Recherche appliquée

Des souris d'une souche non consanguine, choisies pour leur variabilité génétique, vont être rendues épileptiques à vie par injections répétées d'un agent convulsivant. 448 souris vont être utilisées au total, 96 femelles et 352 descendants, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'état convulsif recherché dure au moins trente minutes, avec des contractions musculaires involontaires douloureuses, et le porteur attend une mortalité de 30 à 50 % par arrêt cardio-respiratoire à cette seule étape. Les survivantes boivent ensuite de l'acide valproïque dilué dans leur eau pendant deux à huit semaines, sont mises à la reproduction, et leurs filles reçoivent deux injections d'hormones pour la récupération d'ovocytes, avant que toutes soient tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Les médicaments antiépileptiques représentent un enjeu majeur dans la recherche pour la santé publique. L’épilepsie affecte plus de 60 millions de personnes dans le monde. De nombreuses études ont montré le risque de provoquer des malformations chez l’embryon au cours de son développement de certains traitements antiépileptiques. Cependant beaucoup de femmes atteintes d’épilepsie continuent d’être traitées au cours de leur grossesse et allaitement. En plus du risque de malformations au cours du développement, l’acide valproïque, un traitement antiépileptique largement prescrit ces cinquante dernières années, a montré des effets secondaires persistant sur plusieurs générations chez des rongeurs. Ces études ont utilisé des animaux non atteints d’épilepsie, de plus le traitement antiépileptique n’a été administré que sur de courtes périodes. Pour rendre compte de la réalité clinique, il est nécessaire de tester chez des animaux atteints d’épilepsie les effets secondaires sur plusieurs générations de l’acide valproïque et autres traitements sur une longue période, et ainsi montrer que l’exposition aux antiépileptiques peut être un facteur de risque chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but, dans un premier temps, de tester la possibilité d’induire une épilepsie chez une souche de souris non consanguine (souris générées par des croisements d’animaux non apparentés) ainsi que de s’assurer de la capacité de ces animaux à se reproduire. Utiliser une souche de souris non consanguine permet de se rapprocher au mieux de la réalité chez l’homme (forte variabilité génétique contrairement aux souches de souris consanguines) afin d’évaluer de potentiels facteurs de risque. Dans un second temps, l’objectif de cette étude pilote est de déterminer une concentration optimale d’acide valproïque qui permette de se rapprocher au mieux de la concentration thérapeutique utilisée chez les patients et qui n’empêche ni la reproduction des animaux épileptiques traités, ni la viabilité des portées engendrées par ces animaux. Valider les étapes expérimentales de cette étude pilote supporterait la mise en œuvre d’un projet dont l’objectif est de déterminer dans quelle mesure les médicaments antiépileptiques affectent les descendances (au moins sur trois générations) de souris femelles épileptiques exposées à ces traitements. Ces objectifs de recherche dans le traitement de l’épilepsie se placent dans un cadre de santé publique.

Bénéfices attendus

En validant la possibilité d’induire un modèle d’épilepsie chez des souris femelles et de reproduire ces animaux traités à l’acide valproïque, cette étude pilote permettra à plus long terme de mieux comprendre les effets observés sur plusieurs générations des médicaments antiépileptiques. Démontrer le facteur de risque pour l’Homme que représentent les antiépileptiques aidera à améliorer les traitements de l’épilepsie ainsi que de limiter les effets secondaires sur les futures générations.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement à un agent épileptogène qui permet le développement d'une épilepsie qui perdure à vie. Ce traitement est injecté à plusieurs reprises si nécessaire. Une première dose est injectée 30 minutes après l’administration d’un médicament protégeant des effets secondaires de ce traitement. Si au cours des 20 minutes suivant cette injection l’animal ne présente pas d’état convulsif, alors une seconde dose, plus faible, est injectée. Si aucun état convulsif n’est observé chez l’animal 10 minutes après cette seconde dose, alors une dose encore plus faible est administrée de façon répétée (toutes les 10 minutes) jusqu'à apparition d'un état convulsif. L’état convulsif doit durer au minimum 30 minutes pour qu’une souris soit considérée en épilepsie chronique. Passé ce délai, un anticonvulsivant est administré à l’animal. Ces animaux ingéreront un traitement antiépileptique directement dilué dans leur eau pour une durée minimum de deux semaines pouvant aller jusqu’à 8 semaines. MODIFICATION – Les femelles issues des portées recevront à 6-8 semaines 2 injections d’hormones espacées de 48heures.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables sont attendus durant l’induction de l’épilepsie. Pour induire cette épilepsie il est nécessaire de déclencher un état convulsif chez les souris naïves. Pour obtenir cet état convulsif, les animaux subissent des injections répétées d’un agent épileptogène qui peuvent induire un stress au cours de la contention de l’animal. L’état convulsif dure au minimum 30 minutes au cours desquelles les animaux peuvent ressentir des douleurs dues aux contractions musculaires involontaires. Une perte de poids peut subvenir mais elle se rattrape dès le deuxième/troisième jour suivant l’induction de l’épilepsie. Au cours de cette procédure une mortalité de 30 à 50% est attendue due aux effets secondaires de l’agent épileptogène injecté (arrêts cardio-respiratoires). L'ajout du traitement antiépileptique dans l'eau des boissons des animaux pourrait avoir des effets indésirables sur les animaux tels qu'une diminution dans la prise d'eau et perte de poids. Ces effets seront surveillés afin de ne pas dépasser de points limites. Les effets de l’épilepsie et du traitement à l’acide valproïque étant inconnus sur le comportement de reproduction des femelles, des nuisances pourraient être occasionnées par celles-ci sur leurs portées telles qu’un manque de soin (peu ou pas d’allaitement) ou des blessures physiques. Également, durant les périodes de gestation, des complications pourraient survenir engendrant un état de stress et de douleur (contractions prolongées, terme de mise-bas dépassé). MODIFICATION – Les deux injections d’hormones pour stimuler l’ovulation et récupérer les ovocytes chez les femelles des portées peut engendrer un stress à la suite de la contention et une légère douleur à l’introduction de l’aiguille. A la fin de l’étude ou dans le cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront transférés dans une cuve d'induction afin de les anesthésier avant euthanasie. Cette manipulation peut engendrer un stress chez l'animal avant d'être complètement anesthésié.

Devenir

Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Au cours de cette étude pilote, il sera développé et utilisé un modèle d’épilepsie chez la souris reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’Homme (affects cognitifs et comportementaux). L’épilepsie est une pathologie dont l’origine est localisée dans le cerveau, qui est un organe contrôlant l’ensemble des fonctions de l’organisme. De ce fait, les effets recherchés du traitement antiépileptique nécessitent l’accès à l’organisme entier (étude du comportement de reproduction, atteintes anatomiques sur les portées générées), ce qui n’est pas compatible avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale telles que la modélisation informatique ou bien les expériences in vitro. De plus, il est compliqué d’étudier les conséquences d’un traitement sur plusieurs générations chez un modèle humain. C’est pourquoi le modèle animal se retrouve nécessaire pour mener ce projet de recherche dont le but est de mieux comprendre les effets secondaires transgénérationnels, potentiellement dangereux pour la santé, des antiépileptiques.

Réduction

Le caractère méconnu des mécanismes cérébraux de l’épilepsie ne permet pas de calculer un nombre précis d’animaux pour les différentes procédures de cette étude pilote. L’induction de l’épilepsie peut engendrer une mortalité de 30 à 50% chez les animaux. Compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle, du comportement de reproduction inconnu chez les souris épileptique et de ce taux de mortalité, le nombre d’animaux a été optimisé à 448 souris CD-1 (96 femelles et une estimation de 352 souris générées par reproduction d’une partie de ces souris) pour permettre d’obtenir les observations nécessaires à cette étude, tout en réduisant au minimum le nombre d’animaux. L’organisation des animaux en différents lots permettra dans le cas d’un taux de mortalité plus faible que prévu de ne pas avoir recours au nombre total d’animaux estimé pour cette étude. Les souris femelles seront utilisées pour l’ensemble des procédures.

Raffinement

Au cours de cette étude pilote, des points limites suffisamment précoces et adaptés pour chaque procédure (induction épilepsie et traitement antiepileptique) seront mis en place pour réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse chez les animaux durant les manipulations ainsi qu’en dehors de ces périodes. Les animaux seront suivis quotidiennement jusqu’à leur mort. Leur poids ainsi que différentes variables, regroupées sur des fiches de suivi, seront surveillés afin de pallier quelconques signes de douleur ou de souffrance. Selon les observations, un protocole prévoit une action curative pouvant impliquer l’utilisation de médications pour soulager rapidement la douleur. L’induction de l’épilepsie chez les souris nécessite l’injection répétée de substance épileptogène. Le comportement de chaque souris sera surveillé entre chaque injection et permettra de prendre la décision de réinjecter ou non chaque animal individuellement. Ce protocole individualisé permet de réduire le temps de souffrance que les souris peuvent subir jusqu’à l’apparition d’une épilepsie chronique et accélère leur rétablissement. La semaine suivant l’induction de l’épilepsie, les animaux seront observés deux fois par jour pour s’assurer de leur bonne récupération, surtout dans la perte de poids qui peut survenir les 2 premiers jours. Des croquettes ramollies dans de l’eau avec du sucre seront placées dans les cages afin de réduire la perte de poids et faciliter la convalescence. Au cours du début du traitement antiépileptique, une attention particulière sera portée sur l’abreuvement des animaux. Si le traitement présente un caractère trop aversif et provoque des déshydrations trop importantes, celui-ci sera interrompu. Après accouplement, les femelles seront surveillées 2 fois par jour au cours de la dernière semaine de gestation afin de s’assurer que la mise-bas se déroule correctement. Les portées générées seront également surveillées et pesées quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne croissance jusqu’au sevrage. Une attention particulière sera portée sur le comportement des mères envers leurs portées pour s’assurer que les souriceaux sont bien allaités et ne subissent pas de violences physiques. Le bien-être des animaux est également privilégié au niveau de leurs conditions d’hébergement. Ils seront regroupés par 2 jusqu’à 4 selon la taille des cages. Des études montrent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu’ils sont hébergés en groupe.

Choix des espèces

De nombreuses études ont montré la similarité des régions cérébrales impliquées dans l’épilepsie entre l’Homme et les rongeurs (rats et souris). Cette similarité permettra de mieux extrapoler les résultats de notre étude aux mécanismes pathologiques chez l’Homme. Des souris d’au minimum 6 semaines seront utilisées, cet âge correspondant à la maturité sexuelle nécessaire pour la reproduction. Les portées générées seront conservées jusqu’au sevrage (21jours après la parturition) pour étudier leur croissance.

Infectées par le SARS-CoV-2 ou l'un de ses variants, 5 400 souris subissent des prélèvements sanguins répétés, des mesures de fonction respiratoire en chambre fermée et des anesthésies dont le porteur décrit le réveil comme lent, avec frissons et perte d'appétit. Pour les 5 400 animaux, la souffrance est déclarée sévère, et tous sont tués par perfusion terminale sous anesthésie profonde afin que leurs organes soient prélevés. Aucun anti-inflammatoire ne leur sera administré, le porteur jugeant impératif de ne pas fausser la mesure des marqueurs immunitaires. Le projet annonce aussi un modèle de covid long chez la souris, avec fatigue, difficultés de concentration et troubles de la mémoire, sans préciser par quels tests ces symptômes seront mesurés ni quelles molécules seront administrées.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment le virus responsable de la COVID-19 et ses différentes variantes provoquent la maladie, et de tester de nouvelles façons de la prévenir ou de la traiter. Pour cela, nous utiliserons des modèles de souris qui permettent de reproduire certains aspects de la maladie observés chez l’être humain. L’étude s’intéressera d’abord à la manière dont le virus se multiplie et se propage dans le corps, puis à la façon dont l’organisme réagit pour se défendre. Le système immunitaire peut être comparé à une armée de défense : il est constitué de cellules et de molécules qui reconnaissent le virus et essaient de l’éliminer. Cependant, si cette réponse est trop forte ou mal contrôlée, elle peut provoquer une inflammation importante et abîmer certains organes. Comprendre cet équilibre est essentiel pour savoir pourquoi certaines personnes guérissent facilement, alors que d’autres développent des formes plus graves ou durables de la maladie. Le projet s’intéressera aussi au COVID long, c’est-à-dire aux symptômes qui persistent après l’infection, comme la fatigue, les difficultés de concentration ou les troubles de la mémoire. En développant un modèle de souris reproduisant ces effets, les chercheurs espèrent identifier les mécanismes responsables et trouver des pistes pour mieux les traiter. Enfin, différentes stratégies thérapeutiques seront testées, notamment des molécules capables de mieux réguler la réponse immunitaire, afin de limiter la multiplication du virus, réduire les symptômes et prévenir les complications. Ce projet respectera strictement les principes des 3R, qui sont au cœur de la recherche animale responsable : • Remplacer : utiliser des méthodes alternatives (cultures cellulaires, modélisation informatique) chaque fois que cela est possible. • Réduire : limiter le nombre d’animaux utilisés en ne réalisant que les expériences indispensables. • Raffiner : adapter les techniques et assurer un suivi attentif pour réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. L’objectif global est d’améliorer la compréhension de la maladie afin de développer plus rapidement des traitements sûrs et efficaces pour l’être humain, tout en garantissant le meilleur niveau possible de bien-être animal.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mettre au point de nouveaux modèles de souris pour mieux comprendre comment la maladie causée par le virus SARS-CoV-2 se développe et évolue. Ces modèles permettront aussi de savoir pourquoi certains modèles des souris et, par corrélation, certaines personnes — tombent plus gravement malades que d’autres. Une fois ces modèles établis, ils serviront à tester de nouvelles stratégies de prévention et de traitement, comme des vaccins, des anticorps ou des médicaments destinés à bloquer le virus ou à aider le corps à mieux se défendre. Les résultats attendus permettront d’améliorer les étapes de recherche avant les essais chez l’humain et de favoriser le développement de traitements plus sûrs et plus efficaces contre la COVID-19 et ses variantes. À terme, ce projet contribuera à mieux protéger la santé humaine tout en respectant le bien-être animal.

Procédures

Les souris recevront différents traitements selon le protocole étudié et la nature des molécules testées. Les produits pourront être administrés par différentes voies afin de tester les voies d'administration chez l'Homme. L’état général des animaux sera observé attentivement avant et après chaque manipulation afin de s’assurer de leur bon rétablissement. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à différentes étapes (avant et après l’infection) afin de suivre la réponse de l’organisme. Les fonctions respiratoires seront mesurées à l’aide d’un appareil permettant d’enregistrer la respiration de la souris sans la contraindre : l’animal reste éveillé et peut bouger légèrement à l’intérieur de la chambre. Une observation clinique sera réalisée avant et après chaque mesure pour vérifier qu’il n’y a pas de signe d’inconfort. Certaines procédures nécessiteront une anesthésie, réalisée avec des produits adaptés au poids de l’animal. Dans certains cas, un antidouleur sera administré avant l’anesthésie afin d’éviter toute douleur. En fin d’étude, une anesthésie profonde sera pratiquée avant la perfusion terminale, qui consiste à faire circuler une solution dans les organes pour pouvoir ensuite les prélever et les analyser. Cette étape est effectuée uniquement lorsque l’animal est totalement endormi et insensible.

Impact sur les animaux

À la suite de l’infection des animaux par le SARS-CoV-2 ou l’un de ses variants, plusieurs effets indésirables peuvent être observés. Les principaux signes attendus incluent une perte de poids, des altérations comportementales (telles qu’une baisse d’activité, une posture recroquevillée ou un pelage ébouriffé) ainsi que des signes de détresse respiratoire (respiration rapide, irrégulière ou superficielle). Des réactions locales peuvent également survenir au niveau des sites d’injection, se manifestant par une irritation, une légère inflammation ou un saignement transitoire. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer une gêne légère et passagère au point de ponction, rapidement résolue après compression locale. Les manipulations répétées, telles que les mesures de fonction respiratoire ou les anesthésies, peuvent induire un stress léger à modéré lié à la restriction de mouvement et à l’isolement temporaire. La récupération post-anesthésie chimique est plutôt lente s’accompagnant d’une baisse temporaire d’activité, de frissons, d’une diminution de l’appétit et, plus rarement, d’une respiration ralentie. Dans certains cas, notamment au cours des phases avancées de l’infection, une réduction modérée de la mobilité ou une perte de poids persistante peut être observée. Chez les animaux génétiquement modifiés, les réponses inflammatoires ou les troubles respiratoires peuvent être plus marqués ou durer plus longtemps. L’état des animaux sera évalué quotidiennement à l’aide de grilles de suivi incluant l’observation de la respiration, de l’apparence générale, des yeux et des comportements spontanés. Tout changement significatif sera consigné, et les individus présentant des signes d’alerte feront l’objet d’une surveillance accrue, assurée conjointement par le personnel animalier et les ingénieurs responsables des protocoles expérimentaux.

Devenir

Pour toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sélectionnés seront mis à mort conformément aux recommandations réglementaires, afin de permettre le prélèvement des organes et leur analyse.

Remplacement

À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de manière satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires lors d’une infection naturelle ou après une vaccination. En effet, les modèles in vitro ne parviennent pas à capturer la complexité des interactions entre les différents types cellulaires, les tissus et les mécanismes systémiques qui se produisent dans un organisme vivant. C’est pourquoi il est indispensable de recourir à des modèles animaux, qui permettent une étude plus fidèle des réponses immunitaires dans un contexte biologique complet et dynamique. Ces modèles animaux offrent une plateforme essentielle pour mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme et pour tester l’efficacité des traitements et des vaccins avant toute application clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux pour chaque type de procédure sera précisé dans le protocole. Les effectifs sont déterminés sur la base d’expériences antérieures et/ou de calculs de puissance statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des animaux des deux sexes, âgés de 8 à 20 semaines, répartis en groupes homogènes pour garantir des analyses statistiques pertinentes. Lorsque possible, un même groupe témoin sera partagé entre plusieurs expériences afin de réduire encore le nombre d’animaux.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des conditions optimales, avec un soin et un respect constant, et sont exposées à divers éléments d'enrichissement pour favoriser leur bien-être. Elles seront hébergées en groupes de 5 afin de prévenir le stress lié à l'isolement. Les cages seront systématiquement enrichies par l'ajout d'éléments comme un dôme en carton, offrant aux animaux un abri, et de la nourriture hydratée, qui sera fournie dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentation feront l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé pour mener ces expérimentations. L'utilisation d'une grille de score spécifique, associée à un suivi pondéral quotidien, permettra de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des mesures appropriées, y compris la mise à mort lorsque nécessaire, seront mises en œuvre sans délai afin d’éviter toute aggravation de l’état des animaux. Étant donné que notre étude porte sur la réponse immunitaire, il est impératif de ne pas administrer d'anti-inflammatoires aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats en altérant l'expression des marqueurs d’intérêt, ce qui pourrait fausser l’interprétation des réponses immunitaires observées.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser le modèle murin (la souris) car c’est un mammifère dont environ 99 % des gènes sont similaires à ceux de l’être humain. La souris est un animal de petite taille, se reproduisant rapidement et facile à élever. De plus, son anatomie, sa physiologie et sa biologie sont aujourd’hui très bien connues, ce qui en fait un modèle de référence pour la recherche scientifique. La souris est particulièrement adaptée à l’étude du système immunitaire grâce aux nombreuses connaissances déjà acquises et aux outils largement disponibles pour ce modèle. Pour nos expérimentations, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines et pesant au minimum 22 g. Ces critères garantissent que les animaux possèdent un système immunitaire pleinement développé et un poids stable au début du protocole, ce qui permet de limiter les variations naturelles qui ne seraient pas liées à l’étude elle-même.