suture des paupières. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Des enricchissements supplémentaires (une balle de cellulose en plus, par exemple) sont prévus dans le cas des lapins qui seront hebergés individuellement.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, cette pratique chirurgicale est largement connue en médecine vétérinaire et s'effectue très bien chez le lapin et chez le rat. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.