Recherche appliquée

Jusqu'à six interventions sous anesthésie générale par animal, espacées de deux semaines : 200 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. On leur implante des stents dans des artères saines, avec pour certains un gavage quotidien pendant trois mois, l'hébergement individuel élevant leur niveau de stress de base. Le porteur reconnaît une gêne post-chirurgicale, un risque d'infection et de thrombose au niveau du dispositif. Le projet teste des dispositifs médicaux avant leur usage chez l'humain, sur des artères pourtant saines.

Objectifs

Le traitement de pathologies cardio-vasculaires (anévrismes, sténoses, dissection) nécessite souvent le recours à des stents, dispositifs médicaux apparenté à un minuscule tube expansible qui maintient une artère ouverte. Cependant, malgré la mise en place d’un stent, il existe un pourcentage de cas (de 10 à 30 % en fonction du dispositif) dans lequel l’endothélialisation du stent, c’est-à-dire la bonne reconstruction biologique de l’intérieur du vaisseau sanguin, n’est pas obtenue, ce qui incite aujourd’hui à développer de nouvelles technologies de ces dispositifs afin d’améliorer la cicatrisation biologique. Les industriels modifient également parfois la composition et/ou la forme du dispositif afin d’améliorer ses performances, ou créent de nouveaux dispositifs permettant de s’affranchir de traitement médicamenteux antiagrégant. L’adjonction d’un autre type de traitement médicamenteux pourrait en revanche permettre de favoriser cette cicatrisation. Le projet consiste à étudier la conformabilité, la biocompatibilité et/ou l’endothélialisation de stents sur artères saines (accompagné ou non par l’adjonction d’un traitement médicamenteux). Ce projet, qui sera scindé en plusieurs études pilotes, utilisera des contrôles par imagerie à rayons X avec possibilité d'imagerie optique et nécessitera donc l'utilisation de l'animal pour être mené à bien. L’analyse sur artères saines permettra d’étudier l’endothélialisation des stents. Cela permettra, au sein d’un même animal, de comparer plusieurs dispositifs implantés (de 1 à 3). Ce projet sera réalisé sur deux sites différents identifiés EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

Ce projet se déclinera en plusieurs études pilotes et permettra d’effectuer des analyses non réalisables chez l’être humain afin évaluer la faisabilité d'implantation, la sécurité et/ou la réponse biologique in vivo à l’implantation du dispositif, en fonction du ou des traitements administrés aux lapins. Il permettra notamment d’évaluer l’efficacité et la sécurité du dispositif dans des conditions proches de l’humain. L’analyse de la prolifération tissulaire sur le dispositif et sa susceptibilité à engendrer une thrombose (formation de caillots dans les vaisseaux sanguins), apportera des connaissances supplémentaires et une meilleure compréhension sur les indications du dispositif avant de l’utiliser chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis entre 2 et 6 interventions sous anesthésie générale : l’implantation du dispositif et le contrôle avant la mise à mort, d’une durée de 1h chacune +/- 15min. Des contrôles intermédiaires (jusqu’à 4 imageries à rayons X avec possibilité d'imagerie optique nécessitant une nouvelle anesthésie générale et chirurgie) pourront être effectués d’une durée attendue de 45 min. La fréquence des anesthésies générales sera discutée en amont, en fonction des hypothèses de recherches définies par l’étude, en étroite collaboration avec un vétérinaire pour la faisabilité. Pour les animaux recevant un traitement, ils seront manipulés 1 à 2 fois par jour (pendant 3 mois maximum) et le traitement sera donné par une sonde de gavage (environ 1 min par animal). En fonction des études issues de ce projet, des prélèvements sanguins pourront être effectués (jusqu’à 4 prélèvements sur la durée du projet, dans des volumes raisonnables et en laissant un temps de récupération à l’animal entre chaque prélèvement). De manière générale ces prélèvements seront effectuées lorsque l’animal sera sous anesthésie générale, ou sous contention adaptée avec la possibilité de recourir à une sédation légère ou une anesthésie locale. Ces interventions seront réalisées dans l’EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux étant hébergés en cages individuelles, le niveau basal de stress peut être plus important que la normale et sera monitoré au long de l’étude (stéréotypies, etc) (EU 1/2 et 2/2). Le reste des nuisances concernera uniquement l’EU 1/2. L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque geste/prélèvement. Un stress supplémentaire peut être observable sur les animaux qui seront amenés à recevoir un traitement oral quotidien. Une gêne et une douleur post-chirurgicales sont possibles au niveau des abords artériels, de même qu’une infection locale au niveau de l’incision. Une thrombose au niveau du dispositif implanté peut également survenir, mais reste un évènement rare. Dans le cas de la procédure 2, les animaux recevront tout au long du projet un traitement oral antiagrégant 1 fois par jour (sonde de gavage, 2 minutes/jour). Par expérience, aucun effet indésirable dû à un traitement oral antiagrégant n’a été observé. Les animaux subiront plusieurs anesthésies générales : une pour la procédure chirurgicale, une pour chaque contrôle intermédiaire et une pour les imageries de contrôle avant mise à mort avec un maximum de 6 prévues pour le projet (et 2 semaines entre chaque anesthésie). Indépendamment de la procédure, la durée d’anesthésie est d’une heure (+/- 15 min), qu’il s’agisse de la phase d’implantation et / ou de contrôle). L'administration d'un analgésique est possible. Les transports d’animaux entre les EU1/2 et EU 2/2 se feront à une fréquence définie en amont selon les conditions spécifiques des études. Des temps d’acclimatation et de récupération post-opératoires seront respectés à l’arrivée et avant chaque départ, avec un examen clinique réalisé par le vétérinaire de la structure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des dispositifs et pièces anatomiques d’intérêt à des fins d’analyse sur les tissus.

Remplacement

Le projet consiste à étudier la sécurité, la conformabilité, la biocompatibilité et l’endothélialisation (l’endothélium étant le tissu cellulaire qui tapisse l’intérieur des vaisseaux sanguins) de dispositifs médicaux implantables dans des artères saines (accompagné ou non par un traitement médicamenteux) dans des conditions in vivo. Les phénomènes biologiques, tels que l’endothélialisation, la coagulation sanguine, la pression sanguine, ou encore les contraintes liées au déploiement du dispositif implantable n’ont à l’heure actuelle aucune méthode alternative, in vitro ou ex vivo, permettant de reconstruire un modèle proche de ces conditions, ainsi que son suivi au cours du temps. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est ainsi indispensable.

Réduction

Ce projet est à visée exploratoire et a pour objectif l'obtention de résultats préliminaires au cours d'études pilotes de faisabilité et de sécurité. Ces données pourront au besoin servir de base pour établir un nouveau projet intégrant des analyses d'efficacité avec calcul statistique, dans un dossier APAFiS dédié (distinct de ce dossier). Nous sommes donc ici dans le cadre d’un APAFIS général pour lequel plusieurs études pilotes distinctes pourront être développées. Dans le cadre de ce présent projet d’APAFIS, pour chaque étude, le nombre minimal de lapin sera utilisé. Ainsi, pour chaque dispositif testé dans les conditions de procédure choisie (c'est-à-dire avec ou sans antiagrégants), de groupes nécessaires ; et pour prendre en compte le risque d'échec de la procédure, de 5 à 20 lapins par étude seront utilisés, conformément aux études pilotes précédemment réalisées. Par ailleurs, l’implantation chez le même lapin de plusieurs dispositifs pourra éventuellement servir de contrôle et ainsi diminuer le nombre de lapins nécessaires. Le nombre d’animaux nécessaire dans le cadre de prochaines études supportées par cet APAFIS sera défini méthodologiquement, en fonction de(s) l’hypothèse(s) de recherche, en association avec la puissance définie à la conception de l’étude. Ce nombre sera également validé en amont par le Conseil Scientifique de l’EU 1/2.

Raffinement

Dans le cadre de chaque étude les animaux seront indifférenciés (mâles ou femelles). Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles disposant de mezzanine, mais dont les parois sont vitrées et non étanches ou comportent des trous, permettant des échanges visuels, auditifs et olfactifs entre animaux. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale de l’EU 1/2, et leur première entrée en procédure. Dans les deux EU, une attention particulière sera apportée afin que les animaux disposent d’un enrichissement adapté et suffisant (bûchettes ou blocs de cellulose à ronger, foin (+/- compressé), jouets, cachettes...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental, avec un suivi comportemental du fait de l’hébergement individuel. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés. Au besoin, un traitement antibiotique pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort. L’avis du vétérinaire est systématiquement demandé pour chaque EU. Le transport des animaux entre les EU sera pris en charge par l’EU 2/2, fournisseur d’animaux, qui possède un agrément pour le transport d’animaux ainsi qu’un véhicule agréé. La durée du transport est estimée à 4h. Une nouvelle période d’acclimatation de 5 jours sera observée à l’issue de chaque transport pour permettre à l’animal de récupérer. Les animaux seront transportés en cage individuelle adaptée à l’espèce avec des copeaux de bois. Des précautions supplémentaires seront prises pour tous les transports post-opératoires avec délivrance d’un certificat médical (vétérinaire de l’EU 1/2) attestant que l’animal peut être transporté sans risque.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des adultes indifférenciés (males et/ou femelles) de plus de 3 kg pour la taille des artères et la taille des dispositifs usuellement utilisés chez l'Homme. Historiquement la majorité des études précliniques sur l’implantation de dispositifs utilisaient des mâles. Cependant on retrouve également quelques études incluant les deux sexes et discutant des différences. .

Pour évaluer un complément alimentaire à base d'extraits d'insectes destiné à la filière avicole, 120 poules vont être infectées par le parasite Eimeria, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les poussins sont infectés par voie orale dès leurs premiers jours, équipés de puces télémétriques sous anesthésie, puis tués à vingt et un jours pour prélever leurs tissus. Le porteur situe d'emblée l'enjeu du côté des pertes économiques de l'aviculture, chiffrées à plus de douze milliards d'euros par an dans le monde. Le bénéfice visé est de pouvoir recommander la supplémentation aux éleveurs.

Objectifs

Les coccidioses représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture conduisant à d'importantes pertes économiques de plus de 12 milliards d’euros dans le monde et par an. Ces maladies infectieuses sont provoquées par la multiplication de parasites protozoaires. Une fois ingérés, ces parasites envahissent les cellules intestinales et se multiplient massivement avant d’être excrétés. Les pertes de production observées dans les élevages avicoles sont principalement dues à une morbidité chez le poulet de chair. En outre, l’infection par ce parasite prédispose les oiseaux à l'entérite nécrotique, ainsi qu'à la colonisation par d’autres bactéries pathogènes. La dégradation de la litière causée par cette infection peut également entraîner de la boiterie de la volaille. Le traitement repose principalement sur l’administration d’anticoccidiens dans l’aliment des oiseaux pendant toute la durée de l’élevage. Cependant, l’apparition de résistances souligne l’urgence de trouver des moyens de lutte alternatifs : nouvelles formulations vaccinales ou nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à évaluer les propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels d’insectes, en conditions contrôlées. Un projet antérieur a permis de caractériser in vitro les propriétés anticoccidiennes d’extraits naturels d’insectes (extrait lipidique et extrait protéique). La poursuite du projet nécessite désormais d’objectiver l’effet des extraits d’insectes in vivo. L’objectif est de quantifier l’effet de la supplémentation sur des paramètres parasitaires, la physiologie et la réponse immunitaire des oiseaux, comme la poule.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme, dans le cadre de ce projet, seraient que les lots supplémentés présentent un meilleur contrôle de l’infection parasitaire (effet anticoccidien : moins de lésions, moins d’excrétion de parasite) et une amélioration de la physiologie (moins d’inflammation et tissu à l’homéostasie). Les oiseaux non infectés et supplémentés pourraient également bénéficier d’une meilleure croissance. Le bénéfice à moyen terme serait de pouvoir recommander la supplémentation en extrait d’insecte sur le terrain, auprès des éleveurs (des produits commerciaux existent mais n’ont pas encore été recommandés pour la volaille).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration par voie orale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. L’objectif est de reproduire une infection expérimentale par voie orale (0.5 mL à l’aide d’une seringue munie d’un embout en silicone (4mm de diamètre ; 2cm de long) ou pipette avec cône de 0.5 mL) pour étudier l’effet de la supplémentation en extrait d’insecte chez des oiseaux infectés ou non par Eimeria. Les contrôles recevront 0.5 mL d’eau. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). Aucune douleur n'est attendue suite au gavage. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté. Tous les animaux seront régulièrement pesés au cours de l’expérimentation (1, 14, 21 jours d’âge) et les animaux seront soumis à un prélèvement de sang juste avant leur mise à mort. 3 mL de sang seront prélevés. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Après une anesthésie gazeuse flash (quelques minutes), les puces télémétriques sont injectés en intrmusculaire (moins de 1 minute) et la récupération très rapide des animaux (moins de 5 min sous lampe chauffante) et puis remis en lot dans la foulée.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux infectés non supplémentés sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. L’effet attendu de la supplémentation est d’améliorer l’état des animaux comme par exemple de limiter la perte de poids causée par l’infection et les conséquences négatives de l’infection (lésions, inflammation), diminuer l’excrétion parasitaire. Dans le cas peu probable que l’état des animaux supplémentés et infectés soit pire que les animaux contrôles, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation. Les puces télémétriques seront placées chez 10 animaux par lot, sous anesthésie générale, pouvent engendrer un stress et une douleur légère au point d'implantation.

Devenir

Pour l’unique procédure de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever différents tissus (caeca) et de pouvoir analyser la charge parasitaire contenue, le scoring des lésions et la réponse immunitaire induite.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer les propriétés anticoccidiennes in vivo or, l’agent pathogène Eimeria tenella responsable de la coccidiose a un spectre d’hôte restreint : il infecte exclusivement le poulet Gallus gallus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est choisi en fonction de la dispersion des paramètres mesurés. Nos effectifs sont basés sur les études du laboratoire portant sur les scores lésionnels lors de supplémentation et pour lesquelles il faut en moyenne 20 animaux / groupe entre deux groupes pour avoir une différence significative avec une puissance de 93% avec un seuil alpha de 0.05 pour un test non paramétrique défini par le plan expérimental.

Raffinement

Les poulets seront hébergés dans des conditions environnementales contrôlées, ils disposeront d’un enrichissement social et comportemental. Ils seront hébergés en groupe de 20 poussins, au sol, dont la température est régulée (ajout le lampe chauffante) avec aliment et eau ad libitum ainsi qu’un éclairage 12h/24h. Ils bénéficieront également d’un enrichissement environnemental et matériel : l'espace de vie sera enrichi par la suspension de rubans, de perchoirs et de la litière favorisant le grattage (litière de miscanthus pour éviter les poussières). La prise de sang est réalisée avant l’euthanasie par du personnel formé et qualifié, ce qui permet d’effectuer une prise de sang en douceur et rapidement pour éviter toute souffrance. Dans ces conditions, l’animal est détendu et ne présente pas de signes d’angoisse et de stress. L'anesthésie gazeuse flash dure quelques minutes et récupération très rapide des animaux (moins de 5 min sous lampe chauffante), qui sont remis en lot dans la foulée. Pas de gène visible, ni de modification d’interactions entre les poussins. .

Choix des espèces

Le poulet Gallus gallus est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria. Des poulets de statut sanitaire protégé sont utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule. Des poussins de 1 jour sont utilisés afin d’apporter la supplémentation alimentaire contenant les extraits lipidique ou protéique de larves d’insecte le plus tôt possible dans la vie des oiseaux, cela pouvant agir sur la composition du microbiote digestif, et contribuer la lutter contre l’infection parasitaire. Les oiseaux seront utilisés dès l’éclosion et seront ou non supplémentés dès leur début de vie pour évaluer l’effet de la supplémentation alimentaire en extraits d’insecte sur le contrôle de l’infection parasitaire, la croissance ds oiseaux et l’inflammation. Une coccidiose expérimentale sera ensuite induite à 14 jours d’âge afin de reproduire expérimentalement la fenêtre d’infection de la coccidiose aviaire. Les animaux sont mis à mort à 21 jours d’âge.

1 550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant environ quatorze jours, des gavages et une irradiation de la tumeur sous anesthésie générale. Les retombées annoncées, faire de la triple combinaison un traitement de référence de certains cancers, sont renvoyées au conditionnel. Le porteur affirme que le recours à un modèle animal est "indispensable", les interactions du microenvironnement tumoral ne pouvant selon lui être reproduites in vitro.

Objectifs

Le but du projet consiste en l’étude de l’efficacité antitumorale de la radiothérapie associée à un médicament inhibiteur ainsi qu’à une immunothérapie. Le rôle de la ferroptose dans les effets observés précédemment et comment mieux exploiter cette mort cellulaire afin de potentialiser les effets de la triple combinaison de traitement. L'immunnothérapie permet d'inhiber une molécule qui induit une polarisation des lymphocytes T du microenvironnement tumoral vers un phénotype anti-inflammatoire et pro-tumoral. De récentes études montrent que l’association de la radiothérapie et d’une immunothérapie ciblant cette voie est susceptible d’améliorer la réponse antitumorale en comparaison avec l’immunothérapie seule. De plus, d’autres études ont montré que l’utilisation de cet inhibiteur combiné avec la radiothérapie, entrainait une réponse antitumorale

Bénéfices attendus

Les résultats de ces expériences pourraient, en expliquant le mécanisme d’action des interactions des traitements, ouvrir la voie à de nouveaux schémas thérapeutiques, dans lesquels la triple combinaison thérapeutique pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers. De plus, l’utilisation d’inducteur ou d’inhibiteur pourront nous permettre (i) d’exploiter cette mort cellulaire dont les cellules sont particulièrement dépendantes et (ii) d’élucider la proportion que représente la ferroptose dans les effets observés en réponse à notre triple combinaison de traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (anesthésie locale) de cellules tumorales, à des injections intrapéritonéales quotidienne (anesthésie locale) durant environ 14 jours ainsi qu'à trois gavages lors des différentes procédures. Pour finir les souris subiront également sous anésthésie générale une irradiation localisée de la tumeur.

Impact sur les animaux

Le developpement de tumeurs sous-cutané chez la souris peut entrainer une gêne chez ces dernières lorsque la tumeur sous-cutané va grossir. De plus, les diférentes injections sous-cutanées, intra-péritonéales ainsi que les gavages sont suscetibles d'entrainer chez l'animal un stress du a la manipulation de l'animal et aux différents traitements appliqués ainsi qu'une douleur légère et temporaire. Il en est de même pour l'irradiation des tumeurs des souris qui va déclencher un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédures, pour examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car les interactions au sein du microenvironnement immunitaire tumoral est au centre des effets de la triple combinaison, impliquant des composantes cellulaires et moléculaires impossibles à reproduire actuellement dans des modèles ex-vivo. Nous allons donc procéder à des expériences in vivo utilisant des modèles murins, mais aussi des expériences in vitro complémentaires en utilisant le modèle de culture d’organoïdes murins.

Réduction

Pour chaque point expérimental nous utiliserons le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous comptons utiliser 4 lignées cellulaires tumorales (génétiquement modifié pour les différentes voies de signalisation étudiées). Le nombre mnimal d'animaux, nécessaire et suffisant, a été déterminé grâce à un calcul de puissance.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe, avec un équipement et des conditions sanitaires adéquates. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux seront en groupes sociaux de 5. Les protocoles d’exposition aux agents anticancéreux ont déjà été utilisés chez les souris et ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, ils recevront un antiinflammatoire non stéroïdien ou un analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre radiothérapie et immunothérapie au sein d’une tumeur obéissent à des processus cellulaires complexes impliquant de multiples voies immunitaires et métaboliques impossibles à reproduire in-vitro.

510 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée, les autres tuées. Les mères et leurs petits sont soumis à un protocole de stress précoce, les mâles adultes servant d'agresseurs dans des séances de défaite sociale, et les petits sont tués pour prélever leur cerveau. L'objectif est de mettre au point chez la souris un modèle de traumatisme de l'enfance transposé de l'humain, en vue de futurs travaux sur des lignées génétiquement modifiées. Cette version modifiée ajoute trois tests comportementaux que le porteur qualifie d'"essentiels" pour affiner les mesures.

Objectifs

L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.

Procédures

Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure. MODIFICATIONS 3 TESTS COMPORTEMENTAUX SONT AJOUTES SUR LES MEMES ANIMAUX DE LA PROCEDURE 1 (MARBLE TES (TEST ENFOUISSEMENT BILLES FREQUENCE 1FOIS DUREE 20 MIN) OU DE LA PROCEDURE 3 (TEST DE MEMOIRE SOCIALE DUREE 20MIN ET TEST D’INTERACTION SOCIALE DIRECTE DUREE 6 MIN). ILS SONT ESSENTIELS POUR AFFINER LES MESURES COMPORTEMENTALES ILS SERONT EFFECTUES 1 SEULE FOIS CHACUN.

Impact sur les animaux

- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).

Devenir

Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.

Réduction

Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.

Pour mettre au point un modèle d'infection sur un dispositif implanté sous la peau, 49 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer la charge bactérienne. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation, deux anesthésies générales et des prélèvements à travers la peau. L'objectif est de calibrer une infection à staphylocoque doré et la formation d'un biofilm. Hébergées à plusieurs, les souris peuvent arracher leurs points de suture et rouvrir les plaies, ce qui accroît la douleur.

Objectifs

Staphylococcus aureus représente la cause la plus courante d’infection bactérienne de la peau et des tissus mous. Cette bactérie infecte généralement la peau d'individus en bonne santé à la suite d'un traumatisme, de brûlures ou d'interventions chirurgicales, ainsi que la peau de patients atteints de maladies chroniques caractérisées par des démangeaisons ou encore des patients atteints de diabète. Les bactéries du genre Staphylococcus sont très efficaces pour créer des amas structurés adhérent à une surface. Cette formation appelée biofilm, leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles et les rend plus résistantes à la réponse immunitaire de l’hôte ainsi qu’aux traitements antibactériens. L’objectif de ce projet dans un premier temps est d’évaluer la charge bactérienne adéquate permettant une infection stable, localisée et la formation d’un biofilm mature dans un modèle d’infection de « tissu cage » chez la souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de déterminer le meilleur inoculum permettant d’avoir une charge bactérienne stable sur 21 jours avec la formation d’un biofilm localisée. De plus, avec ce dispositif (cage perforée de 130 trous), le prélèvement du liquide interstitiel est possible sans mise à mort de la souris, une fois la mise au point réalisée, ce qui permettra de réduire significativement le nombre d’animaux dans la phase suivante. A terme, ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de plusieurs bactériophages sur la formation d’un biofilm à Staphylococcus aureus.

Procédures

- 2 injections (anesthésie) : 3 sec - 10 injections (analgésie) : 3 sec - 1 procédure chirurgicale correspondant à ouverture cutanée et à la pose du dispositif en sous cutanée et à la fermeture de l’incision sous anesthésie : 10 min - 1 injection (5 sec) et 6 prélèvements (30sec) sous anesthésie - 1 nouvelle ouverture du site chirurgicale pour mimer la mise en place du médicament dans le dispositif (10 min)

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue sera une douleur liée à l’incision permettant la mise en place du dispositif en sous cutanée. Les animaux subiront également deux anesthésies générales. Le liquide interstitiel se trouvant dans le dispositif de certains animaux seront prélevés sous anesthésie volatile à travers la peau et le dispositif. La préhension, l’injection et le prélèvement peuvent entrainer un stress chez la souris. Le dispositif peut également créer une gêne. Durant la phase de mise au point, les animaux seront hébergés à 3 ou 5 par cage. Dans ces conditions, des évènements d’arrachage de points de suture peuvent être observés et abimer les plaies, augmentant ainsi la douleur des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecter la cage et évaluer la charge bactérienne au cours du temps.

Remplacement

Un gros travail a été réalisé in vitro sur l’efficacité du cocktail de bactériophages sur un grand nombre de souches de S. aureus ainsi que dans des modèles de biofilm. Toutefois, l’efficacité de tels composés in vivo peut s’avérer très différente de celle obtenue in vitro tant sur le plan de l’efficacité elle-même que sur la cinétique des phages dans un organisme vivant au niveau du site de l’infection. Enfin, les modèles pré-cliniques sont règlementaires pour le développement de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, au vu du peu d’informations existantes sur ce sujet.

Réduction

La phase de mise au point consiste à évaluer le meilleur inoculum permettant la formation de biofilm et une charge bactérienne stable sur 21j. Le dispositif « tissus cage » grâce à ses 130 trous permet de prélever les animaux à différents temps sans mise à mort de l’animal. Cette phase de mise au point participera à la réduction globale du nombre d’animaux sur l’ensemble du projet. De plus cette étude se déroulera de façon séquentielle. Un inoculum sera évalué et s’il permet d’atteindre l’objectif souhaité, le deuxième ne sera pas testé ce qui permettra une réduction de 23 animaux. Le nombre d’animaux a été réduit à 5 par point, le minimum nécessaire pour une évaluation statistique de la charge bactérienne et de la formation du biofilm.

Raffinement

L’acte chirurgical d’incision cutanée sera réalisé sous anesthésie générale. Une couverture analgésique sera mise en place 30min avant la chirurgie et pendant 72h. Les animaux seront suivis quotidiennement dans les 5 jours suivant la chirurgie puis tous les 2 jours. Une fois infectés, les animaux seront de nouveau suivi quotidiennement. Les animaux seront hébergés par trois ou cinq. Pour limiter le stress et pour le bien-être des animaux, les cages seront enrichies de jouets et de matériaux de nidation. Des critères d’arrêt de l’étude ont été mis en place pour assurer le bien-être animal.

Choix des espèces

Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour les modèles infection ainsi que pour l’évaluation de nouvelles molécules. Cette espèce a pour intérêt d’avoir un système immunitaire et une physiologie proche de ceux de l’homme, ce qui permet d’étudier au mieux le comportement de molécules qui sont destinés à la clinique humaine. Les souris représentent dans la littérature une référence pour le modèle « tissu cage ». Des souris adultes (10 semaines) seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 25g et un système immunitaire mature.