Recherche appliquée

Jusqu'à vingt-et-une injections, huit séances d'imagerie sous anesthésie et une greffe de cellules cancéreuses par animal: 860 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet teste une thérapie fondée sur l'ARN messager, censée introduire des mutations toxiques dans les cellules tumorales. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et un mal-être général. Les bénéfices annoncés, un traitement d'autres cancers à "mauvais pronostic", restent renvoyés au long terme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester des thérapies géniques innovantes (en utilisant la technologie de l’ARN messager, similaire à l’utilisée pour fabriquer les vaccins contre le covid) en introduisant des mutations toxiques spécifiquement dans des cellules tumorales injectées au préalable chez la souris. Ce projet nous apportera les preuves précliniques du potentiel de ce type de traitement comme thérapie innovante anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la capacité du nouveau traitement à induire la mort des cellules cancéreuses dans un modèle tumoral. Les résultats serviront également de base à l’exploration de l’efficacité de notre traitement innovant pour traiter d'autres cancers, en particulier des tumeurs solides à mauvais pronostic.

Procédures

- Souris injectées (21 fois au maximum / souris.) Durée de l’intervention : quelques secondes par souris. - Souris anesthésiées (10 fois maximum / souris). Durée de l’intervention : quelques minutes par souris. - Imagerie sur souris anesthésiées (8 fois maximum /souris). Durée de l’intervention : environ 10 minutes. - Souris qui subiront des prélèvements de sang (2 prélèvements au maximum). Durée de l’intervention : quelques secondes par souris.

Impact sur les animaux

Les tumeurs (issues des cellules cancéreuses injectées) peuvent induire une perte de poids et un mal être général. D’autres effets indésirables pourraient être attendus : - Les injections et prélèvement de sang causent un stress et douleur modéré de courte durée. - La contention nécessaire pour l’imagerie cause un stress et douleur légère de courte durée. Une anesthésie sous forme gazeuse sera réalisée avant la manipulation de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour les raisons suivantes : prélèvements des tissus d’intérêt à la fin de la procédure expérimentale ou point limite atteint avant.

Remplacement

L’efficacité des approches de thérapies innovantes antitumorales ne peut être évaluée que dans un modèle mimant la pathologie. Les expériences sur l’animal sont donc nécessaires et justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris est le minimum nécessaire pour obtenir des données reproductibles tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. En plus, les mesures nécessaires sont effectuées sur les mêmes animaux tout au long de l’expérimentation.

Raffinement

L’imagerie sera faite en même temps que les observations nécessaires au suivi des animaux. Des points limites strictes et spécifiques au projet sont mis en place.

Choix des espèces

Les souris ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour étudier le développement des leucémies humaines et servir de modèles pour l’évaluation de nouvelles thérapies. L'utilisation de la souris est parfaitement adaptée à la durée du projet, aux quantités de cellules leucémiques nécessaires pour la réalisation du projet, et pour modéliser l'administration de molécules thérapeutiques chez l'Homme. Nous allons utiliser des souris jeunes adultes au début des expérimentations (6-10 semaines de vie), choix le plus approprié par rapport au développement des leucémies aigues chez l’homme.

Soumises à des tests répétés sur rotarod, de force musculaire et à des mesures par électrodes implantées sous la peau, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris reproduisent la maladie de Charcot-Marie-Tooth et reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique sous anesthésie. Les tests, réalisés deux à trois fois selon les animaux, précèdent le prélèvement des organes après mise à mort. Le porteur espère un effet transposable à l'humain, un bénéfice qui reste conditionné aux résultats obtenus sur ce modèle.

Objectifs

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une neuropathie d'origine génétique qui se manifeste dès l'enfance ou à l'âge adulte par une faiblesse musculaire et une diminution de la sensibilité des pieds et des mains. Ces manifestations sont la conséquence d'une atteinte des nerfs périphériques des jambes et des bras. Elle est accompagnée d'une atrophie musculaire progressive. La CMT touche environ 1 personne sur 2 500 dans la population générale à la naissance. Le modèle murin étudié développe les mêmes symptômes que ceux décrits chez l’Homme : faiblesse musculaire, diminution de la sensibilité au niveau des pattes. Contrairement à l’homme ces souris ne présentent pas de scoliose. Ces manifestations sont la conséquence d’une atteinte des nerfs périphériques. Ces souris ont un développement et une durée de vie comparable à celles de souris génétiquement non modifiées Ce modèle murin permettra d’étudier les effets du traitement par transfert de gène sain. Dans un premier temps, nous évaluerons les effets de cette thérapie avec des tests comportementaux : force musculaire, position des pattes, sensibilité à un stimulus électrique (électromyographie). Dans un second temps, une analyse biomoléculaire et histologique sera réalisée afin de regarder les effets de ce traitement par transfert de gène au niveau cellulaire et tissulaire.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.

Procédures

Injection du vecteur) : Cette injection (1 seule par animal) se fera sous anesthésie en moins de 15 secondes. Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par jour par souris, 5 jours consécutifs. Une à deux fois selon le protocole. Tests comportementaux : Deux types de tests comportementaux seront réalisés afin d’évaluer la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le système périphérique pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour c’est-à-dire 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 1 fois par jour, 3 jours consécutifs Test 3 : test pour évaluer l’asymétrie motrice Durée : 15 secondes Répétition : 1 fois Ces trois tests seront réalisés MODIFICATION : 2 À 3 fois selon les animaux. Mesures électrophysiologiques : Ces tests se feront sur des animaux anesthésiés. Ces tests seront réalisés après les tests comportementaux, les animaux seront donc habitués à l’expérimentateur. La mesure de la vitesse de conduction nerveuse consiste à stimuler un nerfet à mesurer la vitesse de transmisssion du signal. . Parallèlement, la réponse d'un muscle distal sous influence du nerf stimulé est recueillie par d’autres électrodes. Durée : 15 minutes maximum. MODIFICATION 2 À 3 répétitions selon les animaux. Répétition : les mesures seront réalisées au total 2 À 3 FOIS selon le groupe.

Impact sur les animaux

- Une possible complication liée à l’injection - est un gonflement autour du site d’injection. - Les tests comportementaux sont réalisés sur les animaux vigiles et sont conçus pour entrainer un minimum de nuisances. Cela peut cependant entrainer un stress chez les animaux que nous maintiendrons le plus bas possible. . Les mesures électrophysiologiques nécessitent l’implantation de fines électrodes sous la peau. L’implantation de ces électrodes est comparable à la pénétration d’une aiguille fine dans la peau. Cela peut entraîner un picotement ou une légère piqûre. Les souris CMT ont un développement, une durée de vie, et une fertilité comparable à celles des animaux non génétiquement modifiées. Cette pathologie se caractérise par une crispation des orteils et une diminution de la vitesse de conduction nerveuse. La diminution de la vitesse de conduction nerveuse peut se traduire chez l’animal par une faiblesse musculaire, pouvant entrainer une diminution du poids.

Devenir

A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem et de réaliser des analyses tissulaires.. Le but est de regarder l’effet du vecteur thérapeutique sur les marqueurs de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Remplacement

Toutes les constructions génétiques utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité du vecteur pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées, afin d’obtenir des données statistiquement significatives permettant d’évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche nous a permis d’optimiser nos procédures et le nombre d’animaux afin d’obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. La constitution des groupes est également basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées, et un test statistique. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum.

Raffinement

L’injection du vecteur thérapeutique se fera sous anesthésie générale. Un analgesique sera appliqué au niveau de l’œil avant que l’animal ne soit placé dans la boîte à induction. Une fois l’animal endormi, l’injection est réalisée en moins de 15 secondes par un expérimentateur maitrisant cette technique. La souris injectée est ensuite placée dans une cage propre jusqu’à son réveil. Elle est ensuite immédiatement replacée dans sa cage d’origine. Une observation hebdomadaire des animaux, des pesées hebdomadaires seront réalisées. Un soutien nutritionnel sera apporté si besoin. Test comportementaux et tests d’électrophysiologie: Les tests seront précédés d’une phase d’habituation (handling) à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences. Puis auront les tests d’éléctrophysiologie. Cinq minutes avant l’anesthésie, la peau sera insensibilisée avec de la crème analgesique au niveau des sites de pose des électrodes afin d’éviter le picotement ou la légère piqûreCes tests seront réalisés après les tests comportementaux, les animaux seront donc habitués à l’expérimentateur. Pendant les mesures l’animal sera placé sur un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle. La souris est ensuite placée dans une boite chauffante jusqu’à son réveil. Elle est ensuite remise dans sa cage d’origine. Des points limites seront mis en place afin de s’assurer de réduire au maximum la douleur éventuelle : suivi respiratoire, arrêt des tentatives de mesures électrophysiologiques en cas de 2 échecs consécutifs lors des mesures. Des points limites ont été établis afin de réduire au maximum les nuisances chez les animaux. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’existence d’un modèle murin reprenant de nombreuses caractéristiques de la maladie humaine - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer chez un plus grand animal - la maitrise par notre équipe des tests comportementaux et électrophysiologiques chez la souris permettra une étude fine de ce modèle. L’injection du vecteur se fera à deux stades de vie différents : - à l’âge de 10 jours de vie dans le but de stopper ou ralentir l’apparition des signes cliniques - à l’âge de 3 mois , à un moment où les signes cliniques sont déjà présents. Le but est de ralentir l’évolution des signes cliniques ou les stopper.

4102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir une biopsie de la queue, douze semaines de régime gras, jusqu'à dix injections, des jeûnes de six à seize heures, des gavages et cinq à dix prélèvements de sang à la queue. L'obésité provoquée entraîne prise de poids et baisse d'activité, et le pancréas ainsi que d'autres organes sont prélevés après mise à mort. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules immunitaires du pancréas dans le diabète de type 2, une piste thérapeutique annoncée comme lointaine.

Objectifs

Le pancréas régule la glycémie grâce à des cellules spécialisées qui produisent de l’insuline. Il contient aussi des cellules immunitaires qui participeraient à cet équilibre, mais dont le rôle reste encore mal connu. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, en particulier dans le cas de consommation excessives de graisses, pouvant conduire au développement d’une obésité et d’un diabète.

Bénéfices attendus

Étudier la fonction des cellules immunitaires du pancréas est essentiel pour mieux comprendre comment le pancréas régule le sucre dans le sang et réagit aux déséquilibres métaboliques, comme ceux causés par une alimentation riche en graisses. Ces cellules immunitaires, longtemps considérées comme de simples défenseurs contre les infections, jouent en réalité un rôle plus complexe dans le soutien des cellules productrices d’insuline et dans le maintien de la santé métabolique. En comprenant les mécanismes par lesquels ces cellules influencent le fonctionnement du pancréas, ce projet pourrait révéler de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou traiter des maladies comme le diabète de type 2.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras et en cholestérol (WD - 12 semaines), 1 régime riche en graisse (HFD - 12 semaines), 1 à maximum 10 injections (20s), 1 à 2 jeun (6h ou 16h), 1 à 2 gavages (1min), 5 à 10 prélèvements de sang à la queue (3s).

Impact sur les animaux

Injections : douleur légère due à la piqure. Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Coupure du bout de la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée. -Gavage : contention soutenue et introduction de la sonde.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue de chaque procédure afin de permettre le prélèvement du pancréas ainsi que d’autres organes d’intérêt. Ces prélèvements sont indispensables à la réalisation d’analyses visant à comprendre les mécanismes étudiés dans ce projet, notamment pour identifier les voies de régulation du métabolisme dans différentes conditions expérimentales et caractériser et localiser les différentes populations cellulaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle des cellules immunitaires du pancréas en condition normale et de surcharge lipidique. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux, réduit à son minimum, a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles pour les étudier. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) et 22 semaines (adultes).

Pour tester des molécules dans trois modèles d'inflammation pulmonaire, dont l'asthme et la vascularite, 1460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La maladie est provoquée par des inhalations intranasales de molécules bactériennes sous anesthésie et des injections répétées dans l'abdomen, avec inconfort et désorientation au réveil. Tous les animaux sont tués en fin d'étude pour évaluer l'évolution de la maladie et l'effet des molécules. Les bénéfices annoncés, une nouvelle génération de traitements et une baisse des dépenses de santé, sont renvoyés au moyen et au long terme.

Objectifs

Les maladies pulmonaires liées au système immunitaire sont causées par divers mécanismes. Parmi elles, l’asthme allergique résulte d’une réaction excessive de l’immunité face à un allergène (comme les acariens, le pollen, etc.). L’asthme constitue un problème de santé publique majeur, car il touche un nombre croissant de personnes. L’un des éléments clés dans l’apparition de l’asthme est l’activation de cellules appelées lymphocytes B, qui produisent des molécules pathogènes. Ces dernières reconnaissent l’allergène et déclenchent une série de phénomènes responsables des symptômes de l’asthme. Par ailleurs, l’activation du système immunitaire dans les poumons peut parfois conduire à la formation de structures appelées structures lymphoïdes tertiaires. Ces regroupements de cellules immunitaires peuvent être bénéfiques, notamment lors d’infections pulmonaires ou de cancer du poumon, en renforçant les défenses locales. Cependant, lorsqu’elles sont mal régulées, elles peuvent provoquer des lésions et aggraver certaines maladies. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment elles se forment et comment les contrôler selon les besoins. Un sous-type particulier de lymphocytes B, appelés lymphocytes B régulateurs, joue un rôle important dans ces deux phénomènes. Ils peuvent atténuer les symptômes de l’asthme et limiter la formation des structures tertiaires, empêchant ainsi les dommages aux tissus pulmonaires. Ce projet a donc pour objectif de tester des molécules capables d’induire l’activation des lymphocytes B régulateurs, à la fois dans un modèle d’asthme allergique et dans un modèle de formation de structures lymphoïdes tertiaires dans les poumons. Enfin, le projet s’intéresse à une autre maladie grave : la vascularite, une maladie auto-immune sévère qui peut toucher les petits vaisseaux sanguins, notamment au niveau des poumons et des reins. Le traitement repose actuellement sur des médicaments immunosuppresseurs, qui doivent être administrés rapidement pour limiter les dommages. Cependant, ces traitements présentent de nombreux effets secondaires, et leur efficacité dépend de la rapidité du diagnostic. L’objectif est donc de développer de nouvelles approches thérapeutiques, à la fois plus ciblées, mieux tolérées, et utilisables plus précocement dans le cours de la maladie. Ce projet vise ainsi à enrichir les options de traitement disponibles pour les patients.

Bénéfices attendus

L’asthme allergique touche de plus en plus de personnes, et les traitements disponibles aujourd’hui ne sont souvent que partiellement efficaces. Avec ce projet, à moyen terme, nous espérons développer de nouvelles approches thérapeutiques capables de rétablir une tolérance du système immunitaire face aux allergènes, afin de mieux contrôler la maladie. À long terme, nous espérons ouvrir la voie à une nouvelle ère thérapeutique fondée sur l’induction de la tolérance immunitaire, plutôt que sur la suppression de l’immunité. Un autre objectif de nos recherches, à moyen terme, est de mieux comprendre la formation de certaines structures immunitaires au niveau des poumons. Ces structures peuvent être utiles ou nuisibles selon les contextes. Une fois ces mécanismes élucidés, à long terme, les bénéfices attendus seraient un meilleur contrôle du système immunitaire, notamment dans des cas tels que le cancer du poumon ou les infections pulmonaires chroniques. Enfin, notre étude s’intéresse également à une maladie auto-immune grave : la vascularite, qui peut affecter les poumons ou les reins. Cette maladie est difficile à traiter et peut entraîner des complications sévères. Notre objectif est de mieux comprendre ses mécanismes, afin de développer des traitements plus spécifiques, plus ciblés, et mieux tolérés, dans le but de soigner plus efficacement les patients et d’améliorer leurs chances de guérison. À moyen terme, cela permettra une meilleure prise en charge des patients. À long terme, cela pourrait réduire drastiquement les dépenses de santé, car les traitements actuellement disponibles ont un coût sociétal important.

Procédures

Les souris seront prélevées pour des analyses sanguines une fois au début de la procédure et une fois à la fin. Afin de minimiser le stress lié à ces prélèvements, les souris seront sous anesthésie générale pendant le prélèvement, qui dure moins de 2 minutes. Selon les mêmes modalités, certaines souris recevront des traitements par voie intraveineuse tous les deux jours (entre 3 et 4 injections). Ce geste dure également moins de 2 minutes. L’induction des pathologies pulmonaires se fera par inhalations intranasales (entre 1 et 8 selon les modèles) de molécules issues de bactéries, effectuées sous anesthésie générale et durant moins de 2 minutes. Ces inhalations pourront, dans certains cas, être associées à une injection intrapéritonéale réalisée sur souris vigile pour induire la pathologie. Ce geste dure également moins de 2 minutes. Certaines souris seront traitées par injection intrapéritonéale sur souris vigile (entre 4 et 8 injections).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, certaines procédures pourraient entraîner des changements de comportement chez les souris, en lien avec la modulation de leur fonction pulmonaire. Des injections répétées dans la cavité abdominale pourront occasionner un inconfort momentané. Par ailleurs, des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur. Après leur réveil, les souris pourraient être temporairement désorientées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon des régles stricte à la fin de l'étude afin d'évaluer l'évolution de la maladie et d'analyser l'impact des molécules testées sur cette dernière.

Remplacement

Les études réalisées dans des systèmes simplifiés ont démontré l’efficacité de ces molécules. Cependant,ces systèmes ne parviennent pas à reproduire la complexité des interactions cellulaires dans un organisme entier et ne permettent pas d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nos molécules dans un contexte aussi complexe que l’asthme allergique, la formation de structures lymphoïdes tertiaires dans un organe, ou la vascularite.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé en fonction du nombre minimum requis pour atteindre une puissance statistique suffisante. Ce calcul prend en compte l’hétérogénéité intrinsèque des modèles de maladies induites. Pour éviter tout biais lié aux cages, les animaux seront aléatoirement répartis entre les différentes cages. De plus, des études préliminaires seront menées sur les souris génétiquement modifiées afin d’évaluer le développement normal de la maladie. En cas de résultats non concluants, cela permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Chaque animal bénéficiera d'une période d'acclimatation d'une semaine après sa réception. Chaque cage sera équipée d'enrichissements, tels que des igloos en plastique, pour permettre aux souris de se cacher et d'améliorer leur bien-être. Par ailleurs, le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par le personnel de l'animalerie à l'aide d'une grille de score spécifique. Cette grille permet d'évaluer le bien-être animale et, si un seuil critique est atteint, des soins particuliers seront fournis aux animaux. Si les niveaux de souffrance dépassent un seuil prédéfini, les animaux seront euthanasiés conformément à cette grille.

Choix des espèces

Les modèles disponibles d’inflammation pulmonaire sont, le rat et la souris. Les modèles murins ont été privilégiés, car notre équipe ainsi que le personnel de l’animalerie possèdent une meilleure expertise dans ces modèles. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines.

8500 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, soit environ 146 composés testés chaque année. Chaque animal peut recevoir une injection du virus de l'hépatite B, des administrations quotidiennes de composés pendant 28 jours par voies orale, veineuse ou rétro-orbitale, et des prélèvements sanguins répétés jusqu'à une ponction terminale du cœur. L'injection hydrodynamique peut provoquer une distension abdominale et une baisse de mobilité, et le porteur reconnaît que des effets imprévisibles peuvent survenir à ce stade précoce. Une partie des souris sont "humanisées" par greffe pour reproduire le cycle du virus, et toutes sont tuées, leur état infecté interdisant toute réutilisation.

Objectifs

Malgré l’existence d’un vaccin pour lutter contre le virus de l’hépatite B (Hepatitis B virus ; HBV), cette infection virale reste un problème majeur de santé publique mondial. Il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant l’élimination complète du virus. Ce projet, vise à évaluer l’activité de composés sur la prévention et l’élimination du HBV, en ciblant le virus à différents stades de son cycle, que ce soit dans ses phases de réplication active, d’infection chronique ou sous sa forme de cccDNA nucléaire pouvant persister chez les patients. Nous pourrons également étudier l’immunité de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale et potentiellement chercher si ces composés ont la capacité de la moduler et ainsi d’accélérer l’élimination complète du virus (disparition des HBsAg et du cccDNA).

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet vise à tester de futurs traitements contre l’hépatite B afin de vérifier leur efficacité. Pour cela, nous utiliseront différents modèles de souris spécialement conçus pour reproduire l’infection humaine par le virus : certains modèles permettent d’étudier comment le virus se réplique, d’autres comment il interagit avec le système immunitaire, et d’autres encore comment les cellules infectées du foie réagissent aux traitements. Ces modèles permettent de tester plusieurs types de candidats médicamenteux comme des anticorps, protéines, petites molécules, vaccins ou encore siRNA. Ils aident aussi à déterminer les meilleurs moments pour traiter, et à repérer les éventuels effets toxiques. Les souris « humanisées » sont particulièrement utiles car elles imitent très fidèlement le cycle du virus chez l’humain. A long terme, ce travail permettra d’accélérer l’arrivée de nouveaux traitements contre l’hépatite B. Les données obtenues aideront à comprendre comment le virus et le système immunitaire interagissent et comment éliminer plus efficacement l’infection. L’objectif est de développer des thérapies plus ciblées, notamment en visant différentes protéines virales, capables de réduire la persistance du virus dans l’organisme et de limiter les complications graves liées à l’hépatite B, au bénéfice de la santé publique. Le projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité d'environ 146 composés par an en 24 études maximum.

Procédures

Selon les procédures appliquées : - Infection par l’hépatite B des souris: Injection rétro-orbitale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Administration intraveineuse à haut débit (Injection hydrodynamique par la veine caudale) : vigile, 1 fois par animal, 1 minute OU Injection sous cutanée de cellules : sous anesthésie générale, 1 fois par animal, 1 minute - Administration de composés thérapeutiques sur une durée max de 28 jours. Par voie orale, vigile, 1 à 4 fois par jour par animal, durée 1 minute Ou Par voie sous-cutanée : vigile, 2 fois par jour maximum, durée 1 minute ou par voie intramusculaire : sous anesthésie, 1 fois par jour maximum, durée 1 minute ou par voie intrapéritonéale : vigile,1 fois par jour maximum, durée 1minute ou par voie intraveineuse : sous anesthésie, 1 fois par jour par voie caudale ou par voie rétro-orbitale, avec une alternance de l’œil droit et gauche avec un minimum de 48h entre 2 injections au même œil et un maximum de 4 injections seulement sur toute la durée de l’étude, durée 3 minute - Suivi clinique et pondéral : pesée et bilan clinique 1 fois par semaine minimum par animal sur la durée de l’étude, vigile, 2 minutes - Prélèvements sanguin : Par la veine submandibulaire : vigile, 1 fois tous les 15 jours, pour une durée maximale de 8 semaines, durée 2 minutes. Par micro-sampling à la queue : vigile, exclusivement au cours des semaines sans prélèvement submandibulaire, 1 fois par semaine, durée 2minutes. Dans le cadre spécifique des études de pharmacocinétique (PK) : par micro-sampling répétés à la queue, sans aucun prélèvement submandibulaire, 7 prélèvements sur 24h, vigile, durée 2minutes. Par prélèvement terminal, sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, 1 fois en fin de procédure, pour une durée estimée à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des souris seront utilisées pour étudier l’infection par l’hépatite B et tester de futurs traitements antiviraux. Les interventions prévues peuvent entraîner des gênes légères à modérées, selon la technique employée. Lors de l’injection du virus (AAV/HBV), les souris peuvent ressentir un stress momentané lié à la manipulation, ainsi qu’une légère douleur ou une petite inflammation au point d’injection, qui disparaît généralement rapidement. Les injections hydrodynamiques peuvent provoquer une gêne plus marquée juste après la procédure, comme une sensation de ventre distendu et une baisse temporaire de la mobilité, mais ces effets s’estompent en quelques heures. Dans les modèles transgéniques, humanisés ou ceux impliquant l’implantation de cellules, les interventions consistent surtout en des injections ou des prélèvements sanguins, ce qui peut entraîner un stress bref ou une réaction légère au point d’injection. Aucun effet grave n’est attendu avec les candidats médicaments testés, mais comme il s’agit d’étapes précoces de recherche, certains effets imprévisibles peuvent parfois survenir, tels qu’une perte de poids, des variations de température ou un comportement inhabituel. Pour préserver le bien-être des animaux, une surveillance quotidienne sera assurée afin de repérer tout signe de douleur, de stress ou d’inactivité anormale. Leur poids sera contrôlé au moins une fois par semaine et plus fréquemment si nécessaire. En cas de problème, des mesures adaptées seront mises en place avec l’aide d’un vétérinaire pour réduire au maximum l’inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’étude, car les procédures expérimentales nécessitent le prélèvement d’organes et d’échantillons biologiques incompatibles avec le maintien en vie des animaux. De plus, l’état physiologique des animaux (infectés par HBV) ne permet pas leur réutilisation.

Remplacement

Avant d’avoir recours aux animaux, toutes les solutions permettant de les remplacer seront examinées. Des tests in vitro permettront d’évaluer d’abord si les traitements envisagés sont efficaces contre le virus, ce qui évitera d’utiliser des animaux pour des molécules qui ne fonctionneraient pas. Lorsque des tests sur animaux sont indispensables, des modèles de souris spécialement développés pour reproduire l’infection par l’hépatite B seront utilisés, car ils offrent des résultats plus fiables tout en limitant le recours à d’autres espèces. L’ensemble de ces démarches assure que les animaux ne sont utilisés que lorsque cela est réellement nécessaire pour faire avancer la recherche..

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum grâce à plusieurs actions. Les quatre méthodes de recherche prévues sont complémentaires : elles permettront de choisir, pour chaque question scientifique, le modèle le plus adapté, évitant ainsi de répéter inutilement les expériences. Chaque souris servira également à recueillir plusieurs types d’informations (comme le suivi du virus, la mesure de différents marqueurs dans le sang ou les tissus, ou encore l’analyse de la réponse immunitaire), ce qui permet d’obtenir un maximum de données sans augmenter le nombre d’animaux. De plus, les traitements potentiels seront d’abord testés in vitro, sans animaux, afin de ne retenir que les candidats les plus prometteurs. Le nombre final d’animaux sera déterminé à partir de calculs statistiques rigoureux pour s’assurer que les groupes ne sont ni trop grands ni trop petits. Sur l’ensemble des cinq années du projet, au maximum 8500 souris seront utilisées pour toutes les études prévues. Ce total se répartit de la façon suivante : environ 3 200 souris pour les modèles AAV/HBV, 2 000 pour la technique dite d’hydrodynamie, 2 400 pour les modèles utilisant des cellules tumorales exprimant le virus ou des particules virales, et environ 900 pour les souris humanisées. Chaque procédure correspond à un certain nombre d’études par an et à une taille d’échantillon adaptée à chaque méthode scientifique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long du projet. Les expériences seront conçues pour être les moins douloureuses et les moins stressantes possible, et les animaux ne seront manipulés que lorsque cela est réellement nécessaire. Chaque fois que c’est possible, les interventions seront réalisées sous anesthésie afin de réduire l’inconfort. Un suivi attentif et régulier permettra de repérer rapidement tout signe de douleur ou de détresse, grâce à une grille d’observation adaptée, et des mesures appropriées seront prises en concertation avec le vétérinaire. Les interventions seront organisées pour limiter leur durée et éviter la répétition de procédures invasives. Les prélèvements seront effectués avec des méthodes qui réduisent au maximum la souffrance, et, lorsque c’est possible, avec des techniques non létales permettant d’utiliser le même animal pour plusieurs mesures sans augmenter son stress. Enfin, toutes les personnes impliquées dans les expérimentations seront formées et qualifiées, garantissant des pratiques soigneuses et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les tests réalisés uniquement en laboratoire (in vitro) ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’une infection réelle. Pour étudier le virus de l’hépatite B et développer des traitements capables de l’éliminer complètement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche : elle dispose de nombreux modèles bien établis qui reproduisent les différentes étapes de l’infection et permettent d’évaluer à la fois l’action du traitement sur le virus et la réponse du système immunitaire. Sur le plan pratique et éthique, la souris est un petit animal facile à héberger et à suivre, ce qui réduit le stress et les souffrances. Son utilisation respecte les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) : elle évite de recourir à des espèces plus sensibles, limite le nombre d’animaux nécessaires et permet d’adapter les protocoles pour améliorer leur bien-être. Enfin, la souris est déjà largement utilisée dans la recherche sur l’hépatite B, ce qui garantit des résultats fiables et comparables pour la suite du développement des traitements. Les souris sont âgées de 5-7 semaines à la livraison avec un poids autour de 20 grammes afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Les souris humanisées auront quant à elles 6-7 mois à réception pour permettre une bonne humanisation de leur foie (et de leur système immunitaire le cas échéant). Il s’agit donc de rongeurs matures et adultes.

Deux à trois heures d'opération sous anesthésie pour poser un greffon d'œsophage et une prothèse interne: 12 mini-cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Quatre d'entre eux portent en plus une sonde nasogastrique pendant quatre semaines, et une endoscopie sous anesthésie retire la prothèse à deux mois. Les animaux sont suivis quatre à six mois puis tués pour analyser au microscope la zone de greffe. Le projet vise à préparer une future greffe d'œsophage chez l'enfant, un bénéfice que le porteur formule au conditionnel et subordonne à la confirmation de la faisabilité.

Objectifs

Certaines maladies sont à l’origine de la perte de certaines parties de l’œsophage chez l’enfant, ou le rendent inutilisable. Les opérations chirurgicales actuelles pour les traiter (par exemple remplacer l’œsophage par un morceau d’estomac ou de côlon) sont lourdes et peuvent entraîner des complications et des réinterventions. Nous testons une autre voie : un greffon d’œsophage préparé en laboratoire à partir d’un tissu d’adulte dont on a retiré toutes les cellules. Il ne reste que la charpente du tissu, comme une coquille vide que le corps accepte mieux et qui peut se recoloniser par des cellules ensuite. Ce greffon est remodelé pour avoir un diamètre adapté à l’enfant. Avant d’aider des enfants, nous devons vérifier la faisabilité et la sécurité dans un organisme vivant. Les mini-porcs sont choisis car leur taille, leur croissance et la chirurgie utilisée se rapprochent de celles d’un enfant. Les tests sur maquette ou au laboratoire ne permettent pas de reproduire la déglutition, la cicatrisation, l’immunité et la croissance. Les connaissances acquises (décellularisation, remodelage, soins après l’opération) pourront aussi bénéficier à d’autres greffes pédiatriques et renforcer le potentiel de l’ingénierie tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet peut apporter des bénéfices à plusieurs niveaux, à court et à long terme, s’il confirme que la méthode est sûre et réalisable. Pour la recherche médicale. Les résultats enrichiront les données de base (sécurité, faisabilité, tolérance) nécessaires pour préparer un essai chez l’enfant. Les échantillons et observations aideront à comprendre comment le greffon se répare dans le temps. Pour les enfants concernés. Offrir, à terme, une autre option que les opérations actuelles quand l’œsophage manque ou ne fonctionne pas. Le greffon est pensé pour grandir avec l’enfant. On espère moins de complications, moins de réinterventions et une alimentation plus simple après la guérison. Pour la sécurité des soins. Améliorer la technique chirurgicale, définir un suivi après l’opération simple et clair : ce qu’il faut observer au quotidien, quels signes d’alerte surveiller, quand revoir l’animal et quelles actions entreprendre. L’objectif est de repérer plus tôt tout problème, de mieux le traiter et ainsi de réduire les complications et les réinterventions. Pour les familles. Si la méthode fonctionne, elle pourrait conduire à moins d’allers-retours à l’hôpital et à moins d’actes lourds, donc à un stress moindre pour l’enfant et ses proches. Cela peut harmoniser les pratiques entre hôpitaux et améliorer la prise en charge.

Procédures

Chaque animal aura une seule opération, réalisée alors qu’il est endormi complètement (anesthésie générale), pour mettre en place un morceau d’œsophage préparé et un petit tube souple (prothèse) à l’intérieur. Elle sert de tuteur. Elle maintient le passage ouvert, protège les coutures et stabilise le greffon pendant qu’il se fixe et cicatrise. Elle aide à éviter les rétrécissements et à ce que les parois ne se collent pas. Durée : 120 à 180 minutes. [MODIF] À 2 mois, un examen par caméra souple (endoscopie), aussi sous anesthésie générale, servira à retirer le tube (endoprothèse). Durée : ~20 minutes. Si un problème apparaît, un deuxième examen pourra être fait. Durée : ~30 minutes. [AJOUT] Pour 4 animaux, une sonde d’alimentation nasogastrique sera mise en place au moment de la chirurgie et utilisée pendant 4 semaines pour une alimentation liquide, avec contrôles quotidiens. Des pesées rapides seront réalisées (environ 1 à 3 minutes). En dehors de ces actes, aucune autre manipulation ne sera faite sur un animal éveillé. Des médicaments contre la douleur et une surveillance vétérinaire sont prévus.

Impact sur les animaux

Après l’opération, les animaux peuvent avoir mal pendant 1 à 2 jours, être somnolents, parfois un peu refroidis, et stressés. Ils peuvent ressentir une gêne pour avaler et bouger un peu moins au début. Les examens par caméra (endoscopies) peuvent provoquer une petite irritation locale. Le principal risque est que le tube intérieur (endoprothèse) se bouche ou se déplace.. [AJOUT] Pour 4 animaux portant une sonde nasogastrique, une irritation locale ou un arrachement sont possibles.

Devenir

Tous les porcs inclus dans ce projet seront mis à mort en fin de suivi afin de procéder aux analyses histologiques détaillées de la zone de greffe, étape indispensable pour évaluer la réparation tissulaire et le fonctionnement du greffon. [MODIF] Le suivi est programmé à 6 mois pour la cohorte principale (8 animaux) et à 4 mois pour le lot qui portera la sonde nasogastrique (4 animaux).

Remplacement

Nous avons d’abord cherché des solutions sans animaux (tests en laboratoire, modèles informatiques, mannequins, pièces d’organe artificielles). Ces méthodes aident, mais elles ne reproduisent pas ce qui se passe dans un corps d’enfant vivant : la circulation du sang, la déglutition répétée, la cicatrisation, les défenses immunitaires et la croissance. Pour savoir si le greffon d’œsophage est bien toléré, s’il tient en place, s’il reste ouvert pour laisser passer les liquides et s’il permet une alimentation normale, il faut l’observer dans un organisme vivant. Le mini-porc a été choisi car sa taille et son fonctionnement digestif se rapprochent de ceux d’un enfant ; il permet d’utiliser les mêmes gestes chirurgicaux et outils que chez l’humain. Il n’existe donc pas d’alternative non animale permettant d’évaluer complètement cette technique avant d’envisager une étude chez l’enfant. Si, au cours du projet, une méthode sans animal devenait disponible et suffisante pour répondre aux mêmes questions, elle remplacerait l’essai chez l’animal.

Réduction

Le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en assurant des résultats fiables. Des tests préalables en laboratoire ont permis de préparer les greffons et d’anticiper les difficultés mécaniques liés aux sutures. Cela permet d’éviter des essais inutiles chez l’animal. Le nombre d’animaux nécessaires a été défini avec soin, en s’appuyant sur les résultats d’études animales précédentes. Chaque animal suivra un protocole précis permettant d’obtenir un maximum d’informations. Ce projet utilise ainsi le nombre minimal d’animaux possible, dans le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Raffinement

Toutes les étapes du projet seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur pendant les interventions. Des traitements contre la douleur seront systématiquement administrés après l’opération et adaptés à l’état de chaque animal. Les animaux seront suivis chaque jour, avec une attention particulière portée à leur comportement, leur alimentation et leur respiration. Un environnement confortable et enrichi sera mis en place pour réduire leur stress. Des points limites clairs ont été définis et seront appliqués. Les animaux seront hébergés dans un cadre favorisant leur bien-être. Ces mesures visent à garantir une prise en charge respectueuse, limitant au maximum la souffrance animale.

Choix des espèces

Le porc a été choisi pour sa ressemblance anatomique avec l’humain, notamment au niveau de l’œsophage. Contrairement aux petits animaux, il permet de réaliser les gestes similaires à ceux effectués chez l’homme. Le minipig Yucatan a été retenu pour sa taille, sa croissance lente et sa bonne tolérance aux manipulations, ce qui permet un suivi prolongé. Il sera utilisé à un âge jeune correspondant au stade de développement d’un nourrisson. Ce choix permet d’évaluer une technique qui pourrait, à terme, éviter des opérations lourdes chez les enfants, en proposant une réparation de l’œsophage sans utiliser d’organes sains.