Recherche appliquée
- Alimentation animale
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- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
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- Troubles immunitaires
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Impact de l’acide lipoïque sur le statut oxydatif et la pigmentation des salmonidés soumis à un stress d’élevage.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Soumises à dix jours de stress d'entassement, avec réduction du volume d'eau une heure par jour, des jeûnes de 36 puis 45 heures et sept sorties hors de l'eau, 400 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvements. Le porteur présente le projet comme visant la santé et le bien-être des poissons d'élevage. Il précise pourtant que la pigmentation du filet est un "critère économique majeur" et que l'acide lipoïque testé pourrait réduire les dévalorisations commerciales liées à une couleur insuffisante. La truite sert ici de modèle pour le saumon atlantique.
Objectifs
En pisciculture, les poissons sont souvent exposés à différentes formes de stress, dont le stress oxydatif. Celui ci apparaît lorsque l’organisme produit trop de dérivés réactifs de l’oxygène par rapport à ses capacités de défense. Ces substances sont générées naturellement, notamment lors de la respiration ou de la transformation des nutriments en énergie. En conditions normales, le poisson contrôle ces composés grâce à ses systèmes de défense et à des éléments de l’alimentation, comme les vitamines C et E ou certains pigments antioxydants tels que l’astaxanthine. En élevage, cet équilibre peut être rompu par des facteurs environnementaux défavorables : forte densité, qualité de l’eau variable, variations de température, faible oxygénation, polluants ou manipulations fréquentes. La qualité de l’alimentation joue également un rôle, notamment lorsque les matières premières sont oxydées. Une production excessive de substances oxydantes peut alors nuire à la santé des poissons : altération des cellules, baisse des performances de croissance et de l’efficacité alimentaire, et sensibilité accrue aux maladies. Chez les salmonidés, le stress oxydatif peut aussi affecter la pigmentation, favoriser certaines pathologies, provoquer des troubles branchiaux ou la formation de cataractes. Pour limiter ces effets, les éleveurs agissent sur la qualité de l’eau, réduisent les manipulations et enrichissent l’alimentation en antioxydants. Malgré ces mesures, le stress oxydatif peut persister dans certaines conditions d’élevage. L’acide lipoïque est un antioxydant naturel capable d’agir à la fois dans les milieux aqueux et lipidiques. Il neutralise les composés oxydants en excès et renforce l’action d’autres antioxydants, comme les vitamines C et E. Des études internes suggèrent qu’il aide les poissons à mieux faire face au stress et à maintenir un meilleur état de santé. L’objectif du projet est d’évaluer l’effet de l’acide lipoïque sur la coloration de la truite arc en ciel à l’aide d’un modèle de stress représentatif des conditions d’élevage
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des avancées concrètes en matière de santé, de bien être et de résilience des salmonidés d’élevage. Dans les pratiques aquacoles actuelles, certaines interventions techniques – telles que les manipulations mécaniques ou les opérations en bateau puits – peuvent constituer des sources de stress pour les poissons. En Norvège, les données de 2023 indiquent qu’environ 58 millions de saumons sont morts en mer, soit près de 16,7 % de la production annuelle, une partie de cette mortalité étant associée aux manipulations liées notamment aux traitements antiparasitaires. Par ailleurs, l’évolution observée entre 2012 et 2022 met en lumière une augmentation de la fréquence et de l’ampleur des épisodes de mortalité, suggérant une sensibilité accrue des poissons lors de certaines interventions techniques. Dans ce contexte, l’étude d’antioxydants nutritionnels tels que l’acide lipoïque pourrait contribuer à soutenir la robustesse des animaux et à atténuer les effets physiologiques liés à ces procédures indispensables. L’objectif ce de projet apportera des bénéfices qualitatifs importants en limitant les pertes de pigmentations associées aux conséquences du stress mécanique auquel les animaux sont soumis à travers les conditions d’élevage. Une étude récente a en effet démontré que les manipulations répétées, notamment les traitements de déparasitage, peuvent entraîner une dégradation marquée de la coloration du filet, touchant entre 2 % et 40 % des poissons selon les sites et l’intensité des traitements. Or, la pigmentation du filet est un critère économique majeur en salmoniculture. En améliorant le statut oxydatif et la stabilité pigmentaire, l’acide lipoïque pourrait réduire la fréquence des dévalorisations commerciales liées à une coloration insuffisante des filets. Enfin, l’utilisation de l’acide lipoïque et de l’astaxanthine lipoate permettra d’évaluer et de soutenir des stratégies nutritionnelles innovantes, potentiellement plus stables et plus efficaces pour aider la physiologie des poissons dans des conditions d’élevage exigeantes. En renforçant la résilience biologique et la qualité du produit final, ce projet contribuera à une aquaculture plus durable, en réduisant les pertes, en optimisant l’utilisation des ressources et en améliorant le bien être des animaux dans un cadre expérimental contrôlé.
Procédures
Une mise à jeun de 36 h, correspondant aux pratiques standards de gestion en aquaculture des salmonidés, est appliqué afin de diminuer le stress métabolique avant la mise en place des animaux. Les animaux seront soumis à la procédure (stress d’entassement) pour une durée effective de 10 jours. Une mise à jeun de 45 heures sera appliquée avant la période de stress. Au cours du stress, le volume d'eau dans le bassin sera diminué une heure par jour pendant 10 jours. Les animaux seront sortis hors de l’eau pour les pesées et le prélèvement (7 fois pendant 30 secondes ). Un prélèvement de sang sera réalisé une fois par animal avec un temps de prélèvement qui ne dépassera pas une minute.
Impact sur les animaux
Pendant la période de stress : Perte de poids, diminution du facteur corporel, diminution de l'appétit, détérioration de l'état corporel. Stress chronique avec une densité plus élevée (densité de 100 kg/m³) dû à la diminution du volume d'eau pour simuler un entassement des poissons. Douleur transitoire à l’endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques. Ces prélèvements permettront de mieux appréhender l'effet de l’inclusion d’un antioxydant pour palier à la dégradation de la pigmentation des poissons soumis à des conditions d’élevage exigeantes.
Remplacement
Au moment de la réalisation de la procédure expérimentale il n'existe aucun modèle in vitro ou in silico capable de reproduire tous les facteurs cellulaires et acellulaires impliqués dans la complexité du stress physiologique, et les effets sur le stress oxydatif systémique et la modulation de ces réponses physiologiques par la nutrition. De ce fait, la procédure est nécessaire et ne peut être remplacée par une autre stratégie qui n'implique pas l'utilisation d'animaux vivants.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats obtenus dans d'autres études sur la réponse au stress d’élevage lors de l’utilisation du complément alimentaire chez d’autres espèces aquatiques. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux sont définies de manière à ce que la densité d'animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température, luminosité), l'enrichissement des bassins (bâche semi-opaque simulant un refuge, aérateur stimulant les poissons) et la qualité de l'eau offrent un confort maximal aux animaux et restent conforme à la législation en vigueur. Aucun animal ne sera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, afin de minimiser l'anxiété et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou échantillonnage) au cours de cette étude, les truites arc-en-ciel sont anesthésiées. La capture et le stress liés à la sortie des bassins (moins de 30 secondes avant l'anesthésie ; procédure légère) pour la pesée par groupe des animaux et le prélèvement sanguin (approche ventrale ; durée : 30 secondes ; procédure légère) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l'utilisation de mousse humide pour placer l'animal sur le support de contention et un point de pression sur le site de prélèvement, comme décrit dans la procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Pendant la période de stress (60 minutes, procédure modérée), le poisson reste dans l'eau en permanence ; seule la nageoire dorsale sort de l'eau. Les concentrations en oxygène sont mesurées toutes les 12 minutes dans tous les bassins, ainsi que la température. Ce contrôle est assuré par des sondes placées à l'intérieur de chaque bassin et dotées d'alarmes si l'une des valeurs est atteinte.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est utilisée dans cette étude comme modèle animal représentatif pour les salmonidés. La truite est une excellente espèce modèle car elle est elle-même un salmonidé largement élevé et est taxonomiquement proche du saumon, ce qui permet une extrapolation significative des résultats au saumon atlantique. De plus, la truite arc-en-ciel est bien établie comme un animal de laboratoire fiable et robuste. Ils présentent une forte résilience aux conditions de reproduction contrôlées, des taux de croissance relativement plus élevés et une plus grande résistance aux maladies courantes. Ces caractéristiques les rendent particulièrement adaptés à l'évaluation des effets antioxydants nutritionnels de l'acide lipoïque et des impacts sur la pigmentation chez les animaux stressés dans des conditions expérimentales contrôlées. Les truites utilisées dans cette étude auront 125 g au début du nourrissage, environ 220 g au début de la période de stress, 260 g après 10 jours, puis 300 g après récupération. Ces stades correspondent précisément à la phase juvénile tardive / sub adulte, reconnue comme optimale pour l’étude de la pigmentation musculaire chez les salmonidés. En effet, plusieurs travaux scientifiques montrent que la capacité d’absorption, de transport et de dépôt des caroténoïdes dans le muscle — en particulier l’astaxanthine — augmente fortement chez les truites entre 50 g et 300 g, avec une efficacité de dépôt maximale dans cette fourchette de poids.
Etude de toxicité chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 7040
Administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou nasale jusqu'à 120 fois pour certains, 14 080 souris et rats vont être utilisés dans des études de toxicité, tous tués à l'issue pour analyser leurs organes. Ces procédures d'un niveau de souffrance modéré visent à évaluer l'innocuité de nouveaux candidats médicaments avant tout passage chez l'humain. Le porteur mentionne des points limites qui déclenchent la mise à mort anticipée des animaux dont l'état se dégrade. L'effectif, le plus élevé du lot, est présenté comme "adapté des recommandations de l'OCDE", sans que le total soit autrement justifié.
Objectifs
L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.
Procédures
1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Les animaux seront sous anestésie chimique lors des administration intratrachéales. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).
Choix des espèces
L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.
Évaluation de la transmission de la capacité à résister à la chaleur entre la mère et sa progéniture chez les poulets de chair – MODIFICATION – PARTIE 1/2
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
260 poulets de chair d'une lignée à croissance lente vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une partie subit à 24 jours la pose chirurgicale de deux capteurs de température, l'un dans l'abdomen, l'autre sous la peau, avant une exposition en fin d'élevage à cinq jours de vagues de chaleur artificielles oscillant entre 32°C le jour et 25°C la nuit. Le porteur décrit les risques de la chirurgie, le stress des prises de sang et de l'exposition à la chaleur, jusqu'aux comportements de picage aggravés par la chaleur. Les carcasses seront valorisées commercialement, sauf celles des dix animaux ayant porté les capteurs.
Objectifs
Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux. LE PROJET SE DEROULERA DANS L'EU 1, SAUF LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE PAR VOIE CHIRURGICALE QUI SE DEROULERA DANS L'EU 2.
Bénéfices attendus
L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.
Procédures
Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 24 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement. DANS L'EU1 SERONT EFFECTUEES TOUTES LES EXPERIMENTATIONS SAUF L'ANESTHESIE GENERALE ET LA POSE DES CAPTEURS DE TEMPERATURE QUI SERONT REALISES DANS L'EU2. LES ANIMAUX SERONT TRANSPORTES DEUX FOIS ENTRE LES DEUX EU (5 MIN PAR TRAJET).
Impact sur les animaux
La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur. LE TRANSPORT ENTRE LES DEUX EU PEUT ENGENDRER UN LEGER STRESS.
Devenir
Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).
Réduction
Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.
Raffinement
Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins. LE TRANSPORT DES ANIMAUX DE L'EU 1 VERS L'EU 2 AVANT L'OPERATION ET LEUR RETOUR DE L'EU 2 VERS L'EU 1 SERA REALISE PAR UN TECHNICIEN FORME DANS UN VEHICULE AGREE POUR LE TRANSPORT D'ANIMAUX VIVANTS. LE TRAJET EST TRES COURT (MOINS DE 5 MIN).
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 24 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).
Développement et comparaison d’ARNm formulés dans le traitement des problèmes de peau dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Jusqu'à huit anesthésies, une électroporation par micro-choc électrique et huit injections par animal: 395 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les sites d'injection. Le porteur reconnaît les douleurs liées aux injections et aux électroporations ainsi que le stress des anesthésies répétées. L'objectif est de comparer des formulations d'ARNm afin d'en retenir les plus efficaces avant un éventuel essai chez l'humain. La régénération plus rapide de la peau promise aux patients reste une perspective, alors que les atteintes aux souris sont immédiates.
Objectifs
Dans ce projet, plusieurs candidats médicaments ont déjà été sélectionnés à l’issue de nos travaux précédents, et le modèle murin d’administration par électroporation (micro-choc électrique permettant au candidat de rentrer plus facilement dans les cellules cibles) est désormais développé et validé. L’objectif est maintenant de tester et de comparer différentes formulations de ces candidats, notamment selon une approche dose-réponse, afin d’identifier les formulations les plus efficaces et les mieux tolérées. Cette étape est indispensable pour affiner la sélection des meilleurs produits avant leur caractérisation finale et la conception d’un futur essai clinique chez l’homme..
Bénéfices attendus
Les problèmes de peau, pour certaines qui sont des pathologiques chroniques, handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La régénération des tissus de la peau est un processus très long et qui parfois ne permets pas totalement de retrouver l’état d’origine de la peau. Les patients attendent donc aujourd’hui des traitements efficaces et rapides. L’injection de nos composés pourrait permettre de régénérer la peau plus rapidement et plus longuement avec seulement une injection.
Procédures
Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesies de 10-15 min. 1 injection intradermale (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intradermale, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intradermale puis maximum 7 intrapéritonéales) - Les douleurs et stress liés aux électroporations - Stress lié aux anesthésies multiples
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, dans ce projet, les sites d’injection seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible dans ce projet car les objectifs nécessitent l’étude d’un organisme vivant intégrant l’ensemble des paramètres physiologiques. L’évaluation de l’administration intradermique par électroporation, de la tolérance locale et systémique, de la bio distribution, de l’expression spatio-temporelle de l’ARNm et de l’efficacité biologique des candidats implique des interactions complexes entre la peau, le système immunitaire, la vascularisation et les processus de réparation tissulaire. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des modèles in vitro, ex vivo ou in silico. Les modèles alternatifs (ou ces constructions/formulations ont été évaluées) permettent uniquement d’étudier des mécanismes isolés (cytotoxicité, pénétration, expression locale), mais pas la réponse globale de l’organisme ni l’efficacité fonctionnelle des composés. De plus, le suivi par bioluminescence de l’expression de la luciférase nécessite un organisme vivant. Ainsi, l’expérimentation animale constitue une étape indispensable de validation préclinique.
Réduction
Nous utiliserons donc nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à des résultats statistiquement significatifs . Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergées en groupe de 3 ou 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. L’injection intradermique sur le flanc est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient le plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.
Choix des espèces
Bien qu’il existe actuellement des modèles de peaux humaines reconstruites ou encore des modèles ex vivo permettant de tester la toxicité ou la pénétration de certains produits ou vecteurs, ceux-ci ne prennent pas en compte la totalité des conditions physiologiques de l’Homme. Ainsi, après vérification in vitro de la non-toxicité (sur peau reconstruite notamment) des vecteurs d’intérêt dans les différentes formulations testées, nous souhaitons tester leur efficacité en condition « la plus proche de l’Homme » en reproduisant au mieux la complexité (avec des interactions cellulaires, une vascularisation et une réponse immunitaire similaires) de la peau humaine. De plus, la réponse immunitaire et l’inflammation est un facteur clé dans l’évaluation de l’efficacité des constructions/formulations (élimination plus ou moins rapide par l’organisme). Souris swiss femelles âgées de 7 semaines en début d’expérimentation et 9-14 semaines maximum en fin d’expérimentation. La peau de ces animaux est parfaitement stable et n'évolue plus à cet age.
Cartographie multidimensionnelle de l’ischémie reperfusion sur prélèvements d’organes porcins
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
20 cochons juvéniles vont être utilisés, anesthésiés profondément puis tués sans reprise de conscience, pour prélever leur cœur, leurs poumons, leur foie et leurs reins juste après l'arrêt de la circulation. L'objectif déclaré est de reproduire ce qui se passe chez les donneurs d'organes humains décédés, afin de mieux trier les organes greffables. Le porteur présente la procédure comme sans souffrance, tout se déroulant sous anesthésie générale suivie de la mise à mort immédiate. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit l'ischémie sur plusieurs organes à la fois et juge le recours au porc "indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à créer un modèle porcin qui reproduit au mieux ce qui se passe chez les donneurs d’organes décédés après un arrêt circulatoire contrôlé. L’objectif est de comprendre comment l’interruption du sang (appelée « ischémie chaude ») abîme les organes comme le cœur, les poumons, le foie et les reins. Pour cela, plusieurs analyses seront réalisées pour suivre très précisément les changements biologiques dans ces organes juste après l’arrêt de la circulation. Les organes seront ensuite testés sur des machines de perfusion pour vérifier leur capacité réelle à fonctionner après ce type d’ischémie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des effets de l’ischémie chaude sur les organes destinés à la transplantation. Les résultats aideront à mieux définir quels organes peuvent être greffés en toute sécurité, à réduire le nombre d’organes refusés et, à terme, à augmenter les chances de succès des greffes. Les analyses réalisées pourraient également conduire au développement futur de nouveaux outils d’évaluation des organes avant transplantation.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés profondément puis mis à mort selon une procédure réglementaire. Après le décès, les organes seront prélevés. Aucune intervention n’est réalisée sur des animaux conscients. Il n’y a pas de procédures prolongées, ni de réveil après chirurgie.
Impact sur les animaux
Aucun effet secondaire autre qu'un stress léger à modéré de courte durée lors de la contention n’est attendu puisque toutes les interventions ont lieu sous anesthésie générale suivie immédiatement de la mise à mort.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie générale car les organes doivent être prélevés immédiatement pour l’analyse scientifique. Cette étape est indispensable pour obtenir des échantillons représentatifs des conditions rencontrées chez les donneurs d’organes humains. Aucun animal ne peut être replacé ou adopté car la procédure implique leur mise à mort.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier l’effet réel de l’ischémie chaude sur plusieurs organes simultanément dans des conditions proches de celles de la transplantation humaine. Les modèles informatiques, les cultures cellulaires ou les organes isolés ne peuvent pas reproduire l’ensemble des interactions physiologiques.
Réduction
Le modèle multi organes permet d’étudier quatre organes chez un même animal, ce qui réduit très fortement le nombre total d’animaux nécessaires par rapport à des études séparées organe par organe. Chaque animal fournit de nombreuses données, limitant l’effectif global au strict minimum scientifique.
Raffinement
Lors de la période d'acclimatation, les animaliers profitent du temps du change de litière dans les hébergements et de la distribution d'aliment et d'eau pour les habituer à la présence de l'homme et distribuer caresses ainsi que friandises. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale profonde, suivie immédiatement de la mise à mort. Les animaux ne se réveillent pas et ne ressentent pas de douleur. Les manipulations sont limitées au minimum nécessaire, en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Le porc est choisi car son anatomie, sa physiologie et la taille de ses organes sont proches de celles de l’être humain. Cela en fait un modèle de référence pour les études liées à la transplantation. Les animaux utilisés sont des juvéniles, en bonne santé, ce qui permet d’obtenir des organes comparables à ceux des donneurs humains tout en garantissant un haut niveau de bien être animal avant la procédure.
Contremesures ciblant le botulisme MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Une paralysie flasque progressive jusqu'à l'arrêt respiratoire : 5 028 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères, pour un test de létalité mesurant des sérums équins contre les toxines botuliques. Injectées ou gavées avec la neurotoxine, elles développent une hypothermie et une posture repliée en "taille de guêpe" que le porteur utilise pour prédire leur mort. Le protocole mesure la dilution d'anticorps protégeant la moitié d'un groupe. Le porteur décrit ce test sur souris comme la "seule méthode reconnue" par la Pharmacopée, tout en développant en parallèle un dosage censé le remplacer.
Objectifs
Ce programme de recherche vise à caractériser l’activité neutralisante de produits sériques équins dirigés contre les neurotoxines botuliques (BoNTs). Dans ce programme de recherche, nous utilisons des produits innovants. Il est donc nécessaire de définir l’activité neutralisante des produits sériques équins et d’apporter la preuve que les anticorps dirigés contre chaque BoNT sont capables de protéger contre une intoxication par voie digestive. De larges quantités d’anticorps neutralisants ont été produites pour générer un prototype de traitement. Sur le modèle de ce qui a été mis en place dans l’étude précédente, nous prévoyons de définir des produits équins afin de garantir une couverture de protection plus large. La mesure des titres neutralisants des anticorps sera effectuée à l’aide d’un test de léthalité chez la souris. Ceci nous permettra de définir la dilution d’anticorps protégeant la moitié des souris au sein d’un groupe. Le troisième volet correspond à la mise en œuvre d’une expérience d’ingestion des BoNT par gavage chez la souris, suivie de l’injection à différentes dilutions du mélange d’anticorps correspondant. Ceci nécessitera la production de lots de neurotoxines et la mesure de l’activité toxique de ces lots. Cette étude permettra de démontrer qu’un produit prototype offre une protection contre l’ingestion de neurotoxines et que cette protection est conférée à une dose équivalente de celle requise pour protéger l’Homme. A l’issue du programme, nous aurons donc caractérisé l’activité de différentes BoNT et d’anticorps lyophilisés. Nous prévoyons aussi d’apporter la preuve de concept que le prototype de candidat médicament ciblant certains sérotypes de BoNTs est protecteur dans un modèle d’ingestion de neurotoxine.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser des produits sériques neutralisants d’origine équine contre les sérotypes de neurotoxines botuliques connus pour être responsables du botulisme chez les patients. Nous montrerons aussi que l’injection d’un produit prototype chez la souris offre une protection contre l’ingestion de neurotoxines (issues de souches isolées des patients). Ce programme contient plusieurs livrables dont la production de différents types de produits « standards » que sont : 1) les lots de neurotoxines et 2) les anticorps équins anti-toxines d’activité neutralisante définie dans ce programme. Nous apporterons aussi la preuve de concept que le produit prototype offre une protection contre l’ingestion de neurotoxines natives que ce produit soit co-injecté mais aussi par voie intraveineuse dans le cas d’une intoxication digestive, qui constitue la voie naturelle du botulisme.
Procédures
Les deux premières procédures consistent à injecter (quelques secondes) aux animaux des neurotoxines avec ou sans produit sérique neutralisant avec un suivi de la paralysie sur quatre jours. La troisième procédure consistera à administrer aux animaux les toxines par voie orale (quelques secondes) puis consistera à injecter une heure après des anticorps (quelques secondes). Un seul prélèvement de sang de quelques secondes sera effectué sur un groupe contrôle pour s’assurer que la toxine est passée dans le compartiment sanguin. Les effets létaux des toxines et de protection des anticorps seront suivis sur une période de 4 jours.
Impact sur les animaux
Le botulisme humain et animal est dû à l’action de neurotoxines qui ciblent la terminaison nerveuse des motoneurones, ce qui entraine un blocage de la transmission neuromusculaire. Il s’ensuit une paralysie flasque progressive allant jusqu’à l’arrêt respiratoire. Au stade intermédiaire les souris adoptent un phénotype caractéristique dit en « taille de guêpe » et présentent une hypothermie. Elles apparaissent très allongées, pour maximiser leur capacité respiratoire. Les souris sont progressivement impactées dans leur liberté de mouvement pour boire et se nourrir et montrent des signes d’hypothermie et d’isolement. C’est l’ensemble de ces symptômes, lorsqu’ils sont combinés, qui permettent de prédire la mort des souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure car les effets de la toxine sont irréversibles après l’injection et ils ne peuvent être ré-utilisés.
Remplacement
Les méthodes alternatives que nous développons pour la détection, la quantification des neurotoxines botuliques (BoNT) et leur sérotypage nécessitent la mise en place et la calibration d’outils « standards », qui font l’objet des procédures 1 et 2 de cette étude. A ce jour, aucun modèle in vitro permet de reproduire la complexité d’une intoxication par la toxine botulique. Les études sur un modèle animal restent donc indispensables pour évaluer l’activité de la toxine botulique ainsi que l’efficacité des traitements développés. Ces études dans un organisme complet permettent de recueillir des données nécessaires à la calibration de standards qui seront utilisés pour le développement de méthodes alternatives et l’évaluation l’efficacité des traitements pour une application chez l’humain. En particulier, un test de dosage enzymatique requérant des fragments d’anticorps standards est mis en place pour remplacer les tests de mesure de létalité chez la souris. Ce test doit permettre, à terme, de définir des titres protecteurs des anticorps obtenus à partir des chevaux hyperimmunisés lors de la phase de production du produit thérapeutique.
Réduction
La méthode de réduction appliquée est l’emploi du plus faible nombre de souris possible afin d’atteindre un coefficient de variation proche de 20% idéalement, avec : 1) des protocoles adaptés, utilisant de groupe de 4 animaux et des tests avec un nombre minimal de dilutions encadrant les doses létales ou de neutralisation mais permettant de définir des intervalles de confiance suffisamment précis. 2) les bonnes pratiques de laboratoire et une gestion des résultats, afin de limiter le nombre d’expériences nécessaires à l’obtention de résultats fiables, en intégrant les recommandations de la Pharmacopée européenne.
Raffinement
La surveillance des souris a été accrue afin de détecter le plus tôt possible les signes cliniques du botulisme. Pour ce faire, les animaux sont observés quotidiennement afin de réduire les risques de souffrance, nous avons identifié des critères précoces notés sur une feuille d’observation, qui nous permettent de prévoir la mortalité des souris et de limiter la souffrance animale par mise à mort rapide. Des mesures d’amélioration des conditions de vie des souris ayant du mal à se déplacer après l’injection ont été mises en place (des gels hydriques imbibés d’eau et de nourriture sont placés dans la cage).
Choix des espèces
Le test de référence de létalité sur souris est la seule méthode reconnue de référence dans la Pharmacopée pour la détection et le dosage des toxines botuliques. Cette méthode doit être réalisée sur un modèle murin afin d’obtenir la meilleure sensibilité de tous les sérotypes connus pour être pathogènes chez l’homme. Souris âgées de 3 à 5 semaines. La sensibilité des souris aux toxines botuliques dépend de leur âge et de leur poids. Le test de référence de létalité sur souris MBA est la seule méthode reconnue dans la Pharmacopée pour la détection et le dosage des toxines botuliques, ainsi que pour la détermination des titres neutralisant de produits sériques anti toxines. Cette mesure doit être réalisée sur la souris car aucune méthode alternative fiable n’existe à ce jour.
Réalisation d’acquisition scanner à des fins d’évaluation préclinique de produits de santé/ dispositifs médicaux
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Renvoyés vivants dans leur établissement d'origine après chaque séance, 200 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour des acquisitions au scanner évaluant des dispositifs médicaux avant leur mise sur le marché. Chaque animal reçoit une anesthésie et parfois un produit de contraste par cathéter, lors d'une à six séances d'imagerie espacées d'au moins quinze jours. Le porteur retient le lapin parce que la taille de ses organes permet d'implanter plusieurs dispositifs sur un même animal. Le suivi par imagerie évite, selon lui, de tuer les animaux à chaque point d'analyse.
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche et développement qui vise à étudier la performance (efficacité) de produit de santé/ dispositifs médicaux et/ou d’en évaluer la tolérance (sécurité). Les produits évalués sont destinés à être mis en contact avec le corps humain et doivent donc être préalablement testés pour garantir la sécurité des patients et l’efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. En ce sens, différents types d’essais peuvent être menés : - Essais de performance : - Essais de screening d’efficacité : Les essais de screening d’efficacité vérifient si la performance d’un produit mérite d’être approfondie ou s’il est nécessaire de mener d’autres études avant de passer aux essais de confirmation de performance. Ces essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés. - Essais de confirmation de performance : Les essais de confirmation de performance sont effectués après validation des essais de screening d’efficacité. Comme leur nom l’indique, ils visent à confirmer les résultats obtenus lors des essais préalablement menés sur un produit. - Essais de tolérance locale : Les essais de tolérance locale évaluent la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger. Dans ce projet, ces essais peuvent être réalisés en complément des essais de performance, sur les mêmes animaux. Afin d’évaluer ces différents points, des acquisitions d’imagerie scanner seront réalisées au sein de notre établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance des produits de santé/ dispositifs médicaux testés. En mimant au plus près l'implantation du dispositif chez les patients, ces études permettront de mieux appréhender la réaction de l’organisme au produit à tester, et ainsi améliorer la sécurité et/ou les performances du produit, avant sa mise sur le marché.
Procédures
Des acquisitions scanners pour observer les produits de santé / dispositifs médicaux en cours d'étude seront réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 6 sessions d'imagerie peuvent être envisagées en cours d'étude, espacés de minimum 15 jours). La durée de l'intervention est d'environ 20 minutes (anesthésie comprise).
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une anesthésie volatile ou fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant les anesthésies. Le transport des animaux de leur EU d’origine jusqu’à notre EU peut générer du stress.
Devenir
Les animaux retourneront dans leur EU d’origine à la fin de la réalisation de chaque acquisition scanner.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé/ dispositifs médicaux en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé et le produit ou dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Le suivi longitudinal des produits de santé/ dispositifs médicaux par imagerie scanner offre une évaluation répétée dans le temps, sans nécessiter l’euthanasie des animaux à chaque point d’analyse pour réaliser des évaluations par histologie par exemple permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux devant être inclus dans les études.
Raffinement
Les transports des animaux entre l’EU d’origine et notre EU seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur. Les animaux seront transportés dans des cages individuelles jetables adaptées et un substrat sera fourni aux animaux. Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie scanner, afin de limiter le stress des animaux, une période de repos de minimum 1 heure sera instaurée entre la réception des animaux et l'anesthésie en l’absence de signe de stress marqué (agitation importante, tachypnée marqué, …) et entre le réveil des animaux et le transport retour vers l’EU d’origine (ou attente de la récupération complète de l’animal). Si des signes de stress marqués sont observés, les actes d’imagerie ne seront réalisés qu’après amélioration de ces signes. Du gel oculaire est appliqué au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux pour prévenir l'assèchement oculaire. Une attention particulière est portée à la lutte contre l'hypothermie : température de la salle, tapis chauffants et lampes chauffantes si besoin. En cas de doute, une mesure de la température rectale est réalisée.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conforme aux textes réglementaires encadrant l’évaluation préclinique des produits de santé/ dispositifs médicaux. Les produits de petite taille ou miniaturisés sont classiquement testés chez les rongeurs ou chez le lapin. Le lapin a été retenu dans ce projet car sa morphologie et la taille de ses organes permettent d’implanter plusieurs produits de santé/ dispositifs médicaux sur un même organe, tout en maintenant une distance suffisante entre elles. Cette configuration réduit le nombre total d’animaux nécessaires et garantit une analyse fiable de chaque site lésionnel par imagerie scanner, sans risque de chevauchement des zones d’intérêt. Le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée.
Rôle de la dégradation des réseaux périneuronaux par la microglie activée au niveau du cortex rétrosplénial dans la douleur neuropathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Toute souris dont le score de grimace dépasse 6 sur 10 reçoit un antalgique : 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie classée sévère. Une lésion chirurgicale du nerf sciatique provoque une douleur neuropathique et des troubles anxio-dépressifs pendant huit à dix semaines, avec l'implantation d'une canule dans le cerveau et des tests de sensibilité au froid et à la douleur. Le projet étudie le rôle de cellules immunitaires cérébrales dans la douleur chronique. Les animaux sont mis à mort pour prélever le cerveau.
Objectifs
La douleur suite à une lésion et/ou une maladie du système nerveux sensoriel appelé douleur neuropathique touche environ 10 % de la population mondiale. Malgré des années de recherche, les traitements restent limités et souvent associés à de nombreux effets indésirables. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant ce type de douleur et des comorbidités associées pourrait améliorer sa prise en charge. Il a été suggéré que la dégradation d'un composant du réseau de molécules qui entourent les neurones, les réseaux périneuronaux, par les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central, la microglie,modulent l'activité neuronal et pourrait jouer un rôle crucial dans la douleur neuropathique, au moins, au niveau de la moelle épinière. Nous avons démontré précédemment qu’une structure du cerveau, le cortex rétrosplénial, pourrait jouer un rôle important dans la douleur neuropathique par une approche d’imagerie cérébrale. Ce changement d'activité du cortex rétrosplénial était associé à une activation de la microglie. Cependant, le rôle de la dégradation des réseaux périneuronaux par la microglie activée, le type de neurones (inhibiteurs ou excitateurs) affectés et les conséquences de cette dégradation sur les comorbidités associées à la douleur neuropathique ne sont pas encore connus. Enfin, l'effet de l'inhibition de l’activation de la microglie dans cette structure cérébrale dans la douleur neuropathique reste également inconnu. L'objectif de ce projet est de mieux caractériser la dégradation des réseaux périneuronaux et le type de neurones plus particulièrement affectés, par la microglie dans le cortex rétrosplénial dans un modèle de douleur neuropathique. Nous étudierons également l'effet de l'inhibition de la microglie dans ce cortex rétrosplénial sur la dégradation des réseaux périneuronaux, le comportement douloureux et surtout l'anxiété et la dépression associées dans ce type de douleur par des approches d’immunohistochimie et comportementales.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle de la dégradation des réseaux périneuronaux, composant dun réseau de molécules entourant les neurones, par la microglie sur l’activité neuronale au sein du cortex rétrosplénial dans la douleur neuropathique. A plus long terme, comprendre ces mécanismes pourrait permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques impliqués dans les mécanismes de dégradation des réseaux périneuronaux potentiellement impliquée dans les comorbidités (anxiété et dépression) associées la douleur chronique.
Procédures
Les interventions seront des injections d'une molécule induisant l'expression du gène (5 injections au totale) et une injection d'un antalgique lors de la chirurgie stéréotaxique. Chaque injection dure moins d’une minute. La mesure de la sensibilité mécanique au niveau de la patte avant et 1 et 8 semaines post-chirurgie ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la patte de l'animal. La mesure de la sensibilité thermique au froid au niveau de la patte avant et 1 et 8 semaines post-chirurgie ; cette mesure se fait par l'application d'une goutte d'acétone. La mesure de l'anxiété se fait par le test de la croix surélevée qui dure 5 minutes. La mesure de dépression se fait par le test du "novelty supressed feeding" qui dure 5 minutes. Ces deux tests provoquent une nuisance légère de courte durée. Les animaux (n=80) subissant la procédure chirurgicale afin d'implanter dans le cerveau une canule d'injection. Cet acte dure environ 40 minutes et se fait sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite utilisés pour afin d'évaluer l'effet de l'inhibition de la microglie sur le comportement douloureux et l'anxiété et la dépression. L'induction du modèle de douleur se fera sous anesthésie générale gazeuse, durée
Impact sur les animaux
Les interventions seront des injections d'une molécule induisant l'expression du gène (5 injections au totale) et une injection d'un antalgique lors de la chirurgie stéréotaxique qui dure moins d'une minute et induise un stress très léger chez l'animal. La chirurgie Spared Nerve Injury (SNI) consiste à réaliser une lésion du nerf sciatique qui entraine une douleur sévère et des comorbidités anxiodépressives durant environ 8 à 10 semaines. Les stimulations mécaniques avec les filaments fins induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée ainsi que l’application d'acétone. L’anesthésie précédant la chirurgie stéréotaxique induit un stress léger de l’animal seulement le temps de l’injection (moins de 1 min) de l’anesthésique. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h. L’induction de l’anesthésie à l’isoflurane précédant la chirurgie, les injections systémique d'antalgique et d'une susbstance par les canules induit un stress léger de l’animal. L'ensemble des injections (cad 6 injections au total) induisent L'ensemble des chirurgies effectués sur le même animal constitue une procédure sévère en particulier la lésion du nerf sciatique.
Devenir
Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever le cerveau.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Il n’est pas encore possible d’utiliser des méthodes alternatives pour modéliser l’ensemble du cerveau. Enfin, seuls des animaux génétiquement modifiés permettent d'inhiber spécifiquement la microglie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Nous utiliserons un nombre équivalent d'animaux mâles et femelles en respect de la règle des trois "R" et des directives sur la Recherche Animale. Ainsi pour l'ensemble des procédures nous utiliserons 128 animaux (64 mâles et 64 femelles). Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisé pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.
Raffinement
La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre du modèle utilisé et des stimulations appliqués lors des tests comportementaux. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques et thermiques, nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain sur le bien être des animaux dans ce type de recherche. Nous limitons la fréquence des tests (deux sessions sur une durée de 8 semaines) et les stimulations en durée et en intensité au minimum. Enfin, l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Enfin ces tests sont réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la recherche sur la douleur et l'analgésie. Pour améliorer le bien-être des animaux suite à la chirurgie, le réveil suite à l'anesthésie est effectué dans une cage sur un tapis chauffant afin d'éviter tout risque d'hypothermie et après injection de sérum physiologique afin d'éviter tout risque de déshydratation suite à l'anesthésie. Les animaux sont ensuite stabulés dans des cages contenant au maximum 4 mâles ou 5 femelles avec une augmentation de la quantité de papier de nidification par rapport à la normale et un accès facilité à la nourriture pendant 2 à 3 jours (croquettes humidiés dans la cage). Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites selon une grille de score et après consultation de la SBEA. En outre, la douleur spontanée sera évaluée grâce à l'échelle de grimace chez la souris (mouse grimace scale). Si le score de cette échelle dépasse 6 sur 10, les animaux recevront un antalgique afin de soulager la douleur.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés permettant l’inhibition spécifique de la microglie, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-24 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature.
Maintien d’une colonie de souris immunodéprimées NSG
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 000 souris immunodéprimées vont être élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour fournir des animaux à des projets de cancérologie déjà autorisés. Privées de défenses immunitaires, elles sont exposées aux infections et maintenues en conditions stériles strictes. Le projet ne prévoit aucune intervention pendant l'élevage lui-même. Les animaux trop vieux ou surnuméraires, environ 80, sont mis à mort, les autres partant vers des greffes de cellules cancéreuses où ils seront utilisés puis tués.
Objectifs
Ce projet consiste à amplifier et maintenir une colonie de souris immunodéprimées à partir d'animaux reçus d’un éleveur agréé en respectant les recommandations pour un élevage dans des conditions optimales garantissant leur bonne santé et adaptées à la nature immunodéprimée des animaux. Cet élevage, en évitant les transports par camion d’animaux d’un lieu de naissance externe vers notre animalerie, améliorera le bien-être animal et leur disponibilité. Les souris immunodéprimées sont de bonnes reproductrices si elles sont maintenues dans des conditions d'hébergement optimales garantissant leur bonne santé. Nous mettrons en œuvre des mesures d'isolement rigoureuses et des techniques aseptiques pour maintenir ces souris exemptes d'agents pathogènes. Les souris seront utilisées dans des projets scientifiques d’étude sur les cancers déjà approuvés.
Bénéfices attendus
Les souris immunodéprimées seront utilisées dans plusieurs projets de recherche translationnel de cancérologie qui posent les questions de la dynamique des cellules tumorales leucémiques ou métastatiques pour les cancers épithéliaux (cancers intestinaux, cancers du sein, mélanomes, cancers de la prostate). Le maintien d'une colonie de manière rigoureuse nous permettra de disposer à tout moment de souris pour des greffes de cellules cancéreuses avec une réactivité optimale. L'élevage des animaux au sein de notre animalerie évitera également le transport des animaux d'un lieu d'élevage externe vers notre animalerie, ce qui génère du stress pour les animaux, et nous permettra de maîtriser les conditions sanitaires pour les optimiser.
Procédures
Dans le cadre du maintien de la colonie, aucune nuisance n'est attendue si les conditions d'élevage et de stérilité sont respectées. Il s’agit ici d’un élevage et aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéprimées présentent une immunodéficience sévère et sont sensibles aux infections causées par un large éventail d'agents pathogènes courants, opportunistes et commensaux. Elles seront suivies régulièrement. Le principal risque est le risque infectieux. Ces risques sont quasiment nuls dans les conditions strictes d’élevage proposées dans le projet.
Devenir
Les animaux trop vieux ou surnuméraires seront mis à mort (environ 80 animaux). Les autres animaux issus de cet élevage seront utilisés dans des projets de recherche en cancérologie associés.
Remplacement
Les souris immunodéprimées seront utilisées dans plusieurs projets de recherche translationnel de cancérologie qui posent les questions de la dynamique des cellules tumorales leucémiques ou métastatiques pour les cancers épithéliaux (cancers intestinaux, cancers du sein, mélanomes, cancers de la prostate…). Ces études nécessitent l'utilisation d'animaux vivants pour l'étude de la biodistribution des cellules cancéreuses et de leur interaction avec d’autres cellules de l’organisme pour mimer ce qu’il se passe chez l’Homme. Les méthodes in vitro existantes (tumoroïdes, organoïdes ou « organ on a chip ») ne permettent pas de récapituler la complexité du système médullaire ou de la cascade métastatique.
Réduction
Nous produirons des animaux pour les projets existants autorisés et des projets à venir. La gestion de la colonie sera stricte pour éviter la naissance d'animaux surnuméraires qui ne seront pas nécessaires dans les projets de recherche associés. Les reproductions se feront en continu et seront contrôlées jusqu'à obtention du nombre d'individus nécessaires aux projets autorisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées SOPF empêchant le développement d’infection et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. Ils seront manipulés à l’aide d’un tunnel de contention en polycarbonate. La procédure d’élevage a été établie afin de réduire au le stress. Les animaux seront surveillés quotidiennement de la naissance à la mort. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local et un avis vétérinaire sera demandé. Nous avons établi des points limites permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Une maximum nourriture adaptée pour les rongeurs et l’eau de boisson sont données ad libitum. Tous les aliments, l'eau, la litière et les cages entrant dans la pièce seront autoclavés ou stérilisés d'une manière ou d'une autre. L'équipement de protection individuelle (blouses stériles, blouses, gants, masques et charlottes) sera porté en permanence afin de couvrir la peau et de minimiser les risques de transmission de bactéries aux souris.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) immunodéprimée qui permet de greffer des cellules d’une autre espèce sans rejet. Elle représente l’espèce animale la plus propice pour le type d’étude associées à ce projet. Des animaux adultes de plus de 6 semaines seront utilisés pour les reproductions.
Impact de l’isolement social a l’adolescence sur le vieillissement cognitif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolées deux semaines pendant l'adolescence, puis soumises à des injections, des gavages, un stress de contention et jusqu'à six tests comportementaux, 736 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de quarante minutes. Le projet cherche à relier l'isolement social précoce au vieillissement de la mémoire. Les souris expérimentales sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 64 souris partenaires, moins éprouvées, sont gardées vivantes pour d'autres projets.
Objectifs
Il est aujourd'hui documenté que l'isolement social durant la période adolescente est associé à un risque accru de développer des troubles anxieux et des problèmes de mémoire à l'âge adulte, et pourrait constituer un facteur de risque au vieillissement cognitif. Néanmoins les mécanismes impliqués restent mal connus. Pour combler cette méconnaissance, notre projet a pour objectif de déterminer l'impact de l'isolement social restreint à la période adolescente sur le vieillissement des capacités mnésiques, de mettre en relation ces capacités mnésiques avec le statut émotionnel des animaux à l'âge adulte, et d'élucider certains des mécanismes pouvant expliquer les atteintes cognitives, si elles sont observées. De nombreuses données de la littérature indiquent que la neurogénèse hippocampique adulte (création de nouveaux neurones à l'âge adulte) constitue une cible de choix pour relier l'isolement social au vieillissement cognitif, aussi testerons nous l'hypothèse de son implication. Si nous mettons en évidence le rôle de cette neurogénèse, nous affinerons les mécanismes impliqués en testant l'hypothèse selon laquelle une activation anormale de l'axe du stress suite à l'isolement pourrait être a l'origine de l'altération de neurogénèse .
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre l'impact comportemental à court et à long terme de l'isolement social à l'adolescence, et de déterminer s'il constitue un facteur accélérateur du vieillissement cognitif. Si tel est le cas, la compréhension des mécanismes sous jacents devrait nous permettre à moyen terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ceux ci, et d'envisager des interventions préventives visant à améliorer le vieillissement cognitif, ce qui représente un enjeu majeur en terme de santé publique.
Procédures
1) Isolement social: il sera d'une durée de 2 semaines. 2) Injections intrapéritonéales: leur nombre est au maximum de 5 avec un temps inter injection de 24h. La durée moyenne d'une injection, préhension de la souris inclu est de 30-40 secondes. 3) Gavage: 1 par jour pendant 5 jours. La durée moyenne d'un gavage, préhension de la souris inclu est de 30-40 secondes. 3) Stress aigu: stress de contention d'une durée de 30 min. 4) Tests comportementaux: ils ont pour but de tester l'état émotionnel des animaux, et leurs capacités mnésiques; ils sont au nombre maximum de 6 par souris espacées d'au moins 24h pour les moins invasifs basés sur l'exploration, et d'au moins 1 semaine pour les plus impactants, et leur durée par jour varie de 5 à 30 min. 5) Prélèvements sanguins: ils sont au nombre de 1 à 6, et durent moins de 3 min, préhension de l'animal inclu. 6) Chirurgie: sur animal adulte une chirurgie de 40 min environ est pratiquée sous anésthésie générale.
Impact sur les animaux
1) L'isolement social peut induire un état de stress et de détresse de degré modéré puisque de courte durée. 2) Les manipulations des animaux et les tests comportementaux peuvent induire du stress et de la détresse chez les animaux d’un degré de gravité léger. 3) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un incomfort de courte durée. 4) Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une douleur aigue liée à l'incision de la queue. 5) Les procédures chirurgicales comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur postopératoire d’un degré de gravité modéré et minorée par les antalgiques administrés. 6) L'utilisation d'agents chimiques pour la manipulation de l'activité neuronale peut potentiellement entraîner des effets secondaires non désirés, tels que des altérations du comportement ainsi que de l’inconfort et du stress lié aux injections de ces agents chimiques. Ces effets secondaires parfois décrits dans la littérature sont d’un degré de gravité léger. 7) Le gavage nécessite une préhension de l'animal et peut générer un inconfort modéré de faible durée.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux sont mis a mort afin de prélever le cerveau ou de faire des mesures d'activité cérébrale. Les souris servant de partenaires dans les tests d'interaction sociale n'ayant subi qu'une procédure de severité légère seront maintenues en vie pour être utilisées dans d'autres projets.
Remplacement
L’étude de fonctions complexes telles que l'evolution des capacités mnésiques au cours du vieillissement et leur relation avec les états émotionnels ne peut être réalisée que sur animaux vivants ce qui rend impossible leur remplacement par des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes . Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, comme précisé dans les procédures, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience plusieurs test sur les mêmes animaux. Notamment, pour le test d'interaction sociale, une même souris partenaire sera utilisé pour plusieurs sessions (jusqu'a 3 maximum) afin de réduire les besoins. Enfin, un effort sera fait pour optimiser la production des souris transgéniques d'intérêt en utilisant les croisements les plus adéquats.
Raffinement
Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1. Pour les périodes hors expérimentation, les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement 2. Pendant les tests comportementaux, les souris seront habituées à l'experimentateur et aux pièces expérimentales avant toute intervention 3. En période de chirurgie: Avant la chirurgie, un analgésique sera administré par voie sous-cutanée, à titre préventif; les chirurgies se feront sous anesthésie générale, controle de la température et protection contre le dessechement oculaire. Après la chirurgie, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage, et un analgésique sera injecté pendant 3 jours post opératoire. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. En cas de dégradation de l'état de l'animal, détéctée par une perte de poids associée un comportement anomral, l'animal sera sorti de l'étude et mis à mort. Notre étude reposant sur des mesures comportementales exigeant une integrité physique, aucune mesure conservatoire ne sera mise en place.
Choix des espèces
La création de nouveaux neurones dans le cerveau adulte, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les liens entre stress a l'adolescence et vieillissement cognitif, a été largement étudiée chez les rongeurs qui représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. Par conséquent, la souris a été choisie comme modèle principal dans ce projet car 1) il est en continuité avec les études publiées sur des modèles équivalents , et 2) il permet l'utilisation d'outils transgeniques pour valider les hypothèses mécanistiques que nous pourrons formuler. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage et jusqu'a l'âge de 20 mois environ pour les animaux expérimentaux puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact de l'isolement social à l'adolescence (de 3 à 5 semaines) sur la vulnérabilité / résilience à développer des troubles comportementaux au cours du vieillissement.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments sur la fonction cardiaque dans un modèle rongeur d’insuffisance cardiaque diastolique (EU 1/2) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
Rats : 1170
Rendus insuffisants cardiaques par un composé bloquant la dilatation des vaisseaux et un régime gras, 2 340 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements de sang, une imagerie cardiaque mensuelle sous anesthésie, des mesures de pression au brassard et une épreuve d'effort sur tapis roulant. À la fin, une chirurgie ouvre la cage thoracique pour mesurer la pression directement dans le cœur, ce qui entraîne la mise à mort. Le projet vise une preuve de concept à confirmer ensuite en clinique.
Objectifs
Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). L’insuffisance cardiaque est une maladie progressive qui se caractérise par une incapacité du cœur à assurer un débit de sang suffisant pour couvrir les besoins du corps en oxygène, d’abord en cas d’effort puis même au repos. Il existe 2 formes d’insuffisance cardiaque. La première due à un défaut de la contraction cardiaque, généralement consécutive à un infarctus. La seconde forme d’insuffisance cardiaque est due à un défaut de relaxation du muscle cardiaque et ses causes sont multiples : âge, hypertension, obésité, diabète… Malgré les nombreuses recherches et études cliniques menées ainsi que l’arsenal thérapeutique déployé et testé, aucune thérapie ne semble être efficace en termes d’allongement de la durée de vie pour cette forme d’insuffisance cardiaque. Afin de pouvoir tester de nouveaux composés médicaments, le développement et l’utilisation de modèles animaux aux plus proches des atteintes cardiovasculaires de l’insuffisance cardiaque est nécessaire. Le modèle rongeur mimant cette pathologie est obtenu en combinant une injection d'un composé qui bloque la production de monoxyde d’azote (une molécule essentielle pour la dilatation des vaisseaux sanguins), et un régime alimentaire riche en graisses. Cette combinaison entraîne une insuffisance cardiaque où le cœur a du mal à se remplir correctement entre deux battements en raison d’une rigidité accrue du muscle cardiaque. Ainsi, l’objectif du projet est d’utiliser ce modèle d’insuffisance cardiaque pour évaluer l’efficacité de nouveaux composés à visée thérapeutique sur la progression de l’insuffisance cardiaque et la fonction cardiaque.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur un modèle animal d’insuffisance cardiaque. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d’insuffisance cardiaque.
Procédures
Au sein du site 1 (EU1), plusieurs prélèvements de sang au cours du protocole sont réalisés sur animaux vigiles au niveau d'une veine de la mâchoire ou de la patte pour la souris ou d’une veine de la queue pour le rat ainsi qu’au niveau de la pointe de la queue après une légère incision (1min par prélèvement). Les animaux sont soumis mensuellement à une analyse d'imagerie cardiaque (30min par analyse) réalisée sous anesthésie générale. Une mise à jeun de 6 heures est appliquée pour explorer la glycémie à jeun. A la fin du protocole, les animaux sont à nouveaux anesthésiés et mis sous analgésie dans le but d'exposer le cœur par chirurgie et d'évaluer la pression sanguine directement dans le cœur (15min).Les animaux sont également soumis à des mesures de pression artérielle à l'aide d'un brassard gonflable sur 3 jours consécutifs, pendant environ 15 minutes, 6 fois maximum au cours du protocole. Le transfert des animaux de l’EU1 vers l’EU2 sera réalisé par transport routier (moins de 2h) . Au sein du site 2 (EU2), les animaux sont soumis à la continuité de leur régime riche en graisse associé ou non à la molécule médicamenteuse testée, puis sont soumis à une épreuve d'effort sur tapis roulant (durée : 15-30min selon la sévérité de la pathologie). L'épreuve d'effort sur tapis roulant peut s'avérer stressante, occasionner des douleurs musculaires transitoires et de la fatigue. Un des effets indésirables potentiels est lié à l'administration du candidat médicament (1min par acte).
Impact sur les animaux
Ce modèle de maladie du cœur chez les rongeurs est causé par deux choses : une substance empêchant le bon fonctionnement des vaisseaux sanguins et causant de l'hypertension, et un régime très gras, qui rend les animaux plus gros et perturbe leur métabolisme. À cause de cela, leur cœur fonctionne moins bien, ils sont plus fatigués et ont du mal à bouger. Ils mangent différemment et sont plus stressés. Pour vérifier leur état de santé, des prises de sang et des tests de glycémie sont faits, ce qui peut être stressant. Les échographies du cœur nécessitent une anesthésie gazeuse qui peut irriter leur respiration. L’épilation des animaux pour l'échographie peut entrainer une irritation cutanée. Les mesures de pression longitudinales nécessitent un placement en boîte de contention pendant environ 15 minutes, source de stress pour les animaux. Le transfert des animaux de l’EU1 vers l’EU2 sera réalisé par transport routier dans des cages de transport différentes des cages d’hébergement et dans des compartiments individuels, ce qui est source de stress pour les animaux. À la fin, une opération sous anesthésie permet de mesurer la pression du sang. Enfin, le médicament testé peut avoir des effets secondaires, surtout s’il s’agit d’une nouvelle substance encore peu connue. Le traitement par injection intra-péritonéale peut entrainer une inflammation de l'abdomen et le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car les mesures effectuées en fin de procédure sont des mesures terminales nécessitant l’ouverture de la cage thoracique pour les mesures de pression.
Remplacement
Ce projet vise à démontrer l’efficacité de nouveaux composés chez le rongeur. L’utilisation d’un modèle animal est essentielle pour étudier l’insuffisance cardiaque, car il prend en compte les comorbidités influençant la maladie et pouvant être ciblées par les traitements. Contrairement aux modèles cellulaires, il permet d’analyser les effets du composé dans un organisme entier et d’évaluer son action sur les organes de manière réaliste.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=15) est basé sur des données issues de la littérature (n=12), en tenant compte des critères d’inclusion stricts et d’une possible mortalité liée aux procédures. Les différences entre groupes sont analysées statistiquement. Les animaux sont randomisés après les pesées et mesures de glycémie à jeun. L’échocardiographie et les mesures de pressions non invasives à la queue permettent un suivi d'un même individu au cours du temps réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Des échantillons de plasma et/ou de tissus des animaux contrôles sont conservés pour d’autres recherches, limitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux pourrait être ajusté à la baisse.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux. Les cages des animaux sont transparentes et disposées les unes à côtés des autres afin que les animaux puissent se voir et se sentir. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole approprié est mis en place si besoin. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sur animaux calmés et endormis. Ce protocole entrainant une prise de poids, les animaux peuvent avoir des difficultés à atteindre les mangeoires et les biberons. Ainsi, l’hydratation et la bonne nutrition des animaux sont surveillées avec une prise en charge adaptée : tétines plus longues sur les biberons et nourriture au sol. Les animaux sous anesthésie lors de l’échographie sont placés sur un plateau chauffant et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Lors des sessions de mesures de pression artérielle à la queue, le plateau du dispositif et les boîtes de contention sont chauffés à 36°C avant d’y placer les animaux. Après chaque prélèvement, une injection de solution saline est réalisée (au moins 2 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volume sanguin. Les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques, calmants et de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses, volume). Les mesures de la pression sanguine réalisées en fin de protocole nécessitent une chirurgie et se font sous anesthésie et calmants. Lors du transport entre les 2 établissements utilisateurs les animaux sont placées dans des cages agréées contenant de la litière, des enrichissements et une source d'hydratation. Les véhicules utilisés sont tempérés, limitent les vibrations et les variations de température. La durée du transport est réduite au maximum. Avant les épreuves d'effort, les animaux sont habitués sur plusieurs jours au tapis de course et un expérimentateur est toujours présent au cours du test pour adapter immédiatement la séance en cas de signes de fatigue excessive.
Choix des espèces
Les rongeurs, souris et rats, classiquement utilisés en laboratoire, présentent des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et du fonctionnement vasculaire et cardiaque. La réponse corporelle dans les insuffisances cardiaques est comparable à celle des humains notamment en termes de remodelage cardiaque et de modification des pressions. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines permettant qu’ils soient matures sexuellement.
Identification et caractérisation de biomarqueurs en imagerie dans les modèles rongeurs de la maladie de Parkinson EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.
Objectifs
Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.
Impact sur les animaux
Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.
Choix des espèces
Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.