Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
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- Troubles urogénitaux
Étude des altérations visuelles dans un modèle murin d’AVC ischémique.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une prothèse crânienne, subir un accès chirurgical à l'artère cérébrale moyenne, un AVC provoqué, puis six séances d'imagerie fonctionnelle d'une heure étalées jusqu'au quatre-vingt-dixième jour. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère et toutes les souris sont tuées à J+90, le porteur estimant que les maintenir en vie plus longtemps entraînerait une souffrance chronique. Les déficits fonctionnels et cognitifs consécutifs à l'ischémie cérébrale sont eux-mêmes classés sévères, et la mise à mort intervient dès une perte de poids supérieure à 20 % ou un score de grimace supérieur à 7. Le même document affirme pourtant que les acquis du laboratoire montrent des animaux qui se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, caractérisé par l'obstruction d'un vaisseau sanguin cérébral, induit des lésions cérébrales séquentielles : les premières atteintes touchent le compartiment vasculaire, suivies d'une altération de la barrière hémato-encéphalique et de lésions du parenchyme cérébral. Bien que l'injection intraveineuse de l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rtPA) soit le traitement de référence pour les AVC aigus, les séquelles neurologiques, notamment au niveau du cortex somatosensoriel, restent importantes. De nombreux travaux ont mis en évidence que l'ischémie cérébrale induit des lésions neurologiques sévères, notamment au niveau du cortex somatosensoriel de la souris. Ces lésions, consécutives à l'occlusion vasculaire, altèrent significativement la plasticité cérébrale et entraînent des déficits sensoriels persistants. Ces résultats soulignent l'importance du cortex somatosensoriel dans la perception tactile et la localisation spatiale, ainsi que sa vulnérabilité face à l'ischémie. Si les conséquences d'un AVC sur le cortex somatosensoriel ont été largement étudiées, celles sur le cortex visuel demeurent méconnues. Cette lacune souligne l'importance d'une caractérisation approfondie des atteintes visuelles post-AVC. De plus, l'utilisation d'anesthésiques chez les modèles animaux, bien que nécessaire, peut influencer les résultats expérimentaux. Ainsi, notre étude vise à combler ces lacunes en caractérisant les atteintes visuelles structurelles et fonctionnelles consécutives à un AVC, ainsi qu'à évaluer la récupération fonctionnelle du cortex visuel et du cortex barrel. Nous porterons une attention particulière à l'intégrité du système vasculaire, notamment sous traitement thrombolytique associé ou non à un neuroprotecteur, en évaluant leur potentiel prédictif des altérations cérébrales à long terme. Cette approche originale permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux atteintes visuelles post-AVC et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À notre connaissance, une telle caractérisation approfondie n'a pas encore été réalisée, soulignant ainsi l'originalité et l'importance de ce projet.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en plaques ; SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
Procédure 1 (n=500) : Modèle d’AVC 1 & Procédure 2 (n=500) : Modèle d’AVC 2. - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures (durée : 50 minutes). - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, recanalisation) post-AVC par IRM (durée : 10 minutes). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Evaluation par Imagerie par fUS (durée : 1 heure). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 10 minutes/test). - J+90 : mis à mort par surdosage anesthésique/dislocation cervicale. Procédure 3 (n=500) : Modèle d’AVC vigile 1 & Procédure 4 (n=500) : Modèle d’AVC vigile 2. - J-11 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 45 minutes). - J-6/J-2 : Habituation (durée : 15-30 minutes). - J-1 : Accès à l'artère cérébrale moyenne (durée : 30 minutes). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures (durée : 50 minutes). - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, recanalisation) post-AVC par IRM (durée : 10 minutes). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Evaluation par Imagerie par fUS (durée : 1 heure). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 10 minutes/test). - J+90 : mis à mort par surdosage anesthésique/dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
Maintenir en vie des animaux ayant subi un AVC ischémique sur le long terme pourrait engendrer une souffrance chronique et une qualité de vie altérée, rendant la mise à mort éthiquement préférable pour minimiser leur douleur et préserver leur bien-être. Ainsi, l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet aucune approche statistique n'a été réalisée, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.
Étude du métabolisme mitochondrial au cours de la migration neuronale dans le cerveau embryonnaire et post-natal chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Une échelle de grimace et la recherche d'un défaut de toilettage servent à décider si la douleur postopératoire justifie d'intervenir. 4 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 332 d'entre elles et modéré pour 3 528. Des femelles gestantes subissent une chirurgie de 45 minutes pour électroporer le cerveau de leurs embryons in utero, ou reçoivent des injections quotidiennes pendant cinq jours, et les petits ainsi traités présentent une hyperactivité persistante avec, dans environ la moitié des cas, des crises d'épilepsie légères. Le porteur justifie ses effectifs par dix animaux par condition et quatre embryons correctement électroporés par gestante, sans expliquer comment ce calcul aboutit à 4 860.
Objectifs
L’hippocampe est une structure cérébrale impliquée dans la mémorisation. Les patients atteints d’une mutation affectant certains gènes présentent des déficits cognitifs sévères et des épilepsies résistantes aux traitements. Les souris portant une mutation sur ces gènes sont un modèle de choix pour mimer la pathologie humaine et présentent des défauts de développement de l’hippocampe et également une propension à l’épilepsie. L’objectif de ce projet est de comprendre l’origine de ces défauts et de tenter de les corriger. En effet, les cellules progénitrices se divisent et génèrent des neurones qui vont migrer jusqu’à leur destination finale dans l’hippocampe. Cette migration des neurones est très finement régulée. Une des pistes de recherche nouvelle consiste à comprendre comment la régulation du métabolisme énergétique par ces gènes et les composantes des microtubules contrôle cette migration.
Bénéfices attendus
Les malformations au niveau du cortex cérébral sont des maladies rares (incidence 1:100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques
Procédures
Une chirurgie est réalisée sur des femelles gestantes sous anesthésie générale avec analgésie pendant une durée d’environ 45 minutes. Une injection, soit en aiguë (injection unique sur animal vigile d’une durée de 30 secondes), soit en chronique (une injection par jour pendant 5 jours) d’agents pharmacologiques est administré à des femelles gestantes. Les embryons traités in utero sont euthanasiés à l'âge adulte au cours d'une chirurgie réalisée sous anesthésie générale, avec administration préalable d'un traitement analgésique. La procédure dure environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable se manifeste par une hyperactivité persistante et, dans environ 50 pour cent des cas, par des crises d’épilepsie légères survenant au repos ou pendant le sommeil lent. Ces troubles entraînent fatigue, stress et perturbation du sommeil . Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire. L’injection d’agents pharmacologiques peut induire une péritonite au niveau du site d’injection.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des analyses histologiques. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont subi une chirurgie.
Remplacement
Pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes. Des données préliminaires in vitro de notre équipe, ont montré un rôle du gène étudié dans la régulation du transport axonal au niveau cellulaire. Nous étudierons son rôle sur des cultures de tranches de cerveau, ex vivo.et in vivo.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. Pour les études d’immunohistochimie après électroporation, 10 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Dans le cas du protocole d’électroporation, en moyenne, 4 embryons sont correctement électroporés dans l’hippocampe par souris gestante sur 6 embryons électroporés. Ces considérations permettent de limiter le nombre de souris nécessaires. Le nombre total d'animaux utilisé est de 4860.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les administrations seront effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois par jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin de limiter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées (points limites définis). Les souris sont placées dans les cages avec de la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont anesthésiées et placées sur une plaque chauffante, et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques, une analgésie locale sur le site d’incision. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (points limites définis et traitement des plaies). Une échelle de grimace est utilisée pour déterminer le niveau de douleur, ainsi que des comportements anormaux comme le manque de toilettage. L’état des animaux est alors surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique de chirurgie d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 16,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles à la naissance, 7 et 15 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype ou de son atténuation/correction.
Sclérodermie systémique : Rôle des macrophages et thérapies ciblées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux injections par jour, cinq jours par semaine, six semaines de suite: chaque souris de ce protocole reçoit une soixantaine d'injections destinées à lui faire développer une sclérodermie. 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir quels macrophages entretiennent la fibrose et à tester des vésicules issues de cellules stromales, une piste jamais essayée dans cette maladie. Le modèle a été retenu parce que la sclérodermie se déclenche chez 100 % des souris qui y sont soumises, et le porteur décrit les blessures cutanées obtenues comme réversibles à l'arrêt des injections.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie rare où le corps attaque ses propres organes, comme la peau, les poumons et le cœur. Cela cause une cicatrisation excessive (fibrose), des problèmes de vaisseaux sanguins et un mauvais fonctionnement des défenses du corps (le système immunitaire). Même si des progrès ont été fait, on ne comprend pas encore bien ce qui déclenche ces problèmes ni pourquoi ils persistent. Les macrophages, qui sont des cellules du corps jouant un rôle important pour se défendre et réparer les tissus, semblent très impliqués dans cette maladie. Il existe plusieurs types de macrophages : certains vivent déjà dans les tissus (on les appelle "résidents"), et d'autres viennent du sang pour aider quand il y a un problème (on les appelle "recrutés"). On ne sait pas encore bien lequel de ces types de macrophages est le plus impliqué dans la maladie. Aujourd'hui, les traitements pour la sclérodermie ne sont pas très efficaces. Mais il existe des cellules appelées "cellules stromales mésenchymateuses" (CSM), qui produisent des vésicules contenant des substances utiles (elles sont appelées "vésicules extracellulaires" ou VE). Ces vésicules pourraient peut-être aider à réparer les macrophages et à réduire les cicatrices et l'inflammation, mais cela n'a pas encore été testé dans cette maladie. Notre projet a donc pour objectif : 1. De mieux comprendre les différents types de macrophages dans les organes touchés par la sclérodermie. 2. De savoir si ce sont les macrophages "résidents" ou "recrutés" qui jouent un rôle plus important dans la maladie. 3. De tester si les vésicules des CSM peuvent aider à réparer les macrophages malades. 4. Et de rendre ces vésicules encore plus efficaces pour traiter la maladie. Pour cela, nous allons utiliser un modèle de souris qui imite la sclérodermie humaine. Ce modèle nous permettra d’étudier les phases de la maladie, comme l’inflammation et la cicatrisation, et de tester les effets des vésicules sur les macrophages. Nous espérons ainsi mieux comprendre cette maladie et développer un traitement plus ciblé et efficace.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices importants : 1. Mieux comprendre la maladie : La sclérodermie systémique est une maladie rare et grave dont on connaît encore mal les causes. Cette étude pourrait nous aider à mieux comprendre pourquoi elle apparaît et comment elle évolue. 2. Trouver un traitement : Actuellement, il n'existe pas de traitement efficace pour cette maladie, qui est mortelle. Ce projet pourrait permettre de développer un médicament capable d’aider les personnes atteintes à vivre mieux et plus longtemps. 3. Améliorer les connaissances scientifiques : En étudiant les macrophages et en utilisant des vésicules extracellulaires, les chercheurs pourraient découvrir une nouvelle façon de soigner non seulement cette maladie, mais peut-être aussi d’autres maladies.
Procédures
Pour mener ce projet, nous utilisons des souris afin d'étudier la maladie. Voici comment cela fonctionne : 1. Créer la maladie chez l'animal : Les souris vigiles reçoivent deux injections par jour, 5 jours par semaine pendant 6 semaines, cette injection dure 30 secondes. Cela permet de reproduire les symptômes de la sclérodermie pour les étudier. 2. Suivre les macrophages : Pour voir comment les macrophages se comportent, on injecte une molécule qui les rendent fluorescents. Cette injection d’une durée de 10 secondes est répétée à 3 reprises sur la souris vigile, elle permet de suivre les macrophages et de mieux comprendre leur rôle. 3. Tester le traitement : Une fois les vésicules extracellulaires prêtes, elles sont injectées dans la souris, cette injection unique est réalisé sur la souris vigile et dure 10sec. Cela permet de voir si le traitement peut réduire les symptômes de la maladie.
Impact sur les animaux
Pour réaliser cette étude, les souris reçoivent des injections permettant de reproduire la maladie. Voici comment cela se passe : 1. Injections rapides : Les souris sont contentionnées pour les injections, qui durent 30 secondes. Ces injections peuvent causer une douleur légère à modérée d’environ 1min, les souris ne montrent plus de signes d’inconfort après s’être habituées aux manipulations quotidiennes. 2. Effets sur la peau : Le modèle peut parfois provoquer des petites blessures sur la peau, mais celles-ci s’améliorent lorsque les injections sont arrêtées ou après avoir reçu le traitement. Si des blessures apparaissent et ne guérissent pas spontanément, les injections sont suspendues pour laisser le temps à la peau de cicatriser. Ces précautions permettent de limiter la douleur et d’assurer le bien-être des souris tout au long de l’étude. Cela est important pour obtenir des résultats fiables tout en respectant les animaux utilisés.
Devenir
À la fin de l’étude, toutes les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de récupérer les organes et d’analyser les effets du modèle expérimental et des traitements testés.
Remplacement
À ce jour, il n'existe aucune alternative non animale permettant d’étudier de manière complète l’origine et le rôle des macrophages dans les tissus malades. Également, avant de proposer un traitement pour les humains, il est crucial de prouver que les vésicules extracellulaires sont à la fois efficaces et sûres en utilisant un modèle pré-clinique qui ressemble le plus possible à la réalité. Bien que des tests en laboratoire (modèles in vitro) soient effectués en amont, ces tests ne suffisent pas à évaluer correctement l’efficacité des traitements dans un organisme vivant, où la situation est beaucoup plus complexe. En effet, les modèles in vitro actuels ne parviennent pas encore à recréer fidèlement les interactions complexes entre les organes et les systèmes biologiques d’un organisme vivant.
Réduction
Nous avons utilisé les résultats d'expériences précédentes menées au laboratoire et avons calculé que l'inclusion de 16 souris par groupe expérimental est suffisante pour obtenir des résultats fiables et significatifs tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ce nombre de souris nous permet d’avoir confiance dans les résultats obtenus avec notre traitement pour le proposer par la suite chez les patients.
Raffinement
Les souris sont examinées quotidiennement pour détecter d’éventuelles lésions cutanées et s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. On cherche aussi des signes de douleur ou de souffrance, en utilisant des méthodes validées d’évaluation de la douleur. Par exemple en surveillant la perte de poids ou les changements dans leur comportement. Si les lésions cutanées ne guérissent pas, les injections seront arrêtées jusqu'à ce que la cicatrisation soit complète, et des médicaments contre la douleur seront administrés pour soulager les animaux. En cas de perte de poids, les injections seront arrêtées et de la nourriture enrichie sera donnée.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé pour la sclérodermie systémique a été choisi parce qu'il reproduit de manière très fidèle les caractéristiques de la maladie observées chez l’être humain et est largement reconnu comme une référence pour étudier cette pathologie. Les souris utilisées dans l’étude ont entre 8 et 12 semaines, c'est-à-dire qu'elles ont atteint leur maturité sexuelle. Les tests de mise en place du modèle ont montré que la sclérodermie se développe chez 100 % des animaux utilisés.
Mesures de paramètres sanguins lors d’essais zootechniques chez la truie et le porcelet élevé sous la mère
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Élevés comme dans un élevage porcin conventionnel plutôt qu'en animalerie, 2 520 cochons, truies gestantes ou allaitantes et porcelets de moins de vingt et un jours, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué au titre du projet. Le sang leur est prélevé sur animal vigile, à la jugulaire ou par piqûre de l'oreille ou de la queue, sous une contention de deux à cinq minutes : trépied pour les porcelets séparés de leur mère, lasso serré sur le groin pour les truies, une eau sucrée venant en récompense. Chaque truie peut être prélevée six fois par an, chaque porcelet deux fois avant ses trois semaines, et les mêmes animaux passent d'un essai à l'autre. Ils repartent ensuite vers l'élevage ou sont vendus à d'autres éleveurs, l'objet du projet étant de formuler des aliments moins coûteux et moins polluants pour des porcs destinés à l'alimentation humaine.
Objectifs
La mission de notre centre de recherche est de mettre au point des aliments destinés à l’alimentation des porcs, élevés dans des élevages conventionnels et destinés à l’alimentation humaine. Au cours de nos essais, nos principales mesures sont les suivantes : consommation d’aliments, évolution de la croissance, suivi de la santé des porcs. Afin d’approfondir certaines thématiques d’essais, nous sommes parfois amenés à réaliser des prélèvements sanguins pour évaluer l’impact de la nutrition sur plusieurs mécanismes de l’organisme animal (reproduction, stress, immunité, etc.). Certains de nos essais s’inscrivent dans la poursuite d’études au niveau cellulaire ayant déjà permis de réduire et cibler le nombre de paramètres à étudier sur les animaux. Le projet consiste donc à réaliser des prélèvements sanguins pour mesurer des paramètres sanguins d’intérêt pour la compréhension des mécanismes de l’organisme (marqueur d’inflammation, marqueur du stress, glycémie, enzymes hépatiques, etc.). L’objectif est d’évaluer les besoins nutritionnels des porcs à plusieurs stades physiologiques pour adapter au mieux les niveaux nutritionnels des aliments. La nutrition des animaux, comme de l’homme, a des effets simultanés sur de nombreux mécanismes biologiques dans l’organisme. Les formules alimentaires pourraient, dans certaines conditions d’élevage, avoir des effets différents sur la santé, la reproduction, le bien-être des animaux et/ou sur la qualité de leurs produits. Avant de généraliser une solution nutritionnelle à un grand nombre d’animaux en élevage, il est nécessaire d’évaluer les impacts sur l’organisme sur un nombre limité d’animaux. Les enjeux sont non seulement économiques (coût de formulation des aliments, performances des animaux), mais aussi environnementaux (émissions de gaz à effet de serre), et sociétaux puisque l’alimentation participe au bien-être des animaux. Dans un contexte actuel de réduction de l’impact environnemental des pratiques d’élevages, les formulations des aliments sont particulièrement retravaillées pour incorporer de nouvelles matières premières ou ingrédients (nouvelles sources par ex) répondant à cet enjeu. Cela nécessite de réévaluer l’impact de ces nouveaux aliments sur l’organisme, la croissance et la santé des porcs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples : ils permettraient à la fois l’amélioration de la composition des aliments, le développement de solutions nutritionnelles « santé » ayant un rôle préventif contre l’apparition de certaines maladies, mais également l’amélioration de l’impact de la conduite d’élevage sur le bien-être des animaux et l’environnement. Plusieurs « recommandations nutritionnelles » (quantités minimales d’apport de vitamines, etc.) de la composition des aliments pour porcelets et truies reposent sur des travaux anciens, ne tenant pas compte des évolutions de performances des animaux et de leur génétique. Or, les enjeux environnementaux liés à l’approvisionnement de certaines matières premières ainsi que la volatilité de leur prix nous amènent à revoir à la baisse le niveau d’apport voir même à étudier leur remplacement par une autre source, sans impacter les performances et la santé de ces animaux. Ainsi, ce projet pourrait permettre de diminuer l’impact environnemental de certains aliments tout en s’assurant de limiter les effets néfastes sur l’organisme des truies et de leurs petits. De même, de nouvelles solutions nutritionnelles à base de plantes ou d’extraits végétaux sont de plus en plus développées dans un objectif d’améliorer la santé des truies et donc à terme diminuer l’utilisation de certains produits médicamenteux. Par la mesure des paramètres sanguins, ce projet pourrait permettre d’évaluer l’impact de ce type de solutions sur la santé des truies et de leurs petits et améliorer leur bien-être.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins par ponction jugulaire ou cutanée. Les prises de sang sont des actes reconnus d’élevage et sont réalisées par un personnel qualifié et préalablement formé. Ces prélèvements sont réalisés sous contention d’animaux vigiles. La procédure se déroule en 3 phases successives : mise en place de la contention, ponction jugulaire ou cutanée et prélèvement, retrait de la contention et distribution d’une récompense sous forme d’eau sucrée par exemple. La méthode de contention est adaptée en fonction du stade physiologique de l’animal : utilisation d’un trépied (pour les porcelets) ou d’un lasso (pour les truies uniquement). Pour la ponction jugulaire, la zone de prélèvement est située à la base du cou. Le sang est récupéré dans des tubes : le volume de sang prélevé peut aller de 5 à 12 ml maximum. Dans le cadre d’une ponction cutanée, la zone peut être l’oreille ou bien la queue. La zone est percée à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette stérile. Les gouttes de sang sont récupérées via la lancette ou un buvard par ex pour être analysées immédiatement. Au global, la phase de contention + prélèvement peut durer entre 2 et 5 min par animal. Pour les porcelets sous la mère, le nombre de prélèvements est limité à 2 sur la phase naissance – 21 jours d’âge. Pour les truies, le nombre de prélèvements sur un cycle de reproduction (gestation + lactation) est limité à 4.
Impact sur les animaux
La réalisation de la contention avec le lasso peut entrainer une douleur légère pendant la durée du prélèvement (entre 2 et 5 min maximum), à cause de la pression exercée par le lasso sur le groin de la truie. Pour les porcelets sous la mère, ils sont momentanément isolés de leur mère et placés sur un trépied pour permettre une immobilisation pendant le prélèvement. Cette étape de contention peut être une source de stress puisque cela contraint l’animal et l’empêche temporairement d’accéder à une zone de fuite. Pour réaliser la ponction, la piqure d’aiguille entraine une douleur légère de courte durée, équivalente à la durée du prélèvement et peut induire également du stress et de la peur.
Devenir
En fonction de l’état général des animaux (application des mêmes signes que ceux listés dans les points limites), les animaux poursuivent leur croissance/vie dans nos locaux d’élevage ou sont vendus à d’autres éleveurs. Certains animaux prélevés peuvent être réutilisés dans un essai gestante/lactation ou un essai post-sevrage puis engraissement avec procédure de prélèvement sanguins. Dans ce cas, dans un objectif de prise en compte du bien-être de nos animaux, s’il est souhaité de prélever des animaux à la fois en stade sous la mère + post-sevrage + engraissement alors le nombre maximum de prélèvements sur les 25 semaines est plafonné à 6 prélèvements, en respectant toujours les 2 semaines d’intervalles minimum entre 21 et 35 j d’âge. Pour les truies, étant donné qu’une truie fait en moyenne environ 2.5 cycles/an, le nombre de prélèvements est limité à 6 par an par truie.
Remplacement
Les méthodes actuelles cellulaires menées en laboratoire ne sont malheureusement pas toujours suffisantes pour comprendre les relations complexes entre les différents mécanismes de l’organisme, entre les individus ou encore avec l’environnement. C’est pourquoi, pour certaines thématiques d’essais, il n’existe pas de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux (même si une phase de recherche in vitro est parfois réalisée en amont lorsqu’elle est possible). Lorsque d’autres indicateurs (autres que sanguins) sont possibles alors le prélèvement de sang est remplacé par une autre méthode moins invasive (collecte d’urine et/ou de déjection au moment de la défécation). Cette stratégie a d’ailleurs été appliquée dans le passé pour le dosage du cortisol (hormone du stress). Des études récentes montrent que le cortisol contenu dans les poils des porcs est un indicateur de stress chronique car il s’y accumule au cours du temps. Dans ce cas, les prélèvements sanguins peuvent être remplacés par la récolte des poils des porcs. Les animaux placés en essais et concernés par ces procédures ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme dans un élevage porcin conventionnel. Nos essais s’inscrivent dans le cadre de la recherche agricole et pour certains dans la poursuite d’études cellulaires ayant déjà permis de réduire et cibler le nombre de paramètres à étudier sur un nombre réduit d’animaux. Lorsque d’autres mesures via des prélèvements moins invasifs tels que la collecte de déjection ou de poils ne sont pas possibles, la prise de sang devient le seul moyen d’obtenir les informations sur les effets des aliments testés.
Réduction
Le nombre de porcs entrant dans cette procédure est étudié pour limiter le nombre d’animaux tout en se donnant suffisamment de chance de montrer une différence de résultat si celle-ci existe (c’est ce qu’on nomme également la puissance statistique). Pour définir ce nombre, nous utilisons un logiciel de statistiques. Par ailleurs, en plus de cette méthode, nous nous appuyons sur notre expérience (traitements statistiques des précédents résultats d’essais depuis 20 ans) ainsi que sur les résultats d’autres études réalisées dans d’autres centres de recherche (nombre d’animaux/groupe dans les études avec résultats significatifs) pour affiner le nombre d’animaux concernés par les prélèvements. En outre, certains animaux concernés par cette procédure entrent également dans le cadre d’essais ayant déjà intégrés une phase de recherche au niveau cellulaire permettant de réduire le nombre de paramètres à tester et le nombre d’animaux.
Raffinement
Plusieurs mesures sont intégrées dans la mise en place de la procédure afin de réduire les nuisances sur le bien-être. D’abord, s’il est constaté que des animaux à prélever présentent un état général affaibli ou pour lesquels la contention est difficile, alors ils sont retirés de la procédure et ne sont pas prélevés. Ensuite, la méthode de contention est réfléchie en fonction de l’âge de l’animal afin que cette dernière soit la plus adaptée à son stade physiologique pour faciliter le prélèvement et donc en limiter sa durée. Une fois le prélèvement réalisé, une récompense sous forme d’eau sucrée est proposée à l’animal. Nos animaux connaissent leur environnement ce qui réduit le stress lors de leur sortie de la case pour les prélèvements par exemple. Par ailleurs, le nombre de tentatives sans réussite du prélèvement est réduit à 2 afin de limiter la durée de contention. Comme présenté dans les points limites, une surveillance particulière des animaux est réalisée durant les 3 jours qui suivent les prélèvements et des soins sont définis en cas d’apparition de signes cliniques notables ou sévères.
Choix des espèces
C’est l’espèce cible de notre activité de recherche. Les résultats de nos essais sont valorisés pour améliorer l’alimentation des truies et des porcelets sous la mère dans les élevages conventionnels. Les animaux placés en essais et concernés par ces procédures ne sont pas des animaux de laboratoire mais sont élevés comme dans un élevage porcin conventionnel. Les animaux utilisés sont des truies en gestation ou en lactation et leurs porcelets élevés sous la mère pendant leur 21 premiers jours de vie. C’est sur ces stades physiologiques que nous souhaitons faire avancer nos connaissances.
Evaluation et développement pré-clinique des cathéters pour cartographie, cautérisation ou électroporation irreversible des arythmies cardiaques dans des modèles porcins et ovins
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Moutons : 125
Valider des prototypes de cathéters pour que des partenaires industriels obtiennent leur certification et accèdent à un marché "mondial en pleine croissance" : 125 cochons et 125 brebis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit une opération de quatre à six heures sous rayons X, avec cinq à vingt cautérisations ou électroporations du muscle cardiaque, précédée ou suivie de deux à quatre heures d'imagerie. Certains sont réopérés un à trois mois plus tard, et le porteur annonce comme effets attendus une paralysie temporaire du diaphragme, des tachycardies dégénérant en fibrillation et des saignements aux points d'introduction des cathéters. Le cochon et la brebis ont été retenus parce que la taille de leur cœur approche celle du cœur humain et parce que l'équipe maîtrise déjà ces deux modèles.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité et la sécurité de prototype de cathéters de diagnostic ou de traitement par ablation pour les troubles du rythme cardiaque. Pour cela l’évaluation préclinique est obligatoire, via l’utilisation de modèles animaux, sains ou malades, en conditions proches de la clinique, avant leur utilisation chez l’homme. Les cathéters sont des dispositifs médicaux manœuvrables à l’intérieur des gros vaisseaux et du cœur et permettent aux cardiologues soit de diagnostiquer une maladie cardiaque soit de la traiter. Les cathéters d’ablation sont des dispositifs médicaux utilisés pour le traitement de maladies cardiaques. Ils permettent grâce à une électrode positionnée à leur extrémité, de causer une cautérisation ou une lésion contrôlée dans le cœur. Cette lésion interrompt les circuits favorisants l’activation désynchronisée du muscle cardiaque. Les cathéters de diagnostic eux, utilisent plusieurs électrodes positionnées en différentes configurations géométriques pour capturer les signaux du cœur et aider à trouver les sources anormales d’activation cardiaque. Le projet permettra de valider les paramètres suivants de prototypes de cathéter avant de pouvoir être utilisés chez le patient : les aspects ergonomiques (robustesse et préservation de l’intégrité mécanique, manœuvrabilité d’un cathéter, capacité à atteindre les cibles cardiaques), l’efficacité (capacité à cibler les points de contrôle lors du diagnostic, capacité à induire des lésions durables sur toute l’épaisseur du myocarde) et enfin la sécurité (risques de créer des caillots de sang pouvant être responsables d’AVC, risque d'endommager les organes adjacents…). Lors de procédure médicale réalisée chez le patient (identique à celle réalisée dans le projet), les patients sont conscients (sédation légère), avec une gestion de la douleur par voie médicamenteuse ajustée par pallier en fonction de la réponse du patient au traitement. Les tests réalisés chez les modèles animaux se déroulent en anesthésie générale. L’objectif de ce projet est de travailler sur des prototypes des cathéters qui devraient permettre une manœuvrabilité optimale, montrer une absence ou minimisation des risques collatéraux pendant la procédure, et provoquer des lésions du tissu cardiaque ayants des effets durables sur les propriétés électriques du cœur traité, afin de pouvoir les proposer à terme dans la prise en charge de maladies cardiaques.
Bénéfices attendus
Les tests des cathéters sur les animaux pour les thérapies du trouble du rythme cardiaque sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d'efficacité et d'ergonomie attendus. L’évolution permanente des dispositifs médicaux dans la prise en charge des patients met en évidence l’intérêt des cathéters pour le diagnostic et le traitement par ablation thermique et non-thermique de certaines maladies cardiaques, ces dispositifs ont donc un marché mondial en pleine croissance. Les tests précis et éthiques ouvriront aux partenaires industriels et aux collaborateurs la possibilité de passer à la phase suivante d'investigation chez les patients, ce qui leur permettra d'obtenir la certification réglementaire pour mettre leurs dispositifs sur le marché.
Procédures
Toutes les procédures et les étapes décrites dans ce projet se déroulent sous anesthésie générale. Nous allons utiliser des cochons jeunes ou des brebis adultes, selon la disponibilité et la nécessite d’effectuer un protocole chronique ou aigü. Nous prévoyons d’utiliser maximum 250 animaux en 5 ans. Les animaux pourront être sains ou être des modèles de maladies cardiaques précédemment créés. Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : examens d’imagerie non-invasifs par IRM et/ou scanner CT (durée 2-4 heures), prélèvements sanguins, urinaires, fécaux et tissulaires (30-45 mins), et une opération (identique à celle réalisée chez le patient) pour le test des cathéters sous imagerie par rayons X (durée 4-6 heures). En fonction du dispositif médical à tester, certains animaux pourront avoir une phase de récupération et de répétition, d’un à trois mois après l’ablation, de l’imagerie, des prélèvements, et des cartographie diagnostique afin d’évaluer les résultats chroniques de l’intervention réalisée (durée 4-6 heures)
Impact sur les animaux
Les niveaux de stress et les effets cardiaques dus aux thérapies de diagnostic et d'ablation sont identiques à ceux que connaissent les patients en milieu clinique. Les effets secondaires peuvent être une paralysie temporaire du nerf phrénique ou du diaphragme, un déclenchement de tachycardies ventriculaire débordantes en fibrillations ou un saignement aux sites d’introduction des cathéters.
Devenir
A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo, les organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.
Remplacement
A ce jour, pour les objectifs envisagés dans ce projet, nous n’avons pas à disposition d’autres options pour le test de cathéter d’ablation et diagnostic que d’utiliser des modèles animaux. Nous pouvons obtenir des modèles cellulaires en laboratoire pour des analyses préliminaires, mais ces modèles qui se basent sur les cellules cardiaques n'offrent que des résultats extrêmement simplifiés par rapport au cœur entier. Les modèles tissulaires ex vivo ne peuvent pas nous permettre d’observer les effets du remodelage à long terme qui certifie la validation des cathéters pour leur utilisation en clinique.
Réduction
Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux utilisés repose sur la maximisation du nombre de sites que nous pouvons traiter par ablation. Dans l’objectif de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous prévoyons d’effectuer certaines évaluations en parallèle (ex : évaluer un cathéter diagnostic et un cathéter d’ablation), si leur coévaluation n’affecte pas les résultats attendus. Si un cathéter montre des limitations importantes en termes de sécurité et/ ou de fiabilité, l’évaluation sera arrêtée ou suspendue en l’attente d’une amélioration du dispositif par le constructeur. De même, si l’évaluation statistique atteint une puissance suffisante, aucun autre animal ne sera inclus dans l'évaluation du cathéter d'intérêt. Chez un jeune porc ou un jeune mouton, nous pouvons effectuer entre 5 et 20 lésions en considérant à la fois les ventricules et les oreillettes. Cela nous donne suffisamment de répliques techniques pour rendre les résultats plus robustes et réduire l’erreur apportée par la variabilité biologique et anatomique individuelle. Cette confiance nous permet d’utiliser la quantité minimale de 5 animaux par conditions afin d’avoir une puissance statistique acceptable. En outre, dans le cas où le paramétrage des thérapies doit être testé en amont du test sur le tissu cardiaque, nous pouvons tester différentes conditions sur les muscles de la cuisse.
Raffinement
Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constantes de leurs paramétres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, tempérautre...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel formé, qui peut intervenir rapidement auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, cochon, chèvre, chien), le cochon et le mouton ont été retenus car ces modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent une référence dans la communauté scientifique. De plus le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. Stades de développement des animaux inclus : - Porc : jeune de 50-70kg environ (environ de 4-5 mois) - Ovins : adultes à partir de 12 mois Au stade défini, et pour les deux espèces, la taille et les caractéristiques du cœur des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des dispositifs médicaux.
Etude des mécanismes permettant aux cellules B régulatrices induites de soigner la sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 283 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 2 387 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 1 896 un niveau sévère. Une paralysie partielle leur est provoquée par deux injections sous-cutanées qui déclenchent une attaque de leur propre système nerveux central, et elles subissent par ailleurs quatre gavages, des prélèvements de sang, une biopsie de la queue dès l'âge de sept jours et plusieurs injections. L'enjeu déclaré est de comprendre comment des cellules B régulatrices, transférées en grand nombre, ramènent la maladie en rémission, avec l'espoir d'un traitement contre la sclérose en plaques. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central n'étant pas modélisable in vitro à ce jour.
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B dans différents modèles de sclérose en plaques. La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle est la première cause de déficit neurologique chez le jeune adulte. Les femmes sont atteintes deux fois plus que les hommes et le coût socio-économique de la sclérose en plaques est le second après les traumatismes dans ce groupe d’âge. Il n’y a actuellement pas de traitement curatif pour la sclérose en plaques qui est donc une maladie chronique persistant tout au long de la vie du patient. Certains traitements permettent d’en ralentir la progression chez certains patients. La sclérose en plaques implique des cellules du système immunitaire qui attaquent le système nerveux central. L’activation des cellules pathogènes est normalement inhibée par un autre type de cellules immunitaires appelées cellules B régulatrices. Les cellules B régulatrices sont déficitaires chez les patients atteints de sclérose en plaques si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter la sclérose en plaques en transférant des cellules B régulatrices chez ces patients. Des cellules B régulatrices peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. La sclérose en plaques peut être modélisée chez la souris, et il a été démontré dans ce modèle que les cellules B régulatrices étaient essentielles à la rémission de la maladie. En utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, ces cellules sont capables de contrôler le développement de la pathologie ainsi que d’en induire la rémission. Nous souhaitons dorénavant mieux comprendre le mode d'action des cellules B régulatrices ainsi que de raffiner leur utilisation.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les cellules B régulatrices pour traiter la sclérose en plaques, et la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet thérapeutique de ces cellules immunorégulatrices au niveau de l'organe atteint dans cette maladie, le système nerveux central. Ce modèle est prédictif de la sclérose en plaques, et a déjà servi à la mise en place des traitements principaux aujourd'hui utilisés pour cette maladie.
Procédures
Identification d'un animal : ~10 secondes. Biopsie caudale : ~5 secondes. Prélèvement sanguin : ~15 secondes. Gavage x4 : ~20 secondes/gavage. Anesthésie : ~15 minutes. Deux injections sous cutanées : ~30 secondes. Injection intra-péritonéale : ~10 secondes/injection. Une injection intra-veineuse : ~45 secondes. Anesthésie x2 par voie intra-péritonéale : ~15 minutes. Les injections sous-cutanées se font sur animaux anesthésiés. Les autres interventions se font sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection sous-cutanée = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Gavage = contention soutenue, introduction de la sonde dans l’œsophage et jusqu’à l’estomac pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle EAE=paralysie partielle et transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser l’effet de lymphocytes B dans deux modèles de sclérose en plaques. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires entre différents organes qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du systèmes nerveux central impliquent également la migration des cellules du système immunitaire dans le système nerveux central, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du système nerveux central. Ces processus ne sont actuellement pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez l'animal.
Réduction
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec un programme d'analyse de puissance statistique. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Une veille bibliographique sera effectuée dans ce contexte scientifique afin d'éviter la duplication inutile de travaux.
Raffinement
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission après un court épisode de paralysie afin de réduire la souffrance des animaux. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites adaptés qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable et inutile des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal ainsi que par le/les expérimentateur(s). Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement. les animaux sont hébergés par groupes sociaux et dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le modèle expérimental de sclérose en plaques chez la souris a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients. Il s'agit donc d'un modèle pertinent pour le développement et la compréhension de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. Utilisation de souris à partir de l’âge de 7 jours pour effectuer les gestes d'identification ainsi que le prélèvement pour la biopsie. Utilisation des souris à partir de 4 semaines pour effectuer un prélèvement pour génotypage ou pour effectuer un gavage. Cet âge est requis afin de s’assurer que les souris aient une taille appropriée et suffisante pour effectuer les gestes susmentionnés sans porter atteinte à leur intégrité physique. A partir de 6 semaines d’âge et jusqu'à 16 semaines d’âge, les souris pourront être immunisées pour induire l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale parce que cela correspond à l'âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est adaptée pour étudier la pathogenèse de la maladie.
MeCP2_Cortex_KO
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une prostration, une difficulté respiratoire majeure ou une perte de poids supérieure à 20 % déclenchent la mise à mort par dislocation cervicale. 240 souris mâles privées de la protéine MeCP2 dans le cerveau vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cortex à la naissance puis à deux, quatre, six et huit semaines. Le porteur indique que le déficit neurologique apparaît vers la cinquième semaine, avec ataxie, tremblements, nervosité et respiration difficile, et que la moitié de ces souris meurent d'elles-mêmes à six semaines, 90 % à huit semaines. Le projet vise à valider une hypothèse sur l'organisation de l'ADN dans les neurones, un traitement pour les filles atteintes du syndrome de Rett restant, lui, une perspective.
Objectifs
L'ADN, qui contient l’ensemble des informations nécessaires au fonctionnement de nos cellules, est organisé sous une forme compacte appelée chromatine. Cette structure doit être souple et adaptable pour permettre aux cellules de fonctionner correctement. Lorsque cet équilibre est perturbé, cela peut entraîner des maladies, notamment des maladies dites « épigénétiques », qui affectent l’expression des gènes sans modifier directement l’ADN. Le syndrome de Rett est un exemple de maladie épigénétique rare qui touche presque exclusivement les filles. Il se manifeste par des troubles du développement neurologique entraînant un polyhandicap sévère, incluant une déficience intellectuelle, des troubles du spectre autistique et des complications respiratoires et cardiovasculaires pouvant réduire l’espérance de vie. Cette maladie est liée, dans la majorité des cas, à une mutation du gène MeCP2, situé sur le chromosome X. Les recherches sur le syndrome de Rett reposent en grande partie sur des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’étudier la fonction de MeCP2 dans le cerveau. Il a ainsi été démontré que cette protéine joue un rôle clé dans le développement du système nerveux. Nos travaux récents suggèrent que le syndrome de Rett pourrait être une maladie de la chromatine : la mutation de MeCP2 empêcherait son rôle essentiel dans l’organisation de la chromatine des neurones, en perturbant son interaction avec certaines séquences répétées d’ADN. Pour mieux comprendre cette hypothèse, nous étudierons la fonction de MeCP2 dans le développement du cortex chez un modèle murin du syndrome de Rett.
Bénéfices attendus
Ce projet associera différentes approches fonctionnelles à l'échelle du génome novatrices et complémentaires. Il permettra une meilleure compréhension de la fonction neuronale de MeCP2, et clarifia l'étiologie moléculaire du syndrome de Rett. Les données obtenues pourraient conduire au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie neuro-développementale sévère et incurable. De plus, nos travaux contribuent à la compréhension du rôle des courtes séquences d'ADN répétées sur l'organisation tridimentionnelle du génome et l’expression des gènes au cours du développement du cerveau, et peuvent avoir un impact plus large, notamment sur l'identification des mécanismes moléculaires impliqués dans les troubles du spectre autistique et dans les maladies neurodégénératives.
Procédures
Nous envisageons d'effectuer nos expériences sur des cortex prélévés sur des souris agées de 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. Mais le déficit neurologique des mâles dépourvus en MeCP2 débute entre 4 et 5 semaines, entrainant une létalité de 50% à 6 semaines et de 90% à 8 semaines. Les souris agées de 6 ou 8 semaines seront donc probablement difficile à obtenir. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal pour ces souris, nous avons choisi une application stricte de point limite dès les premiers signes de souffrance (diminution importante de l’activité motrice ou prostration, difficulté respiratoire majeure ou perte de poids supérieure à 20% au poids attendu). Les souris seront observées quotidiennement, l'une de ces observations suffira à mettre en œuvre le point limite et les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les troubles neurologiques décris chez les souris où MeCP2 a été inactivée spécifiquement dans le cerveau à un stade embryonnaire précoce sont bien décris. Ils apparaisent vers la 5ème semaine et associent de l'ataxie, une hypoactivité, des tremblements, de la nervosité, une respiration diffcile et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem du cortex.
Remplacement
En associant des données biochimiques, structurales obtenues in vitro à des données génomiques obtenues à partir de cellules en culture, nous avons accumulé beaucoup de résultats préliminaires qui suggèrent que MeCP2 puisse agir comme un facteur de transcription pionnier dans les neurones, capable d'envahir la chromatine en se liant aux répétitions CA. Le syndrome de Rett pourrait ainsi être considéré comme une "maladie de la chromatine" provenant de l'incapacité qu’a MeCP2, lorsqu’elle est mutée, à moduler l'organisation de la chromatine. Nous souhaitons dans ce projet valider définitivement notre hypothèse de travail par des expériences effectuées sur l'animal, étape indispensable pour le développement d’approches thérapeutiques.
Réduction
Nous ne travaillerons que sur des souris mâles pour lesquelles l'expression de MeCP2 aura été supprimée dans le cerveau, car les femelles équivalentes ne sont pas viables. L’objectif est ensuite de minimiser le nombre d'animaux utilisé tout en assurant une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives des données issues des analyses par séquençage haut-débit et atteindre l'objectif scientifique du projet. Nous estimons que de 3 à 5 réplicats biologiques seront nécessaires par expérience et par âge, soit un total de 240 souris en tenant compte de leur mortalité précoce.
Raffinement
Les mâles KO pour MeCP2 présentent une régression neurologique importante conduisant à une mort prématurée typiquement entre 6 et 8 semaines. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal, nous avons choisi une application stricte de point limite. Les souris seront observées quotidiennement et notées selon une grille de scoring de la douleur appliquée à l’animalerie qui repose sur l'aspect général (poids corporel, apparence physique, signes cliniques mesurables) et le comportement (modifications du comportement non provoqué, et après stimulation) : -Un score de niveau zéro n’entrainera aucune intervention particulière. -Un score de niveau 1 entrainera des soins spécifiques comme l’utilisation d’aliments gélifiés à même la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture des animaux présentant une hypoactivité ou de l’ataxie, l’utilisation de tunnels de transfert pour la manipulation des souris présentant un phénotype de nervosité, l’utilisation d’analgésiques complémentaires, un contrôle biquotidien, une pesée régulière, une consultation éventuelle avec la Structure du Bien-Etre Animal et le vétérinaire. -Un score de niveau 2 sera le point limite et nécessitera une décision de mise à mort par la méthode de dislocation cervicale.
Choix des espèces
La lignée de souris crée est le modèle murin idoine puisqu'il développe des symptômes cliniques similaires au syndrome de Rett, avec un déficit neurologique sévère qui apparait vers la 5ème semaine et une létalité de 50% à 6 semaines. Pour ces raisons, nos expériences seront limitées aux 8 premières semaines de vie mais à différentes étapes du développement du cortex : 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. La multiplication des points de cinétique est essentielle à notre étude puisqu'elle permettra de vérifier si la fonction chromatinienne de MeCP2 lors du développement post-natal, est concommitante à l'apparition des troubles neurologiques dans les neurones en maturation dépourvus de MeCP2.
DETERMINATION PRELIMINAIRE DE LA TOXICITE ET TOXICOCINETIQUE DE CANDIDATS MEDICAMENTS ADMINISTRES PAR VOIE INTRAVEINEUSE CENTRALE, VIA UN CATHETER CHEZ LE RAT
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 280 rats vont être utilisés, chacun porteur d'un cathéter implanté dans la veine fémorale ou jugulaire, avec jusqu'à trois administrations par jour pendant quatre semaines, six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et jusqu'à seize heures en cage à métabolisme, privés d'eau. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, pour rechercher dans leurs organes les cibles de la toxicité des molécules testées. Une partie d'entre eux est hébergée seule, de l'implantation à la fin du traitement, quand le cathéter oblige à poser un harnais qu'un congénère abîmerait. Ces essais interviennent en amont des études réglementaires, pour trier les candidats médicaments d'une recherche pharmaceutique privée avant les tests obligatoires, plus consommateurs d'animaux.
Objectifs
L’objectif de la Recherche et Développement (R&D) Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. Pour un candidat médicament, la R&D pharmaceutique vivo se doit de déterminer la fenêtre thérapeutique pour l’administration chez l’Homme, c’est-à-dire l’intervalle de doses entre lequel le candidat est à la fois actif et efficace et engendre le moins de toxicité possible. Pour cela, des études de toxicologie (incluses dans ce projet) ainsi que des études de pharmacologie (efficacité, mode d’action du candidat médicament) doivent être mises en place conformément à la réglementation. Les études préliminaires in vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet permettent de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (marge de dose permettant une efficacité et absence de toxicité). Les données d’efficacité et de sécurité permettent ainsi conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament. Les études de ce projet concernent des candidats médicaments dont l’administration sera réalisée par administration intraveineuse chez le Rat via un cathéter implanté dans un vaisseau de large diamètre tel que la veine fémorale ou jugulaire (mimant l’administration chez l’Homme, ce qui diminue les risques d’intolérance locale par rapport à une administration périphérique dans un vaisseau de plus petit calibre et permettant des administrations répétées et/ou sur une longue durée sans aucune contention de l’animal). Elles interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo réglementaires) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après une première étape de caractérisation et de sélection des molécules in vitro (modèles cellulaires de neurotoxicité, d’hépatotoxicité, de cardiotoxicité...) et in silico (analyse informatique de la génotoxicité). Ces études sont réalisées chez le Rat (présentant une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et étant considéré comme le plus prédictif en toxicologie) en utilisant les candidats médicaments les plus prometteurs mais également les composés autres que le principe actif du candidat médicament qui seront utilisés pour la suite du développement afin de déterminer en parallèle leurs profils de sécurité s’ils n’étaient pas encore établis.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et du développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet de recherche) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires et d’évaluation pharmacologique qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet ainsi d’optimiser les études et de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament dans le cadre d’administrations via un cathéter. Les deux procédures de ce projet (et associées aux informations fournies par les études de pharmacologie) permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique donné.
Procédures
L’ensemble des animaux inclus dans ce projet pourront être soumis : - A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés via le cathéter (de quelques minutes jusqu’ à perfusion de 4 heures maximum) - A l’administration d’analgésique avant l’euthanasie (administration unique de quelques secondes) - A des prélèvements de sang en prélevant une faible quantité de sang prélevée à la veine marginale externe de la patte ou veine caudale sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude (30 secondes par prélèvement environ) - A des prélèvements via le cathéter dédié de courte durée et maximum 6 fois par jour à ces prélèvements si besoin de quantités répétées plus importantes - A des recueils urinaires d’une durée comprise entre 6h (cas standard) et 16 heures (cas exceptionnel) en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) avec diète hydrique d’une durée correspondant à celle du recueil (6h en standard et 16h maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère (en dessous du seuil réglementaire) au maximum 2 fois par étude
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • L’administration via le cathéter nécessite une contention douce quel que soit le système utilisé (VAB ou VAH) et le placement de l’animal dans une cage dédiée au traitement – Traitement hebdomadaire à une fois par jour pendant 4 semaines maximum – Durée de quelques minutes à plusieurs heures – Degré de sévérité modéré • Hébergement individuel : le cathéter implanté peut nécessiter la mise en place d’un harnais de protection sur l’animal. L’utilisation de ce système appelé VAH (Vascular Access Harness), qui sera limitée à son maximum, et mise en place seulement si le système VAB (Vascular Access Button) ne peut pas être utilisé, nécessite une stabulation individuelle des animaux de l’implantation jusqu’à la fin de la période de traitement puis du maintien des animaux (afin d’éviter la dégradation du dispositif par un congénère) ce qui peut générer un stress pour l’animal – Degré de sévérité modéré • Prélèvements de sang à la veine marginale externe de la patte ou à la veine de la queue : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (Degré de sévérité modéré). Placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux dans le cas d’un prélèvement à la veine de la queue (5 minutes – degré de sévérité modéré) • Recueil urinaire (cage à métabolisme) : Le changement d’environnement et l’hébergement individuel de courte durée (6h en prélèvement diurne en standard, exceptionnellement prélèvement nocturne inférieur à 16h, cas qui devra être justifié par le demandeur) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal – 1 seule fois par étude (Degré de sévérité léger) • Administrations sous-cutanées (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (Degré de sévérité léger) - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, le poids corporel par exemple).
Devenir
Tous les animaux de la procédure ayant reçu une administration de candidat médicament (ou de formulation/véhicule) seront euthanasiés pour prélèvements et examens divers (histologie, toxicogénomique, etc…) puisqu’un des objectifs est de rechercher les organes cibles potentiels. Si les animaux cathétérisés venaient à ne pas être utilisés dans le cadre de ce projet ils seront euthanasiés pour prélèvement d’organes ou de fluides et mise au point (histologie, biologie clinique, études vitro par exemple).
Remplacement
Ce projet couvre la réalisation d’études très précoces réalisées sur l’ensemble des candidats médicaments de notre recherche (intervenant en complément d’autres études de sécurité non clinique décrites dans d’autres projets, et mises en place seulement si nécessité d’utilisation de cathéters pré-implantés des administrations centrales longues ou des composés non tolérés quand administrés par voie périphérique telle que la veine de la queue), études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. En effet, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo.
Réduction
Une sélection des molécules les plus prometteuses est réalisée à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel de rats (2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace pour atteindre les objectifs des procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus réduit possible (nombre éprouvé basé sur une solide expérience en interne et sur les recommandations de la littérature). Il permet d’intégrer de la mixité (nécessaire pour évaluer principalement la toxicité d’un composé sur l’appareil reproducteur mâle et femelle) dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Ces études permettent de confirmer ou d’infirmer les données obtenues grâce aux méthodes alternatives. Elles sont mises en place précocement et profitent des informations des études de pharmacologie réalisées en parallèle (développement de modèle et recherche du mode d’action du candidat médicament). Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études de pharmacologie, le développement de la molécule peut être arrêté évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un nombre d’animaux plus important. Elles permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque et l’impact en termes de bien-être pour les animaux. Un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporels, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour cinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, et à son issue prélèvements d’organes …) réduisant aussi le nombre de rats nécessaire dans chaque procédure. En cas de protocole particulier (ex besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques sera sollicité pour définir le design expérimental le plus optimal. Enfin, l’utilisation du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale externe de la patte ou à la veine caudale) peu invasive, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre de rats (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant la volémie physiologique.
Raffinement
L’utilisation du cathéter pour l’administration Intraveineuse permet de réaliser les administrations uniques ou réitérées des substances étudiées sans contention de l’animal contrairement à une administration intraveineuse périphérique. De plus l’administration via un cathéter dans un vaisseau de gros calibre diminue les risques d’intolérance locale par rapport à une administration périphérique dans un vaisseau de plus petit calibre. L’une des voies d’accès au cathéter à l’extérieur de l’animal consiste en un harnais de protection du cathéter, réglé tous les jours pour s’adapter à la croissance du rat (impliquant une manipulation régulière du rat). La présence de ce harnais nécessite néanmoins l’hébergement individuel et nous privilégierons donc, une nouvelle voie d’accès au cathéter consistant en un bouton transcutané (permet l’hébergement collectif et donc un raffinement important). Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable d’étude, la Structure en charge du Bien-être animal (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase de traitement ou non, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat qui est mise en place rapidement. Le personnel technique formé interagit tous les jours avec les animaux (manipulation) pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Pour les prélèvements de sang, la technique de prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale externe de la patte est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique, de respecter la volémie physiologique du rat et d’améliorer ses conditions de manipulation. La durée du recueil urinaire est limitée, réalisée en standard en journée sur une durée de 6h ou exceptionnellement sur une période nocturne
Choix des espèces
Les 2 procédures de ce projet sont réalisées sur l’espèce rat car elles interviennent en amont des études réglementaires réalisées sur ce modèle. Comme ces études permettent, en particulier, de choisir les doses et le schéma d’administration des études réglementaires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires obligatoires, elles doivent être réalisées sur le même modèle expérimental que celui des études réglementaires. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. Lorsque cela est possible, l’espèce rat doit répondre aux effets pharmacodynamiques du candidat médicament. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en parallèle chez la souris. Les animaux sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.
Rôle d’HSPB5 dans la sécrétion de vésicules extracellulaires : étude dans un modèle murin de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Un inhibiteur de la protéine HSPB5 développé par le laboratoire comme candidat médicament contre la fibrose pulmonaire motive l'utilisation de 1 040 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dose de bléomycine leur est administrée en trente secondes par aspiration au fond de la gorge sous anesthésie, ce qui déclenche entre le deuxième et le septième jour une inflammation des poumons, une perte de poids et des troubles respiratoires, puis une fibrose progressive. Le porteur justifie un effectif supérieur aux usages du domaine par la quantité de vésicules extracellulaires qu'il doit obtenir des animaux pour les injecter à d'autres souris. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude d'un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.
Objectifs
Les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ont une accumulation de vésicules, appelées vésicules extracellulaires (EVs). . Ces vésicules aggravent la maladie de ces patients en transportant des molécules actives (protéines, ADN etc). .Si on inhibe la machine des cellules pour incorporer ces molécules actives dans ces EVs, on réduit la progression de la fibrose dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition de la protéine de stress HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Les objectifs de ce projet sont de : 1) Confirmer que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion des EVs 2) Tester si l’absence d’HSPB5 réduit l’activité des EVs pour aggraver la fibrose.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire développe des inhibiteurs de la protéine de stress HSPB5 comme un médicament dans la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Nous devons mieux comprendre les rôles d’HSPB5 pour développer notre médicament et permettre une meilleure prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire.
Procédures
Les souris seront soumises à une administration unique de bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale (isoflurane). Cette intervention dure 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine est le modèle le plus utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose. Les souris sont exposées à la bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale. Le modèle est composé d’une étape inflammatoire puis d’une fibrose pulmonaire progressive. Entre 2 et 7 jours après bléomycine, un phénomène inflammatoire se met en place. Il est associé à une perte de poids des animaux, ce qui peut entrainer des troubles respiratoires plus ou moins importants suivant la dose injectée. Pour ce projet, une faible dose de bléomycine sera utilisée. Cette dose permettra de réduire au maximum l’apparition potentielle d’effets indésirables induits chez l’animal, et entrainera une fibrose pulmonaire détectable.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour des études biochimiques et histologiques.
Remplacement
Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.
Réduction
Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Pour la procédure 2, une analyse de puissance a été réalisée pour établir les effectifs. Pour la procédure 1, les effectifs décrits sont supérieurs au nombre d’animaux utilisés classiquement. Ceci est expliqué par le nombre d’EVs que nous devons produire pour les injections décrites en partie 2 et par les contraintes statistiques associées aux études biochimiques et histologiques (méthodes indispensables à notre projet). Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au centre de zootechnie de l’université de Bourgogne. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane). Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, l’utilisation de souris offre l’avantage de pouvoir travailler sur des modèles génétiquement modifiés. Dans ce projet nous utiliserons des souris délétées pour le gène Hspb5. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, la toxicité de la bléomycine est d’autant plus importante et rapide que les souris sont petites. Pour minimiser les signes de toxicité aigüe de la bléomycine, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.
Développement des thérapies pharmacologiques et géniques des surdités
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 343
Des rates gestantes boivent chaque jour une eau additionnée de pesticides organophosphorés ou subissent une exposition quotidienne au bruit, puis l'audition de leurs 294 petits est testée à 21 jours, 3 mois et 6 mois. En parallèle, 90 souris porteuses d'une mutation responsable d'atrophie optique dominante reçoivent une injection dans l'oreille interne, et 45 autres, exposées à un bruit du niveau de ceux rencontrés au travail, reçoivent des injections à travers le tympan. 478 animaux au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur attendant chez les rates gestantes de l'agitation, une baisse d'activité et moins d'interactions sociales. Tous sont tués après les derniers tests, leurs cochlées prélevées.
Objectifs
La surdité représente un enjeu majeur de santé publique, avec des causes multiples telles que des facteurs génétiques, l'exposition au bruit, certains médicaments ototoxiques et le vieillissement. À ce jour, les mécanismes exacts responsables de ces pertes auditives demeurent insuffisamment compris, et aucun traitement curatif n'est disponible. Notre recherche se concentre sur trois axes principaux : 1. Développement de thérapies géniques : Nous utilisons un modèle murin simulant la maladie héréditaire d'Atrophie Optique Dominante, qui entraîne une déficience auditive ou visuelle progressive, liée à l’âge à partir de six mois, en comparaison avec les souris témoins. Nous explorons différentes stratégies visant à ralentir ou stopper l'apparition de la déficience auditive chez ces souris. 2. Utilisation des nanoparticules pour le transport de molécules thérapeutiques dans les cellules de l'oreille interne : Cette approche a pour objectif de favoriser la régénération des fibres nerveuses auditives chez des souris adultes ayant subi des lésions auditives dues à un traumatisme sonore. 3. Étude de l'impact de l'exposition au bruit et aux polluants environnementaux chez les rates gestantes : Nous investiguons les effets de ces expositions pendant la gestation sur l'audition des rats descendants.
Bénéfices attendus
Les implications cliniques, sociales et économiques de ce projet sont importantes. Le développement réussi d’une nouvelle technique innovante basée sur la thérapie génique pourrait être appliqué aux patients, offrant ainsi un nouvel espoir aux personnes souffrant d’atrophie optique dominante. Nous savons aujourd’hui que les synapses reliant les fibres nerveuses auditives aux cellules sensorielles de l'oreille interne sont particulièrement vulnérables aux effets du bruit, du vieillissement ou des substances ototoxiques. En démontrant qu’il est possible de traiter ces lésions précoces, nous pourrions proposer des solutions thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes âgées et favoriser un vieillissement en meilleure santé. Enfin, il n'existe actuellement aucune législation européenne encadrant les risques d'exposition au bruit ou aux polluants sur l'audition du fœtus pendant la grossesse. Nos résultats obtenus de ce projet fourniront des données précieuses sur les troubles auditifs chez les descendants dont les mères ont été exposées au bruit ou aux polluants pendant la grossesse.
Procédures
1. Injection de molécules thérapeutiques génétiques dans l'oreille interne est une technique maîtrisée par notre équipe. Cette intervention, qui durera entre 10 et 20 minutes, nous permettra d'explorer différentes stratégies génétiques pour ralentir ou stopper les troubles auditifs (comme les bourdonnements d’oreille ou les difficultés à comprendre dans un environnement bruyant) causés par une mutation du gène . Pour mener à bien ces tests, nous aurons besoin de 90 souris présentant cette mutation. 2. Injection de traitements pharmacologiques pour traiter les troubles auditifs. Nous allons effectuer des injections intra-tympaniques de molécules thérapeutiques pharmacologiques chez des souris ayant subi des lésions nerveuses auditives, provoquées par une exposition à des bruits fréquemment rencontrés sur les lieux de travail. Cette injection durera environ 5 minutes. Pour cette étude, nous avons besoin de 45 souris exposées à ces bruits. 3. Effets du bruit et des pesticides sur les rats gestants: Des rates gestantes de 5 mois seront exposées quotidiennement à du bruit environnemental ou à des pesticides organophosphorés (dissous dans l’eau de boisson). Ces facteurs de pollution sont courants dans notre environnement quotidien. Nous évaluerons l’audition de leurs petits à l'âge de 21 jours, 3 mois et 6 mois, en utilisant des tests fonctionnels et morphologiques. Pour cette étude, nous avons besoin de 49 rates gestantes. Nous estimons obtenir environ 294 descendants. À la fin de chaque expérience, après les tests auditifs finaux (soit 6 mois après le traitement, soit 6 mois après la naissance), les animaux seront euthanasiés, et leurs cochlées seront prélevées pour des analyses morphologiques et immunocytologiques.
Impact sur les animaux
Lors de l’intervention chirurgicale pour l’administration locale de traitements dans la cochlée, les animaux pourraient éprouver une douleur modérée pendant leur réveil et durant les 12 heures suivant l’opération. Pendant les tests fonctionnels, une douleur légère pourrait être observée en raison de l'injection d'un médicament destiné à endormir l'animal. Selon les données publiées dans la littérature, aucune douleur ni perte de poids n'ont été observées chez les rates gestantes exposées aux doses autorisées de pesticides dans l'eau potable . Cependant, bien que le bruit utilisé dans cette expérience soit un bruit à un niveau conforme aux normes autorisées, il pourrait tout de même influencer la physiologie et le comportement des rates gestantes, qui sont plus sensibles aux changements de leur environnement. Nous nous attendons ainsi à observer des modifications de leur comportement, comme de l’agitation, une baisse de leur activité ou une diminution de leurs interactions sociales.
Devenir
A la fin des derniers tests d’exploration fonctionnelle soit à l’âge de plus 6 mois, tous les animaux participant à l'étude seront euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre de notre démarche visant à respecter la règle des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en matière d’expérimentation animale, nous avons déjà réalisé des études in vitro sur des cellules de patients atteints d’atrophie optique dominante ainsi que sur des cellules cochléaires provenant des souris, un modèle qui reproduit une perte de synapse de la cochlée. Cependant, pour prouver que nos stratégies thérapeutiques peuvent réellement restaurer la fonction auditive, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux in vivo, qui sont plus proches des conditions réelles observées chez les humains. Nous avons également étudié l’effet toxique de certains fongicides sur des cellules cochléaires de souris, mais pour mieux comprendre l’impact de ces polluants sur l’audition, en particulier en lien avec des troubles comme l’autisme ou les maladies neurodégénératives, l’utilisation de modèles animaux plus complexes, tels que le rat, s’avère nécessaire. Ces études in vivo nous permettront de mieux comprendre les relations possibles entre une exposition prolongée au bruit ou à des polluants environnementaux pendant la grossesse et les troubles auditifs observés chez les descendants.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques. Voici la répartition prévue : • Pour développer des traitements génétiques visant à ralentir ou stopper l’apparition des troubles auditifs liés à un défaut génétique : Nous tiendrons compte des différences individuelles dans la gravité et la progression des symptômes. Grâce à un calcul statistique, nous avons déterminé qu’un total de 90 souris serait nécessaire, réparties en 6 groupes de 15 souris. • Pour évaluer l’effet de deux traitements pharmacologiques contre une surdité induite par l’exposition au bruit : Afin de limiter le nombre d’animaux, un seul groupe témoin sera utilisé. En tout, 45 souris seront nécessaires, réparties en 3 groupes de 15 souris. • Pour étudier l’impact de l’exposition aux polluants de rates gestantes sur l’audition de leurs descendants : Nous réduirons également le nombre d'animaux en utilisant un groupe témoin de 15 rates gestantes non exposées, et deux groupes de 17 rates chacune, exposées soit à un cocktail de polluants, soit au bruit. Cela représente un total de 49 rates gestantes. Nous prévoyons d’obtenir environ 90 jeunes rats dans le groupe témoin, 102 dans le groupe exposé aux polluants , et 102 dans le groupe exposé au bruit. Ces effectifs sont suffisants pour mener à bien l’ensemble des évaluations fonctionnelles et des analyses morphologiques prévues dans le protocole expérimental. Pour les analyses morphologiques, nous envisageons d’inclure environ 5 à 6 jeunes rats par type d’analyse, à chaque point temporel (21 jours, 3 mois et 6 mois), et pour chaque sexe. Cela représente environ : 5 rats × 3 types d’analyse × 3 âges × 2 sexes = environ 90 rats par groupe. Ces choix ont été faits afin de minimiser l’utilisation d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques solides et fiables
Raffinement
Dans les groupes d'animaux utilisés pour développer des traitements génétiques et pharmacologiques : • Les animaux seront observés quotidiennement dès leur inclusion dans le protocole expérimental. • Ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec des copeaux, des rouleaux de cellulose, et des refuges en plastique pour améliorer leur bien-être. • Après l’opération, une injection sous-cutanée d'antibiotiques sera administrée pour prévenir les infections. Si des signes de douleur ou d'inconfort sont détectés, une euthanasie anticipée sera effectuée pour éviter toute souffrance. • Le réveil après l’opération aura lieu dans un espace isolé. Une fois réveillées, les souris seront remises avec d’autres souris qui étaient dans la même cage et opérées le même jour. • Une visite quotidienne, y compris les week-ends, sera assurée pour veiller à leur état de santé. • Les tests auditifs seront réalisés chez les animaux anesthésiés. Ces tests, non-invasifs, sont couramment utilisés chez l’humain sans anesthésie. Dans l'étude de l'impact de l’exposition aux polluants sur l’audition des descendants de rates gestantes : • Les rats gestants seront surveillés régulièrement tout au long de la grossesse et après la naissance de leurs petits. • Une grille de suivi sera utilisée pour évaluer l'état des animaux. • Pour réduire le stress lié à l’exposition au bruit, les femelles gestantes seront maintenues en groupes sociaux, favorisant ainsi les interactions positives entre elles pour diminuer le stress.
Choix des espèces
Pour évaluer la possibilité de restaurer la fonction auditive chez les patients atteints d'atrophie optique dominante (AOD), nous avons choisi d'utiliser des souris mutantes qui présentent une neuropathie auditive et optique, reproduisant la condition humaine AODplus. Nous testerons également des traitements pour favoriser la repousse des fibres du nerf auditif à l'aide de de petites molécules qui imitent le facteur de croissance, protégées dans de très petites particules. Ces traitements seront testés sur un modèle de souris ayant une synaptopathie auditive, causée par une exposition à un bruit rencontré dans le lieu de travail. Enfin, nous étudierons l'impact sur l'audition des jeunes rats dont les mères auront été exposées au bruit ou aux pesticides pendant leur grossesse. Les souris mutantes et les souris sauvages exposées au bruit auront entre 1 et 2 mois, et seront suivies pendant 1 à 6 mois après le traitement afin d'évaluer les effets protecteurs des traitements sur l'audition. Pour examiner l'impact des bruits et polluants sur l'audition fœtale, nous utiliserons des femelles rats gestantes. Les humains et les rats réagissent de manière similaire aux sons de basse fréquence, ce qui permet d’étudier les effets de l'exposition au bruit. L’audition des rats se développe après la naissance, tandis que celle des humains est déjà active avant la naissance. Cette différence permet de mieux comprendre comment le bruit et les polluants influencent le développement et la maturation de l'audition.
Etude de faisabilité de l’implantation d’une endoprothèse dans la crosse aortique dans un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Cinq heures d'opération pour implanter une endoprothèse dans la crosse aortique, avec un risque de mort en cours d'intervention par rupture de l'aorte, infarctus, accident vasculaire cérébral ou choc hémorragique que le porteur chiffre lui-même à 20 %. 46 cochons de 80 à 100 kilos vont être utilisés, 31 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 15 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant qu'aucun effet indésirable ni nuisance n'est attendu pour ces animaux, puisque tout se déroule sous anesthésie générale. Tous sont tués en fin de protocole pour retirer l'endoprothèse et analyser l'aorte, le dispositif visant un marché de patients aujourd'hui écartés de la chirurgie ouverte.
Objectifs
Si les dissections de la crosse aortique touchent 250 000 patients par an dans le monde, 90% d’entre eux n’ont pas accès à un traitement chirurgical par contre-indication opératoire ou absence de centre de chirurgie cardiaque . Dans les pays développés qui possèdent un système de santé optimal et un réseau de centres chirurgicaux dense, le taux de mortalité est de 30% tout traitement confondu. L’objectif du projet est de développer une endoprothèse (ou implant) permettant de traiter les dissections de la crosse aortique via une implantation simple, accessible au plus grand nombre de patients. Cette innovation repose sur l’association de matériaux adaptés et d’un design précis. Cette endoprothèse, grâce à l’innovation technologique proposée, s’adapte à la plupart des anatomies et n’est donc pas fabriquée sur mesure ce qui lui permet d’être disponible immédiatement (off the shelf) et donc de traiter les pathologies de l’urgence c’est-à-dire les dissections aortiques ; pathologie non traitée par les modèles existants qui ne peuvent traiter que les anévrismes de la crosse aortiques.
Bénéfices attendus
Le projet en permettant le développement d’un traitement endovasculaire des dissections de la crosse aortique par un dispositif disponible immédiatement (off the shelf), est susceptible d’entrainer plusieurs bénéfices : Permettre de traiter les patients contre-indiqués à la chirurgie: 30% des patients sont contre-indiqués au traitement chirurgical du fait de co-morbidités (âge, fragilité, insuffisance cardiaque ou respiratoire, cancer etc.) mais seraient éligibles à un traitement moins invasif tel qu’un traitement endovasculaire. Permettre de traiter les patients qui n’ont pas accès à un centre de chirurgie cardiaque : Le traitement chirurgical n’est disponible que dans certains centres experts disposant d’un plateau de chirurgie cardio-vasculaire (30 centres en France) ce qui engendre des retards de prise en charge (distance par rapport au centre, délais d’attente liés à la disponibilité des équipes) pour une pathologie qui ne peut supporter le moindre délai (1% de mortalité par heure les 2 premiers jours). Permettre de mieux traiter les patients actuellement opérés par chirurgie ouverte: Le traitement chirurgical est grevé d’un taux de mortalité important (15-20% à 30 jours dans la dissection aortique aigue).
Procédures
Tous les animaux animaux seront soumis aux interventions suivantes : (1) implantation d'une endoprothèse de la crosse aortique par abord vasculaire sous anesthésie générale (N=1 - 5 Heures). (2) Toujours sous anesthésie générale, évaluation angiographique de perfomance (N=2 - 60 minutes). (3) Prélèvement sanguin périphérique sous sédation (N=2 - 30 minutes).
Impact sur les animaux
La douleur liée à la procédure chirurgicale est un effet indésirable attendu. Durant la procédure expérimentale, les animaux seront sous anesthésie générale avec sédation et analgésie profonde afin de prévenir toute souffrance. L’apparition d’un stress est un effet indésirable attendu. Avant d’entrer dans le protocole, les animaux auront 7 jours minimum d’acclimatation dans l’animalerie avec une adaptation de l’environnement de façon à réduire l’angoisse des animaux. Le risque de décès per procédure est une éventualité. Les causes principales sont : anesthésique (arythmie cardiaque sévère, choc anaphylactique, dépression respiratoire grave) évalué à
Devenir
A la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études histologiques au niveau de l'aorte et des études mécaniques sur l'endoprothèse.
Remplacement
Nous avons utilisé plusieurs modèles alternatifs aux animaux. Nous avons dans un premier temps réalisé des tests numériques simulant la compression de l’implant dans une paroi aortique . Nous avons ensuite réalisé des tests mécaniques d’évaluation de la force radiale de l’endoprothèse afin de simuler la compression de l’implant. Nous avons enfin réalisé des essais sur modèles imprimés en 3D d’aorte humaine et porcine avec circuit hydraulique. Ces fantômes d’aorte sont réalisés à partir de scanner de cochon afin d’être le plus proche possible des essais sur modèle animal. Ces modèles alternatifs restent cependant incomplets. La navigation le long des axes vasculaires, la résistance de l’aorte au lanceur et à la force radiale de l’endoprothèse ainsi que l’évaluation des risques de saignements et de rupture aortique ne peuvent être testées que sur modèle animal. Par ailleurs, il est nécessaire d’évaluer le comportement du système cardio-vasculaire lors de cette implantation qui présente plusieurs risques à ce niveau (risque d’infarctus du myocarde, fibrillation ventriculaire, tamponnade, AVC). Par ailleurs, après chaque test animal, si une modification du dispositif doit être réalisée, des tests numérique et mécanique sur fantômes sont à nouveau réalisés.
Réduction
Afin de déterminer le nombre de sujet nécessaire à cette étude de faisabilité, de performance et de sécurité du dispositif médical, nous avons réalisé un premier essai animal de faisabilité qui nous a permis d’étudier le dispositif selon les critères d’évaluation de la norme ISO 25539-1:2017(E) pour les prothèses endovasculaires. Ce premier essai a servi de base au calcul du nombre de sujets nécessaire (NSN) pour cette étude. Le NSN pour obtenir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre limité mais suffisant d'animaux. En prenant en compte le risque de complication anesthésique grave (arythmie cardiaque sévère, choc anaphylactique, dépression respiratoire grave), il est nécessaire d’inclure des animaux supplémentaires dans chaque groupe du protocole. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, si les critères de performance minimaux pour l'évaluation du lanceur sont atteints, la procédure d'évaluation de la prothèse en aigu pourra être réalisée sur le même animal. Dès que le nombre d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs sera atteint, aucune autre inclusion ne sera nécessaire.
Raffinement
Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Privilégier les ponctions vasculaires percutanées échoguidées artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue : moins de souffrance, moins de saignement et risque infectieux réduit. S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée (narcose, analgésie et curarisation) aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie. Lors des contrôles quotidiens, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Enfin, une grille de points limites a été établie et sera suivie pour assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’objectif de ce programme étant de développer un dispositif médical dont la principale innovation repose sur son design, il est essentiel de pouvoir tester l’endoprothèse dans un modèle possédant une anatomie cardio-vasculaire la plus proche possible de l’homme. Les animaux utilisés dans le protocole expérimental sont des porcs de 80 à 100 kg (entre 20 et 24 semaines). A ce stade de développement les porcs ont un système circulatoire très proche de l’homme et leur gabarit permet une modélisation chirurgicale optimale, notamment en ce qui concerne les diamètres aortiques.
Évaluation de l’effet du Zolédronate sur la cicatrisation et l’ostéointégration en implantologie dentaire : Développement d’un modèle intra-oral chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Tués douze semaines après leur première opération pour que leur mâchoire soit photographiée, scannée et découpée en coupes histologiques, 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux premières molaires du haut leur sont arrachées sous anesthésie, puis ils reçoivent du zolédronate en injection dans l'abdomen, éveillés, avant qu'un implant dentaire ne leur soit posé quatre semaines plus tard. Le porteur qualifie la douleur de modérée et les complications postopératoires de rares. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la cicatrisation osseuse autour d'un implant après la prise de ces médicaments, et présente son propre protocole comme un modèle réutilisable pour tester ensuite le tabagisme ou la maladie gingivale.
Objectifs
L'ostéonécrose des mâchoires associée aux médicaments est une complication potentiellement sévère qui affecte les patients atteints de pathologies concernant le tissu osseux, comme l'ostéoporose et certaines maladies oncologiques, en particulier les cancers du sein et de la prostate. Ces patients suivent des traitements médicamenteux qui modifient le renouvellement normal du tissu osseux, entraînant une augmentation de sa densité. Parmi ces médicaments, on retrouve les bisphosphonates De nombreux modèles précliniques ont été développés chez le rat, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension de cette pathologie. Cependant, les mécanismes à l'origine du développement de la nécrose osseuse restent encore partiellement élucidés. La recherche animale a permis de mettre au point des modèles intégrant des facteurs de risque initialement observés chez l'humain. Il est clairement établi que la nature du médicament administré ainsi que le protocole de dosage influencent le risque de développer cette maladie chez les patients. En fonction de la dose administrée, les patients sous traitement avec ces médicaments sont classés en deux catégories : forte dose (patients oncologiques) et faible dose (patients atteints d’ostéoporose). Selon la littérature actuelle, outre les facteurs systémiques et médicamenteux, des facteurs locaux peuvent également favoriser le développement de cette maladie, notamment la chirurgie implantaire. Les recommandations scientifiques internationales contre-indiquent la pose d'implants chez les patients sous traitement à forte dose. En revanche, chez les patients sous faible dose, l'implantologie est autorisée, bien que le risque de développer une ostéonécrose des mâchoires reste incertain. LL'objectif de cette étude est de développer un modèle expérimental chez le rat afin d'évaluer l'effet de différentes doses de ces médicaments sur le processus d’ostéointégration dans un alvéole totalement cicatrisé. Plus précisément, le médicament choisi est le Zolédronate, qui appartient à la classe des bisphosphonates. Ce modèle exposera les animaux à deux dosages distincts, reproduisant ceux administrés chez l’humain pour le traitement de l’ostéoporose (faible dose) et des pathologies oncologiques (forte dose).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant dentaire après l’administration de traitements avec des médicaments qui altèrent le fonctionnement normal du tissu osseux. De plus, il aidera à évaluer la faisabilité de la pose d’implants chez les patients recevant une faible dose de ces médicaments (qui représentent la majorité des utilisateurs), ainsi qu'à analyser les risques liés à une administration à forte dose chez les patients oncologiques. Pour les recherches futures, cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (ex. : tabagisme, maladie gingivale, etc.) dans le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implantau sein de cette population vulnérable.
Procédures
Pour tous les animaux, une période d’acclimatation (minimum 7 jours) est appliquée avant l’initiation du protocole T0 : Extraction dentaire Au début de l'expérience (T0), une extraction de la première molaire maxillaire gauche et droite sera pratiquée sur tous les animaux. Ils recevront une injection d’analgésique (quelques secondes), puis seront anesthésiés pendant 15 minutes sur un tapis chauffant. L'administration de l'analgésique (renouvelée 2 fois par jour) se poursuivra pendant les deux jours suivants. T1 : Administration des traitements Quatre semaines après, l'administration des traitements assignés ou l’absence de médicament débutera sur animal vigile par une injection intrapéritonéale de quelques secondes. T2 : Chirurgie implantaire Quatre semaines après administration médicamenteuse, la pose d'implants sera réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention durera 15 minutes. Une couverture analgésique sera mise en place. Le même protocole pré- et post-opératoire que celui décrit pour l'extraction dentaire sera appliqué. T3 : Analyses post-mortem Quatre semaines après la chirurgie implantaire, les rats seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : - L’extraction ainsi que la pose des implants peuvent entraîner une douleur modérée, qui peut être facilement contrôlée par l’administration d’analgésiques. Les complications post opératoires sont rares. - L’administration du traitement ou de l’analgésie peut induire une courte douleur (moins d’une minute) - Lors du reveil après les chirugies, les animaux peuvent être désorientés et stréssés
Devenir
Afin d’évaluer l'effet des traitements, il est necessaire • D’analyser le site avec l’implant et prendre des photographies. • De réaliser d'un scanner • De prélever des échantillons pour analyse histologique. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de tous les animaux du projet.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’évaluer le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant en simulant le métabolisme osseux après la prise de médicaments. Cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (tels que le tabagisme, etc.) dans le processus d'ostéointégration au sein de cette population vulnérable.
Réduction
Les lots ont été réduits au minimun pour obtenir toutefois des résultats significatifs. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur la littérature et sur une analyse statistique.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation sera observée avant le début du projet afin de réduire le stress des animaux. Avant l’extration dentaire et la chirurgie, les animaux seront analgésiés. Les interventions seront ensuite réalisées sous anesthésie médicamenteuse et sur tapis chauffant. Le bien-être des animaux sera évalué par du personnel compétent à l’aide d’une grille de score. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. De même un arbre décisionnel ainsi que des critères d’arrêt sont définis si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat représente une espèce appropriée pour cette expérience. En effet, la chirurgie d’implant dentaire est bien décrite dans la littérature, et les processus de cicatrisation et d’intégration d’implant sont largement documentés. Cependant, peu d’études se sont spécifiquement intéressées au risque associé à la chirurgie implantaire. Cette expérience pourrait ainsi offrir une opportunité de comparaison avec la littérature existante et d’apporter des données précieuses dans ce domaine. Les animaux utilsés auront de 8 semaines en début de projet. Les rats seront alors adultes, leur machoire ne se developpera donc plus.