Recherche appliquée

Jusqu'à deux gavages par jour pendant vingt-huit jours, et dix prélèvements de sang au maximum sur la durée du protocole : 1 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des dosages sanguins et tissulaires. Certains subissent en fin de protocole un prélèvement intracardiaque sous sédation profonde. Il s'agit de mesurer si des probiotiques modifient la quantité de L-Dopa qui atteint les tissus, la L-Dopa étant le traitement de référence de la maladie de Parkinson. Le rat a été retenu plutôt que la souris parce qu'il fournit des volumes de sang plus importants.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une pathologie neurodégénérative qui constitue un enjeu majeur de santé publique. Son diagnostic clinique repose sur des symptômes moteurs caractéristiques tels que la rigidité, les tremblements, l’altération des réflexes posturaux et la bradykinésie. Outre ces symptômes moteurs, la maladie s’accompagne de nombreuses complications, notamment des troubles cognitifs et sensoriels, des douleurs, ainsi que des troubles du sommeil. Par ailleurs, 80 % des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent également de troubles gastro-intestinaux. Ces troubles, qui précèdent généralement l’apparition des symptômes moteurs, tendent à s’aggraver avec la progression de la maladie. Le traitement de référence repose sur la L-dopa, un précurseur de la dopamine. La conversion de la L-dopa en dopamine est assurée par l’enzyme L-aromatic amino acid décarboxylase (AADC), permettant ainsi de compenser le déficit dopaminergique chez les patients. Contrairement à la dopamine, la L-dopa est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, sa conversion prématurée en dopamine avant de franchir la BHE diminue son efficacité et provoque de nombreux effets secondaires. Pour limiter sa conversion prématurée, la L-dopa est généralement administrée avec un inhibiteur de l’AADC. Des études ont montré que le microbiote intestinal peut réduire la biodisponibilité de la L-dopa. Par exemple, la tyrosine décarboxylase, produite principalement par la bactérie Enterococcus faecalis, peut convertir la L-dopa en dopamine au niveau de l’intestin. A l’inverse, des traitement probiotiques pourraient améliorer certains symptômes chez les patients Parkinsoniens. Toutefois, il est essentiel de vérifier que ces probiotiques n’altèrent pas les concentrations plasmatiques de L-dopa. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les concentrations de L-dopa (dans le plasma, l’intestin ou le cerveau) lors de l’administration combinée de L-dopa (avec ou sans inhibiteur de l’AADC) et de probiotiques.

Bénéfices attendus

La maladie de Parkinson touche environ 1% de la population de plus de 60 ans et représente un problème majeur de santé publique, d’autant plus que son incidence croît en raison du vieillissement de la population. Les traitements actuels ont une efficacité qui ne perdure pas dans le temps alors qu’ils ont de nombreux effets secondaires, il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, telles que les traitements probiotiques, pour améliorer la biodisponibilité des traitements actuels.

Procédures

Les traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles (max 2/jour, environ 30 secondes par gavage). Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 28 jours maximum. Les animaux auront des prélèvements sanguins soit par ponction sublinguale sous anesthésie gazeuse (max 3 ponctions/24h, durée de la ponction environ 1 minute), soit par prélèvement au niveau de la veine caudale (max 2 ponctions/24h, durée de la ponction environ 1 minute). Ils auront un maximum de 10 prélèvements au cours du protocole, et jamais plus de 5 par période de 24h. En fin de protocole, certains auront un prélèvement sanguin intracardiaque sous sédation profonde.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : 1) un stress dû aux administrations répétées par voie orale 2) un stress et une douleur lors des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de sang ou d’organes pour dosages.

Remplacement

Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne reproduisent pas la complexité des interactions systémiques présentes dans un organisme vivant (le métabolisme de la L-dopa dépend de multiples organes) et ne permettent pas de modéliser les interactions entre L-dopa et le microbiote intestinal, ni de modéliser la barrière hémato-encéphalique.

Réduction

Le nombre d'animaux par condition expérimentale a été déterminé par une approche statistique afin de garantir la robustesse des résultats. En raison de la variabilité des réponses aux effets d’un traitement administré par voie orale chez le rongeur, une taille minimale de groupe de 10 animaux est nécessaire. Un effectif inférieur augmenterait le risque de ne pas atteindre une puissance statistique suffisante, pouvant ainsi nécessiter la répétition des expériences pour valider la fiabilité des données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les administrations par voie orale seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté, à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. Les prélèvements sanguins sublinguaux se feront sous anesthésie générale. L’état clinique des animaux sera évalué quotidiennement et attentivement en respectant les points limites mis en place et décrits dans les paragraphes 4.2.1 et 4.2.2. Ils seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs sont des modèles fréquemment décrits. Le rat sera choisi dans ce projet car les quantités de sang obtenues sont plus importantes que chez la souris. Etant donné que la maladie de Parkinson touche les adultes, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures décrites.

Pour sélectionner des candidats vaccins à ARN messager contre les allergies, une société privée va utiliser 1 120 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit trois injections dans le muscle de la patte arrière, puis des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, cinq en trois mois pour 700 d'entre elles, quatorze en un an pour 180 autres. Les atteintes annoncées vont de l'œdème au site d'injection à une douleur musculaire que l'animal signale en se mordant, jusqu'aux douleurs oculaires, œil rouge ou opaque et sécrétions lacrymales. Une grille de points limites est prévue, et les souris qui en atteignent un seuil critique sont mises à mort.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie. Les cytokines sont des protéines sécrétées par les cellules, leur permettant de communiquer entre elles, et pouvant stimuler le système immunitaire. Dans notre étude nous travaillons sur les cytokines IL4 et IL13. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement d'immunothérapies contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s) après administration d’un vaccin. Ce dernier se présente sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm) encapsulé dans des particules lipidiques leur permettant d'entrer dans les cellules. Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin est évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de neutraliser les effets de la cytokine. Dans nos précédentes études, nous avons démontré que le vaccin murin induit une réponse immunitaire neutralisante contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s). Nous avons également démontré que le vaccin humain induit une réponse immunitaire chez des souris humanisées. Ces souris expriment les cytokines humaines IL4 et IL13 ainsi que le récepteur humain IL4Rα. Dans cette nouvelle étude, nous avons 3 objectifs : - Optimiser la réponse immunitaire induite par le vaccin ARN humain en testant différentes doses de vaccins - Evaluer la réponse immunitaire induite par différentes construction de vaccins ARNm humains encapsulées dans différentes particules lipidiques sur du court terme et du long terme. -Evaluer l'effet des vaccins sur les taux de cytokines dans le sang. Pour cela, nous utiliserons les souris exprimant les cytokines humaines IL4 et IL13 ainsi que le récepteur IL4Rα.

Bénéfices attendus

Il permettra de sélectionner les meilleurs candidats vaccins ainsi que la meilleure formulation de particules lipidiques, ainsi que la dose adéquate. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -1060 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (50 à 100 μl). Elles recevront 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28. Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins ARN étaient nécessaires. De plus, des études préliminaires ont montré que chez les souris exprimant les cytokines et le récepteur humains 3 à 4 injections étaient nécessaires pour obtenir une réponse immunitaire efficace. 2)Prèlévements sanguins : Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. Parmis ces 1060 souris : - 700 subiront 5 prélèvements de 150uL chacun sur 3 mois (jour -7, jour 26, jour 38, jour 58, jour 99). - 180 souris subiront 14 prélèvements de 150uL sur 1 an ( A jour -7, jour 26, jour 38, jour 58, jour 99 et une fois par mois jusqu'à 12 mois). - 180 souris subiront 9 prélèvements de 70uL de sang sur 3 mois. ( pré-injection, à jour 1, jour 7, jour 8, jour 28, jour 29, jour 38, jour 58, jour 99).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Nos études nécessitant le prélèvement des organes des souris afin d'approfondir la caractérisation de notre produit, l'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c'est à dire de 7 à 9 semaines, soit environ 20-25 g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

Sept prélèvements de sang à la queue en deux heures, un gavage de glucose et une injection d'insuline, répétés à 20, 60 et 120 jours de vie, plus trois échocardiographies sous anesthésie : 1 350 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvements post-mortem. Les génitrices reçoivent un régime riche en graisses pendant quatre mois, et leur descendance le même régime jusqu'au sevrage, pour reproduire l'effet d'une obésité maternelle sur le cœur des petits. Le porteur indique que la manipulation des ratons peut conduire la mère à les rejeter ou à les mutiler, et que certains animaux ne survivent pas à l'anesthésie malgré l'intubation. Il évoque aussi une injection de vecteur viral pouvant provoquer une insuffisance cardiaque, sans la faire figurer parmi les procédures décrites.

Objectifs

L'obésité est un problème majeur de santé publique et sa prévalence croissante contribue à augmenter l’incidence de maladies cardiovasculaires. L'épidémie de surpoids touche les femmes enceintes et des études épidémiologiques rapportent que les enfants nés de mères obèses présentent un risque accru de cardiopathies congénitales et, à l’âge adulte, des taux plus élevés d'événements cardiovasculaires et de mortalité. Cependant, il existe une véritable lacune dans nos connaissances sur l’origine des mécanismes moléculaires conduisant au développement de ces pathologies cardiaques.Notre objectif est d’établir l’impact du dysmétabolisme périnatal sur le développement de l’insuffisance cardiaque d’origine congénitale. Nous proposons une étude longitudinale sur la descendance pour caractériser la chronologie des altérations cardiaques et les défauts d’organisation postnataux des cardiomyocytes. Nous étudierons les voies (moléculaires, métaboliques) impactées (précocement ou plus tardivement) par le dysmétabolisme maternel pouvant expliquer les altérations développementales du cœur et, pour in fine, identifier des signature spécifiques et biomarqueurs potentiels

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhension du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines d'intérêt identifiées au laboratoire dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Une partie des animaux seront mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les génitrices (2 mois avant la reproduction et pendant la durée de reproduction et lactation). Les géniteurs seront sous régime riche en gras uniquement pour la reproduction. Les petits seront sous le régime maternel correspondant (riche en gras ou contrôle) jusqu’au sevrage (20 jours de vie). Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront réalisées sur animaux vigiles. Le gavage de glucose, procédure très rapide (quelques secondes) sera réalisé à 3 stades : 20, 60 et 120 jours de vie pour tester la tolérance au glucose. Le test de tolérance à l'insuline sera réalisé par injection intrapéritonéale aux 3 stades (20, 60 et 120 jours de vie). Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue (quelques secondes) est effectué sur les animaux vigiles et permet de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte sera répété 7 fois en 2 heures pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le phénotypage cardiaque sera réalisé par échocardiographie (15 minutes), sous anesthésie gazeuse légère, pour d'obtenir de nombreux paramètres morphométriques et hémodynamiques. Les mesures seront effectuées aux 3 temps, 20, 60 et 120 jours de vie (soit 3 fois pour chaque animal). L’électrocardiogramme (ECG) de surface sera réalisé aux mêmes temps à 20, 60 et 120 jours de vie : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie (animaux vigiles) et sera réalisée dans la foule de l'échographie pour réduire le nombre d'interventions. Les animaux sont placés dans un tunnel en plexiglas aéré, les quatre pattes positionnées sur des plaques métalliques permettant de suivre le rythme cardiaque. Une seconde partie des animaux vigiles seront soumis à une injection de virus (AAV) par voie systémique à 1jour de vie (veine jugulaire facilement visible à ce stade). L'intervention est très rapide (quelques secondes). Ils seront phénotypes par ECG de surface et échographie, aux 3 stades (20, 60 et 120 jours de vie). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation. Les tests métaboliques peuvent induire : une sensation de faim lors de la mise à jeun des animaux, une irritation de l'oesophage lors des administrations per os, une légère douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales et des prélèvements de sang. Les prélèvements peuvent induire également une irritation de la queue de l'animal.

Devenir

A l'issue de cette étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem. Ces prélèvements sont nécessaires pour les analyses et pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (1350) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 20 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablement frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont agrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, bâton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anesthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anesthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anesthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont très rapides et peu douloureux. Un analgésique est administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, déshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du cardiomyocyte, qui se fait en postnatal (d'où les stades 5, 20, 60 et 120 jours de vie). - Afin d'étudier le rôle de la protéine d’intérêt sur le développement myocardique (d'où l'injection à 1 jour postnatal). Les rats sont utilisés dès le premier jour après la naissance, et euthanasiés à 4 mois maximum. Ce stade correspond au stade suffisant du développement du remodelage cardiaque. C'est également le stade de maturité totale du myocarde.

Deux plaies de pleine épaisseur dans le dos, sous anesthésie, pour caler la taille des lésions et la durée d'observation d'un projet ultérieur de pansement : 87 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est tondue et ses griffes arrière coupées avant l'intervention, puis ses pansements sont changés tous les trois jours, chaque fois sous anesthésie. Aucun pansement fonctionnalisé n'est testé ici, cette étape sert à préparer celle qui le fera. Le porteur affirme que les modèles de peau in vitro comportent "trop de lacunes" et qualifie le modèle animal d'"incontournable", puis annonce que les 87 souris seront gardées en vie et proposées à l'adoption.

Objectifs

Le projet présenté ici est une étude pilote qui a vocation à mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée. Il est le pré-requis d’une étude sur le développement d’un pansement pour la libération locale et prolongée d’agents pro-cicatrisants type vitamine E en utilisant des pansements fonctionnalisés avec des polymères thermo-répondants. En effet, la cicatrisation des plaies est un processus complexe visant à maintenir la fonction de barrière de la peau. Faute de cicatrisation suffisante, les plaies chroniques entraînent des infections persistantes et l'incapacité des cellules cutanées à se réparer, entraînant une gêne et une détresse importantes chez le patient. Dans notre projet l’idée est qu’après élimination des débris et tissus inertes, le pansement appliqué peut être exploité comme une plateforme pour délivrer des molécules bioactives afin de prévenir l'infection bactérienne et de favoriser la cicatrisation. Le projet a pour objectif de développer des revêtements de polyarginine thermorépondants pour la fonctionnalisation de pansement. Les revêtements développés posséderont trois propriétés : (i) bactéricide à la fois par contact grâce à la polyarginine, (ii) antioxydante et (iii) favorisant la cicatrisation par la libération d'un agent cicatrisant naturel.

Bénéfices attendus

Le projet présenté ici est un projet pilote pour le développement d’un dispositif médical favorisant la cicatrisation de plaies chroniques. L’étude pilote en elle-même doit permettre de mettre en place un modèle murin de cicatrisation cutanée sur lésion de pleine épaisseur. Il permettra de déterminer avec précision la taille des lésions à réaliser ainsi que le temps d’observation. Ainsi nous pourrons raffiner au mieux nos expériences pour la validation de l’effet des recouvrements de surface en cours d’élaboration en assurant plus de reproductibilité.

Procédures

Tonte et coupe des ongles des pattes arrières sur animaux anesthésiés d'une durée de 10 minutes Réalisation de plaies cutanées et mise en place des pansements sous anesthésie d'une durée de 30 minutes Changement des pansements et observation des plaies sous anesthésie d'une durée de 10 minutes tous les trois jours.

Impact sur les animaux

Au cours de l’expérimentation deux plaies cutanées seront réalisées sur le dos de l’animal. La nuisance générée sera de deux ordres. Le premier est la douleur associée à la procédure chirurgicale. La seconde nuisance est l’application de pansement sur les plaies.

Devenir

Animaux gardés en vie et proposés à l'adoption.

Remplacement

Il existe des modèles de peau in vitro. Ces derniers sont plus ou moins complexes. Le plus simple est un modèle en deux couches, une couche épithéliale constituée à partir de kératinocytes et une couche mimant le tissu conjonctif sous jacent sous la forme d’une matrice (biologique ou synthétique) ensemencée avec des fibroblastes. Dans les modèles plus complexes, des cellules immunitaires sont ajoutées dans le succédané de tissu conjonctif. Certains modèles testent également l’incorporation de cellules endothéliales. Ces modèles sont intéressants mais ne permettent pas de recréer les différentes phases de la lésion cutanée et de sa cicatrisation : création d’un caillot sanguin, formation d’un tissu de granulation à partir du tissu conjonctif, ré-épithélialisation. Il manque également les éléments propres à la réaction immunitaire locale qui peut être pertubée par un matériau ou encore un élément essentiel qu’est le mouvement de la plaie. En effet les plaies cutanées par essence sont soumises à des contraintes mécaniques. Ceci doit être pris en compte dans l’évaluation de nos stratégies. En effet pour un pansement l’application de ce dernier sur la plaie est un facteur qui va modifier potentiellement la libération locale du principe actif. Les modèles in vitro comportent donc trop de lacunes qui ne leur permettent pas de représenter fidèlement la situation clinique à traiter et qui nous oblige donc a utiliser un modèle animal.Le modèle animale est également incontournable car les éléments qui seront testés après établissement de ce modèle sont de nouvelles molécules qui nécessiteront avant leur emplois chez l'homme un validation de leur sécurité et de leur efficacité.

Réduction

Il s'agit ici d'une étude pilote, nous allons donc réaliser une étude descriptive. Nous utilisons une approche incrémentale analysant un paramètre du modèle l'un après l'autre. Pour chaque paramètre, il y aura également une approche progressive permettant de limiter le nombre d'animaux lorsque la variable testée a atteint l'objectif. On travaillera donc avec des petits lots d'animaux (4 à 6).

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées en groupe. Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie locale sur le site de l’incision. L’analgésie post-opératoire sera réalisée pour assurer le bien-être des souris avec une surveillance journalière. La chirurgie sera privilégiée le matin. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, coton, tunnel…) afin de permettre la fabrication de nids. L'évaluation du bien-être des animaux se fera au cours d'évaluations journalières à partir d'un tableau de référence (en annexe).

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris car c’est un modèle de cicatrisation décrit dans la littérature qui permettra de diminuer le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. La cicatrisation chez le rongeur est légèrement différente du processus chez l’humain (Chez l’homme, il y a d’abord la ré-épithelialisation puis la granulation avant la contraction alors que chez les rongeurs le processus débute par la contraction, mais la stabilisation de la plaie permet d’éviter le phenomène de contraction. Les souris seront âgées de 10 semaines, il s’agira donc de jeunes adultes. A cet âge la capacité des animaux à supporter des chirurgies est optimale et le système immunitaire est pleinement mature.

Après des essais menés sur des souris privées de système immunitaire, 50 souris immunocompétentes reçoivent sous la peau des cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues chaque semaine dans un cône de contention en inox pour recevoir en intraveineuse un placebo, un anticorps médicamenteux, une immunothérapie ou les deux traitements associés. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'être humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé chez la souris lors des études précédentes, la gravité déclarée restant pourtant modérée. Toutes seront tuées pour peser les tumeurs, mesurer l'infiltration immunitaire et chercher la toxicité sur les organes, en vue d'un essai clinique de phase 1.

Objectifs

Le carcinome à petites cellules du poumon (SCLC), est la forme de cancer du poumon la plus aggressive, avec une survie à 5 ans de seulement 7% avec très peu d'options thérapeutiques actuellement disponibles. L'approbation de nouvelles immunothérapies en association avec un traitement de chimiothérapie conventionnel en première ligne a représenté une nouvelle étape thérapeutique en 2018 avec une diminution du risque de décès d'environ 30% grâce aux réponses prolongées. Cependant, la survie globale à 3 ans reste inférieure à 20 %, dus aux résistances innées et acquises, les options de traitement actuelles restent limitées. Dans ce contexte, notre projet a pour objectif d’utiliser un anticorps médicamenteux qui a montré in vitro son efficacité thérapeutique sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs mais également in vivo sur un modèle murin immunodéficient (sans système immunitaire fonctionnel). L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité du produit étudié seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle murin immunocompétent avant de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’humain.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est l’évaluation du nouveau anticorps médicamenteux Adcitmer utilisé seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle de souris immunocompétentes utilisant une lignée murine de carcinome à petites cellules du poumon. La validation de ce modèle nous permettra d’évaluer le bénéfice d’une bithérapie biomédicament/immunothérapie. L’objectif plus global etant donc d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de contribuer à la mise en place d’un essai clinique de phase 1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de SCLC (cancer à petites cellules du poumon) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés une fois par semaine en intraveineuse avec le placebo, le biomédicament Adcitmer, l'immunothérapie Avelumab ou la combinaison des deux traitements. Pour cela les souris seront placées dans un cône de contention le temps de l'application de la pommade anesthésiante et de l'injection en intraveineuse (5-10 minutes par intervention).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutanée et une contention hebdomadaire en cône de contention pour l'injection en intraveineuse. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intraveineux. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs, de l'infiltration immunitaire des tumeurs et l'évalution de la toxicité sur les organes impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité d'Adcitmer a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de SCLC humaines et sur la lignée murine KP11. L'obtention de données préliminaires in vitro sur ces différentes lignées a permis de limiter le nombre de doses testées dans la recherche d'optimisation des schémas thérapeutiques dans le modèle de xénogreffes de la lignée humaine de SCLC, en modèle souris immundéficient. Grâce à ces expériences préliminaires, nous proposons dans ce projet, d'évaluer la plus-value apportée par une combinaison biomédicament/immunothérapie en testant une dose optimale du biomédicament et non plusieurs.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et la dose testée sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Pour les injections en intraveineuse, les souris seront maintenues dans un cône de contention en inox, pour leur générer moins de stress lors de cette manipulation, les souris seront habituées à cette contention 2 fois par semaine avant leur inclusion dans l’étude. De plus, une pommade anesthésiante sera appliquée avant chaque injection en intraveineuse, et une friandise sera donnée aux souris après. Pour limiter toute souffrance des animaux, une grille décisionnelle a été élaborée afin de monitorer l'état de santé des animaux, si l'un des critères de souffrance est atteint, la décision de sacrifier l'animal sera prise. De plus, afin de limiter les souffrances lors de l'euthanasie, un sédatif sera injectée en intrapéritonéal avant le sacrifice.

Choix des espèces

La génération d'une lignée carcinomateuse murine présentant l'ensemble des marqueurs caractérisant les lignées de SCLC humaines, nous permet d'utiliser un modèle de souris immunocompétente pour évaluer notre traitement. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.