Recherche appliquée

1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales puis une à trois injections de traitement, la tumeur qui pousse sous la peau étant mesurée au pied à coulisse jusqu'à gêner les déplacements de l'animal. Ulcérations, baisse de température, perte de poids et difficultés respiratoires figurent aussi parmi les effets possibles de la croissance tumorale. L'objectif est de documenter une protéine immunomodulatrice déjà repérée par criblage in vitro, le porteur indiquant que ces études chez l'animal sont "requises" pour que le candidat médicament soit autorisé à passer en clinique.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de détruire les cellules tumorales. Cependant, la proportion de patients répondant à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. De plus, ces traitements s’avèrent inefficaces pour certains types de cancers (pancréas, glioblastome, etc.). Pour pallier ces limites, nous tentons de créer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques. Nous avons développé une technologie permettant de produire une grande variété de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de tests (cribles) d’activité immunologique réalisés in vitro, nous avons identifié et sélectionné une protéine immunomodulatrice capable de limiter, chez un modèle souris, la croissance tumorale de deux cancers différents. Ce composé pourrait représenter un médicament pertinent pour lutter contre les cancers. Ces premiers résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez des patients atteints d’un cancer. L’objectif de notre projet est de réaliser ces études précliniques approfondies. Nous évaluerons le candidat médicament pour sa capacité à induire les défenses immunitaires et le contrôle d’un large panel de cancers afin de déterminer ceux pour lesquels il pourrait constituer un traitement pertinent. Nous l’évaluerons aussi en association avec d’autres immunothérapies actuellement utilisées chez le patient afin de déterminer le bénéfice de traitements combinés.

Bénéfices attendus

La proportion de patients répondant aux immunothérapies anticancéreuses actuelles est pour l’instant trop faible et l’efficacité de ces traitements varie en fonction du cancer dont le patient est atteint. La caractérisation approfondie de l’efficacité thérapeutique et du mode d’action de notre candidat médicament permettra de progresser dans : i) l’identification des types de cancers pour lesquels il peut s’avérer efficace, ii) l’évaluation du bénéfice procuré par son association avec d’autres immunothérapies déjà commercialisées, iii) la définition d’un dosage optimal pour une efficacité maximale et une toxicité minimale. Les études précliniques réalisées dans ce projet ouvriront la voie à l’évaluation clinique de l’innocuité et de l’efficacité du candidat médicament chez le patient.

Procédures

Les animaux subiront une injection de cellules tumorales, puis une à trois injection(s) des traitements sera(ont) réalisée(s). Deux prélèvements de sang seront réalisés avec un intervalle de six jours. Les injections et prélèvements de sang seront réalisés en quelques minutes. La croissance de la tumeur sous-cutanée sera suivie par mesure au pied à coulisse. Pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés avant chaque intervention. Les 1980 animaux mentionnés dans la saisine seront soumis à l’injection des cellules tumorales et aux traitements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une douleur locale liée aux injections et aux prélèvements. La croissance tumorale peut engendrer différents effets chez l’animal. L’effet le plus fréquent consiste en une gêne dans la mobilité liée à l’encombrement de la tumeur. D’autres effets, plus rares, peuvent être rencontrés. Ainsi, les animaux peuvent présenter une température diminuée, iune ulcération des tissus. De plus, de façon encore moins fréquente, les rongeurs peuvent subir une perte de poids, des difficultés respiratoires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de prélever différents tissus ou organes. Ces organes serviront à des analyses précise des tissus et des cellules permettant d’étudier l’état des défenses immunitaire. Ces données permettront de déterminer ainsi l’effet du traitement sur le système immunitaire en lien avec son impact sur la croissance tumorale.

Remplacement

Notre objectif est de développer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques pour lutter contre les cancers. Pour cela, nous avons développé une technologie permettant de produire une très grande variété de protéines immunomodulatrices. Nous avons également mis en place des cribles d’activité immunologique réalisés in vitro permettant de se passer d’animaux dans les premières étapes de sélection de protéines présentant les activités immunomodulatrices les plus adéquates. Ces cribles ont notamment permis de sélectionner le candidat médicament qui fait l’objet de ce projet et qui s’est montré capable de contrôler la croissance tumorale chez la souris lors de travaux préliminaires. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez le patient atteint d’un cancer. L’évaluation approfondie de l’efficacité immunothérapeutique de ce candidat médicament doit être faite chez l’animal car aucune technique in vitro ne permet de reproduire le lien complexe entre la croissance d’une tumeur et son contrôle par les défenses immunitaires, ces dernières s’établissant dans un premier temps à distance, au sein d’organes immunitaires, pour migrer ensuite vers le site à protéger.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser pour le bon déroulement du projet a été réduit au minimum de deux manières. Premièrement, par la réduction du nombre d’animaux dans chacun des groupes d’étude. Pour cela, une étude statistique préalable a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour la mesure d’un effet thérapeutique significatif. Deuxièmement, par la réduction du nombre de groupes dans les études d’efficacité du candidat médicament en association avec d’autres traitements actuellement utilisés chez le patient. Pour réduire ce nombre, uniquement deux traitements, chacun représentatif d’un type d’immunothérapie, seront évalués.

Raffinement

Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’animal. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, ceux-ci seront anesthésiés avant l’injection des cellules tumorales, des traitements et des prélèvements. Leur état de santé et l’apparition de signes de souffrance liés au développement d’une tumeur seront surveillés tout au long de l’expérience de façon à intervenir de manière appropriée, notamment via l’utilisation d’analgésiques ou d’antiseptiques. Une grille de score qui permet d’évaluer précisément le bien-être de l’animal, des points limites et critères d’arrêt seront utilisés pour décider de l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité anti-tumorale du traitement ainsi que son mode d’action, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique pour étudier l’efficacité de traitements contre le cancer. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer l’effet de l’immunothérapie sur le système immunitaire ainsi que sur la croissance tumorale.

Des injections dans l'œil détruisent les cellules à mélanopsine de la rétine, une chirurgie cérébrale de trente à quarante-cinq minutes vient ensuite moduler une structure du cerveau. 546 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever rétine et cerveau. Dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures, chaque animal est isolé dans une cage individuelle pour mesurer son activité locomotrice, puis placé quinze à vingt jours en obscurité constante, afin d'évaluer les effets d'une exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence. Le porteur annonce sept tests comportementaux "validés" sans préciser lesquels, et qualifie l'obscurité constante de procédure standard n'induisant "aucune nuisance".

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 h synchronise l'horloge biologique du cerveau. La lumière a des effets positifs et négatifs selon ses caractéristiques (moment, durée, intensité, spectre, etc.). La littérature montre qu'une exposition aberrante à la lumière, notamment bleue la nuit, altère les rythmes, la cognition et induit des états dépressifs chez l'animal et l'Homme. Les cellules à mélanopsine de la rétine jouent un rôle clé dans la médiation de ces effets. La lumière pénètre dans l'organisme par la rétine, captée par par des cellules particulières, sensibles à la lumière bleue, convertissant le signal lumineux en un signal biochimique transmis aux structures cérébrales régulant les rythmes biologiques, l'humeur et la cognition. Les adolescents, plus sensibles à la lumière, présentent un risque particulier d'exposition nocturne à la lumière bleue, car les troubles mentaux surviennent souvent avant 25 ans. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence contribue au développement de troubles circadiens (par exemple un décalage du cycle veille sommeil ou un retard chronique à l'endormissement), affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Cette étude sera réalisée sur le modèle diurne Arvicanthis ansorgei, plus pertinent que les rongeurs nocturnes comme les rats ou souris. Les objectifs sont : 1) Étudier l'impact de la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition via des tests comportementaux validés. 2) Analyser les conséquences sur la rétine, son fonctionnement et ses projections cérébrales. 3) Caractériser les effets dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine régulant ces systèmes. Cette analyse, de la cellule au comportement, aura des résultats déterminants pour la recherche fondamentale et clinique. Avenant : Nos résultats montrent que les animaux exposés à la lumière nocturne ont un retard de rythme biologique, indiquant une perturbation de leur horloge interne. Une procédure étudiera le rôle de la sérotonine dans cette perturbation. Une autre teste si cet impact affecte leur capacité à se réajuster après un changement d'heure. Enfin, une troisième examine si la lumière bleue nocturne les rend plus sensibles au stress.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Pour définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 interventions. La première, l'électrorétinographie (ERG), évalue la fonction visuelle. Le test est similaire à celui chez l'homme, mais l'animal est endormi pendant l'enregistrement. Chaque test dure 45-60 min, avec deux passages : un avant et un après l'exposition à la lumière pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux passeront 7 tests comportementaux validés pour étudier l'impact de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test varie, mais chaque animal est testé environ 5 min. Pour étudier le rôle des cellules à mélanopsine rétiniennes, les animaux recevront des injections oculaires : une avec un "traceur" pour marquer les projections rétiniennes vers le cerveau, et une seconde avec des molécules pour cibler spécifiquement les cellules à mélanopsine et les détruire. Ces injections se font sous anesthésie et analgésie. Enfin, pour vérifier l'implication d'une structure cérébrale régulant l'humeur et la cognition, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie. Des molécules pharmacologiques seront injectées pour moduler l'activité de cette structure. La procédure dure entre 30 et 45 min. Après récupération, un activateur de ces molécules sera injecté dans la cavité abdominale pour inhiber certains neurones. Avenant : suite aux premiers résultats, les animaux recevront une injection (moins d'une minute par animal) sur animal vigile pour bloquer un messager chimique spécifique. Ils subiront ensuite des changements de cycle lumineux. D’autres animaux seront soumis à des cycles lumineux simulant des décalages horaires ou à du stress par immobilisation (quotidiennement, pendant 2h maximum, et sur 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances: 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur horloge biologique, les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à différents types d'injections, toutes réalisées sous anesthésie. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). 7) Les animaux seront soumis à une exposition à des cycles lumineux perturbants, et à une immonilisation pouvant provoquer du stress, des perturbations physiologiques, un incofort temporaire et une altération du comportement. avenant : l’administration de molécule dans l'abdomen peut causer une légère douleur et un inconfort temporaire à l’endroit de l’injection. Le décalage horaire simulé (jet lag) peut créer du stress, perturber leur activité et nuire à leur sommeil. Ces effets peuvent durer entre 10 et 15 jours, selon la rapidité avec laquelle l’animal se réajuste. Enfin, l’immobilisation peut provoquer une douleur, du stress, des comportements inhabituels, comme des bruits ou de l’agitation, une réduction de l’activité, une perte de poids ou un manque d'appétit. Ces effets varient en fonction de l'animal et de la durée et de l'intensité de l'immobilisation.

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

Six chevaux subissent jusqu'à vingt-cinq prises de sang par phase expérimentale, répétées sur huit phases, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque phase comporte une administration d'antibiotique, l'objectif étant de recalculer doses et intervalles pour des molécules anciennes déjà utilisées chez le cheval, afin de préserver les antibiotiques récents pour la médecine humaine. Le porteur indique que le stress des prélèvements répétés sera limité par du renforcement positif, récompenses alimentaires à l'appui. Les six animaux viennent d'un centre équestre où ils travaillent quotidiennement, et ils y retourneront à la fin du projet, choix que le porteur justifie aussi par le souci de ne pas mobiliser des chevaux pour cette seule étude.

Objectifs

Pour préserver l’efficacité des antibiotiques « récents » en médecine humaine, il est recommandé d'utiliser des antibiotiques « anciens » en médecine vétérinaire. Ces antibiotiques « anciens » sont déjà utilisés chez le cheval mais du fait de l'ancienneté des autorisations de mise sur le marché de ces antibiotiques, une révision et une optimisation des modalités de traitement (doses, voies d'administration, intervalles de traitement) sont nécessaires pour garantir l'efficacité des molécules pour traiter les infections chez le cheval. Les objectifs de ce projet seront donc de (1) déterminer le devenir de certains antibiotiques « anciens » dans l’organisme de chevaux selon plusieurs modalités d'administration, (2) prédire par des modèles mathématiques l'efficacité ou non des différents traitements antibiotiques contre des bactéries rencontrées fréquemment chez les chevaux, et (3), dans l'éventualité d'une inadéquation des protocoles de traitements actuels, proposer par des modèles mathématiques des doses et intervalles d'administration permettant une lutte efficace contre les bactéries les plus fréquemment responsables d’infection chez le cheval.

Bénéfices attendus

Les applications attendues sont (1) l'utilisation plus efficace des antibiotiques « anciens » pour améliorer le traitement des chevaux malades tout en limitant les durées de traitement et les utilisations inutiles (2) la réduction de l’utilisation des antibiotiques « récents » en médecine vétérinaire ce qui permettra de les préserver pour la médecine humaine.

Procédures

Il y aura 8 phases expérimentales comportant chacune 25 prises de sang au maximum et une administration d'antibiotique. L'administration durera de 2 min à 10 min environ. La durée des prises de sang sera de 30 secondes au maximum (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins nécessaires à l’obtention de plasma seront réalisés de manière répétée et peuvent entrainer un stress qui sera diminué au maximum notamment en utilisant le renforcement positif. En ce qui concerne les effets indésirables attendus, aux doses utilisées dans notre étude, leur survenue sera peu probable. Néanmoins, les chevaux auront des examens cliniques quotidiens, la consistance des crottins sera monitorée, et une observation détaillée sera réalisée dans l’heure suivant l’administration.

Devenir

Les chevaux utilisés travaillent quotidiennement en centre équestre. Les actes prévus sur ces animaux (administration d'antibiotiques selon les modalités prévues pour cette espèce et prises de sang) sont compatibles avec un retour à leur activité normale à la fin du projet.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...).

Réduction

Seulement 6 chevaux seront utilisés lors de cette étude. Ce nombre est suffisant pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'une substance tout en étant nécessaire pour détecter une éventuelle variabilité interindividuelle. L'avantage de l'utilisation de chevaux permet également de réaliser plusieurs cinétiques sur le même animal tout en ayant un impact limité sur le bien-être des animaux. Enfin, afin de ne pas utiliser des animaux exclusivement pour ce projet, les animaux utilisés seront des chevaux provenant d'un centre équestre.

Raffinement

Les chevaux utilisés pour ce projet travaillent régulièrement en centre équestre ce qui permet d'avoir des chevaux habitués au contact humain, manipulés quotidiennement, avec un suivi régulier de leur état général par un vétérinaire. Ils vivent au pré en groupes constitués selon leurs affinités et ne seront placés en boxs que ponctuellement pour les administrations et les prises de sang. Au cours de l'étude, les chevaux auront des examens cliniques quotidiens, la consistance des crottins sera monitorée, et une observation détaillée sera réalisée dans l’heure suivant l’administration. Si le suivi clinique d'un animal révèle une intolérance ou un effet secondaire majeur, l'expérimentation sera arrétée sur l'animal en question et des soins appropriés seront effectués. Le stress des prélèvements sanguins sera diminué au maximum notamment en utilisant le renforcement positif (récompenses alimentaires lors de la réalisation des prises de sang).

Choix des espèces

Ce projet concerne la détermination des paramètres pharmacocinétiques d'antibiotiques chez l'espèce cible, le cheval. Nous utiliserons des chevaux adultes, entre 2 et 20 ans, pour pouvoir étudier la pharmacocinétique de chevaux adultes. On évitera les chevaux trop âgés qui pourraient présenter des paramètres pharmacocinétiques différents et non représentatifs des chevaux de sport et de loisir.

Gardés en vie pour être réintroduits plus tard dans d'autres protocoles, 50 porcs, 25 macaques à longue queue et 25 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur prélèvent sous anesthésie salive, cellules de joue, sang ou moelle osseuse, cette dernière ponction pouvant provoquer une douleur au point de piqûre et imposant au moins quatre semaines de récupération. Aucune question scientifique propre n'est posée ici. Ces prélèvements alimentent des tests in vitro préalables, destinés à décider si telle ou telle espèce sera utilisée ensuite, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas de remplacement possible" pour obtenir ces échantillons.

Objectifs

Cette demande correspond à un autorisation de prélèvements d’échantillons biologiques en dehors et/ou en amont de projet autorisés. Effectivement, il est parfois nécessaire de réaliser en dehors et/ou en amont de protocoles autorisés des prélèvements biologiques de petits ou moyens volumes/quantité (sang, moelle osseuse, salive, cellules buccales par exemple …) pour permettre la réalisation de test in vitro préalable à une étude.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ces prélèvements sont de pouvoir étudier et évaluer in vitro certains paramètres liés à ces espèces. Ces résultats préliminaires établis in vitro en amont des protocoles d’expérimentation animale permettent de définir, de cibler et d’affiner l’intérêt et la rationalité d’utiliser ou non telle ou telle espèce, et potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans une démarche de respect de la règle des 3R.

Procédures

Prélèvements sous anesthésie : salive par aspiration (5 min), prélèvement de cellules de bas-joues par frottement (5 min), de sang (5 min) ou de moelle osseuse (15 min). Prélèvement unitaire suivi d’une période de récupération pour chaque individu.

Impact sur les animaux

Les prélèvements biologiques sont réalisés sous anesthésie de façon à atténuer le stress des animaux. Les prélèvements de salives, cellules buccales et de sang sont des prélèvements peu invasifs qui peuvent induire de l’inconfort. Les prélèvements de sang nécessitent un temps de récupération selon le volume prélevé. Le prélèvement de moelle osseuse peut induire une douleur au point de ponction et sera associée à une analgésie. Il nécessite un temps de récupération d’au moins 4 semaines après le prélèvement.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et pourront être introduits ultérieurement dans un autre projet expérimental dans le cadre d'une procédure légère ou modérée, après décision du vétérinaire.

Remplacement

Il n’existe pas de remplacement possible pour l’obtention d’échantillons biologiques intrinsèques aux animaux pour tests in vitro. Ces prélèvements répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement.

Réduction

Cette autorisation correspond à des besoins ponctuels d’échantillons biologiques chez des animaux en dehors et/ou en amont de protocoles, c’est pourquoi aucune approche statistique n’est envisagée. Cependant les animaux concernés par cette autorisation, en première utilisation ou en réutilisation après un protocole antérieur, seront inclus ultérieurement dans différents projets d’études expérimentales pré-cliniques autorisés, selon décision du vétérinaire, ce qui contribue à une réduction du nombre d’animaux utilisés à moyen terme.

Raffinement

De façon à diminuer le stress et l’inconfort des animaux, les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, sur tapis chauffant. Le volume des prélèvements sanguins sera limité à la volémie de chaque individu. Leur fréquence sera limitée au temps de récupération par rapport au volume précédemment prélevé. Cependant, dans la grande majorité des cas, les volumes de sang prélevés seront largement inférieurs aux limites. Le prélèvement de moelle osseuse sera accompagné d’un traitement analgésique. De façon à diminuer les interventions et si les besoins scientifiques de mise au point le nécessitent, plusieurs prélèvements pourront être réalisés en même temps sur un même individu à conditions qu’ils n’altèrent pas la récupération de l’individu. De façon à s'assurer du bien-être des animaux prélevés, les points limites mis en place seront observés et appliqués si besoin. Les primates sont hébergés en volière de façon à respecter leur mode de vie en communauté. Les porcs, selon leur taille, sont hébergés par 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. L’ensemble des animaux sera soumis une surveillance quotidienne.

Choix des espèces

Les prélèvements échantillons biologiques de macaques, babouins et porcs, sont nécessaires à la connaissance de plusieurs paramètres en amont d’évaluation précliniques. Ces animaux présentent des similitudes au niveau anatomique, physiologique, métabolique et immunologique avec l’homme. Il s’agit de jeunes adultes et adultes correspondant aux animaux utilisés dans notre établissement selon l’objectif des projets.

Le nerf sciatique droit de 75 rats est sectionné puis suturé sous anesthésie générale, opération de quarante minutes qui leur fait perdre la motricité et la sensibilité de la patte arrière. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et s'achèvent sans réveil, le nerf étant prélevé pour compter les fibres myélinisées et mesurer la gaine de myéline. Le porteur prévoit des difficultés de déplacement, une atrophie possible du membre, des douleurs après l'opération et des automutilations dont il ne peut estimer la durée, et fait courir les animaux vingt minutes par séance sur un tapis roulant pour les limiter. Il écrit par ailleurs que cette opération est "très bien tolérée" par les animaux.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse périphérique. La stratégie de réparation des nerfs périphériques considérée comme le gold-standard est la suture microchirurgicale directe sans tension, avec l’utilisation de greffe nerveuse d’interposition en cas de perte de substance nerveuse. Dans le cadre des lésions des nerfs périphériques dont la réparation par une suture directe sans tension est possible, différents types d’enveloppement nerveux ont été utilisés dans le but d’améliorer les résultats cliniques des réparations. Un enveloppement nerveux est l’utilisation d’un matériel (biologique ou de bio-ingénierie) sous la forme d’un tube placé autour des moignons nerveux, qu’ils soient suturés ou non. L’objectif principal de notre étude pré-clinique sur modèle murin est de comparer les effets de la protection de la suture nerveuse par une enveloppe graisseuse autologue sur la récupération fonctionnelle motrice et sensitive, par rapport à la protection par un manchonnage veineux. L’objectif secondaire est de comparer les caractéristiques histologiques de la cicatrisation nerveuse lors de la protection de la suture par une enveloppe graisseuse, par rapport à la protection par un manchonnage veineux.

Bénéfices attendus

Bien que la chirurgie réparatrice des nerfs périphériques soit aujourd’hui réalisée de manière quotidienne, les résultats ne sont pas excellents. Sur l’ensemble des procédures de chirurgie nerveuse réalisée, seuls 40 à 50% des patients présentent une récupération fonctionnelle satisfaisante. Une régénération nerveuse incomplète peut entrainer une mauvaise récupération motrice, par dénervation musculaire, ainsi qu’une mauvaise récupération sensitive et des douleurs chroniques. Les lésions traumatiques des nerfs périphériques ont des coûts socio-économiques importants, et les résultats concernant la douleur, la durée de récupération, l’impact psychologique et le retour à une fonction de base sont mauvais. Nous espérons que les différents tests réalisés sur la récupération fonctionnelle montreront une différence significative entre les groupes suture avec enveloppement par manchon ou par graisse autologue versus suture seule. Nous espérons également montrer au moins une absence de différence significative entre les groupes manchonnage veineux et manchonnage graisseux. Nous espérons évaluer histologiquement la présence ou non d’un micro-environnement favorable à la régénération nerveuse en cas d’enveloppement nerveux par graisse autologue. Une meilleure récupération fonctionnelle avec l’utilisation de graisse autologue dans cette étude pré-clinique, en comparaison au gold standard de la réparation nerveuse (suture directe microchirurgicale sans tension) permettrait d’appuyer la réalisation d’étude clinique, en particulier dans le cadre des lésions nerveuses périphériques traumatiques. L’utilisation de graisse autologue entourant une suture nerveuse directe serait une amélioration technique simple et peu couteuse du gold-standard. En effet, la disponibilité de graisse autologue est constante sur le site opératoire d’une chirurgie nerveuse périphérique. De plus, une récupération fonctionnelle meilleure ou équivalente avec l’enveloppement de graisse autologue en comparaison au manchonnage veineux dans cette étude permettrait également d’appuyer la réalisation d’études cliniques.

Procédures

Il y a 4 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique. Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale, sous ventilation et durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond à l’entrainement physique sur animal vigile (tapis roulant horizontal) qui permettra une meilleure récupération du positionnement de la patte lésée ; chaque test durera 20 minutes et cela dès J+1 semaine de l’intervention jusqu’à la fin du protocole. – La troisième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (3,6 et 9 semaines post-opératoire), chaque test durera environ 20 minutes. -La quatrième intervention est le prélèvement du nerf sciatique, réalisé sous anesthésie générale afin de procéder, par la suite, à l’analyse histologique. Cette dernière étape est sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux. Le prélèvement de la veine jugulaire externe, malgré son rôle majoritaire de drainage veineux cervico-facial chez le rat, n’est pas décrit comme à risque de nuisance chez le rat. Son prélèvement nécessite une incision supplémentaire.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

La réparation des nerfs périphériques comporte des mécanismes physiopathologiques hautement intégrés qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifères ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (chirurgie de la main par exemple).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à l’outil BiostaTGV avec un test bilatéral et une analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8) qui montre que l’effectif théorique de 15 rats par groupe permettra de mettre en évidence des différences significatives. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. Avant chaque procédure, nous réaliserons du "Handling" afin de diminuer le stress de l'animal. L’entrainement physique doux (tapis roulant horizontal) permettra aux animaux de limiter toute automutilation rencontrée lors de nos précédents protocoles. Cette nouvelle technique de raffinement permettra aux animaux d’avoir un membre plus fonctionnel. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chez l'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature et à celles de notre laboratoire. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

L'objet réel du projet est de préparer le dossier d'un immunostimulant avant un essai chez l'être humain annoncé pour le second semestre 2025. 20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue pour recueillir le maximum de sérum et prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à 21 prélèvements de sang sur animal vigile et trois injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse. Le porteur passe en revue la modélisation informatique, les tests sur cellules, les technologies omiques, les tissus humains et les organes sur puce, et écarte chacune de ces méthodes au motif qu'elles ne reproduisent pas un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet s'intègre dans le cadre du développement d'un immunostimulant du système immunitaire inné en cancérologie. Le but de projet d’étude préclinique chez le lapin est d’évaluer la réponse inflammatoire du produit avant une étude toxicologique qui sera menée chez l’homme au début du second semestre 2025. L’objectif de ce projet est de mesurer l’effet composé injecté aura pour démontrer sa bonne tolérance chez le lapin à travers des prises de sang et la mesure de plusieurs composantes physiologique (cytokinique) et pharmacocinétique.

Bénéfices attendus

Les besoins de nouveau traitement en oncologies sont importants. Malgré des investissements significatifs de nombreux besoins médicaux restent non couvert et nécessite d’explorer de nouvelle voie thérapeutique. La stimulation du système immunitaire est un axe thérapeutique important pour « réapprendre » à l’organisme à éliminer des cellules cancéreuses de manière autonome et efficace. Les points de contrôle immunitaire (Immune-Check points) ont apporté des avancées significatives en oncologie. Ce projet s’inscrit dans cette optique, avec le développement de nouveau immunostimulant du système immunitaire inné. Contrecarrer les mécanismes d’échappement tumorale mis en place par les cellules cancéreuses devrait permettre à l’organisme de pouvoir identifier et éliminer les cellules cancéreuses. Ce type de traitement est d’autant plus efficace qu’il permet une réponse sur le long terme en réduisant les risques de récidives et de rechute des patients.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 21 prélèvements. - Injection intraveineuse (sous anesthésies profonde gazeuse), environ 10 min, 3 injections. - Mise à mort sous anesthésie profonde chimique

Impact sur les animaux

Un léger stress peut être causé : - par les prélèvements rapprochés - par les injections. - par les contentions lors de l’expérimentation D’après les études faites sur d’autres animaux aucune autres nuisances ne nous a été rapporté. Nous resterons néanmoins vigilants à tous effets imprévus.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

L'objectif du projet est de mesurer l'impact d'un candidat médicament le) sur un organisme ayant un système immunitaire complet et mature et chez une espèce présentant une sensibilité similaire à l'homme. Après discussion avec l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) il a été conclu que le lapin était l'espèce la plus pertinente. Nous avons réalisé des premiers essais sur du sang frais de lapin pour analyser la réponse des globules blancs sanguins au LipoLPS. En revanche une évaluation de la réponse du système immunitaire complet ne peut être réalisée que sur un organisme entier et nécessite l'administration à des lapins. Nous avons étudié les alternatives qui n’ont malheureusement pas pu être retenues : Modélisation informatique/ in silico : Ces modèles peuvent prédire comment un médicament diffusera dans le corps humain. Néanmoins les modèles informatiques n’arrivent pas encore à prédire comment une réaction de type inflammatoire pourra être quantifiable car les paramètres sont trop nombreux. Méthodes in vitro : Les tests réalisés sur des cellules en culture, permettent d'évaluer en partie la réponse inflammatoire. Dans le cas de ce projet, les modèles in vitro ne peuvent pas mimer une réponse complexe avec de nombreux types cellulaires différents. Méthodes in omic : Les technologies omiques, comme la génomique, la protéomique et la métabolomique, permettent d'analyser les réponses biologiques à un niveau moléculaire détaillé. Ces approches peuvent fournir des informations précieuses sur la réponse inflammatoire, là encore la complexité de la réponse ne permets d’obtenir un niveau d’information suffisante (durée de la réaction, évolution des concentrations des molécules cibles …) Utilisation de tissus humains : Les tissus humains, obtenus par exemple lors de chirurgies, peuvent être utilisés pour des tests ex vivo. Cette méthode ne permet pas de mimer l’organisme en entier. Organes sur puce : Ce sont des dispositifs microfabriqués qui reproduisent les fonctions des organes humains. Ils permettent de tester des médicaments et d'évaluer les réponses inflammatoires dans un environnement contrôlé mais comme l’utilisation de tissus humain, ces organoïdes ne peuvent pas mimer un organisme complet.

Réduction

Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés nous n'avons prévu que deux groupes d'animaux : un groupe contrôle et un groupe traité. Ceci est possible grâce à des expériences préalables réalisées chez des lapins porteurs de tumeurs et ayant permis de déterminer une posologie sûre dans le cadre d'une administration intraveineuse lente. L'effectif de cinq lapins a été choisi sur la base de la variabilité attendue dans la réponse au médicament. Les comparaisons entre groupe contrôle et groupe traité seront réalisées à l'aide d'analyses non paramétriques de type Mann-Whitney. Nous avons cherché à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés en n'explorant qu'un seul niveau de posologie du médicament. Ceci a été rendu possible grâce à des études préalables montrant qu'une administration veineuse lente n'entrainait aucun effet secondaire sévère ni irréversible.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus, les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Les injections intra-veineuses seront réalisées sous anesthésie et sur un tapis chauffant. Lors du prélèvement les lapins sont bien maintenus et rassurés. La surveillance de la douleur sera réalisée en utilisant une grille de douleur du masque faciale (degré d’ouverture des paupières et d’aplatissement des joues, la forme du museau, la position des vibrisses et celle des oreilles) Des points limites seront mis en place suffisamment précocement pour limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet.

Choix des espèces

Un test de toxicité a déjà été réalisé sur ce modèle (lapin) et cette expérimentation doit donc se poursuivre sur le même modèle avant de poursuivre les essais chez l’homme. L'objectif du projet est de mesurer l'impact d'un candidat médicament sur un organisme immunitaire complet chez une espèce présentant une sensibilité similaire à l'homme. Après discussion avec l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) il a été conclu que le lapin était l'espèce la plus pertinente était le lapin. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum, environ 1.4kg minimum), cela correspond à l’âge requis pour avoir un système immunitaire mature chez le lapin afin de comparer ces résultats avec l’homme adulte.