Recherche appliquée

Infectées par des salmonelles au cours d'une contention d'une trentaine de secondes, 2 400 poules vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes et noter les lésions. Le protocole ajoute une vaccination, des pesées, un prélèvement de sang à l'aile, et l'analyse des fèces et des œufs pour mesurer l'excrétion de la bactérie. Le porteur indique qu'aucun signe clinique ni mortalité ne sont attendus puisque les oiseaux restent porteurs sains, et attribue le niveau modéré au stress des manipulations plutôt qu'à l'infection elle-même. Ces essais d'efficacité sont exigés pour les dossiers d'autorisation de mise sur le marché des médicaments vétérinaires, et le schéma de vaccination suit le résumé des caractéristiques du produit ou la demande du donneur d'ordre.

Objectifs

Les salmonelles ubiquistes sont un grave problème et pour la santé humaine et pour la filière avicole. La salmonellose est une zoonose majeure, en raison surtout de sa fréquence et de sa gravité médicale pour l’Homme. La contamination à différents niveaux de la filière avicole par la bactérie du genre Salmonella est à l'origine de toxiinfections alimentaires chez l'Homme via la consommation d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair. La maladie humaine se contracte par l’ingestion d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair crue contaminés, et constitue la première cause de toxi-infections alimentaires collectives en France. La prophylaxie repose essentiellement sur une hygiène stricte et de bonnes pratiques d’élevage. Mais les salmonelles sont des germes très difficiles à éradiquer du fait de leur ubiquité et de leur grande résistance dans le milieu extérieur, tant aux agents physiques que chimiques. Il est donc important de trouver de nouvelles stratégies pour renforcer la résistance des poules domestiques à l’infection, de diminuer l’excrétion des germes dans le milieu extérieur et le portage asymptomatique. La vaccination des poules pondeuses et des reproducteurs au couvoir avec des vaccins vivants permet une réduction nette du portage et de l'excrétion, mais cette prévention n'est ni suffisante ni durable. L'objectif de ce projet est de tester différents schémas vaccinaux permettant de réduire significativement et durablement le portage et l'excrétion. Sur les 5 années du projet, nous estimons à 2 le nombre d'études de développement de modèle et à 2 le nombre d'essais d'efficacité, ce qui correspond à un nombre maximal de 2400 oiseaux.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux vaccins contre les Salmonelles, et plus particulièrement de vaccins destinés aux lignées reproductrices ou aux poules pondeuses permettrait de réduire la contamination de la filière, et ainsi de limiter les risques de toxi-infection chez l'Homme. Une meilleure maîtrise des Salmonelles en élevage aviaire permettrait d'éviter l'abattage d'animaux ou la destruction des œufs ou des carcasses en cas de contamination avérée. Le but recherché est d'induire une immunité forte chez les animaux vaccinés et de protéger la descendance pendant les premières semaines de vie via les anticorps maternels (anticorps maternelles transmis de la mère à la descendance par le jaune d'oeuf). Les stratégies vaccinales permettent également d'éviter l'utilisation des antibiotiques dans les élevages avicoles. En effet, l'utilisation massive d'antibiotiques jusqu'aux années 2000 a engendré l'apparition de souches multiresistantes très préoccupantes pour la santé humaine.

Procédures

L'infection sera induite par administration d'un inoculum contenant une ou plusieurs souches de Salmonelles par la voie décrite dans le protocole. Un seul challenge avec l'inoculum sera effectué par essai. L'inoculation est effectuée sur animaux vigiles et la durée de la contention est d'environ 30 secondes. Dans le cas de l’évaluation de vaccins vétérinaires, ces derniers seront administrés selon les modalités prévues dans le RCP (Résumé des Caractéristiques du Produit) ou demandées par le donneur d’ordre. Une seule administration de vaccin est généralement nécessaire, mais certains protocoles vaccinaux peuvent nécessiter un ou deux rappels. L'administration se fait sur animaux vigiles et la durée de la contention est inférieure à 20 secondes. Au cours du projet, des données seront générées dans le cadre du suivi de l’évolution de la maladie chez les animaux: examens cliniques quotidiens (examen visuel depuis l'exterieur de la case), poids (maximum une fois par semaine; sur animaux vigiles; durée entre 30 et 60 secondes), ingérés alimentaires ou hydriques quotidiens (mesure de la quantité d'aliment/d'eau distribués par case et mesure des refus après 24h). Chez la poule pondeuse, les oeufs seront collectés pour analyses bactériologiques. Des prélèvements de fèces (effectués dans la litière) peuvent également être réalisés pour évaluer l'excrétion de la bactérie dans l’environnement. Un prélèvement sanguin pourra être effectué en fin d'étude dans le cadre du suivi de la bactériémie ou de la réponse humorale après vaccination. L'animal vigile sera tenu en contention pendant environ 1 minute pour effectuer le prélèvement à l'aile. Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin d'évaluer les lésions des organes, et pour prélèvement d'organes pour identification et numération bactérienne.

Impact sur les animaux

Aucun signe clinique ni mortalité ne sont attendus chez les animaux inoculés puisque les animaux sont porteurs sains. Bien que l'infection n'induise pas de signes cliniques ni de mortalité, le niveau de gravité des modèles d'infections par Salmonelle est classé "modéré" à cause du stress induit par les manipulations d'animaux au cours des pesées, de l'administration du produit d'étude, du challenge, des prises de sang et des euthanasies. La seule douleur sera celle liée à l'insertion de l'aiguille lors de la prise de sang ou pour euthanasie (en cas d'euthanasie chimique).

Devenir

Les animaux entrant dans ce projet seront euthanasiés en fin de procédure pour scoring des lésions et prélèvements de tissus/organes afin de vérifier la charge bactérienne (portage) et/ou d'effectuer des analyses histopathologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants n’est susceptible de répondre aux objectifs du projet. L'utilisation de modèles in-vitro, ex-vivo ou de simulations informatiques ne permet pas de répondre aux objectifs du projet. En effet, l'efficacité d'un médicament, d'un vaccin ou d'un additif ne peut être évaluée qu'après administration du produit à des animaux infectés par la bactérie afin d'évaluer son efficacité (réduction des signes cliniques, de la mortalité, la réponse immunitaire, le portage et l'excrétion) chez l'espèce cible. Les essais d'efficacité sont obligatoires au dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché de médicaments vétérinaires et doivent être réalisées chez l'espèce cible correspondant aux indications thérapeutiques du produit à tester. Il n'y a donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux implique au préalable une bonne caractérisation du modèle expérimental afin de réaliser ensuite des calculs d'effectifs fiables et d’éviter l'échec d'étude d'efficacité parce que la variabilité n'est pas maîtrisée (modèles pas assez ou trop sévères) ou parce que le nombre d'animaux est insuffisant. Le calcul d'effectif est basé sur le paramètre d'intérêt spécifique au produit dont l'efficacité est évalué et peut se faire sur un score clinique et/ou sur un paramètre zootechnique (poids ou indice de consommation). Selon le paramètre retenu, le calcul d'effectif doit se baser sur le test statistique qui sera conduit. Pour les études de développement de modèles, le nombre d'animaux utilisé sera déterminé de telle sorte que l'expérimentation soit interprétable, en tenant compte de la variabilité biologique individuelle.

Raffinement

Les conditions d'hébergement seront adaptées aux besoins physiologiques des animaux et leur permettront d'exprimer le plus possible leur gamme normale de comportements. Pour les volailles, l'hébergement sera en bâtiment fermé sur paille ou sciure au sol ou sur caillebottis en cages. Les cloisons seront grillagées afin de permettre des contacts physiques, olfactifs, visuels et auditifs entre animaux. Les animaux seront systématiquement hébergés en groupe d'au moins 2 individus. La température, l’hygrométrie et la luminosité de la pièce seront adaptés à l'espèce et au stade physiologique. Des enrichissements (perchoirs, ficelles, blocs à piquer, balles, grelots) seront proposés et renouvelés régulièrement. La contention visera à minimiser le stress. Le bien-être des animaux sera évalué par le personnel en charge des animaux au moins une fois par jour.

Choix des espèces

La contamination à différents niveaux de la filière avicole par la bactérie du genre Salmonella est à l'origine de toxiinfections alimentaires chez l'Homme via la consommation d'oeufs, d'ovoproduits ou de la chair. Afin de réduire le risque de zoonose, il est important de développer de nouveaux vaccins, médicaments ou additifs vétérinaires chez l'espèce cible. La lignée et le stade de développement des animaux utilisés dépendra de la cible du produit testé. En effet, selon les objectifs de l'étude, des poussins d'un jour, des poulets de chair en croissance, des poules pondeuses ou des reproducteurs pourront être utilisés car ils correspondent aux différentes populations ciblées par les vaccins en développement. La première étude visant à renforcer l'immunité vaccinale de poules reproductrices, l'essai sera conduit sur les animaux adultes (12 semaines au moment de la vaccination).

Une injection dans le muscle qui commande le mouvement de l'œil, une autre dans une patte arrière : 40 rats de 24 mois subissent ces deux gestes sous anesthésie générale, avant des injections abdominales quotidiennes pendant deux semaines. Avec 40 rats plus jeunes soumis à quatre prélèvements sanguins en huit heures sur animaux éveillés, 80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs tissus. L'objet est de tester si la forskoline, une molécule végétale repérée en étudiant la résistance des muscles oculaires, améliore la régénération musculaire chez des animaux âgés. Le porteur retient le rat pour sa proximité évolutive avec l'être humain et pour une longévité qu'il juge compatible avec l'étude du vieillissement dans un délai raisonnable.

Objectifs

Dans certaines maladies musculaires graves, comme les dystrophies musculaires, les cellules souches musculaires — responsables de la réparation des fibres — vieillissent trop vite et perdent leur capacité de régénération. Avec l’âge, un phénomène similaire se produit également dans les muscles sains, qui deviennent progressivement moins capables de se réparer. Des recherches récentes menées sur un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne ont montré que la forskoline, une molécule d’origine végétale, peut activer une voie biologique permettant de restaurer partiellement la fonction réparatrice des cellules souches. De façon remarquable, cette substance a été identifiée grâce à l’étude des muscles extra-oculaires (les muscles qui bougent les yeux). Ces muscles sont connus pour être étonnamment résistants, aussi bien au vieillissement qu’aux dystrophies musculaires, suggérant qu’ils disposent de mécanismes naturels de protection. Le présent projet vise donc à comparer les mécanismes de vieillissement normal et ceux liés aux maladies musculaires au niveau des cellules souches, et à tester si la forskoline (ou une molécule analogue) peut également améliorer la régénération musculaire chez des animaux âgés. L’objectif final est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques permettant de préserver la force et la masse musculaire au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables du vieillissement prématuré des cellules souches musculaires. Cette connaissance est essentielle pour développer, à terme, de nouvelles approches pharmacologiques visant à limiter la perte progressive de masse et de force musculaire liée à l’âge. Plus largement, l’étude pourrait mettre en évidence des mécanismes naturels de protection des cellules souches musculaires, en complément de ceux déjà connus et activés par la forskoline. L’identification de tels mécanismes ouvrira la voie à la découverte ou au développement de nouvelles molécules capables de retarder la sénescence des cellules souches et de renforcer la capacité de réparation des muscles.

Procédures

La première moitié des animaux (40 animaux au total, âgés de 2-3 mois) sera traitée une seule fois avec l’une des 4 molécules d’intérêt et le véhicule, via une injection dans la zone abdominale. Des prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés à quatre reprises, réparties sur les 8 heures suivant l’administration des molécules (volume total prélevé de 2 mL). La durée estimée de chaque prélèvement est d’environ 5 minutes par animal. Toutes ces interventions seront effectuées sur des animaux éveillés. La seconde moitié des animaux (40 au total, âgés de 24 mois) sera soumise à une injection dans un muscle d’une patte arrière et d’un œil (dans le muscle que permet le mouvement de l’œil). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 3 minutes par animal au total. Un traitement médicamenteux contre la douleur sera administré par une injection 30 minutes avant de l’injection dans le muscle, puis toutes les 12 h pendant 2 à 3 jours (5 à 6 injections avec la molécule contre la douleur par animal, d’une durée inférieure à une minute chacune). Deux jours plus tard, les animaux — éveillés — seront soumis à des injections quotidiennes dans la zone abdominale (avec le véhicule ou la molécule d’intérêt), chacune durant moins d’une minute. Les animaux seront répartis en deux groupes (20 par groupe) : le premier avec un point de terminaison au jour 6, impliquant 4 injections (jours 2, 3, 4 et 5), et le second avec un point de terminaison au jour 30, impliquant 12 injections (du jour 2 au jour 14 inclus).

Impact sur les animaux

Dans le cas des injections dans la zone abdominale et des prélèvements sanguins répétés, la piqûre de l’aiguille et la contention peuvent provoquer un inconfort passager chez les animaux. Chez les animaux âgés (40 rats, âgés de 24 mois), une sensibilité accrue aux manipulations et aux conditions environnementales est possible, ce qui peut renforcer la gêne ressentie lors des injections. Par ailleurs, les injections dans le muscle (patte arrière et œil) peuvent provoquer une douleur temporaire ainsi qu’un léger malaise ou une gêne passagère dans la mobilité. Ces effets sont généralement transitoires et disparaissent en deux à trois jours, grâce à la mise en œuvre systématique de mesures antidouleur et à un suivi clinique attentif.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Les étapes qui pouvaient être réalisées sans recours aux animaux ont été effectuées en amont de ce projet. Ainsi, l’efficacité des composés a d’abord été testée in vitro. L’innocuité dans un organisme de mammifère a été validée, étape indispensable pour évaluer la toxicité éventuelle des produits administrés ainsi que celle de leurs métabolites issus de la transformation par les organes, en particulier le foie. Sur cette base, ce projet vise à comparer les similitudes et les différences dans le processus de détérioration des cellules souches musculaires entre le vieillissement naturel et la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), en s’appuyant sur les résultats déjà obtenus dans un projet précédent. Cette étude cherche à répondre à une question qui ne peut être abordée qu’in vivo, dans un organisme entier où tous les organes interagissent en permanence : la perte de fonction des cellules souches musculaires observée lors du vieillissement est-elle liée aux mêmes mécanismes que ceux altérés dans un contexte de déficience en dystrophine (comme dans la DMD) ? De plus, la forskoline ou ses analogues conservent-ils leur capacité à stimuler efficacement les cellules souches musculaires et à favoriser la régénération dans un muscle sain mais âgé ?

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, une optimisation préalable du plan expérimental a été réalisée. Les analyses statistiques ont montré qu’un effectif de 8 animaux par groupe était suffisant pour obtenir des résultats fiables dans le cas des animaux jeunes ou adultes. Ce nombre a déjà été validé dans des projets similaires, avec des résultats significatifs. Pour les animaux âgés (plus de 20 mois), un effectif légèrement plus élevé (10 par groupe) est prévu afin de compenser le risque accru de mortalité spontanée. Enfin, les animaux dystrophiques (DMD) ne seront pas inclus dans cette étude, car ils ont déjà été étudiés dans un projet précédent, ce qui permet de réduire davantage le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués hebdomadairement (ou quotidiennement si nécessaire, week-ends et jours fériés inclus) en observant individuellement les animaux. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain, présentant de nombreux aspects anatomiques et physiologiques en commun, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes, ainsi que pour les processus métaboliques. Cette proximité évolutive en fait un modèle très apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis de faire du rat un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent ce type de maladies humaines de manière très fidèle, tout en conservant les atouts propres aux rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’étude des effets à long terme dans un délai raisonnable, en particulier chez les individus âgés.

Pour savoir si les crèmes solaires favorisent le mélanome, 150 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Un mélanome leur est induit par application cutanée répétée de tamoxifène, puis les composés à tester sont appliqués sur la peau pendant deux à vingt-quatre semaines, chaque application précédée d'une tonte sous anesthésie. Les souris portent une collerette et passent des périodes en cage individuelle. Le porteur décrit des papules pigmentées apparaissant en trois à quatre semaines, puis des tumeurs de grande taille et des métastases pulmonaires et ganglionnaires, la mise à mort survenant entre le quarantième et le soixante-quinzième jour pour charge tumorale ou ulcération de la peau.

Objectifs

Le mélanome cutané se situe au 8ème rang des cancers chez l'homme et au 6ème rang chez la femme. C'est une tumeur potentiellement agressive surtout lorsqu'elle est prise à un stade tardif et qui peut donner des métastases mettant en jeu le pronostic vital. L'incidence et la mortalité du mélanome ont augmenté régulièrement au cours des dernières décennies. L'induction du stress oxydatif (SO) par les rayons ultraviolets (UV), en particulier les UVA, par divers mécanismes, est un phénomène bien documenté. Des résultats préliminaires révèlent que les filtres solaires, conçus pour bloquer les rayons UV, peuvent induire indépendamment le SO, in vitro et in vivo. De plus, des données démontrent que les crèmes solaires peuvent induire la réticulation de l'ADN génomique et mitochondrial dans la peau de personnes saines. Il est donc crucial de déterminer si les crèmes solaires sont effectivement capables de générer un SO délétère et de favoriser les lésions de l'ADN, et d'étudier si ces lésions entraînent ensuite une augmentation de l'incidence du mélanome primaire et/ou métastatique dans le modèle murin in vivo. Cette étude pourrait faire progresser significativement nos connaissances et redéfinir les paradigmes entourant la formulation des crèmes solaires et leurs implications biologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’explorer les effets de l’application d’une crème solaire sur le développement de mélanomes cutanés. Ce projet permettra de déterminer si les filtres solaires sont capables de générer le stress oxydatif et favoriser les lésions de l’ADN et par conséquent augmenter l’incidence du mélanome primaire et/ou métastatique dans le modèle murin in vivo. Un total de 6 études environ sera réalisé sur la totalité du projet

Procédures

Le mélanome sera induit chez une partie des souris par application quotidienne (5 minutes) de tamoxifène, (sous anesthésie générale, inférieur à 15 min), pendant au maximum 3 jours. Le nombre de lésions sera enregistré 2 fois par semaine et mesurée 3 fois par semaine à partir de leur apparition (5 min). Les molécules test seront administrées par voie topique aux souris pendant 2 à 24 semaines à une fréquence variable. Les animaux seront pesés un minimum de 2 fois par semaine (< 2 minutes). Les applications topiques seront précédées par une tonte réalisée sous anesthésie pour assurer la reproductibilité (acte d’environ 15 minutes). Les animaux porteront des collerettes et seront hébergés individuellement. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie).

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, des lésions sont attendues aux sites induits chez les animaux recevant un anti-estrogène. Les lésions apparaissent généralement d'abord sous la forme de multiples papules fortement pigmentées avec une latence de 21-28 jours. Ces lésions se développent ensuite en tumeurs de grande taille, de sorte que les animaux porteurs de tumeurs sont généralement euthanasiés entre le jour 40 et le jour 75 après l'induction tumorale, en raison de la charge tumorale ou de l'ulcération de la peau sus-jacente. En plus des lésions mélanocytaires étroitement adjacentes qui sont devenues confluentes avec la progression de la maladie, nous pouvons nous attendre à observer une excroissance de tumeur non pigmentée s'étendant sous les parties superficielles pigmentées. Une telle perte de production de pigment a été décrite pour de nombreux autres modèles de mélanome murin et est en effet souvent observée dans les mélanomes et les naevus humains. Des métastases ganglionnaires et pulmonaires peuvent être détectées à partir de 6 semaines après l'induction tumorale. Chez les souris non traitées par l'anti-estrogène, nous pouvons nous attendre à l’apparition de tumeurs cutanées de manière plus tardive, entre 3 et 6 mois d’âge. Le port de la collerette et l’hébergement individuel pendant une heure peuvent induire un stress de désorientation, transitoire.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des molécules sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Des résultats préliminaires révèlent que les crèmes solaires, conçues pour bloquer les rayons UV, peuvent induire indépendamment le stress oxydatif, in vitro. De plus, des données démontrent que les crèmes solaires peuvent induire la réticulation de l'ADN génomique et mitochondrial dans la peau de personnes saines. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’effet des filtres solaires sur l'incidence du mélanome primaire et/ou métastatique, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou tissus sont impliqués. L’impact réel des filtres solaires devra donc être vérifié in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’Homme. De plus, pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon leur poids. Le nombre de groupes dépendra du nombre de conditions à comparer. Le nombre d’animaux par groupe sera adapté à la question scientifique et variera entre 6 et 8 10 par groupe. Le nombre d’animaux par groupe est choisi de sorte qu’il soit possible à l’issu de l’étude de faire des conclusions statistiquement significatives.

Raffinement

L’apparition de lésions cutanées sera enregistrée au moins deux fois par semaine et chaque lésion sera mesurée trois fois par semaine dès son apparition. Pour les études de tolérance, les animaux seront pesés quotidiennement pendant 7 jours puis au minimum 2 fois par semaine voire quotidiennement si nécessaire. Pour toute autre étude, les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine voire quotidiennement si nécessaire. Le poids constituant un point limite sera adapté au modèle. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages dès un seuil de perte de poids défini sur certains animaux. Les administrations topiques seront réalisées sous anesthésie. Le port d’une collerette avec hébergement individuel sera nécessaire. Une période d’acclimatation au port de la collerette sera réalisée et un enrichissement supplémentaire sera fourni (deuxième élément de nidification et aliment humidifié). Si nécessaire, un nettoyage quotidien des yeux avec une compresse imbibée de sérum physiologique stérile palliera le manque de toilettage imposé par le port de la collerette. Les produits tests seront administrés par voie topique sur la peau du dos des animaux, préalablement tondus sur une surface ne devant pas excéder les limites autorisées. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et de la procédure sont prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de la maladie et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). De plus, les modèles de mélanome sont bien documentés chez la souris. Des souris de 4-8 semaines seront utilisées, le modèle de mélanome induit étant bien décrit chez des animaux de cet âge pour observer l’apparition spontanée des lésions cutanées.

Les souris utilisées portent une ostéogenèse imparfaite, la maladie des os de verre, et s'exposent donc à des fractures spontanées accompagnées de douleurs modérées. 800 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant onze injections et deux radiographies sous anesthésie. Le médicament testé vise à corriger la petite taille associée à la maladie, que les bisphosphonates prescrits aux patients ne traitent pas. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'étudier la croissance dans un "organisme entier", et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

L'ostéogenèse imparfaite, ou « maladie des os de verre », est une maladie génétique rare caractérisée par une fragilité osseuse. Les personnes atteintes se fracturent des os facilement tout au long de leur vie. Cette fragilité osseuse est due à l'anomalie d'une protéine essentielle à la structure des os. Quand cette protéine est défectueuse, les os deviennent plus fragiles et moins résistants aux chocs. Les personnes atteintes sont souvent de plus petite taille que la moyenne, et mesurent entre 92 et 108 cm à l'âge adulte. Les causes de cette petite taille ne sont toutefois pas encore comprises. Pour traiter cette maladie, la plupart des patients reçoivent des médicaments appelés bisphosphonates. Ces médicaments aident à limiter les fractures en réduisant la perte osseuse. Cependant, ils ne favorisent pas la croissance des os ni leur bonne qualité. De plus, environ 20 % des patients ne réagissent pas à ce traitement. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements qui favorisent la croissance et la solidité des os. Ce projet vise à tester un nouveau médicament sur des souris atteintes d’ostéogenèse imparfaite, afin de déterminer s’il améliore la croissance des os, en particulier dans la zone responsable de l’allongement des os longs. Parallèlement, l’étude portera sur l’évolution du cartilage dans cette zone afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de la petite taille observée chez les personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont au nombre de deux : - mettre en évidence un traitement permettant de corriger la petite taille observée chez les patients atteints d'ostéogénèse imparfaite - comprendre comment la plaque de croissance est altérée suite à une anomalie de la protéine

Procédures

Contention et injection : 5 secondes, 11 fois/souris. Radiographie : 5 minutes, 2 fois/souris.

Impact sur les animaux

- La contention peut causer un stress léger de courte durée - Injections causent un stress léger et une douleur légère de courte durée - Risque de fractures spontanées avec douleurs modérés dû à la pathologie.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever leurs organes et de les étudier.

Remplacement

La croissance est un phénomène dynamique impliquant plusieurs types cellulaires. Or, à ce jour, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la croissance dans son ensemble. Il est donc impératif d'étudier ce processus au sein d'un organisme entier afin d'étudier les communications entre ces différentes cellules, plutôt que de se limiter à l’étude d’un seul type cellulaire.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les radiographies et les injections seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter tout stress supplémentaire pour l'animal. Des points limites spécifiques ont été définis. Toutefois, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La croissance chez la souris est très similaire de celle chez l'homme. Le mécanisme de croissance est un processus dynamique faisant intervenir plusieurs types cellulaires et donc il est indispensable de pouvoir l'étudier dans un organisme entier. Les analyses seront réalisées à deux âges clés : à 5 semaines, correspondant à la fin de l’enfance chez l’être humain, à 11 semaines, correspondant à la fin de l’adolescence et donc à la fin de la croissance. Certaines souris seront étudiées à différents moments de la formation de la plaque de croissance, afin de mieux comprendre son développement et son rôle dans la croissance osseuse.

Opérées trois fois sous anesthésie, une à deux heures par intervention, puis maintenues la tête contenue pendant environ deux heures pour une tâche perceptuelle, 946 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent douze injections sous-cutanées et une séance de trente minutes évaluant leurs capacités pré-attentionnelles. Les animaux utilisés appartiennent à une lignée à haut risque de schizophrénie, retenue pour observer comment les neurones des régions auditives échangent des informations. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d’exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. Nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement des neurones, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de schizophrénie. Cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre les fonctions de régions cérébrales clés de la perception auditive chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles souris transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre ces structures permettra d’appréhender les processus de perception et de prédiction, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles ces processus sont altérés. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Procédures

Chirurgie : 3 fois, 1h à 2h. Etude des capacités pré-attentionnelles : 1 fois, 30min. Contention pendant tâche perceptuelle : 1 fois, environ 2h. Injection sous-cutanée : 1 injection, durée 5 secondes, 12 fois. Injection intra-péritonéale : 1 injection, durée 5 secondes, 1 fois.

Impact sur les animaux

L’anesthésie peut entraîner du stress léger de courte durée. Les injections d’anesthésiques et d’analgésiques peuvent entraîner un stress et une douleur légère de courte durée. Une douleur modérée peut être associée à l’acte chirurgical. L’étude du comportement et la contention par la tête peuvent entraîner un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles complexes et comportementales sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.

Raffinement

L’état de santé des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroulent dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de sérum physiologique. La chirurgie se déroule sous anesthésie générale et des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués à leur manipulation afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'exploration des mécanismes de la perception car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les expériences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 7 et 17 semaines car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.

Créées in utero par électroporation d'embryons au douzième jour de gestation, les tumeurs sont ensuite greffées par stéréotaxie dans le cerveau de souris adultes. 2 775 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour conserver et analyser les tissus tumoraux. Les femelles gestantes subissent une ouverture de la paroi abdominale de trente minutes, et le porteur décrit chez les porteuses de tumeur une ataxie, une perte d'appétit, une prostration et un gonflement possible de la boîte crânienne par hausse de la pression intracrânienne. Au titre de la réduction, il indique réutiliser les mêmes femelles pour les chirurgies et la reproduction jusqu'à leurs huit mois.

Objectifs

Ce projet vise à développer de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées pour l'étude du Gliome Diffus de la Ligne Médiane, une tumeur cérébrale pédiatrique rare et incurable. En améliorant nos modèles précédents pour qu'ils possèdent des défenses naturelles (système immunitaire) réalistes, nous pourrons évaluer des stratégies innovantes basées sur l'immunothérapie. L'objectif final est de reproduire fidèlement cette maladie dévastatrice afin de comprendre les étapes précoces de la formation du cancer et de tester des traitements qui renforcent la réponse du corps pour enfin éradiquer la tumeur.

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de Gliome Diffus de la Ligne Médiane permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales. L’induction de modification menant à des tumeurs dans des animaux ayant un système immunitaire compétant permettra l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques, en prenant en compte l’environnement immunitaire de tumeurs, et tester ainsi des approches immuno-oncologiques (immunothérapie, médicaments immuno-modulateurs, stratégies vaccinales…).

Procédures

Les femelles gestantes seront soumises à une intervention chirurgicale telle qu’une ouverture de la paroi abdominale (pour une durée de 30 minutes), précédés d’injections d’analgésiques et anesthésiques. Les embryons quant à eux auront 1 injections ainsi que l’utilisation d’électrodes induisant un faible champ électrique (de moins d’une minute). Ces futures tumeurs seront par la suite greffées dans des souris adultes, par stéréotaxie (sous anesthésie générale, avec une injection unique dans le cerveau d’une durée de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux et à la chirurgie. On pourra observer des symptômes neurologiques modérés qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie). On pourra également observer une perte d'appétit et donc perte de poids modérée, légère prostration des animaux, légère perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut également entraîner un gonflement modéré de la boite crânienne. Ces symptômes peuvent apparaître très progressivement et durer au maximum 1 semaine.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour conservation et analyse de tissus tumoraux post-mortem.

Remplacement

Ces tumeurs du cerveau central sont uniques car elles s'infiltrent partout. Pour trouver un traitement, il faut travailler sur des modèles animaux vivants afin de comprendre leur progression dans un environnement complexe et réaliste. Ces modèles sont vitaux, car le cerveau est protégé par une barrière naturelle, appelé la barrière hématoencéphalique, qui bloque la majorité des médicaments. Tester des traitements sur ces modèles nous permet de vérifier s'ils peuvent franchir cette barrière. Avant cela, nous affinons les doses en laboratoire, sur des traitements de cellule pour garantir leur sécurité. Enfin, ces modèles vivants sont notre seule façon d'étudier pleinement comment les défenses immunitaires peuvent être mobilisées contre la maladie.

Réduction

Le projet utilise une technique d'imagerie appelée bioluminescence pour suivre l'évolution des tumeurs chez les souris sans avoir besoin de les euthanasier. Cette méthode est cruciale car elle permet de diminuer grandement le nombre d'animaux utilisés pour la recherche et de mieux anticiper et gérer la souffrance des souris. De plus, pour réduire davantage le nombre de souris, l'équipe réutilise les femelles pour les chirurgies et la reproduction jusqu'à ce qu’à 8 mois de vie.

Raffinement

Nous appliquons des protocoles rigoureux pour garantir le confort des souris. Cela comprend l'anesthésie générale pour toute procédure, l'administration systématique d'anti-douleur avant, pendant et après la chirurgie, le maintien de leur température et de leur hydratation, et des mesures d'hygiène strictes. Pour les souris malades, nous assurons une surveillance quotidienne (poids et observation) et appliquons des règles très strictes (appelées points limites) pour arrêter immédiatement l'étude si une souffrance est détectée, afin de la minimiser au maximum.

Choix des espèces

L'utilisation de souris ayant un système immunitaire est ici essentielle pour la poursuite de ce projet. De plus, ce modèle, déjà établi, a été réalisé chez la souris. Des femelles âgés de minimum 7 semaines seront mises en accouplement, ce qui correspond à l’âge du jeune adulte possédant les meilleures capacités de reproduction et ceci jusqu’à la limite de leurs capacités de reproduction, à partir de 8 mois. Les embryons seront injectés au jour embryonnaire 12.5-13.5, ce qui représente la fenêtre de développement durant laquelle les potentielles cellules progénitrices de ces tumeurs se développent. Lors de la greffe, les souris seront agées de 6 semaines au minimum.