Recherche appliquée

Tester des candidats médicaments antiépileptiques pour le compte d'industriels du médicament : 1 200 rats issus de deux lignées sélectionnées pour être épileptiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers subit une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, puis vit seul en cage, l'isolement social suivant l'implantation des électrodes d'enregistrement. Les injections peuvent être quotidiennes pendant quatre mois au maximum, et le porteur signale des effets indésirables non attendus possibles, perte de tonus musculaire, somnolence ou excitation selon les molécules. 1 000 rats seront tués pour prélever cerveau et tissus, 200 pourront être réutilisés pour de la formation ou un autre plan d'étude, l'effectif total reflétant selon le porteur "l'activité envisagée de la société" sur cinq ans.

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantes, avec environ 0.8 à 1 % de la population mondiale souffrant d’un syndrome épileptique. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à une forme généralisée d’épilepsie ; l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Au niveau électroencéphalographique, des activités épileptiques sont observées. Ces crises sont appelées décharges pointes-ondes. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requiert tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes en polythérapie puis en monothérapie. Ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence en polythérapie puis en monothérapie. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif. Il existe 2 lignées obtenues de cette façon. Des études pharmacologiques sur ces modèles ont montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients, mais aussi une même sensibilité aux molécules induisant une aggravation chez les patients. Ces modèles, au cours des années, sont devenus des références pour évaluer les effets curatifs et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l’épilepsie absence et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet va subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des enregistrements une à deux fois par semaine. Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées une fois par jour, sur une durée maximum de 4 mois. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédure expérimentale en fonction du plan expérimental établi.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation due au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social. Les prélèvements sanguins pourront produire une douleur modérée (piqure d’aiguille). Les animaux présentent un phénotype d’épilepsie d’absence : les animaux présentent des absences momentanées de courtes durées.

Devenir

Dans la procédure 1 : les animaux pourront être réutilisés au besoin pour de la formation, si leur bien-être le permet et s’ils n’ont pas reçu toutes les administrations prévues dans les procédures. Dans la procédure 2 : les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle implique des mécanismes pathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou fait par ordinateur). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Nous pouvons estimer notre utilisation à 4 lots par an sur 5 ans (soit 400 animaux). Un maximum de 20 rats par lot est prévu, selon le protocole expérimental établi. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 2 lots par lot d’animaux passant en procédure 1 (2x4x20x5 rats) sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisée : utilisation de 4 animaux par condition (en moyenne 5 conditions par plan d'étude). Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’étude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 800 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande. Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un système d’enregistrement de l'activité des neurones chez le rongeur avec une chirurgie. Cependant, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Une analgésie est réalisée avant et après la chirurgie de manière à réduire la douleur pouvant survenir lors de l’acte chirurgical. A leur arrivée, les animaux passent 1 semaine en acclimatation dans l’animalerie avant toute expérience. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. Les lignées des rats épileptiques ont été développées en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et neuronales que l’humain. Les activités neurologiques, visibles à l’enregistrement de neurones ont des tracés similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fassent sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises d’épilepsie apparaissent et sont stables à adulte dans les 2 souches.

Pour entretenir un élevage de tiques au laboratoire, 20 lapines adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à raison d'une lapine par repas sanguin, trois à quatre fois par an pendant cinq ans. Chacune est tondue sur un quart de la surface du dos, porte deux capsules collées à la peau et un gilet vétérinaire, puis reste douze jours seule en cage pendant que les tiques la piquent par intermittence. Le porteur décrit un stress thermique le temps que les poils repoussent, une gêne de trois jours due aux capsules, un prurit de cinq à sept jours et un stress d'isolement sur toute la durée. 15 lapines seront proposées à l'adoption et 5 tuées pour prélèvement d'organes, le porteur indiquant qu'un gorgeur artificiel existe mais n'obtient que 25 % de repas réussis, ce qui rend selon lui le recours au lapin "encore nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’utilisation de lapins pour entretenir et maintenir un élevage de tiques en laboratoire. Les tiques serviront par la suite à réaliser diverses expériences nécessitant l’utilisation de cet acarien hématophage (qui se nourrit exclusivement de sang). Nous utiliserons les tiques pour réaliser des infections expérimentales avec divers agents pathogènes afin d’analyser leur transmission et comprendre la relation entre l’hôte vecteur et le pathogène, pour développer de nouveaux protocoles d’identification de tiques par biologie moléculaire ou encore pour tester des molécules acaricides ou répulsives. Nous collecterons également du sang sur 5 lapins pour étudier le système immunitaire de ces animaux après un cycle de gorgement des tiques.

Bénéfices attendus

Les lapins qui serviront dans la procédure de ce projet, permettront d’entretenir un élevage de tiques dans le laboratoire. Les tiques sont de très importants vecteurs de micro-organismes pathogènes à la fois pour les animaux et pour l’être humain. Pour lutter contre les tiques il est indispensable de connaitre leur biologie et leur physiologie, ce qui ne peut se faire que grâce à un élevage maintenu en laboratoire. Outre l’acquisition de connaissances, cet élevage permettra aussi de tester de nouvelles molécules acaricides dites « naturelles » pour en évaluer l’efficacité. Enfin, nous utiliserons ces tiques pour mettre en place de nouveaux protocoles d’identification moléculaire des différentes espèces. Du sang sera collecté sur des lapins ayant eu une procédure de gorgement pour étudier l’immunité « anti-tique » développée chez ces lapins.

Procédures

Tonte de 5 minutes pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Pose de deux capsules et d’un gilet (quelques minutes) sur la peau des lapins. Dépôt des tiques sur la peau du lapin, piqures par les tiques (12 jours de contact, piqure par intermittence). Prise de sang (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Lors de la procédure expérimentale le lapin pourrait ressentir un stress physique de 5 minutes environ pendant la tonte qui doit être pratiquée avec une tondeuse électrique vétérinaire. Le lapin rasé au niveau du dos (25% de sa surface) pourrait ressentir un stress thermique le temps que les poils repoussent soit environ une douzaine de jours. Les deux capsules, où sont placées les tiques pendant la procédure, collées avec une colle latex non toxique, pourront gêner le lapin pendant environ 3 jours, le temps que l’animal s’habitue. Pour limiter l’accès du lapin aux capsules, il porte pendant la durée de la procédure un gilet vétérinaire qui peut occasionner un stress physique pendant 24 à 48h. Lors du dépôt des tiques sur la peau du lapin, un stress physique de quelques minutes pourra être ressentie. Un prurit pourrait apparaitre lors du repas sanguin des tiques soit environ 5 à 7 jours maximum. Les lapins seront hébergés individuellement le temps de la procédure de repas sanguin qui dure 12 jours, cela pourrait induire un stress d’isolement pendant la durée de cette période. Un stress physique d’environ 5 minutes sera ressenti pendant la prise de sang ainsi qu’une douleur de piqure de sévérité légère de courte durée (3 secondes).

Devenir

15 des 20 lapins seront proposés à l’adoption. 5 lapins seront mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer des organes.

Remplacement

Les tiques sont des animaux hématophages stricts : le repas sanguin sur un animal vertébré est donc obligatoire pour leur métamorphose et donc les maintenir en élevage. Un système de repas sanguin artificiel sera utilisé dès que possible afin de ne pas utiliser de lapin. A l’heure actuelle, ce n’est pas un système totalement optimal (on obtient une efficacité de repas sanguin de 25% en moyenne pour les tiques déposées sur le gorgeur artificiel) ce qui ne permet pas d’obtenir suffisamment de tiques pour maintenir une colonie ou lors d’un besoin ponctuel de nombreux individus. Le recours à un lapin est donc encore nécessaire. En revanche le repas sanguin sur ce système artificiel sera utilisé pour les larves (disponible en très grand nombre) et pour les infections expérimentales.

Réduction

Les tiques sont des acariens hématophages pour qui le repas sanguin est obligatoire pour leur métamorphose et donc pour entretenir un élevage Ces repas sanguins sont réalisés au laboratoire tous les 3 - 4 mois sur des lapins. Nous réaliserons donc entre trois et quatre procédures de repas sanguin par an pendant toute la durée de ce projet. Chaque procédure sera réalisée avec 1 lapin. Nous utiliserons donc au maximum pendant les 5 années du projet 20 lapins. Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type. Un système de repas sanguin artificiel permet de réduire le nombre de lapin dans ce projet. Pour ce dispositif les tiques sont placées dans un flacon de culture cellulaire percé sur sa face supérieure pour y adapter un gorgeur en verre. Ce gorgeur est fermé à sa base avec une peau de lapin pour que les tiques puissent se fixer et il est rempli de sang de mouton défibriné maintenu à 37°C qui sera changé deux fois par jour, pour que les tiques puissent se nourrir. Nous l’utiliserons pour le nourrissage des larves de tiques et lors des expériences d’infection expérimentales des tiques.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. L’absence d’effets indésirables sera contrôlée au cours de l’expérience et des points limites spécifiques sont mis en place, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. La présence d’un prurit important, une déshydratation, un comportement anormal des lapins seront surveillés comme des indicateurs d’effets indésirables. Si l’un de ces indicateurs est atteint, le lapin sortira de la procédure et le protocole de repas sanguin sera arrêté. La consultation du vétérinaire référent permettra de mettre en place un traitement correctif pour cet animal. Les lapins seront maintenus dans des portoirs conventionnels (le milieu est enrichi avec des jouets et des balles autoclavables, hébergement en cage collective pour éviter les stress d'isolement) permettant ainsi l’interaction entre les individus. Lorsque les lapins arrivent de chez le fournisseur, ils resteront 7 jours minimum dans la pièce d’hébergement avant d’entrer dans la phase d’habituation à la procédure. Le lapin en expérimentation sera séparé du groupe, afin d’éviter que les individus non appareillés viennent défaire le gilet et abîmer les capsules du lapin en expérimentation. Même individualisé, les lapins auront un contact auditif et olfactif avec les autres lapins. Les lapins seront habitués à la manipulation une semaine en amont du repas sanguin pour l’habituer à l’opérateur et à la procédure. Nous ferons fonctionner la tondeuse quelques minutes à proximité du lapin la semaine avant le repas sanguin pour l’habituer au bruit. Nous enfilerons le gilet au lapin 3 ou 4 fois la semaine précédant l’expérimentation. Le lapin le gardera quelques minutes à chaque fois. Nous placerons les animaux qui subiront une prise de sang dans un sac de contention plusieurs fois et pendant 5 minutes la semaine précédant l’expérimentation. Pendant le repas sanguin, nous surveillerons l’apparition d’une réaction allergique ou un des effets indésirables cité au début de ce paragraphe. Une crème anti-démangeaison pourra être appliquée sur recommandation du vétérinaire référent si on constate la présence d’un prurit ou d’une allergie à la piqure des tiques. On limitera le nombre de tiques par lapin au strict minimum pour éviter toute spoliation sanguine des lapins.

Choix des espèces

Nous utiliserons des lapins car les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et ne peuvent se gorger que sur certains animaux vertébrés. Afin de maintenir un élevage de tiques au laboratoire, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade et le lapin permet de nourrir simultanément plusieurs tiques sans lui nuire. L’utilisation de lapins permet d’éviter l’apparition d’anémie compte tenu de la sa taille lors de la procédure expérimentale. Les lapins que nous utiliserons seront des femelles adultes d’environ 6 mois. Ce stade permet de gorger un nombre suffisant de tiques pour maintenir la pérennité de l’élevage de tiques. D’autre part, ce stade relativement jeune, permettra un replacement des animaux après l’expérimentation.

Placées dès le sevrage, à trois semaines, sous régime hyperlipidique ou standard pendant douze semaines, 1 300 souris mâles et femelles enchaînent ensuite quatre tests comportementaux espacés d'au moins 48 heures. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'une heure, une partie des femelles une ovariectomie, et 52 d'entre elles un jeûne de cinq heures suivi de sept prélèvements sanguins en deux heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, le conditionnement de peur pouvant provoquer un stress aigu durant 24 heures et la chirurgie une perte de poids limitée à 13 %. Toutes finissent par une mesure de masse grasse de deux minutes, un dernier prélèvement de sang, puis la mise à mort pour récupérer les cerveaux.

Objectifs

Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabètes …), elle est également associée des déficits de mémoire. Ceci est d’autant plus problématique pendant l’enfance et l’adolescence qui représentent des périodes de maturation de certaines structures du cerveau indispensables pour la mémoire, comme l’hippocampe. Notre équipe a récemment mis en évidence chez la souris que la consommation d'une nourriture hyperlipidique (HL) pendant l'adolescence, en plus d'entrainer l’obésité, perturbe la mémoire et ceci implique un important système neuromodulateur, le système endocannabinoïde (SEC), au sein d’une structure particulière du cerveau (l'hippocampe). Nos études, tout comme la quasi-totalité des études de la littérature, ont utilisé des souris mâles comme modèle de l'obésité. Cependant chez l'humain, l'obésité affecte hommes et femmes de façon équivalente. Ainsi, pour élargir l'étendue de ces découvertes chez l'Homme, l’équipe s’est récemment intéressée aux deux sexes en incluant l'utilisation de souris femelles. Il a pu être démontrer que la nourriture HL consommée à l’adolescence a bien des effets délétères sur la mémoire des souris femelles, semblable à ceux observés ultérieurement chez les mâles. Bien que le SEC soit également impliqué chez la femelle, les types cellulaires et/ou les structures cérébrales mis en jeu semblent différentes de celles des mâles. L'objectif du présent projet est d'identifier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans les déficits de mémoire induit par la consommation d'un régime obésogène hyperlipidique à l’adolescence chez les deux sexes, afin de mieux considérer l'effet genre. Pour cela, des souris mâles et femelles seront exposées pendant 12 semaines à un régime hyperlipidique (HL) ou standard (Cont) avant de réaliser des tests comportementaux simples permettant d’évaluer la mémoire. L’ensemble des procédures proposées est en conformité avec les directives européennes 2010/63/UE et françaises, dans le respect des nouveaux standards de soin et de bien-être des animaux (règle des 3Rs).

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux. Chaque étape de ces tests dure entre 6 et 10 minutes. Une partie des animaux (52) subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une intervention chirurgicale. La chirurgie stéréotaxique, réalisée sous anestésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire, dure 1h avec une phase de réveil de 20 minutes. Une partie de femelles subira également une ovariectomie, réalisée sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Cette intervention dure 15 minutes avec une phase de réveil de 5 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme ceux utilisés dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. Les prélèvements de sang à la queue durant le test de tolérance au glucose (GTT) pourront engendrer une légère douleur aux animaux. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. La phase d'acquisition du conditionnement de peur pourrait induire une gêne passagère des animaux et entraîner un stress aigu qui pourrait se poursuivre pendant 24h, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur l’état général ou le poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses biochimiques ou des contrôles histologiques.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico. Les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements spontanées chez les rongeurs. Les chirurgies sont courtes mais nécessaires pour réaliser des manipulations chémogénétiques dans le cerveau et restent peu invasives dans la vie de l'animal. Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire les souffrances inutiles et réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables. Cela représente un total de 1300 (702 femelles et 598 mâles) sur 5 ans. Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Un soin particulier sera porté au bien-être de l'animal tout au long de sa vie. Les souris recevront de l’eau et de la nourriture à volonté et seront surveillées régulièrement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux (application d'un gel ophtalmique, opération sur tapis chauffant, ré-hydratation post-chirurgie). Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie, il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné par la prise d’un anti-inflammatoire pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront surveillés tous les jours de la semaine et pesés 1 fois par semaine par un personnel qualifié. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. L’expérimentateur prendra le plus grand soin en manipulant l’animal et les tests comportementaux seront le moins stressant (lieu calme, acclimaté et inoffensif) et les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de façon aigüe de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou contrôle dès le sevrage (3 semaines d’âge) et pendant 12 semaines afin de couvrir la période de l'adolescence. Les approches immunohistochimiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales.

Seuls les macaques crabiers ont montré une réactivité croisée avec l'anticorps testé lors des essais in vitro, ce qui écarte souris, rats, lapins et chiens. Quatre d'entre eux, jeunes adultes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection intraveineuse lente de quinze minutes sur chaise de contention, puis huit prélèvements sanguins et huit mesures du temps de saignement par micro-incision de la peau, étalés sur un mois, avec des contentions de trois à vingt-cinq minutes. Aucune mise à mort n'est prévue et tous sont gardés en vie à la fin du projet sur avis vétérinaire, en vue d'une réutilisation.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir d’un anticorps bispécifique (ciblant deux protéines sur les plaquettes) à deux doses différentes chez le singe cynomolgus dans le cadre du développement d’un traitement contre les maladies thrombo-inflammatoires chez l’Homme. Ce projet permettra d’établir le profil pharmacocinétique du candidat médicament et ses relations dose-effet mais également de déterminer la dose qui sera utilisée dans de futurs projets précliniques et cliniques. Les données qui seront extraites de ce projet vont également permettre d’évaluer la capacité de l’anticorps à inhiber l’activation plaquettaire tout en préservant une coagulation normale et donc d’obtenir des informations sur sa sécurité. Ce projet ouvrira la voie à des tests cliniques (sur patients humains), offrant l’espoir d’une nouvelle option de traitement pour les maladies causées par une coagulation et une inflammation anormales. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat-médicament. Des prélèvements de sang ainsi que des mesures du temps de saignement seront réalisés à différents délais avant et après administration de la molécule test. Différents paramètres physiologiques seront également suivis (ex : température corporelle, poids, état général). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de déterminer la dose toxique. C’est pourquoi, les deux doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques (d’après des études préliminaires in vitro réalisées sur la même molécule et in vivo sur un anticorps similaire utilisant la même voie d’action et la même cible). Enfin, aucune mise à mort n’est prévue pour raison scientifique dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

La thrombose artérielle est un trouble courant chez l’Homme qui est généralement causé par l'érosion ou la rupture d'une plaque d'athérosclérose (dépôt lipidique dans les vaisseaux sanguins) pouvant provoquer des lésions ischémiques. Lorsque qu’une plaque se rompt et provoque une occlusion dans les artères coronaires ou cérébrales, elle peut entraîner respectivement un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral (accidents vasculaires représentants les principales causes de décès dans le monde). Plusieurs médicaments sont maintenant disponibles pour traiter la thrombose artérielle. Cependant, ces médicaments ciblent des mécanismes communs à la thrombose et à l'hémostase. Leur utilisation entraîne donc un risque accru de complications hémorragiques non contrôlées en parallèle de leur efficacité antithrombotique. Dans ce contexte, il existe une réelle nécessité de développer de nouveaux traitements sûrs et efficaces sans effets secondaires systémiques tels que l'hémorragie. D’après différentes études réalisées in vitro, le candidat médicament (anticorps) testé dans le cadre de ce projet semble avoir le potentiel de fournir une activité immunomodulatrice ciblée avec un profil de sécurité très encourageant pour traiter de manière efficace ce type de maladies thrombo-inflammatoires. En effet, des données publiée sur un anticorps similaire ont montrées que le mode d’action utilisé était efficace et sûr chez les primates et chez l’Homme. En outre, cet anticorps similaire a démontré un excellent profil de sécurité, à la fois chez des volontaires humains sains et chez des patients souffrant d’un accident vasculaire cérébral ischémique aigu, renforçant ainsi le potentiel thérapeutique de ce type d’anticorps. Des tests préliminaires in vitro réalisés sur du sang humain et de singes ont déjà montré des résultats prometteurs pour l’anticorps testé, confirmant son efficacité sans nuire aux cellules sanguines. Les bénéfices attendus du projet sont donc, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps bispécifique utilisé comme thérapie ciblée, efficace et sûre contre les maladies thrombo-inflammatoires. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront notamment de sélectionner la dose à privilégier pour de futures études précliniques et cliniques.

Procédures

DDeux groupes de deux animaux seront inclus dans ce projet : Groupe 1 anticorps à 1mg/kg et groupe 2 anticorps à 5mg/kg. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. À l’issue de cette période, les animaux feront l’objet d’un examen vétérinaire qui permettra de déterminer l’état de santé général des animaux avant l’administration de l’anticorps. Deux prélèvements de sang ainsi que deux mesures du temps de saignement (temps nécessaire à l’arrêt spontané d’un saignement après réalisation d’une micro-incision de la peau) seront réalisés avant l’administration du candidat médicament. Les animaux recevront la molécule test par injection intra-veineuse lente de 15 minutes (temps de contention sur chaise d’environ 25 minutes). Ensuite, 6 prélèvements de sang et 6 mesures du temps de saignement seront réalisés à différent délais post-administration (prélèvements étalés sur une durée d’un mois) afin d'étudier le profil pharmacocinétique, l’effet de la molécule dans le temps et sa capacité à moduler l'activation plaquettaire tout en préservant la coagulation. Les mesures du temps de saignement impliquent une contention sur chaise à contention durant environ 15minutes. Les prises de sang nécessitent une contention de 3 à 15 minutes (contention manuelle ou sur chaise à contention au besoin). Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Les administrations intra-veineuses peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection, des ecchymoses ou des hématomes. Les prélèvements sanguins et les mesures du temps de saignement pourront provoquer un stress léger, une douleur légère, un saignement local mineur et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées ainsi que les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie (selon avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur).

Remplacement

Les études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de sécurité précliniques in vivo sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. Ce projet permettra de déterminer, entre autres, la concentration plasmatique dans le temps de l'anticorps, sa relation dose-effet mais également de déterminer la dose qui sera utilisée dans de futurs projets précliniques et cliniques. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 groupes de 2 animaux ont été constitués, soit 4 animaux au total. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats fiables, interprétables et transposables. Les deux groupes permettront d’étudier les effets de l’anticorps testé à deux concentrations différentes. Le nombre de groupe ne peut donc pas être réduit d’avantage. Le nombre d’animaux par groupe a été limité à 2. Ce nombre permettra de détecter une tendance dans le groupe. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux seront hébergés en groupes sociaux. Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra: 1) Des enrichissements structuraux ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’anticorps étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. Cet anticorps a pour cible deux protéines spécifiques modulant l’activité plaquettaire. Or, au cours d’études préliminaires in vitro, seuls les singes cynomolgus ont démontré une réactivité croisée avec l’anticorps testé. L’absence de réactivité croisée chez la souris, les rats, les lapins et les chiens exclue donc l’utilisation de ces espèces dans ce cadre de ce projet. La proximité phylogénétique et physiologique entre les macaques et l'Homme, notamment concernant l’organisation de leur système immunitaire explique ces résultats. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système cardiovasculaire, il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Implantés d'un faisceau d'électrodes dans la cochlée au cours d'une chirurgie de 45 minutes, 24 rats Wistar sont ensuite reliés cinq heures par jour, cinq jours sur sept pendant un mois, à un émulateur d'implant cochléaire. Ils reçoivent par ailleurs de la rapamycine par voie orale ou de la chloroquine en intrapéritonéal, avec perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation et dysfonction hépatique parmi les effets attendus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués au bout d'un mois pour l'étude des tissus de l'oreille interne, l'objet étant de comprendre la fibrose qui dégrade le fonctionnement des implants chez l'être humain. L'isolement quotidien pendant les phases de stimulation figure parmi les nuisances déclarées, et une cage à rails coulissants est présentée comme permettant à l'animal de se mouvoir "sans contraintes".

Objectifs

L'implant cochléaire est un dispositif médical permettant en cas de surdité de stimuler électriquement les fibres nerveuses du nerf auditif. Les sons sont convertis en impulsions électriques avec un processeur de son, puis transmis à la partie implantée qui délivre le courant dans la cochlée. Chez le rongeur, un implant cochléaire ne pouvant pas être implanté en raison de sa taille, il peut être émulé par un dispositif externe. Dans des études préliminaires, nous avons démontré que le produit TIPH-1 permet de réduire la fibrose après implantation cochléaire et stimulation électrique de la cochlée avec un émulateur d'implant cochléaire. Le mécanisme d'action de TIPH-1 dans la réduction de la fibrose semble être lié à une modulation de l'autophagie. Afin de confirmer cette hypothèse nous allons moduler l'autophagie in vivo par l'administration de rapamycine et de chloroquine sur un modèle d'implantation cochléaire murin (rat) développé dans le laboratoire. Le volume de la fibrose cochléaire sera évaluée 1 mois après l'implantation.

Bénéfices attendus

A l'issue de ce projet, la connaissance des mécanismes responsables de la fibrose après implantation cochléaire permettra de développer des stratégies thérapeutiques pour limiter ce phénomène chez l'Homme et pour lequel il n'existe aucun traitement efficace à l'heure actuelle. Cette fibrose dégrade le fonctionnement de l'implant cochléaire et limite leur utilisation à des personnes présentant une surdité déjà avancée, car la fibrose contribue à la perte de l'audition naturelle chez la personne implantée.

Procédures

Les animaux auront tous une intervention chirurgicale de mise en place d'implant cochléaire sous anesthésie générale (durée 45 minutes) suivie d'une prise en charge de la douleur et du risque d'infection. Les animaux implantés recevront pour la moitié d'entre eux un traitement oral par rapamycine, et pour l'autre moitié des injections intrapéritonéales de chloroquine. Suite à la chirurgie les animaux auront une stimulation électrique de l'audition par implant cochléaire 5 heures par jour, 5 jours sur 7 pendant 1 mois dans une cage adaptée pour ne pas les gêner dans leurs déplacements et autres activités.

Impact sur les animaux

Les procédures suivantes vont être réalisées: /implantation cochléaire: nuisances attendues : stress, douleurs au site opératoire, vertiges, infection du site opératoire /stimulation électrique avec l'implant cochléaire : nuisances attendues: isolement pendant la phase de stimulation (5h/j, 5 jours/7) /administration orale de rapamycine : nuisances attendues : perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation, réduction de l'activité motrice, sensibilité accrue aux infections / administration intrapéritonéale de choloroquine : douleur passagère au point d'injection, perte de poids, diarrhée, retard de cicatrisation, réduction de l'activité motrice, sensibilité accrue aux infections, dysfonction hépatique.

Devenir

A l'issue de la période d'un mois de stimulation électrique, les animaux seront euthanasiés pour réaliser une étude des tissus de l'oreille interne.

Remplacement

Il n'est pas possible à ce jour d'étudier in vitro le développement de la fibrose cochléaire après implantation et stimulation électrique. Il n'existe pas de modèle de remplacement pour mener à bien cette étude. Il n'existe pas de méthode d'imagerie non invasive permettant d'évaluer précisément la fibrose cochléaire. Néanmoins, les études in vivo feront suite à la validation in vitro des cibles mécanistiques et tous les efforts ont été portés sur les points concernant la réduction et le raffinement pour limiter l'usage d'animaux vivants.

Réduction

Afin de limiter au maximum le recours aux animaux vivants, nous avons procédé à l'utilisation du logiciel G power pour calculer le nombre nécessaire et suffisant d’animaux sur la base des résultats obtenus dans des expérimentations antérieures. Sur la base d'un test ANOVA , il est nécessaire d'analyser 10 animaux dans chaque groupe pour obtenir des résultats avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%. Sachant qu'il n'y aura que 2 groupes experimentaux il faudra donc analyser les os temporaux de 20 animaux. Dans notre expérience, la stimulation électrique prolongée 1 mois peut entraîner un descellement du connecteur de stimulation et rendre la stimulation électrique impossible. Nous avons estimé à 20% de nombre de rats supplémentaires à opérer pour anticiper ce problème. Cela porte le nombre total d'animaux à 24 au maximum. Les 4 animaux supplémentaires ne seront utilisés qu'en cas de problème technique en cours d'expérimentation.

Raffinement

Afin de pouvoir réduire le recours aux animaux vivants, les techniques utilisées dans ce projet ont été adaptées. La technique d'implantation cochléaire est utilisée en routine chez le rat dans le laboratoire. Les nuisances liées à l’implantation cochléaire seront limitées par la réalisation du geste sous anesthésie générale, suivie d’un traitement antalgique poursuivi après le geste et une antibioprophylaxie. En période post-opératoire immédiate, les animaux seront surveillés en cage individuelle jusqu'à reprise des activités normale. Les nuisances liées à la stimulation électrique sont davantage liées à la connexion de l’animal à l’émulateur qu’à la stimulation électrique elle-même. Le niveau de stimulation électrique est adapté à partir d'enregistrements électrophysiologiques réalisés à travers l'implant de sorte à ce que l'intensité des sons perçus par l'animal via l'implant soit identique à celle des sons perçus naturellement. La stimulation électrique par implant cochléaire nécessite de connecter un plot électrique à un système de câbles. Afin que ce système n'entrave pas les déplacements et l'activité des animaux, une cage spécifique a été développée pour permettre à l'animal de se mouvoir, s'alimenter et se reposer sans contraintes. Les câbles électriques sont attachés sur un système de rails coulissants au couvercle de la cage qui se déplacent avec l'animal sans tension. En dehors des périodes de stimulation électrique, les animaux seront stabulés par groupes de 2 à 3 animaux dans des cages avec enrichissement, et avec nourriture et boisson ad libitum. Les nuisances possibles liées à la chloroquine et à la rapamycine seront limitées grâce à l’antibioprophylaxie donnée pendant la chirurgie, la surveillance quotidienne des animaux avec pesée, et si besoin réhydratation et alimentation adaptée par gavage.

Choix des espèces

Le rat de souche Wistar offre le compromis le plus intéressant entre la faisabilité d’une implantation chirurgicale d’un faiseau d'électrodes dans la cochlée, et la possibilité d’utiliser les outils classiques de biologie moléculaire et cellulaire. D'autres modèles murins tels que la souris ne permettent pas de positionner le plot de connexion de manière suffisament stable pour pouvoir conserver l'animal pendant la durée de l'experience. La souche Wistar est préférée aux autres souches car 1/ les travaux antérieurs ont été effectués sur cette souche, et la comparaison ne serait pas possible en choissisant une autre souche, 2/ la plupart des kits de biologie moléculaire ont été conçus sur des séquences génomiques de cette souche. Ce modèle offre en outre la transférabilité de nos données in vitro, acquises sur macrophages de rat, vers in modèle in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Des jeunes adultes (environ 250 grammes) seront utilisés. La résistance à l’anesthésie et la taille des animaux rend plus facile l’implantation des animaux, et limitera donc des pertes inutiles.

Six macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à la fin du projet pour une étude post-mortem du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation pouvant durer six heures, des injections répétées de neurotoxine sur quatre mois qui les rendent parkinsoniens, un isolement de 72 heures après chaque injection, une tâche de vigilance de deux heures trois jours par semaine et des tests de latence d'endormissement de trois heures répétés au moins dix fois par condition. Un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place pour maintenir leur motivation. La luminothérapie ayant déjà été publiée chez la souris et le rat, avec des essais cliniques en cours, le porteur affirme qu'une étude chez le primate non humain reste "nécessaire" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude dans le temps et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.