Recherche appliquée

Les souris de ce projet portent une mutation qui les rend profondément sourdes et leur donne un trouble vestibulaire : elles tournent en rond et présentent une activité motrice anormalement élevée. 956 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés. Sous anesthésie, elles reçoivent des électrodes sous la peau pour trente minutes d'enregistrement auditif, une incision fine pour l'injection d'un virus dans la cochlée, et une biopsie de quelques secondes. Le raffinement annoncé tient en trois mesures, anesthésie pour les tests auditifs, tatouage des phalanges et nourriture posée dans la litière, quand les bénéfices avancés s'ouvrent sur le milliard et demi de personnes touchées par un déficit auditif dans le monde.

Objectifs

Les cellules sensorielles auditives sont surmontées d’une touffe ciliaire constituée de stéréocils dans lesquels se produit la transmission du signal sonore. Le dysfonctionnement de cette transmission du signal sonore cause une perte auditive sévère. Certains composants responsables de cette transmission ont déjà été identifié. Toutefois, la régulation du fonctionnement de ces composants n’est toujours pas investie. Le projet porte sur une protéine qui fait partie de ce complexe. L’absence de cette protéine cause une surdité profonde d’origine congénitale et héréditaire. La protéine d’intérêt est très particulière dans sa fonction du fait qu’elle est la seule à interagir avec tous les composants de la machinerie de transmission du signal. Il a récemment été montré, que cette protéine pourrait subir une modification dont les conséquences restent encore inconnues. D’ailleurs, dans d'autres systèmes biologiques cette même modification pourrait jouer un rôle important dans la régulation des propriétés des complexes protéiques et dans leur transport au sein de la cellule. Les différents modèles de souris qui miment les mutations chez l’homme, reproduisent le phénotype humain et causent la surdité. Ainsi, nous envisageons par thérapie génique de restituer l’audition chez les souris mutantes pour la protéine d’intérêt. Également nous allons essayer de comprendre l'impact de cette modification sur son transport au sein de l'organisme et dans la régulation de son activité au sein du complexe de transmission du son. Nous souhaitons aussi identifier les protéines qui catalysent cette modification.

Bénéfices attendus

Les surdités sont un problème majeur de santé publique. On estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. 1- Proposer une opportunité pour soigner une forme héréditaire de surdité par thérapie génique. 2- Comprendre le rôle d’une modification dans la régulation du complexe de transmission du son. 3- Déchiffrer le code protéique qui régule cette modification. Cette modification pourrait être une cible thérapeutique pour restaurer ou corriger une perte des seuils auditifs.

Procédures

Disposition d’élétrode en sous-cutanée sur animal anésthésié pour un enregistrement qui dure 30 minutes. Une incision cutanée très fine lors de l’injection au niveau de la cochlée sur animal anésthésié. Acte de Biopsie: geste qui dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris manifestent un trouble vestibulaire en plus de la surdité. Ils ont donc une activité motrice plus élevée que la normale. Les souris tournent en rond assez souvent. Afin d’injecter les virus, nous allons réaliser une incision très fine. Cette procédure peut provoquer une douleur légère malgré que les souriceaux soient endormis. Aussi, cette procédure et malgré la désinfection cutanée, pourrait causer une infection locale. Également, suite à l’acte de Biopsie, on pourrait avoir une infection locale. Les infections sont des risques rares aussi bien dans la pratique de la biopsie que l'incision lors de l'injection du virus.

Devenir

Pour effectuer le prélèvement des organes et réaliser les expériences, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Pour réaliser cette étude il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale car on ne sait pas mettre en culture les systèmes auditifs. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

- Les 2 oreilles de chaque souris seront utilisées systématiquement afin de ne pas doubler le nombre d’animaux. - Le sexe n’est pas pris en compte dans cette étude car il n’intervient pas jusqu’à preuve du contraire dans l’audition. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles dans notre étude.

Raffinement

Réduction de la douleur, souffrance & l’angoisse (raffinement) - Pour les tests auditifs, les animaux seront anesthésiés. - Les animaux seront marqués par tatouage au niveau des phalanges. - Les animaux présentent un trouble vestibulaire de ce fait on leur propose la nourriture dans leur litière.

Choix des espèces

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficit auditif chez la souris et l’architecture de la cochlée du rongeur est similaire à celle de l’homme ce qui permet d’étudier chez ces animaux le mécanisme de l’audition humaine. Pour restaurer l’audition de ces souris et comprendre l’impact des mutations étudiées, nous devons connaître la localisation exacte de la protéine d’intérêt dans son état sauvage et une fois mutée dans l’oreille interne à différents stades (embryonnaire, au cours du développement et adultes). Nous devons mesurer les courants produits par la transmission du son pour se rendre compte de la fonctionnalité des cellules de l’oreille interne.

230 poulets de deux lignées de pondeuses vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sept jours après l'inoculation. Chacun reçoit par gavage soit le parasite Eimeria tenella, soit une suspension de microbiote prélevée sur une lignée résistante, et subit un prélèvement de duvet sous contention. La mise à mort sert à récupérer les parasites multipliés dans l'intestin et à caractériser la réponse immunitaire, l'enjeu affiché étant les pertes économiques que la coccidiose cause aux élevages. Le porteur écrit que la dose inoculée ne provoque ni morbidité ni signes proches du point limite, alors que le projet repose sur la comparaison de lésions intestinales plus ou moins sévères entre lignées.

Objectifs

La coccidiose aviaire conduit à de fortes pertes économiques. Cette maladie est causée par des parasites intestinaux. L’espèce la plus pathogène conduit à des lésions plus ou moins sévères au niveau caecal. Au laboratoire, nous avons mis en évidence l’importance de la présence du microbiote sur le développement du parasite. De plus, nous avons montré qu’à charge équivalente, la pathologie est plus sévère avec notamment des lésions caecales, une réponse inflammatoire et une perte d’intégrité intestinale plus fortes chez les animaux avec microbiote par rapport à des animaux sans microbiote. Ces données suggèrent que le microbiote joue un rôle dans la physiopathologie de l’infection. Suivant la génétique de l’animal, la sévérité de la pathologie est variable, certains poulets étant plus résistants à la pathologie liée à cette infection en comparaison à d’autres lignées. Chez la poule, les travaux actuels ont montré que la composition du microbiote peut être variable en termes de composition et abondances selon la lignée génétique, pour des animaux élevés dans les mêmes conditions. La composition du microbiote des poulets résistants n’a jamais été explorée. Nous émettons l’hypothèse que ces animaux pourraient présenter une composition en microbiote très différente des autres lignées élevées dans le même environnement, ceci pouvant être relié à la pression génétique de l’animal. Cette lignée résistante présente une génétique et des phénotypes très distincts de ceux des lignées de poule exploitées en production, et l’hypothèse que son microbiote intestinal diffère également est vraisemblable, dans la mesure où génétique et microbiote influent conjointement l’expression des phénotypes de l’hôte considéré comme holobionte. Les microbes présents dans cette lignée plus résistante, sous l’influence de sa génétique bien spécifique, pourraient jouer un rôle protecteur sur la physiopathologie de cette infection. Moduler le microbiote pourrait alors constituer un levier intéressant pour prévenir le développement de pathologies trop sévères associées à une morbidité et mortalité élevées.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est que les animaux recevant le microbiote des Fayoumi résistent mieux à l’infection et présentent par conséquent moins de pertes zootechniques, moins de lésions, moins d’inflammation, moins développement parasitaire.

Procédures

Inoculation orale par gavage de l'inoculum ou suspension de microbiote par animal (1 fois et environ 5 min contention comprise). Prélèvement du duvet par poussin (1 fois et environ 2 min contention comprise).

Impact sur les animaux

L’administration orale est un acte désagréable pour l’animal et peut également engendrer du stress. La contention peut également engendrer un stress. Ces deux actes sont de courte durée (1-2 minutes maximum). L’infection peut créer des signes cliniques. Cependant, la dose inoculée ne cause pas de morbidité et n’induit pas de signes cliniques proche du point limite. Si toutefois, il y avait des effets indésirables, ce serait en fin d’expérimentation.

Devenir

Tous les poulets inoculés seront mis à mort 7 jours après l’inoculation pour récupérer les parasites qui se sont multipliés dans la lumière intestinale afin vérifier la protection du microbiote contre l'infection à E. tenella et la caractérisation de la réponse immunitaire induite.

Remplacement

L’étude de l’influence du microbiote sur la physiopathologie de l’infection par ce parasite nécessitent des expérimentations in vivo pour lesquelles des analyses des paramètres zootechniques, parasitaires, inflammatoires, biochimiques, et du microbiote intestinal seront réalisées. De plus, le parasite ne fait pas un cycle complet in vitro.

Réduction

Les effectifs sont basés sur les études du laboratoire et de la littérature portant sur les scores lésionnels lors d’essais d’alternatives naturelles aux anticoccidiens et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe avec trois groupes pour avoir une différence significative pour un test statistique non paramétrique. Ces effectifs sont suffisants pour les analyses microbiotes prévues.

Raffinement

Hébergement : Les animaux seront placés en groupe social sur une litière dans laquelle les poules pourront picorer. Les poulets disposeront d’un enrichissement social et comportemental. Dans les box, du bolduc sera suspendu pour permettre aux animaux de piquer dedans. Les animaux se perchant spontanément, des perchoirs seront installés. Ils constituent un enrichissement qui fait partie du comportement naturel. Limitation des nuisances sur le bien-être animal : Evaluation de l’état de santé des animaux deux fois par jour par le personnel de la plateforme expérimentale afin de surveiller l’apparition des premiers symptômes liés à la maladie : plumes ébouriffées, prostration. Si atteinte du point limite : euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient ces parasites. Deux lignées de poules pondeuses seront utilisés dans l’étude pour être dans les conditions les plus proches de celles des élevages industriels, et auront un statut sanitaire propre.

Soumises à une ou deux injections d'une substance qui déclenche une réaction inflammatoire, puis à un prélèvement de sang terminal sous anesthésie, 1 720 souris vont toutes être tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La substance peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine et des dysfonctionnements rénaux et hépatiques, le geste d'injection pouvant lui-même provoquer ulcération, induration et crampes abdominales. L'objet déclaré est de montrer que des candidats médicaments développés au laboratoire bloquent le récepteur TLR4, en vue de traiter des maladies inflammatoires chroniques comme celles de l'intestin ou de la peau. Le porteur indique que ces candidats ont été testés au préalable sur des cellules pour s'assurer de leur non-toxicité, puis reconnaît ne pas pouvoir exclure une toxicité chez la souris, ces travaux étant les premiers menés sur des animaux.

Objectifs

L’inflammation est une réponse de l’organisme face à une menace d’origine exterieure ou intérieure. Il s’agit d’une réaction transitoire mais peut dans certains cas, durer des mois ou des années et donner lieu à une inflammation dit chronique. Dans le cas des maladies inflammatoires dites chroniques, la balance entre l’inflammation et la reconstitution d’une équilibre immunologique est perturbée et peut conduire à des réactions disproportionées de l’organisme. Les traitements actuels sont insuffisants ou inexistants dans certains cas, ce qui rend difficile la prise en charge des patients et impacte leur qualité de vie. De nouvelles cibles sont en cours d’étude pour agir sur la réponse inflammatoire exagérée liée à l’activation de l’inflammation via les facteurs microbiens ou endogènes. Il a été montré que le récépteur TLR4 est impliqué dans le déclenchement de la réponse inflammatoire et au développement de ces maladies inflammatoires chroniques. Les études menées dans le cadre de ce projet s’appuyent sur le ciblage et l’interaction de ce récepteur avec les candidats médicaments développés dans notre laboratoire pour leur effet anti-inflammatoire. Ce projet repose sur deux objectifs. Le premier objectif est de reproduire chez l’animal un contexte inflammatoire similaire à ce qu’il se passe chez l’homme. L’inflammation est induite chez la souris par l’administration d’un produit qui va agir spécifiquement sur ce récepteur TLR4 et déclencher ainsi une réponse inflammatoire. Le second objectif est de démontrer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments administrés chez ce même animal pour lequel l’inflammation a été provoquée. Les candidats médicaments vont reconnaitre spécifiquement le récepteur comme cible sur laquelle agir. L’interaction entre le candidat et la cible permettra de bloquer la réponse inflammatoire et inhiber ainsi les symptômes qui y sont liés. La finalité de ce projet est de démontrer l’efficacité de candidats médicaments ayant une action anti-inflammatoire afin de proposer un nouveau traitement et améliorer la prise en charge des patients atteints de ces maladies inflammatoires chroniques telles que Crohn, Alzheimer, maladies inflammatoires de la peau. Les modifications dans les voies d'administration et de prélèvement nécessitent une modification du projet initial sans ajout d’animaux.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels permettent de soulager les symptômes mais ne permettent pas de traiter l’origine de la maladie. Démontrer l’efficacité de ces candidats médicaments nous permettrait de proposer un traitement de fond avec une nouvelle stratégie qui se focalise davantage sur les mécanismes qui favorisent l’inflammation que sur les symptômes uniquement. Ce nouveau médicament pourrait être envisagé seul ou en combinaison avec d’autres traitement existants pour améliorer le potentiel thérapeutique et assurer une meilleur prise en charge et qualité de vie des patients sur le long terme. De plus l’utilisation de ce médicament pourrait être envisagée dans différentes applications cliniques car le mécanisme ciblé dans ce projet provoquant le développement de la réponse inflammatoire, se retrouve dans beaucoup de maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux injections de substance espacées d'une minute à minima. Les animaux resteront vigiles ou seront anesthésiés selon le mode d’administration (modification) utilisé. Un prélèvement de sang terminal (modification) est prévu chez tous les animaux et sera effectué sur animal anesthésié. Cette intervention durera cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les candidats médicaments ont été testés au préalable sur des cellules pour s’assurer de la non toxicité de ces produits et de leur efficacité pour bloquer la réponse inflammatoire. Cependant il s’agit de premières études menées chez les animaux et nous ne pouvons exclure le fait que ces candidats puissent entraîner une toxicité chez l’animal au moment de l’injection se traduisant par les symptômes cutanés suivants : irritation, démangeaison, gonflement ou rougeur passagère. Des nuisances dues au geste technique au moment de l’injection sont également à prendre en compte : ulcération, induration, crampes abdominales. La substance inflammatoire peut entraîner une perte de poids, une baisse de la pression sanguine ainsi que des dysfonctionnements rénaux et hépatiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses post-mortem.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés au préalable sur des cellules avant de lancer des études chez l’animal pour vérifier la non toxicité et les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Néanmoins, aucune méthode de remplacement ne permet de reproduire la réponse inflammatoire à l’échelle de l’organisme. La réponse inflammatoire entraîne la libération de molécules qui vont diffuser à travers la circulation jusqu’à atteindre différents organes et provoquer des lésions notamment au niveau du foie, reins, thymus, rate, poumons. Ces interactions ne peuvent pas être modélisées par une méthode alternative et nécessitent de réaliser des études chez l’animal sur lequel on a reproduit la réaction inflammatoire afin d’obtenir des symptômes similaires.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour collecter suffisamment de données qui seront analysées à l’aide d’outils statistiques permettant de répondre aux hypothèses et objectifs scientifiques définis dans ce projet. Cette estimation a été déterminée à partir d’études décrites dans la littérature scientifique ayant déjà utilisées ce modèle d’étude. Néanmoins les paramètres expérimentaux utilisés pour mettre en place le modèle sont variables d’une étude à l’autre. Nous avons donc envisagé une étude pilote pour déterminer les conditions expérimentales optimales afin d’obtenir un modèle d’étude stable sur lequel s’appuyer pour évaluer les propriétés anti-inflammatoires de nos candidats médicaments. Dans cette étude, nous étudierons la réponse inflammatoire au cours du temps et selon la dose de substance inflammatoire injectée. Le nombre d’animaux est défini selon deux critères : la dose et le temps. 4 doses et cinq points de temps ont été déterminés à partir de données issues de la littérature. Suite à cette étude pilote, le modèle sera reproduit pour évaluer le potentiel thérapeutique anti-inflammatoire des candidats médicaments. Le nombre d'animaux a été estimé selon les groupes nécessaires à la réalisation de l’étude. Ces groupes sont définis selon le type de candidats et la dose à laquelle ils seront administrés. Les candidats seront évalués selon 4 doses chacun. Les résultats attendus à l’issue de ces études sont une atténuation de la réponse inflammatoire et une amélioration des symptômes chez l’animal. Ce projet prévoit une répartition équivalente de mâles et de femelles dans chaque groupe pour vérifier un effet sexe potentiel sur la réponse inflammatoire.

Raffinement

L’environnement des animaux sera enrichi de coton, d'abris et d’objet afin de subvenir au bien-être animal. Une période d’acclimatation de deux semaines est prévue à l’arrivée des animaux incluant une phase d’habituation à la contention pour limiter le stress de l’animal avant une injection. Le recours à une anesthésie préalable pourra être réalisée selon le mode d'administration utilisé. Un suivi quotidien sera effectué pour évaluer l’état de l’animal et l’apparition d’effets indésirables. Une grille d’évaluation basée sur ces observations permettra si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal.

Choix des espèces

La souris utilisée dans le cadre de ce projet est une espèce particulièrement adaptée au développement du modèle inflammatoire aigu, notamment dans la phase précoce. Cette réponse inflammatoire se traduit par des phénomènes physiologiques similaires à ceux observés lors de la phase inflammatoire induite après une infection chez l’homme : taux élevé et précoce de cytokines pro-inflammatoires, baisse de la pression sanguine, modification de la fréquence cardiaque, et dysfonctionnements des organes périphériques. Les phénomènes physiologiques observés chez la souris sont autant d’indicateurs pour corréler les bénéfices obtenus chez l’animal à ceux que l’on pourrait obtenir chez l’homme. Cette espèce permet de développer un modèle efficace dans la phase précoce de l’inflammation et de le proposer comme un outil permettant d’évaluer les propriétés anti-inflammatoires des candidats médicaments. Il s’agira de souris adulte afin d’inclure dans ce projet des animaux possédant un système immunitaire mature.

Enregistrer une enzyme détoxifiante auprès des autorités suppose de montrer qu'elle réduit la mycotoxine dans les reins et le sérum des poissons : 260 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour caler la dose détectable avant l'étude proprement dite. Pendant soixante-dix jours, elles reçoivent un aliment additionné d'ochratoxine A, sont sorties de l'eau sept fois pour la pesée, puis subissent une prise de sang à la veine caudale suivie d'une mise à mort immédiate, le volume prélevé dépassant 10 % de leur volume sanguin. Le porteur indique que la mycotoxine peut provoquer une perte de poids, un refus de s'alimenter, un gonflement du ventre et une inflammation de l'anus. Il précise l'intérêt de l'opération, enregistrer l'enzyme chez les salmonidés en même temps que chez les espèces terrestres au moyen d'une seule étude au lieu de quatre.

Objectifs

Les aliments pour l’aquaculture ont évolué vers une réduction conséquente des protéines d’origine animale, compensée par l’utilisation de plus en plus importante de substituts d’origine végétale pouvant être potentiellement contaminés par les mycotoxines. Lorsqu’elles sont présentes en trop grande quantité dans l'alimentation des animaux, une fois ingérées par l’animal, elles peuvent s'avérer toxiques, notamment chez les poissons d’élevage et peuvent avoir des conséquences sur leur santé et leurs performances et affecter ainsi la rentabilité économique des élevages. Parmi les centaines de mycotoxines connues, l’ochratoxine A est l’une des plus préoccupante rencontrées en aquaculture car elle s’accumule principalement dans les reins et dans une moindre mesure dans le foie, les muscles et la graisse des poissons. Bien que l'ochratoxine A soit un contaminant connu dans les aliments pour poissons, son effet sur la santé des poissons reste plutôt inconnu avec des données limitées sur la cinétique de toxicité, les effets variant en fonction de la concentration et des espèces de poissons qui l’ingère. La prévention des risques induits par les mycotoxines inclut des stratégies pré et post récoltes souvent classées en physiques, chimiques et biologiques. Une des stratégies de prévention contre les mycotoxines est l’utilisation d’additifs fixateurs de toxines pouvant être ajoutés à l’aliment afin de réduire l’absorption intestinale des toxines en les liant ou en les transformant. Les enzymes constituent un fixateur de toxines permettant de transformer les mycotoxines en composés moins toxiques conduisant à une amélioration des performances des animaux. #Cependant l’ enregistrement d'une solution enzymatique pour la détoxification de la toxine, nécessitera de pouvoir détecter la toxine dans les reins et le sérum et de montrer une réduction de la toxine avec l’ajout de l’enzyme. Ce projet consiste à réaliser un pré-test pour déterminer la dose de toxine analytiquement détectable dans les reins et le sérum sanguin chez les salmonidés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de 1/ déterminer la plage de concentration dans laquelle les effets non létaux dus à l’exposition à la mycotoxine peuvent être détecté, 2/ d’identifier les matrices biologiques pertinentes permettant de quantifier les effets de la mycotoxine rajouté à l’aliment, #3/définir sur la base des résultats obtenus les conditions expérimentales adéquates pour développer une stratégie de détoxification de l’ochratoxine chez les poissons et enregistrer l’enzyme chez les salmonidés en même temps que chez les espèces terrestres au moyen d’une seule étude au lieu de quatre#.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 70 jours. Sorties hors de l’eau pour la pesée des poissons par groupe (7 fois en trois mois, moins de 30 secondes) Prises de sang unitaires au niveau de la veine caudale (durée 30 secondes). Un volume sanguin supérieur à 10% du volume sanguin circulant sera prélevé car les poissons seront immédiatement euthanasiés (durée 1 seconde).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels et supplémenté en mycotoxine pendant 70 jours. La mycotoxine peut exercer une influence sur la santé et la qualité de vie des animaux caractérisés par une perte de poids, une diminution du facteur de condition corporel du poisson, un refus de s’alimenter, changements d’apparence (gonflements du ventre, inflammation de l’anus). Stress dus à la capture et à la sortie des bassins pour la pesée. Douleur transitoire à l’endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques.

Remplacement

Au moment de la délivrance de cette autorisation de projet, il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de reproduire les conditions du tube digestif et les différences entre les espèces animales et leur métabolisme pour démontrer pleinement l'efficacité dans des conditions pratiques. De plus, le développement d’un additif alimentaire correcteur implique de connaitre le mode d’action de la mycotoxine chez l’animal auquel il est destiné. La procédure est nécessaire pour déterminer la plage de concentration dans laquelle les effets non létaux dus à l’exposition à l’ochratoxine peuvent être détecté et identifier les matrices biologiques pertinentes permettant de quantifier les effets de la mycotoxine rajouté à l’aliment.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et répondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins sont réduits par une manipulation délicate des animaux. Les conditions expérimentales sont également raffinées par un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour faire reposer l’animal sur un support de contention adapté, d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle pour les poissons d’eau froide. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car il est taxonomiquement proche du saumon et de physiologie comparable. Les fonctionnalités nutritionnelles sont les mêmes ainsi que les besoins nutritionnels. Par conséquent, la réponse physiologique de la truite au cours de l'étude sera la même que celle des autres salmonidés, les résultats pourront donc être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée. Au début de l’étude les truites pèseront 110 g. Elles seront élevées pendant 12 semaines, pour atteindre un poids final supérieur à 400 g.

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

Valider chez la souris trente-deux combinaisons de médicaments déjà testées sur cellules leucémiques humaines, en vue d'essais cliniques: 1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées quatre-vingt-dix secondes, greffées par voie intraveineuse avec des cellules de leucémie aiguë myéloïde prélevées chez des patients, saignées à la joue chaque semaine et ponctionnées au fémur jusqu'à six fois sous anesthésie. La maladie ainsi installée peut provoquer une perte de poids importante, une déshydratation, une hypothermie et des changements de comportement, avant des traitements administrés par voie orale ou abdominale pendant deux à quatre semaines. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'obtenir des preuves d'efficacité chez des animaux vivants, et justifie ses effectifs par les seules études antérieures du laboratoire.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est un type de cancer du sang où des cellules se multiplient rapidement et ne fonctionnent pas correctement. Ces cellules se retrouvent dans la moelle osseuse et dans le sang, ce qui empêche le sang d’accomplir ses fonctions normales. Le taux de survie à 5 ans pour les personnes atteintes de LAM est faible. Les cellules de LAM présentent souvent plusieurs altérations génétiques qui influencent leur développement et l’évolution de la maladie Ces modifications génétiques persistent tout au long de la maladie, ce qui permet à certaines cellules de survivre au traitement et de provoquer des rechutes. Pour traiter cette situation, des médicaments ont été développés pour bloquer l’expansion des cellules leucémiques. Des essais cliniques ont montré que ces traitements peuvent réduire le nombre de cellules leucémiques ayant ces altérations et améliorer la réponse au traitement. Cependant, d’autres modifications génétiques peuvent rendre ces cellules résistantes aux médicaments, et de nouvelles altérations peuvent apparaître au fil du temps, rendant le traitement moins efficace. Dans ce projet, nous cherchons à tester de nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison avec ceux existants, pour surmonter la résistance aux traitements actuels. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés sur plusieurs types de cellules leucémiques de patients, et certains médicaments ont montré des résultats prometteurs. Cependant, pour vérifier si ces traitements sont efficaces et sûrs, il est nécessaire de les tester sur des modèles vivants de souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients, permettent de recréer les conditions réelles de la maladie en transplantant les cellules leucémiques de patients dans des souris. Ils sont très utiles car ils reflètent bien la diversité des tumeurs humaines, ce qui nous permet de tester les médicaments dans des conditions proches de celles des patients. En résumé, l’objectif de ce projet est de valider les résultats obtenus en laboratoire en les testant sur des modèles vivants afin de pouvoir envisager leur utilisation dans des essais cliniques chez l’homme.

Bénéfices attendus

Nos travaux visent à tester un nouveau traitement, ayant des résultats prometteurs sur culture de cellules cancéreuses dans des modèles de souris avant de le tester chez l’homme. L’objectif est de trouver une stratégie efficace et bien tolérée, afin d'améliorer le pronostic des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde..

Procédures

Pour la mise en place du modème d'étude, un groupe d’animaux sera irradié (durée 90s) pour favoriser la prise de greffe, puis les cellules cancéreuses humaines seront injectées (3 à 6h plus tard) par voie intraveineuse (veine de la queue; durée: 2 min sur souris éveillées). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue seront réalisés chaque semaine (durée: 1 min) et un prélèvement de moelle osseuse au niveau du fémur sera effectué toutes les deux semaines sous anesthésie (durée: 5 min; maximum 6 prélèvements) si aucune cellule humaine n'est détectable dans le sang. Une fois la maladie installée, différents traitements seront administrés en fonction du groupe une fois par jour : 1. Un premier groupe recevra un médicament par injection abdominale tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l'injection: 30s, sur souris éveillée). 2. Un deuxième groupe recevra un autre médicament par voie orale 3 jours par semaine pendant 4 semaines ((durée de l'injection: 1 min, sur souris éveillée). 3. Un troisième groupe recevra un autre traitement par voie orale pendant 5 jours par semaine pendant 3 semaines. 4. Un quatrième groupe recevra un médicament similaire pendant 3 semaines. 5. Un cinquième groupe recevra un autre médicament par voie orale pendant 4 semaines. 6. Un sixième groupe recevra un traitement combiné de médicaments par voie orale pendant 3 à 4 semaines, en fonction de la combinaison. Des groupes supplémentaires recevront des traitements combinés de ces médicaments selon différents protocoles.

Impact sur les animaux

Le développement de la maladie peut entrainer une importante perte de poids, un changement de comportement, de mobilité, une déshydratation et/ou une hypothermie. L’administration orale d’un traitement peut entrainer une possible irritation du tube digestif. Les différents prélèvements et injections peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire surtout après le prélèvement de moëlle osseuse.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps tester sur des cellules cancéreuses humaines 32 conditions différentes afin d'identifier les combinaisons les plus efficaces. Néanmoins, nous devons valider à l'aide d'un modèle d'étude de souris ces résultats. En effet, les cultures de cellules ne permettent pas de reproduire complétement la pathologie humaine et dans ce type de tests, nous n'avons pas la problématique de distribution des molécules médicaments au travers des tissus. Il est donc indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles utilisant des animaux vivants.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites qui seuls ou cumulés qui vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Un suivi clinique hebdomadaire des animaux à l’aide d’une grille d’observation permettra de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi et/ou à l’euthanasie de l’animal. Si un signe de détérioration est détecté, la fréquence du suivi sera augmentée et s’il n’y a pas d’amélioration de l’état général de l’animal, il sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.