Recherche appliquée
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Développement d’un dispositif de préservation prolongée du cœur pour la transplantation
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumis à un prélèvement du cœur sous anesthésie ou à une transplantation cardiaque, 102 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sans réveil et sont tués à l'issue. Avant l'explantation, 1 500 mL de sang sont recueillis sur l'animal par exsanguination pour perfuser le cœur isolé. Le projet teste une machine censée conserver un greffon jusqu'à douze heures au lieu de quatre. Tous sont déclarés morts en cours d'expérience, le cœur ou les tissus étant prélevés pour analyse.
Objectifs
La transplantation cardiaque, traitement de référence de l'insuffisance cardiaque avancée, est limitée par le manque de donneurs. En France, environ 1 000 patients attendent une greffe cardiaque, pour seulement 400 transplantations réalisées par an, entraînant le décès de 11 % des patients en liste d'attente. Plusieurs facteurs expliquent cette pénurie : refus familiaux ou contre-indications médicales au prélèvement, contraintes géographiques liées à la durée de conservation actuelle limitée à 4 heures, et proportion croissante de donneurs « marginaux » (âge >65 ans, facteurs de risque cardiovasculaires, arrêt cardiaque récent) dont les greffons sont plus fragiles. Le projet vise à développer une machine transportable capable de perfuser et d'oxygéner le cœur en continu hors du corps, prolongeant la conservation jusqu'à 12 heures. Cela permettrait d'élargir le rayon de prélèvement géographique, d'améliorer la qualité des greffons et de faciliter l'organisation des transplantations. Un liquide de perfusion spécifique, développé par un laboratoire partenaire, sera utilisé pour optimiser la protection du cœur. Les trois objectifs sont : 1) déterminer la température optimale de conservation de cœurs standards (donneur en mort encéphalique) ; 2) déterminer la température optimale pour les cœurs de donneurs marginaux ; 3) évaluer l'efficacité du dispositif dans un modèle de transplantation cardiaque chez le porc. Ces travaux pourraient augmenter le nombre de cœurs transplantables et améliorer la survie des patients en attente de greffe.
Bénéfices attendus
Le système proposé représente une avancée majeure pour la transplantation cardiaque en permettant une préservation des greffons jusqu'à 12 heures, contre 4 heures actuellement. Cette innovation offrira une meilleure protection de l'organe, réduisant ainsi les défaillances précoces post-transplantation. Face à la pénurie d'organes, les équipes de transplantation sont contraintes de prélever fréquemment des donneurs à critères élargis : personnes de plus de 55 ans, présentant des facteurs de risque cardiovasculaire ou ayant subi un arrêt cardiaque prolongé. Cette catégorie inclut également les donneurs Maastricht 3, prélevés après arrêt circulatoire contrôlé, une source en forte expansion. Ces greffons marginaux présentent cependant un risque élevé de défaillance primaire et d'échec de transplantation. Le système proposé permettra d'augmenter le nombre d'organes utilisables en optimisant la préservation et l'évaluation de ces cœurs marginaux avant transplantation. Au-delà des aspects médicaux, le système présente des bénéfices écologiques et sociétaux considérables. Actuellement, la contrainte des 4 heures oblige les équipes médicales à voyager en avion pour les prélèvements, générant une empreinte carbone importante. L'allongement de la durée de préservation jusqu'à 12 heures permettra d'utiliser les transports routiers ou ferroviaires, réduisant ainsi l'impact environnemental. Cette extension temporelle transformera également l'organisation des transplantations. Aujourd'hui, la limite de 4 heures impose de réaliser les interventions en urgence, le plus souvent en pleine nuit, conditions de travail non optimales pour garantir les meilleurs résultats. Avec ce système, il sera possible de différer les transplantations aux heures ouvrables, améliorant ainsi les conditions d'intervention et potentiellement les résultats cliniques. L'avantage logistique est également notable : actuellement, des transplantations sont parfois refusées car une urgence chirurgicale occupe déjà le bloc opératoire. Le système permettra de préserver le greffon jusqu'à la disponibilité du bloc opératoire, éliminant cette contrainte ce qui en fait un atout considérable pour l'organisation des soins. Le système contribuera ainsi à mieux gérer les ressources hospitalières tout en offrant davantage d'opportunités de transplantation aux patients en attente.
Procédures
Au maximum 79 animaux seront soumis à un prélèvement cardiaque sous anesthésie générale. La durée moyenne de la procédure chirurgicale de prélèvement cardiaque est de 2 heures. Au maximum 23 transplantations cardiaques seront réalisées ; la durée moyenne de la procédure chirurgicale de transplantation cardiaque est de 3 heures (30 minutes pour l'ouverture de la cage thoracique et l'instauration de la circulation externe nécessaire le temps de la transplantation ; 60 minutes pour la réalisation des anastomoses vasculaires entre le greffon cardiaque et le receveur ; 90 minutes pour l'assistance circulatoire et l'évaluation de la fonction cardiaque). La totalité des animaux transplantés seront maintenus en vie 90 minutes après la réalisation de la transplantation afin d'évaluer la fonction cardiaque.
Impact sur les animaux
Le stress pré-opératoire lié à la manipulation, au transport et au changement d’environnement constitue une nuisance attendue. Afin de le limiter, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine avant leur inclusion dans le protocole expérimental. S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances supplémentaire ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront tous déclarés morts en cours d’expérimentation en raison de l’explantation du cœur pour la procédure ou l’analyse histopathologique et moléculaire des tissus myocardiques après la transplantation indispensable à la compréhension des résultats.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif au modèle animal pour étudier l’efficacité d’un dispositif de préservation d’organe pour la transplantation. En effet, la perfusion d’organe ex situ repose sur l’utilisation d’un organe et non d’un tissu ou d’une culture cellulaire (pas d’alternative in silico ou in vitro). Il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un cœur prélevé sur un système vivant. Par ailleurs seul un modèle sur le gros animal permet une instrumentation pour placer le cœur sur un module de perfusion d’organe isolé tel qu’utilisé en pratique clinique. Enfin ce modèle permet d’extrapoler facilement les résultats à l’homme, dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan anatomique, physiologique et métabolique. Des travaux préliminaires à ce projet portant sur la composition du liquide de préservation ainsi que sur la température de préservation ont d’abord été développés sur des cultures cellulaires de cardiomyocytes et sur des modèles rongeurs.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude le nombre d’animaux par groupe à été calculé de manière à pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Dans le groupe avec transplantation, il faudra un animal donneur d’organe et un animal qui recevra la transplantation. En effet notre objectif étant de préserver le cœur pendant 12 heures en perfusion ex situ une fois explanté, il sera impossible de maintenir l’animal donneur en vie pendant cette période ce qui exclut la possibilité de réaliser une autotransplantation, ce qui exposerait à un haut risque de complication technique et donc à un risque d’échec et de sortie prématurée du protocole.
Raffinement
Le stress pré-opératoire lié à la manipulation, au transport et au changement d’environnement constitue une nuisance attendue. Afin de le limiter, les animaux bénéficieront des mesures suivantes: Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). Lors des procédures expérimentales, les ponctions vasculaires percutanées pour la mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue sont réalisées sous contrôle echographique : moins de souffrance, moins de saignement et risque infectieux réduit.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. Il présente une physiologie circulatoire (Fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg) et une anatomie cardiovasculaire proches de celles de l’homme. La modélisation chirurgicale est facilitée par l’usage du gros animal, notamment pour les canulations artérielle et veineuse nécessaires pour sa perfusion isolée. Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum d’échecs techniques. Enfin notre protocole prévoit des prélèvements sanguins et des biopsies myocardiques répétées sur le cœur perfusé ex situ avec respectivement un volume (10 mL) et un poids (20 mg) de prélèvement minimum afin de pouvoir réaliser les analyses plasmatiques et tissulaires respectivement. Là encore, l’expérimentation sur le porc est adaptée pour ces prélèvements répétés, contrairement à un modèle rongeur qui permettrait un recueil plasmatique et tissulaire de plus faible quantité. Les animaux utilisés dans le protocole expérimental sont des porcs de 55 à 65 kg. A ce stade de développement les porcs ont un système circulatoire très proche de l’homme et leur gabarit permet une modélisation chirurgicale optimale, notamment pour la canulation de l’aorte et de l’artère pulmonaire pour l’instrumentation du cœur isolé sur le module de perfusion ex situ . Par ailleurs, le volume sanguin nécessaire à la perfusion cardiaque ex situ normothermique sera recueilli sur l’animal, juste avant l’explantation du cœur et la mise à mort de l’animal. Ce volume sanguin doit être de 1500 mL, ce qui justifie d’inclure des animaux ayant une masse sanguine d’au moins 2,5 à 3 litres, soit un poids supérieur à 50 kg afin de ne pas avoir de difficultés pour recueillir 1500 mL au moment de l’exsanguination.
Évaluation d’une approche thérapeutique innovante pour prévenir la perte de masse musculaire associée à un traitement anti-obésité chez la souris obèse.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
Pour tester un traitement censé préserver les muscles pendant un amaigrissement médicamenteux, 82 souris rendues obèses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une quarantaine d'administrations, des courses forcées sur tapis roulant, des tests de force et des prélèvements sanguins, dont deux mesures de force musculaire sous anesthésie avec réveil. Les muscles sont prélevés après la mise à mort. Les bénéfices annoncés, des traitements "plus sûrs et mieux tolérés" pour les patients, restent au conditionnel alors que l'amaigrissement forcé et les tests sont, eux, immédiats.
Objectifs
L’obésité constitue un problème majeur de santé publique, avec une augmentation importante de sa prévalence au niveau mondial depuis plusieurs décennies. Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus d’un milliard de personnes étaient concernées en 2022. Malgré l’existence de traitements récemment autorisés, tels que la sémaglutide, certaines limitations ont été rapportées, notamment une perte concomitante de masse musculaire, susceptible d’aggraver la faiblesse musculaire chez les sujets obèses. Cette étude a pour objectif d’évaluer, chez la souris, l’efficacité d’un traitement expérimental destiné à protéger les muscles lors d’une perte de poids induite par un médicament. En situation d’obésité, la perte de poids peut s’accompagner d’une diminution de la masse musculaire et de ses capacités fonctionnelles, ce qui peut avoir des conséquences négatives sur la santé. Le projet vise à déterminer si ce traitement permet de préserver la masse et la fonction musculaires tout en conservant les effets bénéfiques de la perte de masse grasse. Cette étude contribuera également à une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la fragilisation des muscles lors d’une perte de poids, dans le but de développer à terme des stratégies thérapeutiques plus sûres et plus efficaces.
Bénéfices attendus
L’obésité représente un problème majeur de santé publique, souvent associé à des complications graves. Certaines stratégies de perte de poids peuvent entraîner une diminution de la masse et de la force musculaires, ce qui peut fragiliser les patients et limiter les bénéfices du traitement. Ce projet vise à identifier une approche thérapeutique permettant de préserver ou de restaurer les muscles tout en maintenant les effets positifs de la perte de masse grasse. Les résultats attendus pourraient contribuer au développement de traitements plus sûrs et mieux tolérés, améliorant ainsi la capacité fonctionnelle et la qualité de vie des personnes concernées.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (24 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (6 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements (49 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes), 5) Prélèvements sanguins (2 prélèvements, durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de l'endurance sur tapis roulant (2 mesures; durée du test : 20 à 30 minutes); 7) Test de force de préhension (2 mesures; durée du test : 2 minutes); 8) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle, les prélèvements sanguins, le test de force de préhension et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations des traitements et les prélèvements sanguins occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. Les mesures de force musculaire nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Les mesures de l'endurance des animaux pourront être source de stress du fait du caractère forcé de la course, ainsi que d'une fatigue musculaire. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les muscles pour analyses.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, et les paramètres de performance musculaire dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés à l'aide d'une sonde avec embout souple et par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Une crème analgésiante sera appliquée sur la queue des animaux 30 minute avant chaque prélèvement sanguin et seront limités au volume minimum nécesaire aux dosages ultérieurs. Durant la phase d'habituation les animaux seront habitués aux tubes de contention nécessaire à la mesure de composition corporelle et aux prélèvements sanguins ainsi qu'aux tapis de course (à faible vitesse) utilisés pour les tests d'endurance. Les mesure de force musculaire in vivo seront réalisées sur animal anesthésié et une attention particulière sera apportée pendant la phase de réveil. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée. Il est a noter que des études préalables de toxicité seront réalisée avant chaque étude par le laboratoire développant les candidats médicaments afin de déterminer une dose de composé non toxique à employer pour chaque étape du présent projet.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 18 semaines. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Compréhension des mécanismes inflammatoires dans l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
766 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie est maintenue plusieurs jours dans un air appauvri en oxygène pour reproduire une hypertension pulmonaire, d'autres reçoivent des injections répétées, avant une échographie cardiaque sous anesthésie. Le porteur décrit une gêne respiratoire qu'il classe modérée et renvoie les bénéfices, de futurs traitements plus efficaces, au long terme. Toutes sont tuées pour prélever les poumons et le cœur et mesurer l'inflammation et le remodelage du ventricule droit.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire est une maladie rare et grave qui touche les vaisseaux sanguins des poumons. Ceux-ci se rétrécissent progressivement, ce qui augmente la pression sanguine dans les poumons et fatigue le cœur, pouvant conduire à une insuffisance cardiaque. Malgré les traitements actuels, cette maladie reste associée à une espérance de vie réduite. Des traitements récents ont montré des effets encourageants, mais leur mode d’action reste encore mal compris. Par ailleurs, l’inflammation semble jouer un rôle important dans l’apparition et l’aggravation de la maladie. Ce projet vise à mieux comprendre comment l’inflammation contribue aux lésions des vaisseaux pulmonaires et à déterminer comment de nouveaux traitements pourraient agir sur ces mécanismes. Pour cela, des modèles murins seront utilisés afin d’étudier le rôle de certaines voies biologiques identifiées comme importantes dans la maladie. Les objectifs sont : • mieux comprendre le rôle de l’inflammation dans la maladie ; • identifier les mécanismes biologiques impliqués dans l’atteinte des vaisseaux pulmonaires ; • évaluer l’effet de nouveaux traitements et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation contribue à l’apparition et à l’aggravation de l’hypertension artérielle pulmonaire, une maladie grave caractérisée par une altération progressive des vaisseaux sanguins des poumons et une surcharge du cœur droit. Les résultats attendus aideront à préciser le rôle de certaines cellules immunitaires présentes dans les poumons et leurs interactions avec les cellules des vaisseaux sanguins. L’étude des phases précoces et tardives de la maladie permettra d’identifier les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation puis dans le remodelage des artères pulmonaires. Les bénéfices attendus sont multiples : • mieux comprendre les étapes clés menant au développement de la maladie ; • identifier des mécanismes biologiques pouvant servir de cibles thérapeutiques ; • repérer des indicateurs précoces utiles pour le diagnostic ou le suivi ; • contribuer au développement futur de traitements plus efficaces et personnalisés. À plus long terme, ces connaissances pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie sévère.
Procédures
Dans ce projet, une partie des animaux sera maintenue dans un environnement appauvri en oxygène pendant 4 à 21 jours afin de reproduire certaines caractéristiques de la maladie étudiée. Selon les groupes expérimentaux, certains animaux recevront une ou plusieurs injections au cours de l’étude, d’autres recevront des administrations quotidiennes pendant une semaine, et certains recevront des traitements répétés sur plusieurs semaines. En fin d’étude, certains animaux feront l’objet d’une échographie cardiaque sous anesthésie de courte durée afin d’évaluer la fonction cardiaque.
Impact sur les animaux
L’exposition à un environnement appauvri en oxygène peut entraîner une adaptation progressive de l’organisme, se traduisant par une diminution d’activité et une gêne respiratoire modérée. Cette nuisance est classée comme modérée. Les manipulations répétées nécessaires aux injections ou aux administrations peuvent provoquer un stress bref lié à la contention ainsi qu’un inconfort transitoire au site d’administration. Ces effets sont classés comme légers. L’anesthésie de courte durée utilisée pour l’échographie peut entraîner un stress lors de l’induction gazeuse ; la nuisance associée est faible.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés conformément aux modalités décrites dans la demande, afin de permettre la collecte standardisée des organes nécessaires aux analyses. Les poumons seront prélevés afin de caractériser de manière précise l’impact des différentes interventions sur la réponse inflammatoire induite par l’hypoxie. Ces tissus permettront d’évaluer la composition et l’activation des populations immunitaires pulmonaires (cytométrie en flux, histologie, immunomarquages), d’analyser la polarisation macrophagique et d’étudier l’expression de marqueurs moléculaires associés aux voies inflammatoires. Le cœur sera également collecté afin de documenter le remodelage du ventricule droit dans un contexte d’hypertension pulmonaire. L’ensemble de ces analyses post-mortem est indispensable pour relier les mécanismes inflammatoires précoces aux altérations vasculaires et fonctionnelles observées, et pour définir avec précision l’effet biologique des interventions évaluées dans ce projet.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des résultats déjà obtenus à partir d’échantillons humains et d’études in vitro sur des cultures cellulaires, qui ont mis en évidence un rôle potentiel des macrophages de type 2 ainsi que des voies de signalisation dans l’inflammation pulmonaire et le remodelage vasculaire associés à l’HTAP. Ces approches in vitro ont permis de caractériser les altérations de polarisation macrophagique, les interactions précoces avec les cellules endothéliales et les effets de ces voies sur la réponse inflammatoire. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire la dynamique spatio-temporelle complexe de l’HTAP, notamment l’évolution de l’inflammation (Jour 4), l’apparition progressive du remodelage vasculaire (Jour 21) et l’implication coordonnée de plusieurs populations cellulaires au sein du microenvironnement pulmonaire. Pour valider le rôle exact des macrophages de type 2 et de voies de signalisation dans ces processus, des modèles animaux restent indispensables. Le modèle d’hypoxie chronique chez la souris est un modèle préclinique largement validé, permettant de reproduire une HTAP modérée et réversible et d’étudier de manière intégrée les interactions entre macrophages, cellules vasculaires, cœur et poumons. Il constitue l’unique approche permettant d’évaluer l’impact réel de ces mécanismes dans un organisme entier, dans un contexte hémodynamique, vasculaire et immunitaire pertinent, et de distinguer les effets précoces de l’inflammation des altérations structurales responsables de l’HTAP.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité en s’appuyant sur des calculs de puissance statistique (GPower) réalisés à partir de nos données préliminaires et des valeurs de référence issues de la littérature sur le modèle d’hypoxie chronique. Les effectifs ont été déterminés pour obtenir une puissance suffisante sur les paramètres majeurs de l’HTAP (pression ventriculaire droite, remodelage vasculaire, infiltration inflammatoire), ce qui évite d’inclure un nombre d’animaux supérieur au nécessaire. Bien que les fonds génétiques distincts ne permettent pas de mutualiser les groupes témoins, chaque animal contribuera à plusieurs analyses complémentaires (hémodynamiques, histologiques et moléculaires), maximisant ainsi l’information obtenue par individu et limitant le recours à des cohortes additionnelles. De plus, les procédures J4 et J21 sont conçues pour analyser deux phases distinctes (inflammation précoce et remodelage vasculaire) au sein d’un même schéma expérimental, ce qui évite de multiplier les modèles. Les analyses en cytométrie, histologie et expression génique seront réalisées sur les mêmes prélèvements, permettant de regrouper les mesures et de réduire fortement le nombre d’animaux par expérience. Enfin, les données produites seront systématiquement exploitées pour les procédures connexes, afin d’éviter la redondance expérimentale et de limiter au strict nécessaire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un score de points limites sera appliqué afin de surveiller de près leur état de santé et d'intervenir rapidement si nécessaire. De plus, l’utilisation de crème anesthésiante à la lidocaïne avant chaque injection sous-cutanée ou intra péritonéale permettra de réduire toute gêne potentielle associée aux administrations. Nous appliquerons également cette crème avant la réalisation des mesures hémodynamiques sur le site d’ouverture. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles standards d’étude des maladies cardiovasculaires et de l’hypertension pulmonaire. Le modèle d’hypoxie chronique, bien qu’il ne reproduise qu’une partie des aspects de l’HTAP humaine, mime fidèlement l’inflammation pulmonaire précoce, la polarisation macrophagique, le remodelage vasculaire et les altérations hémodynamiques. Cette espèce offre un accès privilégié à des outils génétiques, permettant la manipulation ciblée de gènes impliqués dans les réponses immunitaires et de voies de signalisation, tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Afin de garantir la comparabilité des résultats avec les travaux publiés dans le domaine de l’hypertension artérielle pulmonaire expérimentale, des souris adultes jeunes (5 à 6 semaines d’âge, pesant environ 18–22 g) seront utilisées. À ce stade de développement, leur système immunitaire et cardiovasculaire est mature, ce qui permet d’évaluer de manière fiable la réponse inflammatoire, la polarisation macrophagique et le remodelage vasculaire induits par l’hypoxie chronique. L’utilisation de souris jeunes adultes assure également une homogénéité des effets des traitements expérimentaux, tout en limitant la variabilité liée à la croissance ou à l’âge avancé. Ce choix correspond aux standards internationaux pour les modèles murins d’HTAP et permet l’interprétation des résultats dans un cadre comparable à la littérature scientifique.
Étude de l’implication de l’interaction entre un récepteur de l’immunité et la paroi de certains micro-organismes dans la maladie de Crohn dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
6 240 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. On leur administre des bactéries ou des molécules, puis on déclenche une colite, par un produit dans l'eau de boisson ou par voie rectale sous anesthésie, ce qui peut provoquer perte de poids, selles molles et parfois saignements. Le projet teste si les effets anti-inflammatoires d'une bactérie intestinale passent par un récepteur de l'immunité, piste évoquée pour la maladie de Crohn. Le porteur justifie l'effectif de plus de six mille souris par quinze ans d'expérience et par la répétition des expériences pour leur "robustesse".
Objectifs
La maladie de Crohn (MC), un des sous-types les plus courants de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), se caractérise par une inflammation chronique et récidivante du tractus gastro-intestinal. L'étiologie précise de la MC reste incertaine, mais l'hypothèse la plus largement admise implique une activation inappropriée du système immunitaire due à la présence d'un microbiote intestinal altéré chez un patient génétiquement prédisposé. En effet, des études génétiques ont révélé que de nombreux patients atteints de MC sont porteurs d’une mutation perte de fonction d’un récepteur de l’immunité innée. Celui-ci reconnait un composant de la paroi des bactéries. De plus, la MC est associée à une modification du microbiote intestinal, caractérisée par une diminution de certaines bactéries anti-inflammatoires. La diminution d’une espèce bactérienne en particulier est (i) l'un des signes les plus forts des altérations du microbiote associées à la MC et chez les patients atteints de MC avec atteinte iléale et (ii) un facteur pronostique suggéré pour la rechute et la réponse aux traitements. L'objectif du projet est donc d'évaluer si les effets anti-inflammatoires de cette espèce bactérienne dépendent de la reconnaissance de sa paroi par le récepteur de l’immunité en utilisant des modèles de colite induite chez la souris. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’espèce bactérienne et pourra permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur ces propriétés anti-inflammatoires.
Bénéfices attendus
Ce projet fait partie d’un programme de recherche complet et ciblé sur le rôle de l’interaction entre une bactérie et un récepteur de l’immunité dans la maladie de Crohn. En France, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l’immunité et de la microbiologie. Les études décrites dans le projet permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans la maladie de Crohn tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients atteints de maladie de Crohn.
Procédures
Les souris seront traitées avec des bactéries ou des molécules : i) Par voie orale à raison d’une administration quotidienne durant 10 jours sur animal vigile (moins de 10 secondes par animal) ; ii) Par injection unique sur animal vigile (moins de 10 secondes par animal). Les souris seront ensuite soumises à l’un des deux modèles de colites induites expérimentalement : i) Par ajout d’une molécule dans l’eau de boisson durant 7 jours suivi de 5 jours sous eau standard (prise volontaire des animaux) ; ii) Par administration unique par voie rectale d’une molécule sous anesthésie générale (5 minutes). Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état inflammatoire des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formée avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris transgéniques utilisés ne présente pas de phénotype altéré. Néanmoins, ce modèle peut présenter une sensibilité accrue à la colite impliquant des adaptations (dose/durée) par rapport aux protocoles validés. Les bactéries et molécules à tester seront administrées par voie orale ou par injection pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des administrations orales peut induire des irritations ou des microlésions. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables liée à l’inflammation intestinale : perte de poids, selles molles, déshydratation voir des saignements dans les cas les plus graves (rare). Dans un cas, la colite sera induite via une molécule dans l’eau de boisson. Ce changement dans l’eau peut induire une légère baisse transitoire de la consommation hydrique des animaux de courte durée. Dans l’autre cas, la colite sera induite par administration locale d’une molécule sous anesthésie. La principale contrainte sera alors les risques associés à une anesthésie générale : hypo-tension, hypo-thermie ou encore dans de rare cas un arrêt cardio-respiratoire. Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient pas induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons un prélèvement sanguin pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Nous avons réalisé de nombreuses expériences in vitro, suggérant toutes que les effets anti-inflammatoires de la bactérie sont dépendants du récepteur d’intérêt. Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle, il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera un maximum de 6240 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Les productions d’animaux seront adaptées en fonction des expériences à mener et des capacités de traitement par les personnels concernés afin d’éviter toute surproduction. Les expériences seront menées de manière séquentielle pour permettre de réduire le nombre de conditions expérimentales en sélectionnant systématiquement les conditions de traitement les plus intéressantes avec des résultats significatifs en utilisant le moins d’animaux. Si cela est possible, nous mutualiserons les conditions contrôles permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux impliqués. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si la puissance statistique n’est pas encore atteinte. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte dans le cadre de ce projet est liée à la colite induite expérimentalement et aux signes cliniques qui y sont associés. Néanmoins, nous disposons d’une très grande expérience de ce type de modèle et assurons un suivi quotidien associé à une évaluation de la sévérité de la colite permettant une prise de décision immédiate en cas d’aggravation des symptômes. La colite dans ce projet est estimée à modérée compte-tenu des points limites mis en œuvre. De plus, les animaux sont hébergés dans des conditions exemptes d’organisme pathogène spécifique permettant de réduire également les risques d’inflammation supplémentaires. Pour les administrations, nous utilisons du matériel adapté (petite taille) afin de réduire aux maximum la contrainte. L’ensemble des actes sont parfaitement maitrisés et sont effectuées par un personnel formé et autorisé.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en nutrition, infectiologie et immunologie qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin de mettre au point des modèles de colite qui nous permettront par la suite de mieux comprendre les mécanismes d’action d’une bactérie intestinale anti-inflammatoire. Justification des stades : Les animaux seront traités entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites, nous souhaitons utiliser des conditions qui permettent une reproductibilité et une comparaison avec les études précédemment publiées.
Implantation des substituts osseux synthétiques dans des défauts osseux mandibulaires chez le miniporc
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Six pertes osseuses créées dans la mâchoire de chaque animal pour y tester un substitut phospho-calcique: 12 miniporcs vont être utilisés dans une chirurgie unique d'environ une heure, tous tués à l'issue pour l'analyse de leurs os, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cible la reconstruction osseuse de la mâchoire humaine, en évitant une greffe prélevée sur le patient. Le porteur retient le miniporc parce que sa mâchoire ressemble à celle de l'humain. Il annonce une gêne alimentaire surveillée, l'abord chirurgical restant à l'extérieur de la bouche.
Objectifs
Les pertes de substances osseuses sévères de la mâchoire représentent un problème de santé important, notamment chez les patients nécessitant une réhabilitation dentaire par implants. La régénération de ce type de défauts osseux reste un défi en chirurgie orale et maxillofaciale. En clinique, la technique de référence reste la greffe osseuse autologue mais elle présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Ce projet de recherche vise donc à évaluer une nouvelle approche de reconstruction osseuse, plus fiable et mieux adaptée aux situations cliniques complexes grâce à un nouveau matériau phospho-calcique conçu par la technique du moulage dynamique pour la régénération osseuse des mâchoires. La biocompatibilité in vitro et in vivo de ce nouveau biomatériau a déjà été démontrée. Son potentiel pour la régénération osseuse doit maintenant être évalué dans un modèle animal permettant de reproduire au plus près les conditions biologiques de la reconstruction osseuse des mâchoires chez l’homme. Le mini-pig a été choisi comme modèle expérimental car sa structure osseuse, la cicatrisation et les dimensions de ses mâchoires sont proches de celles de l’humain. Ce modèle est largement reconnu et utilisé dans la recherche biomédicale et en chirurgie orale, car il permet d’obtenir des résultats fiables et transposables à la pratique clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à développer une nouvelle approche de reconstruction osseuse, plus fiable et mieux adaptée aux situations cliniques complexes , tout en évitant le recours à une autogreffe osseuse, responsable d’une importante morbidité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique d'une durée estimée à une heure.
Impact sur les animaux
Les conséquences de cette étude sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur locale lors de la réalisation des défauts osseux et de la mise en place des substituts osseux : l’implantation des biomatériaux a lieu à la faveur d’un apport chirurgical extra-oral sur le corps de la mandibule. S’agissant d’interventions de chirurgie maxillo-faciale, une gêne à l'alimentation pourrait être observée et sera strictement monitorée. Toutefois, l’implantation des biomatériaux testés se fera de façon extra-orale, minimisant ainsi le risque infectieux par l’absence d’effraction de la muqueuse buccale et les conséquences en termes de gêne alimentaire. Pour faciliter la prise alimentaire, les animaux seront nourris pendant toute la durée de l’étude avec le même aliment que celui dont ils auront bénéficié chez l’éleveur/fournisseur. - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier. Les éventuels effets indésirables devraient diminuer jusqu'à disparaitre au fil des 8 semaines postopératoires.
Devenir
A la suite de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre l'analyse histologique des défauts osseux
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet. Le comportement biologique in vivo de ces nouveaux biomatériaux nécessite une évaluation chez l’animal avant une éventuelle application clinique humaine.
Réduction
Compte-tenu d’études comparables déjà publiées et des travaux précédemment réalisés sur la plateforme, le nombre d’animaux pour les deux études (N=6, x2) correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. Dans la présente étude, 4 conditions seront testées sur deux fois 6 animaux recevant chacun 6 implants, assurant donc un nombre de 9 explants par condition. Le test statistique retenu pour comparer les différentes conditions sera un test non paramétrique de comparaisons multiples de données quantitatives de plus de deux échantillons indépendants (N
Raffinement
Anesthésie générale doublée d’une anesthésie loco-régionale sous la forme de bloc mandibulaire d’anesthésiques locaux permettant l’insensibilisation du nerf alvéolaire inférieur dans le canal mandibulaire situé à proximité immédiate de la zone de création des défauts osseux.
Choix des espèces
Le miniporc adulte (âgé de 18 à 24 mois et environ 50 kg) a été choisi comme modèle expérimental car sa structure osseuse, la cicatrisation et les dimensions de ses mâchoires sont proches de celles de l’humain. Ce modèle est largement reconnu et utilisé dans la recherche biomédicale et en chirurgie orale, car il permet d’obtenir des résultats fiables et transposables à la pratique clinique humaine.
Etude de la pharmacocinétique et de la biocompatibilité d’agents de contraste pour l’IRM basés sur du fer chez le rat et le lapin
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Lapins : 81
147 animaux seront gardés vivants et réutilisés dans un autre projet, 90 autres tués sans reprise de conscience pour doser le produit dans leurs organes: 237 rats et lapins vont être utilisés pour tester des agents de contraste IRM à base de fer. Chaque animal reçoit une injection unique de produit et passe trois séances d'imagerie sous anesthésie générale. Le porteur présente ces agents au fer comme une alternative au gadolinium, jugée plus sûre pour les patients en insuffisance rénale. Il justifie l'étape animale par les preuves précliniques exigées avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Les agents de contraste pour l’Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) sont des molécules destinées à améliorer la qualité des images en réhaussant le signal là où elles sont présentes (hypersignal). Cela permet, lors d’un examen par IRM, de mettre en évidence certaines régions difficiles à visualiser. Actuellement, les agents de contrastes commerciaux sont basés sur le gadolinium. L’instabilité de certains agents provoque un relargage du gadolinium dans le corps, ce dernier s’accumulant dans différents organes provoquant des maladies chroniques chez les patients en insuffisance rénale sévère. En conséquence, de nombreux produits ont été retirés du marché européen et les radiologues font désormais preuve d’une pharmacovigilance renforcée en ce qui concerne l’utilisation des produits restants, également basés sur du gadolinium mais supposés plus stables. L’utilisation de ces derniers est désormais contre-indiquée chez certains types de patients lorsque d’autres subissent des examens à répétition, et donc une exposition répétée. De plus, avec l’accélération du vieillissement de la population, il est nécessaire de développer des alternatives aux agents à base de gadolinium dans le cadre de l’IRM. L’équipe de recherche qui fait la présente demande d’autorisation de projet développe depuis plus de 15 ans des agents de contraste basés sur du fer. Le fer est présent en grande quantité dans le corps humain qui possède donc des mécanismes de régulation, d’utilisation et d’élimination d’ions fer libres, contrairement au gadolinium qui est absent de celui-ci. Les agents de contraste basés sur du fer comporteront un risque moins élevé chez les patients atteints d’insuffisance rénale sévère. Dans le cadre de ce projet, une preuve de concept in vivo chez la souris a été obtenue et confirme l’efficacité des produis ainsi que l’absence de toxicité aiguë. Le projet doit étendre sa phase d’étude préclinique afin d’évaluer les produits dans des conditions d’utilisation réelles (IRM préclinique) chez le rat et le lapin avant d’envisager une utilisation chez l’humain. L’obtention de ces images permettra la mise en évidence du potentiel de molécules candidates comme alternatives aux produits de contraste commerciaux.
Bénéfices attendus
Les acquisitions d’images réalisées illustreront et exemplifieront le brevet en cours de rédaction, qui constitue la base de la propriété intellectuelle nécessaire pour développer le projet. Ces études précliniques représentent une étape cruciale, en démontrant l’intérêt médical et la faisabilité pratique de la technologie. Les résultats précliniques apportés sont essentiels pour obtenir les autorisations réglementaires nécessaires au développement d’un agent de contraste destiné à l’humain. Les images recueillies valideront pré-cliniquement la structure des molécules testées, permettant ainsi de sélectionner la molécule candidate pour la suite des démarches réglementaires. En définitive, ces résultats favoriseront l’avancement du projet vers son autorisation réglementaire afin de bénéficier aux centaines de milliers de patients en Europe qui souffre d’insuffisance rénale chronique pour leur permettre un diagnostic IRM sans risque.
Procédures
Les animaux seront exposés à trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie générale et une injection unique de produit de contraste lors de la première séance (3 heures); deux séances supplémentaires (30 minutes) sont prévues trois et sept jours plus tard afin de vérifier l'élimination complète du produit (une unique injection de produit, trois anesthésies sur un total de sept jours, trois poses de cathéter pour le lapin et une seule pour le rat). L’injection de produit sera réalisée de manière systémique 30 minutes après l’induction de l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux inscrits dans ce projet seront exposés à une procédure modérée avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les agents de contraste, bien que supposés non toxiques, peuvent avoir des effets indésirables sur la santé de l’animal, notamment si le produit est retenu dans un tissu particulier. Une attention particulière sera portée sur le comportement de l’animal post-injection (respiration, gonflement, rythme cardiaque). Les effets indésirables attendus, bien que rares, sont de même nature que pour une injection de produit de contraste commercial : hypersensibilité, réaction anaphylactique, allergie cutanée, vasodilatation, malaise, fièvre, nécrose tissulaire, phlébite au point d’injection. Nuisances : 1) L’induction de l’anesthésie générale peut entraîner un stress physique modéré et/ou une détresse légère à modérée de courte durée. Elle sera soumise trois fois pour chaque animal à trois jours d’intervalle minimum. 2) La piqûre d'une aiguille pour la prémédication chez le lapin peut entraîner une douleur légère de courte durée. Elle sera soumise trois fois pour chaque animal à 3 jours d’intervalle minimum. 3) L’injection intraveineuse d’agents de contraste peut entraîner un stress physique léger ou réactions hémodynamiques (tachycardie, hypotension) de courte durée. Elle ne sera soumise qu’une seule fois par animal.
Devenir
Un nombre de deux animaux par produit sera euthanasié pendant le protocole d’imagerie afin d’extraire les organes d’accumulation du produit et doser ce dernier dans les tissus. Les trois animaux de contrôle seront également euthanasiés. Cela représente 63 rats et 33 lapins. Les interventions effectuées sur les animaux sont compatibles avec un maintien en vie des animaux. Le groupe d’animaux maintenus en vie pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
Ce projet, à la frontière entre la recherche fondamentale (de par la totale nouveauté des concepts moléculaires développés) et la recherche appliquée (valorisée par un futur brevet), a permis la réalisation d’une preuve de concept in vitro et in vivo. Dans une optique de développement du concept moléculaire vers un agent d’imagerie à destination de l’humain, effectuer des tests de biocompatibilité, de performance et de pharmacocinétique in vivo de molécules sur différents modèles animaux est une étape indispensable avant le passage chez l’humain (essais cliniques réglementaires). Dans ce but, aucune autre procédure ne peut remplacer cette étude.
Réduction
Le nombre total estimé d'animaux nécessaire est basé sur le nombre maximum d'agents de contraste à tester avec au plus cinq animaux par agent (dont deux seront euthanasiés pendant la première imagerie), cinq étant un chiffre jugé suffisant par l’équipe de recherche pour conclure sur l’intérêt d’un produit et juger de la répétabilité des données sur au minimum trois animaux sur cinq. C’est la raison pour laquelle le projet n’utilisera pas d’animaux de réforme, afin de garantir une comparaison fiable des données avec le nombre limité d’animaux utilisés. Les animaux gardés en vie seront imagés à deux reprises pour vérifier la présence ou non d’hypersignal dans certains tissus plusieurs jours après l’injection. L’IRM étant une technique d’imagerie non-invasive, elle permet de réduire par trois le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront suivis de manière quotidienne, manipulés par le zootechnicien pour réduire toute forme de stress. Ils seront pesés pour un suivi de gain de poids qui permettra le bon calcul des doses à administrer le jour de l’expérimentation. Le raffinement est appliqué, par l’utilisation de boxes/cages enrichis : foin, abris, bâton et bloc de cellulose à ronger sont fournis aux lapins. Tunnel, abri, nid et bloc de bois à ronger sont fournis aux rats. Ceux-ci leur permettent d’exprimer au mieux leur comportement naturel. La règle de raffinement est aussi mise en place au cours de la procédure avec l’utilisation d’une grille de suivi et des points limites adaptés. Les animaux seront exposés à une procédure modérée avec un temps d’anesthésie inférieur à trois heures. Les animaux seront conditionnés dans un lit dédié à l’exploration anatomique, chauffé par thermorégulation par système de circulation d’eau chaude avec monitoring de la respiration et suivi de température. On instillera une goutte d’Ocrygel dans chaque œil de l’animal pour prévenir de la dessication oculaire. Notre attention sera portée sur les gestes expérimentaux pouvant causer un stress ou une douleur telle que l’injection intraveineuse d’agents de contraste.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce la plus adaptée pour évaluer pré-cliniquement les agents de contraste sur l’instrument d’IRM préclinique 7 Tesla pour petit animal utilisé pour cette étude. Le faible volume corporel du rat permet une imagerie précise et résolue du corps entier. En effet, l’instrument est adapté à l’imagerie de petits rongeurs en disposant d’une cavité adaptée et d’un lit adapté. De plus, le faible volume sanguin du rat implique un faible volume d’injection et donc la production d’une quantité d’agent de contraste acceptable. Le rat est plus adapté à l’étude des produits de contraste en IRM que la souris car le temps de demi-vie dans le sang est plus long (20 min contre 5 min respectivement) ce qui permet un suivi plus précis de la biodistribution des produits dans les premiers instants après l’injection. Le lapin est l’espèce la plus adaptée pour notre étude sur les instruments IRM cliniques 1.5 Tesla et 3 Tesla utilisé pour cette étude. En effet, le lapin est l’animal le plus petit utilisable sur ces instruments normalement adaptés à l’humain ou aux grands animaux. Le lapin est également l’espèce de choix pour réaliser des études en angiographie. Les animaux seront commandés au stade de développement « jeune-adulte » pour garantir un métabolisme et une morphologie adéquats pour l’étude. Cela permet également une taille et un poids adaptés aux instruments. Enfin, leur âge précoce permet d’envisager leur réutilisation dans d’autres projets.
Rôle des mégacaryocytes dans les syndromes myéloprolifératifs (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deuxième volet mené dans un autre établissement, ce projet utilise 1 491 souris supplémentaires, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Comme dans son jumeau, elles sont irradiées, greffées de moelle osseuse, puis soumises à des prélèvements de sang répétés et à des gavages, pour étudier les mégacaryocytes dans des cancers du sang. Le porteur reprend la même justification, l'absence de modèle in vitro reproduisant la fibrose de la moelle. Les pistes thérapeutiques annoncées pour les patients restent lointaines.
Objectifs
Introduction : Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang où la moelle osseuse fabrique trop de cellules, notamment trop de globules rouges et de plaquettes. Avec le temps, cette surproduction abîme la moelle et crée des cicatrices (myélofibrose), ce qui empêche de produire correctement le sang. Cela peut provoquer de la fatigue, un risque d’infections plus élevé, et parfois même une évolution d’autres types plus graves de cancers du sang. Les mégacaryocytes, les cellules qui fabriquent les plaquettes, jouent un rôle clé dans cette dégradation de la moelle. Pourtant, les traitements actuels n’agissent pas spécifiquement sur ces cellules, ce qui limite leur efficacité. Trouver des traitements capables de cibler directement les mégacaryocytes pourrait permettre d’améliorer la santé et la qualité de vie des patients atteints de NMP. Objectif général : Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant spécifiquement les mégacaryocytes, en étudiant leur fonctionnement dans les NMP. Le projet sera réalisé dans deux établissements.
Bénéfices attendus
En plus d’améliorer nos connaissances sur le rôle des mégacaryocytes dans les NMP, l’objectif final de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques capables de freiner la progression de la myélofibrose et, à terme, d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront réalisés chez des souris vigiles, à raison d’un maximum de dix prélèvements par animal sur une durée totale de 36 à 40 semaines (soit un prélèvement toutes les quatre semaines). Chaque prélèvement aura une durée inférieure à cinq minutes. Certaines souris recevront des traitements administrés par injection et/ou par gavage, à raison d’un maximum de deux injections et de deux gavages par jour, sur une durée maximale de huit semaines consécutives. Ces gestes seront réalisés chez des animaux vigiles et auront une durée inférieure à une minute chacun. Certaines souris vigiles seront préalablement irradiées et transplantées (moelle osseuse). Le geste, réalisé sur animal vigile, dure au maximum 10 minutes. Enfin, un prélèvement sanguin terminal sera effectué chez certains animaux, sous anesthésie profonde sans réveil, pour une durée totale estimée à environ dix minutes
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souris, nécessaires pour la réalisation des gestes ci-après, entraînent un léger stress de courte durée : - Injections: la piqûre entraîne une douleur légère et passagère. - Prélèvement sanguin à la queue : l’entaille d’une veine va provoquer une douleur aigue et passagère. - Irradiation des souris : l’irradiation entraîne une destruction transitoire de la moelle osseuse, provoquant une fatigue passagère et une activité réduite pendant quelques jours. Les symptômes seront corrigés par une transplantation de moelle osseuse. Le transport vers l’irradiateur et l’espace restreint dans les boîtes d’irradiation peut induire un stress léger et temporaire. - Gavage oral : le passage de la sonde peut provoquer une irritation légère et transitoire de l’œsophage. - Modèles de souris NMP : Pas de nuisance lors du développement de la maladie, qui est indolore.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter les principaux échantillons nécessaires aux différentes analyses mises en œuvre dans ce projet (os, rate, poumons…).
Remplacement
Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang dans lesquelles certaines cellules deviennent anormales et perturbent le fonctionnement de la moelle osseuse, le lieu de production de toutes les cellules sanguines. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle in vitro en laboratoire capable de reproduire correctement ce qui se passe dans l’organisme, notamment l’apparition progressive de la fibrose (cicatrisation) dans la moelle. L’utilisation de modèles de souris est donc indispensable pour permettre de mieux comprendre l’évolution de ces maladies et, à terme, d’identifier de nouvelles pistes de traitement plus efficaces pour les patients.
Réduction
Les effectifs ont été définis en amont grâce à une approche statistique, afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Cette estimation tient compte de la variabilité attendue et des objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et leur utilisation sera respectée (valable uniquement pour les souris achetées). Une habituation à la manipulation et à la contention sera réalisée 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. - Par un enrichissement dans la cage de nids, coton compressé et de frisure de papier kraft afin de permettre aux animaux de construire un nid et augmenter la diversité de leur comportement. - Par l’utilisation de boites de transport dédiées en conservant la composition des cages d’origine, et contenant une litière propre, du matériel d’enrichissement comme des nids ainsi que de la nourriture liquide et du gel d’hydratation, afin de limiter le stress et de garantir leur confort pendant le déplacement vers et au retour de l’irradiateur. - Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de gestes invasifs. - Par l’installation de l’animal dans une enceinte thermostatée après administration de l’anesthésie, puis sur une plaque chauffée, afin lutter contre l’hypothermie pendant les gestes invasifs. - Par l’injection d’analgésique avant les gestes invasifs.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée car la formation du sang et le fonctionnement de la moelle osseuse y sont bien connus et très proches de ceux de l’être humain. C’est également la seule espèce pour laquelle il existe des modèles génétiquement modifiés reproduisant les NMP. Ces modèles permettent d’observer l’ensemble des caractéristiques de la maladie telles qu’elles apparaissent chez les patients, y compris la fibrose de la moelle osseuse et les réponses aux traitements utilisés en clinique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 40 semaines), période durant laquelle il est possible d’étudier à la fois l’apparition de la maladie et son évolution vers des formes plus sévères.
Résilience et adaptation des îlots pancréatiques en vue de leur transplantation 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rendues diabétiques, plus de 1 500 souris subissent une transplantation chirurgicale d'îlots pancréatiques, sur un total de 1 844 animaux utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles reçoivent aussi des injections quotidiennes et des prélèvements de sang hebdomadaires. Le projet cherche des cibles pour rendre les îlots plus résistants en vue d'une greffe. Le porteur affirme que la culture cellulaire "n'est pas appropriée" et que transplanter chez l'animal est "le seul moyen" d'étudier la fonction des cellules à long terme.
Objectifs
Certains récepteurs sont des modulateurs du métabolisme et de l'inflammation notamment des cellules du pancréas. Leurs actions ciblent la viabilité et de la fonction des cellules pancréatiques. Notre hypothèse est qu'en modulant leur activité respective dans les cellules du pancréas produisant l'insuline, on pourrait prévenir les processus inflammatoires qui se produisent lors du diabète de type 1 et entrainerait une sécrétion d'hormone défaillante. Leur possible modulation pourrait donc jouer un role majeur. Le projet sera mené dans deux établissements-utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les résultats escomptés sont l'identification de cibles spécifiques dans la création d'ilots pancréatiques résilients capables de survie et d'adaptation à long terme. De plus, il pourra montré l'intérêt de certaines molécules anti-diabètiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1/ des injections quotidiennes au maximum en respectant les volumes maximum (280 animaux en EU1 et 60 animaux dans EU2), 2/ ainsi qu'à des prélèvements sanguins hebdomadaires en respectant les volumes (1784 animaux dans EU 1) , 3/ une unique transplantation d'ilots pancréatiques pour certains animaux (1504 animaux au sein de EU 1).
Impact sur les animaux
Les nuisances induites dans ce projet seront de plusieurs types : Nous utiliserons des modèles de souris diabétiques (induits ou génétiques) qui créera un inconfort pour les animaux (palié par la gestion de leur environnement). Certains animaux subiront une transplantation de cellules qui sera faite par voie chirurgicale qui induit une ouverture des parois cutanée et musculaire qui engendrera une douleur modérée (paliée par traitements associés). Des traitements avec des molécules seront faits par injection intrapéritonéale (douleur légère très transitoire) ou intravasculaire sous anesthésie. Les molécules utilisées n'ont pas d'effets néfastes connus. Les virus utilisés sont sans impact direct sur le phénotype et bien-être murin. Les prélèvements sanguins faits à la queue lors notamment des tests au glucose engendreront une douleur légère paliée par les anti-douleurs locaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever les tissus et les étudier ensuite (histologie).
Remplacement
Le diabète est un maladie qui affecte tous les organes. Aussi les expériences de culture cellulaire et études ex vivo ne sont pas appropriées dans ce contexte. La nécessité de l'étude de la réponse auto-immune nécessite l'usage des animaux. A l"heure actuelle, il n'existe pas de méthode alternative à l'usage des animaux pour étudier la fonction des cellules au long court. Le seul moyen est de les transplanter chez l'animal.
Réduction
1844 animaux sont inclus dans ce protocole. Nous avons estimé un nombre moyen de 3 à 10 souris par groupe pour avoir des résulatsts statistiquement satisfaisants (confiance 95% et puissance 80%). Aprés étude, l'analyse statistique se fera par test Two way anova.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés en portoir ventilé, en cage de 5 maximum. Les animaux diabètiques seront changés plus régulièrement que les congénères sains. Ils seront traités avec soin avec visite quotidienne; enrichissement de l'environnement et traitement anti-douleur le cas échéant. Pour les animaux subissant une chirurgie, des granulés de nourriture seront disposés au sol, avec une portion de nourriture gélifiée pour une meilleure récupération post-opératoire. Le bien-être animal sera observé au quotidien et un arbre décisionnel permettra de guider le personnel quant à la démarche de soin pour éviter d'atteindre un point-limite non réversible. Les animaux immunodéficients seront hébergés dans des portoirs ventilés clos afin de préserver leur environnement. Le transport des naimaux d'un EU à l'autre se fera dans des cages spécifiques comportant de la litière, de l'eau gélifiée, des croquettes et de l'enrichissement (cocon et tunnel) dans un véhicule à température adéquate (22 +/_ 2 °C).
Choix des espèces
Nous disposons de l'ensemble des outils adaptés aux modèles "souris". De plus, sa petite taille permet un hébergement aisé. Pour ce projet, nous utiliserons des souris adultes (maturité sexuelle atteinte). Des souris avec une immunité affaiblie seront utilisées pour permettre la greffe de cellules humaines et ainsi éviter le rejet.
Une nouvelle cible thérapeutique testée dans un modèle murin d’AVC ischémique – suivi à 3 JOURS (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Opérées pendant une heure pour provoquer un accident vasculaire cérébral, suivies trois jours par IRM sous anesthésie, puis tuées pour prélever leur cerveau, 88 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles perdent du poids et développent des déficits sensorimoteurs, dont une hémiparésie et une baisse de sensibilité des vibrisses. Le porteur indique que moins de 10 % meurent d'un œdème ou d'une hémorragie avant terme, ces cas étant mis à mort dès leur détection à l'IRM. Il présente la douleur comme limitée à la cicatrice du cou, l'atteinte du cerveau étant décrite comme indolore.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection et améliorer le devenir des patients. L’objectif global du projet est d’évaluer l’effet protecteur à long-terme d’un nouveau traitement ciblant UNE protéine D’INTERET dans un modèle murin d’AVC transitoire. Des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible thérapeutique suggèrent un effet protecteur de l’activation DE CETTE PROTEINE sur le cerveau en condition d’AVC. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de CETTE PROTEINE dans l’AVCi à long terme, nous allons évaluer les conséquences d’une activation de CETTE PROTEINE à l’aide d’un agoniste (qui favorise l’expression de la cible thérapeutique) par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. Pour vérifier que ces résultats sont maintenus à plus long terme, nous allons réaliser un suivi des animaux traités avec l’agoniste ou le placebo pendant 3 JOURS, Notre hypothèse est que l’activation de LA PROTEINE D’INTERET devrait diminuer la taille des lésions, protéger la barrière hématoencéphalique et ainsi améliorer le pronostic des animaux.
Bénéfices attendus
Si l’effet neuroprotecteur de la modulation DE LA PROTEINE D’INTERET est prouvé, cela validera CETTE PROTEINE comme une nouvelle cible thérapeutique. Il sera possible de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVC.
Procédures
Chirurgie de 60 minutes IRM sur animaux anesthésiés d’environ 60 min Mesures neurofonctionnelles de 10 min
Impact sur les animaux
Suite à l'accident vasculaire cérébral, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie pendant 3 JOURS puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires postmortem (étude des mécanismes).
Remplacement
Cette étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro, ex vivo et in vivo qui ont montré le rôle D’UNE PROTEINE D’INTERET dans l'ischémie-reperfusion. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en perocclusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (
Choix des espèces
Les animaux utilisés pour cette étude seront des souris car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.
Validation de biomarqueurs circulants innovants d’efficacité et de suivi thérapeutique des brûlures radiologiques chez la souris immunocompétente C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Le membre inférieur irradié sous anesthésie pour provoquer une brûlure radiologique, 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue par ponction cardiaque. S'y ajoutent une épilation, une injection de cellules souches ou de vésicules, et jusqu'à huit prélèvements de sang au niveau de l'œil, avec un risque de lésion oculaire signalé. Le projet cherche à valider des marqueurs sanguins pour suivre les traitements après une irradiation accidentelle ou une radiothérapie. Le porteur situe ce bénéfice, adapter les soins aux patients, sur le long terme.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches sur la brûlure radiologique dues à une exposition à de fortes doses de rayonnements ionisants, en particulier dans des contextes incidentels ou accidentels. Il vient compléter un projet en cours visant à identifier, à l’aide d’un modèle préclinique chez la souris immunodéficiente Nude, des indicateurs biologiques (biomarqueurs) permettant d’évaluer l’efficacité et réaliser le suivi du traitement par cellules souches ou vésicules extracellulaires (exosomes). Dans un objectif d’évolution vers une application clinique, ce projet propose de valider l’association de ces biomarqueurs ainsi identifiés avec l’évolution des lésions et au processus de réparation et de cicatrisation chez la souris immunocompétente C57BL/6J. A l’aide d’un modèle de brûlure radiologique établi chez la souris, les microARN (petits ARN non-codants impliqués dans la régulation de l’expression des gènes) et les métabolites (produits issus du métabolisme) présents dans le sang seront analysés à différents temps après irradiation en réponse à une injection de produit thérapeutique (CSM ou VE, procédure 1). Dans le but de valider la pertinence de ces nouveaux indicateurs biologiques dans le sang associés à l’évolution des lésions et au suivi des individus au cours du processus de cicatrisation (3 mois) nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Pour ce projet, le nombre maximum estimé d’animaux est de 180 souris pour réaliser les analyses de validation chez le mâle (90 mâles) et la femelle (90 femelles) des biomarqueurs circulants (procédure 1).
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à valider des biomarqueurs innovants dans la circulation sanguine qui permettraient d’évaluer l’efficacité des traitements testés. L’ensemble de ces recherches vise à transférer sur le long terme ces découvertes vers une application clinique, afin de les utiliser concrètement au cours de la prise en charge médicale pour adapter les traitements en fonction des besoins individuels et améliorer le suivi des individus après un accident d’irradiation ou des patients traités par radiothérapie.
Procédures
- Prélèvements répétés de sang au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse à j+1 / j+7 / j+14 / j+21 / j+28 / j+42 / j+56 / j+70 sous anesthésie : 30 secondes, soit 8 prélèvements maximum - Epilation des membres inférieurs sous anesthésie : 10 min - Irradiation du membre inférieur sous anesthésie (1 fois) : 25 min - Injection unique intra-musculaire sous anesthésie générale : environ 1 min/injection -Prélèvement terminal effectué par ponction cardiaque sous anesthésie générale à j+84 post-irradiation : 30 secondes - Imagerie non invasive sous anesthésie (max 9 fois) : 20 min Ces interventions seront réalisées sur la totalité des animaux de l’étude (180 souris).
Impact sur les animaux
L’irradiation à forte dose du membre inférieur conduit à une lésion radio-induite dont le pic de sévérité est atteint vers 2 semaines post-irradiation, suivi d’une phase de cicatrisation. Un léger ralentissement transitoire dans la prise de poids a été observé dans les premières semaines après irradiation, sans conséquence notable sur le comportement des animaux. Certains animaux peuvent présenter des difficultés à utiliser la patte lésée pour se déplacer, ainsi que des signes de prostration ou poils hérissés. Après injection la souris peut présenter un gonflement transitoire de la patte. Après prélèvements sanguins, l’animal peut développer une lésion oculaire.
Devenir
Aucun individu ne sera maintenu en vie à la fin de la procédure. Afin de réaliser les différents prélèvements pour les analyses des tissus, l’euthanasie de tous les animaux est nécessaire.
Remplacement
Dans le but d’identifier de nouveaux indicateurs biologiques dans le sang associés à la réparation des lésions radio-induites après traitement, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 10 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum les impacts sur les animaux. Selon les retours d’expérience avec ce modèle, il n’est pas attendu de douleur pendant l’irradiation. À la suite de l’irradiation, une rougeur avec ou sans œdème peuvent être observées. Il n’est pas attendu d’impact important sur l’état général des animaux. Les animaux sont observés tous les jours. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire. Si un hématome ou une lésion oculaire est observée en lien avec les prélèvements sanguins répétés, les prélèvements seront stoppés. De même, il n’est pas attendu de douleur pendant les imageries.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental de référence pour les études précliniques. Les animaux utilisés dans cette étude seront âgés de 7 à 9 semaines (stade adulte, mâle et femelle).
Rôle des mégacaryocytes dans les syndromes myéloprolifératifs (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées pour détruire leur moelle osseuse puis greffées, 1 491 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à dix prélèvements de sang sur près de dix mois, des injections et des gavages, avant un prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Le projet étudie le rôle des mégacaryocytes dans des cancers du sang, pour ouvrir des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la fibrose de la moelle, ce qui rendrait la souris "indispensable".
Objectifs
Introduction : Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang où la moelle osseuse fabrique trop de cellules, notamment trop de globules rouges et de plaquettes. Avec le temps, cette surproduction abîme la moelle et crée des cicatrices (myélofibrose), ce qui empêche de produire correctement le sang. Cela peut provoquer de la fatigue, un risque d’infections plus élevé, et parfois même une évolution d’autres types plus graves de cancers du sang. Les mégacaryocytes, les cellules qui fabriquent les plaquettes, jouent un rôle clé dans cette dégradation de la moelle. Pourtant, les traitements actuels n’agissent pas spécifiquement sur ces cellules, ce qui limite leur efficacité. Trouver des traitements capables de cibler directement les mégacaryocytes pourrait permettre d’améliorer la santé et la qualité de vie des patients atteints de NMP. Objectif général : Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant spécifiquement les mégacaryocytes, en étudiant leur fonctionnement dans les NMP. Le projet sera réalisé dans deux établissements.
Bénéfices attendus
En plus d’améliorer nos connaissances sur le rôle des mégacaryocytes dans les NMP, l’objectif final de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques capables de freiner la progression de la myélofibrose et, à terme, d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront réalisés chez des souris vigiles, à raison d’un maximum de dix prélèvements par animal sur une durée totale de 36 à 40 semaines (soit un prélèvement toutes les quatre semaines). Chaque prélèvement aura une durée inférieure à cinq minutes. Certaines souris recevront des traitements administrés par injection et/ou par gavage, à raison d’un maximum de deux injections et de deux gavages par jour, sur une durée maximale de huit semaines consécutives. Ces gestes seront réalisés chez des animaux vigiles et auront une durée inférieure à une minute chacun. Certaines souris vigiles seront préalablement irradiées et transplantées (moelle osseuse). Le geste, réalisé sur animal vigile, dure au maximum 10 minutes. Enfin, un prélèvement sanguin terminal sera effectué chez certains animaux, sous anesthésie profonde sans réveil, pour une durée totale estimée à environ dix minutes
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souris, nécessaires pour la réalisation des gestes ci-après, entraînent un léger stress de courte durée : - Injections: la piqûre entraîne une douleur légère et passagère. - Prélèvement sanguin à la queue : l’entaille d’une veine va provoquer une douleur aigue et passagère. - Irradiation des souris : l’irradiation entraîne une destruction transitoire de la moelle osseuse, provoquant une fatigue passagère et une activité réduite pendant quelques jours. Les symptômes seront corrigés par une transplantation de moelle osseuse. Le transport vers l’irradiateur et l’espace restreint dans les boîtes d’irradiation peut induire un stress léger et temporaire. - Gavage oral : le passage de la sonde peut provoquer une irritation légère et transitoire de l’œsophage. - Modèles de souris NMP : Pas de nuisance lors du développement de la maladie, qui est indolore.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter les principaux échantillons nécessaires aux différentes analyses mises en œuvre dans ce projet (os, rate, poumons…).
Remplacement
Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang dans lesquelles certaines cellules deviennent anormales et perturbent le fonctionnement de la moelle osseuse, le lieu de production de toutes les cellules sanguines. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle in vitro en laboratoire capable de reproduire correctement ce qui se passe dans l’organisme, notamment l’apparition progressive de la fibrose (cicatrisation) dans la moelle. L’utilisation de modèles de souris est donc indispensable pour permettre de mieux comprendre l’évolution de ces maladies et, à terme, d’identifier de nouvelles pistes de traitement plus efficaces pour les patients.
Réduction
Les effectifs ont été définis en amont grâce à une approche statistique, afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Cette estimation tient compte de la variabilité attendue et des objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et leur utilisation sera respectée (valable uniquement pour les souris achetées). Une habituation à la manipulation et à la contention sera réalisée 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. - Par un enrichissement dans la cage de nids, coton compressé et de frisure de papier kraft afin de permettre aux animaux de construire un nid et augmenter la diversité de leur comportement. - Par l’utilisation de boites de transport dédiées en conservant la composition des cages d’origine, et contenant une litière propre, du matériel d’enrichissement comme des nids ainsi que de la nourriture liquide et du gel d’hydratation, afin de limiter le stress et de garantir leur confort pendant le déplacement vers et au retour de l’irradiateur. - Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de gestes invasifs. - Par l’installation de l’animal dans une enceinte thermostatée après administration de l’anesthésie, puis sur une plaque chauffée, afin lutter contre l’hypothermie pendant les gestes invasifs. - Par l’injection d’analgésique avant les gestes invasifs.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée car la formation du sang et le fonctionnement de la moelle osseuse y sont bien connus et très proches de ceux de l’être humain. C’est également la seule espèce pour laquelle il existe des modèles génétiquement modifiés reproduisant les NMP. Ces modèles permettent d’observer l’ensemble des caractéristiques de la maladie telles qu’elles apparaissent chez les patients, y compris la fibrose de la moelle osseuse et les réponses aux traitements utilisés en clinique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 40 semaines), période durant laquelle il est possible d’étudier à la fois l’apparition de la maladie et son évolution vers des formes plus sévères.
Thérapies dirigées contre l’adénocarcinome pancréatique ductal (PDA) en combinaison avec un inhibiteur du cycle cellulaire
- Recherche appliquée
- Cancers
Ouvertes par laparotomie sous anesthésie pour recevoir une injection de cellules cancéreuses dans le pancréas, 2 380 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent ensuite des prélèvements de sang, deux cycles de gavage et des injections répétées, sous une grille clinique qui déclenche la mise à mort au score de 4. Le projet teste un inhibiteur du cycle cellulaire, le palbociclib, seul ou en association, contre l'adénocarcinome du pancréas. Le porteur situe le bénéfice, pour les 40 à 50 % de patients porteurs de la délétion ciblée, au long terme.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier de nouvelles approches thérapeutiques ciblant la voie de signalisation du gène CDKN2A, impliqué dans le contrôle du cycle cellulaire ainsi que dans plusieurs aspects de la réponse immunitaire dans l’adénocarcinome pancréatique. Dans les tumeurs présentant une délétion de CDKN2A, les protéines CDK4/6 sont particulièrement activées. Le palbociclib, un inhibiteur de CDK4/6, a montré une activité antitumorale : il réduit la prolifération cellulaire et augmente l’infiltration tumorale par les cellules immunitaires, notamment les lymphocytes T. Depuis plusieurs années, nous avons développé et caractérisé des modèles murins de tumeur pancréatique orthotopique, et acquis une expertise dans l’analyse de la croissance tumorale et de l’immunité antitumorale via des techniques d’immunohistochimie, de biologie moléculaire et de cytométrie en flux. • La première procédure vise à évaluer l’effet du palbociclib en monothérapie dans des tumeurs pancréatiques. • La seconde procédure a pour objectif de déterminer si l’association du palbociclib à d’autres traitements immunomodulateurs permet d’améliorer la réponse thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont la mise en place des traitements antitumoraux spécifiques des tumeurs du pancréas qui portent la délétion du gène CDKN2A. Ces modèles tumoraux murins ont une relevance pré-clinique de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC). Les bénéfices à long terme sont pour les patients avec délétion CDKN2A qui correspondent à 40-50% des patients PDAC.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 5 minutes, est réalisée. Elle consiste en une laparotomie suivie d’une injection intra pancréatique. Au cours de la cinétique expérimentale, les animaux seront soumis à : deux prélèvements sanguins, réalisés lors des séances d’échographie sous anesthésie générale ; deux cycles de gavage de 5 jours chacun ; trois injections intrapéritonéales (IP).
Impact sur les animaux
La durée expérimentale est d’environ 20 jours à partir de l’injection tumorale. Durant la première phase de croissance tumorale, les souris ne présentent généralement pas de signes cliniques de souffrance. À partir de 18 à 20 jours, certains animaux peuvent toutefois développer des signes liés au développement tumoral, tels qu’une altération progressive de l’état général, une diminution de la mobilité, une perte de poids pouvant évoluer vers un état de cachexie, ainsi qu’un aspect du pelage dégradé. Les manipulations nécessaires au suivi expérimental (capture, contention, pesées, injections répétées selon protocole) peuvent entraîner un stress ponctuel et une gêne transitoire. Les traitements administrés (palbociclib seul ou en association) sont susceptibles d’induire une baisse temporaire de l’activité ou de l’appétit, déjà décrite pour ces molécules. Afin d’assurer un suivi optimal et de prévenir l’installation d’une souffrance prolongée, une grille d’observation quotidienne (jointe en annexe) est utilisée pour évaluer l’ensemble des paramètres cliniques pertinents : état général, mobilité, prise alimentaire, hydratation, perte de poids, aspect du pelage et comportement. Toute dégradation des critères définis conduit à l’application stricte des points limites.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour le prelevement du pancreas et les analyses histologiques et par cytometrie en flux de la tumeur
Remplacement
Des approches alternatives ont été mises en œuvre afin de limiter au maximum le recours aux animaux dans ce projet. Analyses in silico pour l’identification des cibles immunothérapeutiques : Une étude in silico a été réalisée à partir des données de patients atteints de PDAC. Cette analyse a permis d’établir une liste de gènes dont l’expression est modulée par la délétion de CDKN2A. Cette stratégie permet de remplacer des expérimentations animales initiales, habituellement nécessaires pour la recherche et la sélection de nouvelles cibles immunitaires. Mise au point d’essais in vitro : Des tests d’activation des lymphocytes T par des cellules tumorales ont été développés en culture in vitro. Ces méthodes permettent d’évaluer la réponse immunitaire antitumorale sans recourir à des cohortes animales lors des phases exploratoires. Limites actuelles du remplacement : Malgré ces approches substitutives, l’utilisation d’animaux reste indispensable pour étudier : le comportement de la tumeur dans son microenvironnement pancréatique spécifique ; les interactions complexes avec le système immunitaire de l’hôte ; le recrutement intratumoral des cellules immunitaires pro et antitumorales. Aucune méthode alternative fiable ne permet actuellement de reproduire ces interactions in vivo de manière pertinente, ce qui rend l’emploi d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Nous utilisons une méthode d’imagerie par l’échographie qui permet de détecter la prise de tumeur et de la mesurer au cours du temps pour un suivi longitudinal de la croissance tumorale, évitant l’utilisation de plusieurs cohortes d’animaux à différentes périodes. A partir des expériences passées nous utilisons un calcul du nombre d’animaux par groupe à l’aide d’une formule d’estimation détaillé dans les procédures expérimentales qui permet de réduire le nombre d’animaux sur des bases statistiques. Le calcul statistique utilisé est fondé sur une estimation classique recommandée par le Comité d’éthique, basée sur la différence attendue de volume tumoral entre groupe contrôle et groupe traité. Le calcul de la taille d’effet repose sur la formule d = (μ0 – μ1) / δ, où μ représente le volume tumoral moyen et δ sa variance. Le nombre d’animaux minimal est ensuite estimé selon la formule n = 16 / d², permettant d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une différence significative.
Raffinement
Des mesures de raffinement rigoureuses sont mises en œuvre afin d’assurer le bien être des animaux tout au long des procédures expérimentales. L’environnement d’hébergement est enrichi par l’ajout systématique de nestlets dans chaque cage, permettant de réduire le stress, favoriser les comportements naturels de nidification et améliorer le confort thermique. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été optimisés afin de minimiser toute douleur ou détresse liée aux interventions. Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale, un agent permettant un ajustement précis de la profondeur anesthésique et un réveil rapide et contrôlé. Une analgésie préopératoire et postopératoire est administrée systématiquement. Afin de détecter précocement d’éventuels signes de souffrance, une grille d’évaluation clinique standardisée est utilisée quotidiennement. Elle regroupe un ensemble de critères physiologiques et comportementaux, chacun noté par un score numérique. La somme de ces scores permet une évaluation objective et reproductible de l’état de l’animal. Le point limite expérimental est fixé à un score total de 4. À la date prévue de fin d’expérimentation (J20), les scores cliniques n’atteignent généralement pas cette valeur, sauf cas exceptionnels. Dès qu’un animal atteint ce seuil, son suivi expérimental est immédiatement interrompu et une mise à mort est réalisée conformément aux procédures réglementaires. La grille clinique repose sur sept critères correspondant à des altérations significatives : distension abdominale liée à la présence d’une masse tumorale importante, amaigrissement marqué avec diminution de la masse au niveau du bassin, dépilation localisée ou généralisée, arrêt du toilettage, apathie et absence d’interaction, apparition d’un comportement agressif inhabituel, et signes de cachexie. Ce système de scoring assure un suivi précis, standardisé et non subjectif des animaux. Il n’a jamais été observé de situation nécessitant l’isolement d’un animal, les symptômes apparaissant selon une cinétique similaire entre individus d’un même groupe.
Choix des espèces
La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux