Maladies infectieuses
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude du rôle d’une nouvelle protéine du système immunitaire dans l’infection à Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Inoculées dans l'abdomen avec une souche de salmonelle qui provoque chez elles une infection généralisée mortelle, 156 souris vont toutes être tuées, 60 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 96 un niveau modéré. Le porteur décrit l'état fébrile, les poils hérissés, le dos recourbé, les écoulements oculaires et la mobilité réduite qui suivent l'infection, et écarte tout traitement de la douleur au motif qu'il modifierait la cinétique de la létalité. L'enjeu est de vérifier si une protéine repérée en culture cellulaire joue le même rôle dans un "organisme vivant intégré et autonome", étape qu'il juge "nécessaire" avant d'envisager des applications contre les bactéries résistantes. Le résumé annonce trois interventions et n'en décrit que deux, l'inoculation et une prise de sang à la joue.
Objectifs
La réponse immune anti-bactérienne dépend de l’activation de récepteurs spécialisés par des molécules bactériennes, résultant en la production de cytokines pro-inflammatoires. Nous avons récemment identifié une protéine, qui participe à une cascade de signalisation de la réponse immunitaire. Nos données in vitro en culture cellulaire indiquent que cette protéine est centrale pour cette cascade de signalisation, notamment lors de l’infection par la bactérie Salmonella. Dans ce projet, nous avons pour objectif d’interroger le rôle de cette protéine dans l’activation de la réponse immune anti-bactérienne durant une infection à Salmonella in vivo. Ce projet répond à la fois à une question scientifique (améliorer notre compréhension de la voie de signalisation de l’immunité innée) mais aussi médicale (la protéine d’intérêt peut-elle être ciblée pour « booster » la réponse anti-bactérienne ? Question d’autant plus importante au vu de l’augmentation du nombre de souches antibiorésistantes.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de comprendre le rôle d’une protéine dans une voie de signalisation de réponse aux infections bactériennes, en utilisant Salmonella comme modèle. Cela va tout d’abord faire progresser la connaissance scientifique en décrivant une voie majeure d’activation de l’immunité chez l’humain. Nos données in vitro avec des cultures cellulaires indiquent que la protéine étudiée participe à cette voie, mais il est nécessaire de questionner ce fait dans un organisme vivant intégré et autonome, ici chez la souris. Il s’agit d’un bénéfice à court terme, obtenu à la complétion du projet. À plus long terme, ce projet ouvre des perspectives cliniques et vétérinaires. En effet, cette voie d’activation de l’immunité est majeure dans le contrôle de l’infection bactérienne, mais aussi dans les pathologies de sur-activation de l’immunité (choc septique). Si ce projet apporte la preuve que la protéine étudiée participe à la la réponse immunitaire in vivo, nous pouvons imaginer des approches thérapeutiques d'activation de cette protéine (dans le cas d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques) ou d’inhibition de celle-ci (dans le cas du choc septique).
Procédures
3 interventions prévues : inoculation d’une bactérie pathogène par voie intra-péritonéale (1 seule fois, moins de 3 min) et prélèvement de sang à la veine submandibulaire (1 seule fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Salmonella Typhimurium cause une infection systémique létale chez la lignée de souris utilisée, reproduisant les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes chez l’homme. Les symptomes suivants apparaissent au cours de l’infection : état fébrile, poils hérissés, dos recourbé, écoulements oculaires, mobilité réduite. La contention peut générer également du stress. L’inoculation par voie intra-péritonéale et la prise de sang dans la veine submandibulaire peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection de l’inoculum et de la prise de sang respectivement.
Devenir
Les animaux de la procédure létalité sont euthanasiés à l’atteinte du point limite. Les animaux qui servent à évaluer le niveau de colonisation des organes et aux prélèvements de sang sont euthanasiés pour faire les prélèvements.
Remplacement
Avant de proposer ce projet, nous avons implementé des approches de remplacement basée sur de la culture cellulaire : 1) Génération d’une lignée de macrophages murins n’exprimant pas la protéine d’intérêt. Il a été observé une perte de la production de cytokines pertinentes et une augmentation de l’infection à Salmonella dans ces cellules comparées aux cellules contrôles. 2) Modèle de sur-expression de la protéine d’intérêt, la production de cytokines pertinentes est augmentée de manière dose-dépendante dans cette lignée. Ces résultats documentent le rôle central de la protéine d’intérêt dans l’activation cytokinique bactério-induite in vitro. Il s’agit maintenant de tester l’importance de la protéine d’intérêt lors d’une réponse immunitaire à l’infection bactérienne in vivo pour démontrer définitivement son rôle essentiel dans un modèle complexe. Il n’existe pas à ce jour de modèle expérimental autre qu’animal récapitulant de manière convaincante une réponse immune.
Réduction
Différents scénari ont été testés avec une ou 2 études pilotes avant l’expérimentation finale. C’est le scénario avec une étude pilote qui utilise le moins d’animaux. L’étude pilote prévue permet de choisir la dose la plus adaptée à notre question scientifique. Elle permet également de déterminer le pic d’infection afin de déterminer les time-points d’autopsies les plus pertinents de l’expérimentation finale. Le nombre d’animaux par lot a été choisi sur la base de la littérature qui montre que 15 souris par lot permettent de voir une différence significative entre les 2 modèles murins que l’on souhaite tester suite à l’infection par Salmonella et sur le calcul de la puissance du test stastistique utilisé lors de la comparaison des résultats obtnenus sur les deux modèles.
Raffinement
Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Les animaux sont hébergés selon les conditions de l’établissement utilisateur agréé, en tenant compte de l’état physiologique des animaux avec contrôle (relevé télémétrique de la température, signes cliniques tels que le poids, l’aspect du faciès et le comportement général) et enregistrement de la température ambiante. Du papier sopalin est utilisé dans les cages de souris comme raffinement au cours de l’expérimentation. Des igloos, tunnels ont été testés il y a plusieurs années mais ils rendent le suivi des symptomes plus compliqués. Il est alors nécessaire de faire sortir les souris pour les observer. Ce « dérangement » des souris malades nous a paru être plus embêtant que le bien-être que peuvent apporter ces structures en début d’expérimentation lorsque les souris vont bien. Nous avons donc choisi de nous en tenir au papier sopalin comme raffinement. L’utilisation de méthode pour réduire la douleur liée à l’infection par Salmonella n’est pas possible car elle modifierait la cinétique d’apparition des symptômes et la cinétique de létalité et ne reproduirait donc plus la maladie.
Choix des espèces
La lignée de souris inoculées avecSalmonella est un modèle d’infection systémique létale naturel qui reproduit les infections systémiques létales observées chez l’homme et causées par S. Typhi, S. Paratyphi A/B/C ou S. Sendai. Ces souris sont naturellement sensibles à l’infection par Salmonella. Ce modèle est donc particulièrement pertinent pour notre étude. Les souris utilisées sont adultes. Elles ont entre 6 et 8 semaines d’âge, et ce, conformément au modèle publié dans la littérature.
Preuve d’efficacité de candidats vaccins contre le virus de fièvre hémorragique de Crimée-Congo chez le macaque cynomolgus (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Dès qu'un point limite est atteint, les macaques sont anesthésiés puis tués. Ils sont douze, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : implantation abdominale d'une sonde de température, vaccination, jusqu'à douze séances de prélèvements sanguins et d'écouvillonnage, puis inoculation intraveineuse du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo et neuf séances supplémentaires. Ce volet décrit le même protocole que le résumé déposé par l'autre établissement, pour les mêmes douze animaux répartis entre deux animaleries, l'objectif étant de comparer trois candidats vaccins entre eux. Trois macaques par groupe sont présentés comme "le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs", le porteur reconnaissant par ailleurs que les tests statistiques "ne pourront pas être tous hautement significatifs".
Objectifs
A ce jour, aucun vaccin ni traitement antiviral spécifique contre le virus CCHF (fièvre hémorragique de Crimée-Congo) n’est disponible. L’objectif de ce projet est de poursuivre le développement de vaccins contre le virus CCHF. Nous avons premièrement testé nos candidats vaccins dans un modèle souris déficientes pour une partie du système immunitaire afin qu’elles puissent présenter des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV (virus de la fièvre hémoragique de Cirmée-Congo). Tous les animaux vaccinés ont survécu à l’infection. Afin de déterminer l’efficacité des vaccins, il faut ensuite démontrer la protection efficace dans un modèle d’infection sans déficience du système immunitaire et présentant naturellement des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV, c’est-à-dire en modèle macaque cynomolgus. Cette expérimentation permettra valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais également de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement spécifique ou vaccin disponible. La vaccination demeure l’approche la plus pragmatique pour enrayer les épidémies à CCHFV. Le but de ce projet est de démontrer que les candidats vaccins ont un pouvoir protecteur après un ou deux immunisations. Le projet met à l’étude des candidats vaccins dont l’innocuité du vecteur a été testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà évalué au cours d’une première phase trois candidats vaccins contre le virus CCHF dans un modèle murin (souris déficientes pour le récepteur aux interférons de type 1). Ce protocole permettra de démontrer leur efficacité et leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus en modèle primate non humain (PNH), seul modèle qui reproduit la pathologie observée chez l’Homme. Parmi les trois candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale, mesurer les taux d’anticorps spécifiques du virus et la réponse cellulaire de l’hôte. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’efficacité des vaccins utilisés dans cette étude sera mesurée selon le taux de survie des animaux vaccinés ainsi que par l’analyse des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus seront comparés à ceux des animaux non vaccinés pour déterminer l’efficacité de chacun des vaccins testés.
Procédures
Dans l'animalerie 1/2, les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (durée de la chirurgie: 30 mn), à 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin, et jusqu'à 12 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux (environ 15 min à chaque session de prélèvements) sous anesthésie générale (J0, 3, 6, 9, 15, 21, 63, 66, 69, 71, 78, 83). Dans l'animalerie 2/2, ils seront soumis à 1 injection intraveineuse du virus puis à 9 écouvillons nasaux et buccaux (environ 5 minutes à chaque session de prélèvements) et 9 prélèvements sanguins (J0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21) (20 à 30 minutes) etsous anesthésie générale (prévues au nombre de 10, d’une durée de 1 à 2h, pour la réception et les jours de prélèvement). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis des prélèvements (sang) ainsi que la mise à mort seront réalisés.
Impact sur les animaux
En animalerie ½, les dommages attendus suite à la chirurgie sont la douleur liée à l’ouverture de la paroi ainsi qu’à la cicatrisation de la plaie. Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement). L’innocuité de cette construction vaccinale a déjà été démontrée, il n’est donc attendu aucun effet secondaire. En animalerie 2/2, les nuisances attendues sont une inflammation locale légère et transitoire au niveau de la zone d’injection du virus et une irritation des muqueuses nasales et buccales suite aux différents prélèvements. Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies générales ce qui peut induire une hypothermie et un stress lié à la contention. Aucun effet n’est attendu pour les animaux vaccinés. Les animaux contrôles non-vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez les humains suite à l’infection par ce virus, à savoir une perte de tonus, une perte de poids, une fièvre et l’observation de signes hémorragiques éventuels.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et/ou vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies). Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Les candidats vaccins utilisés ici ont d’abord fait l’objet de caractérisation in vitro. La réponse immune induite a été testée et une forte réponse a été observée. Dans le cas des fièvres hémorragiques virales dont fait partie la fièvre hémorragique induite par CCHFV, il est impossible de remplacer les modèles animaux afin de réaliser des études sur la physiopathogénèse et les réponses immunitaires dans leur ensemble. Ce projet vise donc à démontrer l’efficacité de candidats vaccins contre l’infection, ce qui nécessite obligatoirement des organismes entiers. De plus, cela s’inscrit dans des études précliniques, indispensables au développement d’un candidat vaccin.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible pour obtenir des résultats interprétables et pertinents. En effet, un effectif de trois animaux par groupe représente le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs. Au-delà de la survie, les groupes seront comparés en fonction des valeurs de score au cours de la maladie, des valeurs des paramètres biochimiques, virologiques et autres paramètres physiologiques. Les tests statistiques ne pourront pas être tous hautement significatifs, cependant, la multiplicité des paramètres évalués permet de démontrer de manière fiable les résultats obtenus. Les précédentes études basées sur des expérimentations utilisant des groupes expérimentaux de 3 animaux ont permis d’obtenir des données et résultats significatifs montrant que la présence ou absence de virémie est un critère essentiel.
Raffinement
Animalerie 1 : - Hébergement : En raison de l’hébergement dans l'animalerie 2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux est mis en place sur tout le site de l’animalerie 1, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement à court, et moyen termes en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : Les animaux seront anesthésiés à chaque intervention, afin de limiter le stress lié à la manipulation ainsi que la douleur aigue liée à la chirurgie d’implantation, et aux injections et prélèvements sanguins répétés (piqure d’aiguille). Les animaux seront sous couverture antalgique durant et suivant la chirurgie d’implantation. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome (Hémoclar). Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu. Animalerie 2 : les conditions réglementaires d’hébergement sont appliquées. Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par 3 dans un milieu enrichi afin de permettre aux animaux de mettre en avant le plus possible un comportement naturel (perchoir, jeu, diversification alimentaire…). Une évaluation quotidienne sera réalisée dès l’infection, et des points limites ont été définis. Cela permettra une fin de procédure expérimentale dès l’atteinte d’un point limite. L’enregistrement permanent de la température permet une meilleure analyse de la maladie. Les animaux sont également suivis grâce aux caméras permettant un contrôle visuel en dehors des horaires de présence du personnel en laboratoire. En cas de doute sur l’état d’un animal, une entrée en laboratoire sera programmée pour procéder à une observation et à une possible décision.
Choix des espèces
Il n'existe pas de modèle d’infection chez le rongeur pour la fièvre de Crimée-Congo qui reproduise la pathologie observée chez l’Homme excepté dans des souris génétiquement modifiées. Ces modèles présentent une susceptibilité plus ou moins prononcée et ne reproduisent qu'en partie la pathogénèse et les réponses immunitaires qui ont lieu chez l'Homme. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans.
Preuve d’efficacité de candidats vaccins contre le virus de fièvre hémorragique de Crimée-Congo chez le macaque cynomolgus (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour implanter une sonde de température, une à deux injections de vaccin, jusqu'à douze séances de prélèvements sanguins et d'écouvillonnage nasal et buccal, puis une injection intraveineuse du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo suivie de neuf nouvelles séances, l'ensemble sous une dizaine d'anesthésies générales de une à deux heures. Les macaques non vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez l'humain, perte de tonus, perte de poids, fièvre et signes hémorragiques éventuels, et les organes des douze sont prélevés après leur mise à mort. Pour ce virus, le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer les modèles animaux et que la démonstration d'efficacité "nécessite obligatoirement des organismes entiers".
Objectifs
A ce jour, aucun vaccin ni traitement antiviral spécifique contre le virus CCHF (fièvre hémorragique de cirmée-Congo) n’est disponible. L’objectif de ce projet est de poursuivre le développement de vaccins contre le virus CCHF. Nous avons premièrement testé nos candidats vaccins dans un modèle souris déficientes pour une partie du système immunitaire afin qu’elles puissent présenter des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV (virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo). Tous les animaux vaccinés ont survécu à l’infection. Afin de déterminer l’efficacité des vaccins, il faut ensuite démontrer la protection efficace dans un modèle d’infection sans déficience du système immunitaire et présentant naturellement des signes cliniques suite à l’infection par CCHFV, c’est-à-dire en modèle macaque cynomolgus. Cette expérimentation permettra valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais également de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement spécifique ou vaccin disponible. La vaccination demeure l’approche la plus pragmatique pour enrayer les épidémies à CCHFV. Le but de ce projet est de démontrer que les candidats vaccins ont un pouvoir protecteur après un ou deux immunisations. Le projet met à l’étude des candidats vaccins dont l’innocuité du vecteur a été testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà évalué au cours d’une première phase trois candidats vaccins contre le virus CCHF dans un modèle murin (souris déficientes pour le récepteur aux interférons de type 1). Ce protocole permettra de démontrer leur efficacité et leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus en modèle primate non humain (PNH), seul modèle qui reproduit la pathologie observée chez l’Homme. Parmi les trois candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale, mesurer les taux d’anticorps spécifiques du virus et la réponse cellulaire de l’hôte. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’efficacité des vaccins utilisés dans cette étude sera mesurée selon le taux de survie des animaux vaccinés ainsi que par l’analyse des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus seront comparés à ceux des animaux non vaccinés pour déterminer l’efficacité de chacun des vaccins testés.
Procédures
Dans l'animalerie 1/2, les animaux seront soumis à une chirurgie d’implantation abdominale d’un dispositif permettant de mesurer la température corporelle en temps réel (durée de chirurgie de 30 min), à 1 à 2 injections intramusculaire du vaccin, et jusqu'à 12 prélèvements sanguins et écouvillons nasaux et buccaux (environ 15 min à chaque session de prélèvements) sous anesthésie générale (J0, 3, 6, 9, 15, 21, 63, 66, 69, 71, 78, 83). Dans l'animalerie 2/2, ils seront soumis à 1 injection intraveineuse du virus puis à 9 écouvillons nasaux et buccaux (environ 5 minutes à chaque session de prélèvements) et 9 prélèvements sanguins (20 à 30 minutes; J0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 et fin de protocole de J28 à 30) et sous anesthésie générale (prévues au nombre de 10, d’une durée de 1 à 2h, pour la réception et les jours de prélèvement). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis des prélèvements (sang) ainsi que la mise à mort seront réalisés.
Impact sur les animaux
En animalerie 1/2, les dommages attendus suite à la chirurgie sont la douleur liée à l’ouverture de la paroi ainsi qu’à la cicatrisation de la plaie. Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement). L’innocuité de cette construction vaccinale a déjà été démontrée, il n’est donc attendu aucun effet secondaire. En animalerie 2/2, les nuisances attendues sont une inflammation locale légère et transitoire au niveau de la zone d’injection du virus et une irritation des muqueuses nasales et buccales suite aux différents prélèvements. Les animaux seront soumis à plusieurs anesthésies générales ce qui peut induire une hypothermie et un stress lié à la contention. Aucun effet n’est attendu pour les animaux vaccinés. Les animaux contrôles non-vaccinés devraient présenter les symptômes décrits chez les humains suite à l’infection par ce virus, à savoir une perte de tonus, une perte de poids, une fièvre et l’observation de signes hémorragiques éventuels.
Devenir
L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et/ou vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.
Remplacement
Il existe désormais des méthodes in vitro, dérivées de la culture cellulaire qui, bien que très prometteuses, restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Les candidats vaccins utilisés ici ont d’abord fait l’objet de caractérisation in vitro. Dans le cas des fièvres hémorragiques virales dont fait partie la fièvre hémorragique induite par CCHFV, il est impossible de remplacer les modèles animaux afin de réaliser des études sur la physiopathogénèse et les réponses immunitaires dans leur ensemble. Ce projet vise donc à démontrer l’efficacité de candidats vaccins contre l’infection, ce qui nécessite obligatoirement des organismes entiers. De plus, cela s’inscrit dans des études précliniques, indispensables au développement d’un candidat vaccin.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible pour obtenir des résultats interprétables et pertinents. En effet, un effectif de trois animaux par groupe représente le minimum absolu permettant des résultats statistiquement significatifs. Au-delà de la survie, les groupes seront comparés en fonction des valeurs de score au cours de la maladie, des valeurs des paramètres biochimiques, virologiques et autres paramètres physiologiques. Les tests statistiques ne pourront pas être tous hautement significatifs, cependant, la multiplicité des paramètres évalués permet de démontrer de manière fiable les résultats obtenus. Les précédentes études basées sur des expérimentations utilisant des groupes expérimentaux de 3 animaux ont permis d’obtenir des données et résultats significatifs montrant que la présence ou absence de virémie est un critère essentiel.
Raffinement
Animalerie 1 : - Hébergement : En raison de l’hébergement dans l'animalerie 2 et d’optimisation de l’étude, les groupes seront composés en trio compatibles. Un programme d’enrichissement spécifique à l’espèce et à l’âge des animaux est mis en place sur tout le site de l’animalerie 1, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Suivi de la température corporelle : Malgré une chirurgie pour la mise en place de l’implant, le fait d’équiper les animaux avec un tel dispositif représente un raffinement à court, et moyen termes en tant que mesure non invasive et paramètre de surveillance dans le cadre des points limites. - Procédures : Les animaux seront anesthésiés à chaque intervention, afin de limiter le stress lié à la manipulation ainsi que la douleur aigue liée à la chirurgie d’implantation, et aux injections et prélèvements sanguins répétés (piqure d’aiguille). Les animaux seront sous couverture antalgique durant et suivant la chirurgie d’implantation. Afin de limiter l’impact des prélèvements sanguins répétés, les sites de prélèvements seront alternés. En cas d’hématome, un autre site de prélèvement sera utilisé et de la pommade sera appliquée sur l’hématome (Hémoclar). Une grille de points limite est mise en place pour détecter tout problème inattendu. Animalerie 2 : les conditions réglementaires d’hébergement sont appliquées. Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par 3 dans un milieu enrichi afin de permettre aux animaux de mettre en avant le plus possible un comportement naturel (perchoir, jeu, diversification alimentaire…). Une évaluation quotidienne sera réalisée dès l’infection, et des points limites ont été définis. Cela permettra une fin de procédure expérimentale dès l’atteinte d’un point limite. L’enregistrement permanent de la température permet une meilleure analyse de la maladie. Les animaux sont également suivis grâce aux caméras permettant un contrôle visuel en dehors des horaires de présence du personnel en laboratoire. En cas de doute sur l’état d’un animal, une entrée en laboratoire sera programmée pour procéder à une observation et à une possible décision.
Choix des espèces
Certains modèles (souris génétiquement modifiées) présentent une susceptibilité plus ou moins prononcée mais ne reproduisent qu'en partie la pathogénèse et les réponses immunitaires qui ont lieu chez l'Homme. Ce projet ne nécessite pas d'exigences particulières concernant le stade de développement des animaux utilisés hormis le fait de former des groupes homogènes en âge et poids pour pouvoir analyser les résultats sans biais. Les animaux utilisés seront des juvéniles sevrés d’au moins 12 mois et de moins de 3 ans.
Elevage des tiques dures sur lapins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
L'objet réel de ce projet est de nourrir avec du sang de lapines vivantes un élevage de tiques que l'unité entretient depuis quinze ans. 10 lapines vont être utilisées sur cinq ans, cinq tuées et cinq adoptées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tiques restent fixées sur leurs oreilles quatre à sept jours, sans anesthésie ni pendant la pose ni les jours suivants, et chaque lapine sert trois fois en quatre mois pour couvrir un cycle complet du parasite. Le devenir dépend du caractère de l'animal, celles que le porteur juge trop agressives seront tuées après avis du vétérinaire, les plus dociles proposées à des particuliers.
Objectifs
L’élevage des tiques est bien établi dans l’unité depuis 15 ans. L’objectif principal de ce projet est d’établir et de maintenir des élevages de tiques qui sont les vecteurs de certaines maladies humaines et animales et d’étudier le rôle des tiques dans l’acquisition et la transmission de certains microorganismes aux humains et aux animaux.
Bénéfices attendus
Cet élevage permettra de maintenir des espèces de tiques nécessaires pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et les vecteurs (tiques) pour la compréhension de la transmission des maladies humaines et animales (zoonose).
Procédures
Une lapine sera utilisée pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (oeufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Les lapines ne sont pas anesthésiées ni durant la pose des tiques, ni les jours suivants. Les tiques restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont dues à la piqure des tiques qui restent fixées sur les oreilles des lapines pendant quatre à sept jours selon le stade de devéloppement de la tique. Cette fixation provoque des lésions peu importantes et parfois des démangeaisons.
Devenir
Les animaux qui sont trop agressifs pour être adoptés et ceux qui auront d’autres anomalies seront euthanasié après avis du vétérinaire de notre laboratoire. Par contre, les animaux en bonne santé et les moins agressifs seront adoptés pas des particuliers.
Remplacement
Les tiques sont des acariens strictement hématophages à tous les stades de développement. Actuellement, aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des tiques n’est disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisé dans notre laboratoire pour gorger les tiques sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire.
Réduction
Un lapin sera utilisé pour un cycle complet de développement de la tique (adulte (œufs)/larve/nymphe/) soit 3 fois sur une durée d’environ 3 à 4 mois. Sachant que les adultes peuvent rester sans manger entre 10 à 12 mois. Un lapin sera donc utilisé 3 fois/an/espèce de tiques. Donc, seulement 2 lapins seront utilisés par an (un pour chaque espèce de tiques de notre élevage) soit 10 lapins pendant la durée totale de ce projet (60 mois).
Raffinement
Pendant la période d’engorgement nous allons proposer le gel Diet Energy de Safe dites qui est un aliment hydraté contenant 63% d’eau. Après engorgement des tiques les oreilles des lapins seront nettoyées avec de la bétadine et les jours suivants jusqu’à guérison des lésions causées par les tiques. Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec des foins, des jouets en bois.
Choix des espèces
Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les trois stades de développement des tiques, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage des tiques au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille des adultes permettra de les manipuler facilement et de nourrir plus de tiques sans utiliser d'animaux supplémentaires. La grande taille des oreilles permet un nourrissage d'un grand nombre d'individus. De plus, cette taille d'oreille nous permet une fixation facile des chaussettes et carcans.
Mieux comprendre la physiopathologie de la dénutrition sévère et son dimorphisme sexuel lors d’interventions probiotiques et vaccinales
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Sevrées à 21 jours puis nourries quatre à huit semaines avec un régime carencé en macronutriments et en micronutriments, des souris juvéniles reçoivent ensuite par gavage des probiotiques, une souche vaccinale, puis une souche bactérienne virulente qui provoque une infection intestinale. 1 140 souris vont être utilisées, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 660 dans des procédures d'un niveau sévère, avec six prélèvements sanguins caudaux par animal. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur écrit pourtant que son modèle "ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance", tout en reconnaissant que la combinaison de la dénutrition et de l'infection peut faire souffrir les souris non vaccinées.
Objectifs
Près d'une personne sur trois dans le monde souffre de malnutrition. L'apparition précoce de la malnutrition a des conséquences désastreuses plus tard dans la vie. Au moment du sevrage, un changement du microbiote intestinal (flore intestinale) se produit et induit une réaction immunitaire qui protège des pathologies futures liées au système immunitaire. La malnutrition entrave ce processus, entraînant une plus grande sensibilité aux maladies non transmissibles, aux infections et une diminution de l'efficacité vaccinale. Développer de manière durable des thérapies nutritionnelles pour contrer la dénutrition est une priorité sanitaire mondiale notamment chez les enfants souffrant de dénutrition sévère aigüe (Severe Acute Malnutrition, SAM). La guérison de la SAM nécessite la prise en compte simultanée des paramètres de croissance, immunitaires et du microbiote intestinal. De par sa complexité, le modèle animal reste incontournable. Récemment, nous avons développé un modèle de SAM chez la souris mâle juvénile qui récapitule fidèlement les principales caractéristiques de la SAM observés chez les enfants. La prépondérance des différences entre les hommes et les femmes dans la malnutrition plaide en faveur de l'inclusion des deux sexes dans la recherche, et lors de la conception de thérapies. Dans notre modèle murin de la SAM, nous avons démontré que le microbiote intestinal et l'immunité intestinale ne sont pas restaurés lors d’une intervention nutritionnelle et ce malgré un retour de croissance. Il faut donc étudier comment restaurer l’ensemble de ces paramètres simultanément. Les probiotiques sont des microorganismes vivants et non pathogènes qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Certaines souches ont démontré leur capacité à limiter les retards de croissance et les infections intestinales. Dans ce projet nous étudierons donc 1/ le dimorphisme sexuel de la SAM, 2/ l’impact de la SAM sur l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection à Salmonella enterica Typhimurium, 3/ la capacité de probiotiques à améliorer la SAM et 4/ la capacité de probiotiques à améliorer l’efficacité vaccinale vis-à-vis d’une infection intestinale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : ce projet permettra l'identification des mécanismes à l'origine des différences entre les mâles et les femelles dans la dénutrition ainsi que la caractérisation de ses effets lors d’interventions vaccinales et probiotiques. Ce projet permettra non seulement de disséquer la pathogénie de la dénutrition mais aussi de fournir les connaissances manquantes pour améliorer les interventions thérapeutiques. Ce projet permettra notamment l’identification de nouvelles thérapies pour restaurer le microbiote intestinal et l'immunité, pour in fine renforcer l’écosystème intestinal général face aux infections et optimiser la formulation des régimes thérapeutiques et des vaccins. Ce projet fera avancer les connaissances dans les domaines de la nutrition, l'immunité, l'infection, la vaccinologie et le microbiote intestinal. Bénéfices à long terme : ce projet fournira des informations importantes pour concevoir des thérapies nutritionnelles adaptées aux garçons et aux filles souffrant de malnutrition. Des stratégies multifactorielles comprenant des probiotiques devraient fournir des approches thérapeutiques durables en favorisant aussi bien la reprise de poids et la croissance, que la maturation du système immunitaire et du microbiote intestinal.
Procédures
Consommation d’un régime alimentaire carencé en macro- et micronutriments durant 4 semaines ou 8 semaines. Prise de poids sur animaux vigiles quotidienne ou hebdomadaire, durée estimée à 2 minutes/souris. Contention des souris associée à l’administration par gavage de probiotiques, de molécules servant à étudier la perméabilité intestinale ou la capacité d’absorption des graisses, d’une solution de glucose (2g/Kg pour suivi glycémique), de souche vaccinale et souche virulente de bactéries causant des infections intestinales sur animaux vigiles : durée estimée à environ 30 secondes/souris (gestes de contention 10 secondes + de gavage 10 secondes). Mise à jeun 4h00 ou sur la nuit : 1 fois durant la procédure. Prélèvements sanguins sous-mandibulaire sur animaux endormis : 1 à 2 fois/souris sous mélange à 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène. Prélèvements sanguins caudaux sur animaux vigiles : 6 fois/souris.
Impact sur les animaux
Le but de ce projet est de suivre l’impact d’une alimentation entrainant une dénutrition sévère sur la physiologie, l’immunité et le microbiote intestinal des individus. Grâce à notre expérience dans ce domaine, nous savons aujourd’hui que notre modèle murin de malnutrition ne présente pas de signe manifeste de souffrance hors un retard de croissance chez les mâles juvéniles. Nous nous attendons à ce que les femelles juvéniles soient moins sévèrement impactées du fait de leur capacité à mieux résister à certaines carences en vitamines. Dans ce projet, nous nous intéressons donc à caractériser les différences entre mâles et femelles lors d’une dénutrition apportée par un régime fortement carencé en macro- et micronutriments. Ces différences seront également étudiées lors d’essais vaccinaux réalisés avant l’infection. L’administration du vaccin ne devrait pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Par contre la combinaison d’une malnutrition et d’une infection intestinale peut engendrer une souffrance liée à une réponse immunitaire faible chez les groupes d’animaux qui n’auront pas été vaccinés. Afin de renforcer le système immunitaire et contrer les effets de la dénutrition, des probiotiques seront également testés chez les souris dénutries et vaccinées. L’administration des probiotiques ne devraient pas induire de souffrance particulière chez les animaux. Des gavages seront également réalisés sur animaux vigiles. Les gestes de contention (10 secondes), de gavage (10 secondes) génère du stress chez l’animal que nous évaluons à environ 30 secondes/intervention de ce type. En fonction de la procédure cette intervention est occasionnelle, hebdomadaire ou quotidienne. De même, nous allons mettre à jeun les souris 4h00 ou sur la nuit ainsi que réaliser des prélèvements sanguins qui généreront également du stress.
Devenir
De par la nécessité de prélever des organes vitaux pour analyses, tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
De nos jours la complexité de l’écosystème intestinal et notamment l’interaction entre système immunitaire et microbiote intestinal ne peut être reproduite in vitro, les organoïdes ne peuvent pas remplacer l’animal dans ce projet. L’étude de la physiologie, de l’immunité et du microbiote intestinal des individus, implique de facto l’utilisation d’animaux.
Réduction
Grâce à un test effectué au préalable sur 6 souris femelles (3 souris sur régime contrôle (Ctrl) + 3 souris sous régime SAM), nous avons pu réaliser un test statistique basé sur la prise de poids hebdomadaire des souris, et calculer l’effectif nécessaire par expérience pour obtenir une puissance du test 80% minimum, avec un risque de se tromper de 5%. Ceci nous amène à un nombre sujets de 5/groupe pour une puissance du test de 81%. Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées. En parallèle des souris femelles, nous allons utiliser certaines souris mâles que nous allons décomptés d’une autre DAP et non de cette DAP. Nous allons également étudier certains paramètres avant la mise à mort des souris, qui seront par la suite mises à mort pour l’analyses d’autres paramètres. Nous aurons donc besoin de 5 souris/groupe. Nous réaliserons 3 expériences indépendantes pour chaque lot de souris enrôlé dans chaque procédure. Le nombre de souris utilisé est justifié au sein de chaque procédure expérimentale, soit 1140 souris. Nous aurons également 60 souris mâles qui seront décomptés dans une autre DAP.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 souris/cage maximum avec la nourriture et l’eau fournies à volonté. Des dômes et du papier seront mis à disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. La température, l’hygrométrie et la photopériode de l’animalerie sont contrôlées et régulées. Nos visites quotidiennes pour la surveillance des souris seront réalisées plutôt en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. La souffrance potentielle induite par ce régime et son impact sur l’efficacité vaccinale sera prise en compte dans le respect du bien-être animal, et les souris seront observées quotidiennement ou 2 fois par jour afin de prévenir l’apparition de points limites : prise alimentaire et poids corporel, signes cliniques (fièvre, respiration), comportement, apparence générale (poils et sécrétions). Des mesures adéquates seront prises pour soulager la douleur comme l’administration éventuelle d’un analgésique.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de caractériser l'impact d'une dénutrition sévère sur la physiologie, le système immunitaire et le microbiote intestinal afin de proposer un régime thérapeutique durable aux enfants souffrant de SAM. Il est maintenant bien reconnu que le système immunitaire et le microbiote intestinal de la souris sont suffisamment proches de celui de l’Homme pour pouvoir utiliser la souris comme modèle avant qu’une transposition ne soit faite chez l’Homme. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement et physiologiquement proche de celui de l’Homme. Aucun autre organisme modèle de petite taille (danio zébré, drosophile) ne possède une telle structure aussi similaire. Par ailleurs, le modèle murin est celui pour lequel les effets de la dénutrition ont été validés chez les souris mâles. Enfin, le modèle infectieux que nous souhaitons utiliser est très bien décrit et étudié chez la souris. L’ensemble de ces critères fait de la souris l’espèce animale la plus appropriée pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris mâles et femelles sevrées à 21 jours afin d’être au plus proche des conditions de développement de la SAM observée chez l’Homme entre trois et 24 mois lors du sevrage. En effet, l’épithélium intestinal des rongeurs est immature à la naissance. L’intestin grêle de la souris continue à se développer après la naissance et sa maturation est fortement associée à la période de sevrage. Le sevrage est donc une étape clef dans la structuration de l’épithélium intestinal, le développement immunitaire et la maturation du microbiote intestinal des rongeurs. Par ailleurs notre étude chez les mâles a montré que la dénutrition induite à 21 jours reproduit les principaux critères de dénutrition décrits chez l’Homme. A cet âge la maturité du système immunitaire, la physiologie et la maturation du microbiote intestinal sont en cours de développement chez la souris, tout comme ça l’est chez l’enfant à bas âge.
Etude de tolérance et de biodistribution d’un nouveau traitement par aérosol chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est pesée tous les jours pendant une semaine, puis placée vigile dans une boîte d'exposition pour un traitement unique par aérosol de 30 à 45 minutes. Aucune n'est infectée, le projet mesurant seulement la tolérance et l'élimination de nouveaux antibiotiques activables par la lumière, l'efficacité étant renvoyée à une autre demande d'autorisation. Le porteur écrit que les études in vitro ne reproduisent pas la complexité du poumon et conclut que l'expérimentation animale reste une étape "incontournable et irremplaçable", tout en annonçant qu'une espèce plus proche de l'humain, le cochon, pourra être utilisée ensuite.
Objectifs
Ce projet vise à répondre à la pénurie d’antibiotiques restants actifs contre les bactéries pathogènes pour l’homme, en particulier celles responsables d’infections respiratoires. Il s’inscrit dans le cadre de l’appel lancé par l’organisation mondiale de la santé (OMS) pour le développement de nouveaux traitements ciblant une liste de bactéries pathogènes multirésistantes. Pour ce faire, de nouveaux antibiotiques activables par la lumière ont été mis au point et leur intérêt démontré en condition in vitro. Cependant, ces études ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organe tel que le poumon ni de récapituler tous les paramètres d’une infection, des tests sur animaux doivent maintenant être effectués. La nébulisation permet de cibler directement les voies respiratoires et d’y atteindre une concentration élevée tout en réduisant la dose à administrer et ainsi les risques d’intolérance et/ou d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est de déterminer si les nouveaux antibiotiques administrés sous forme d’aérosol chez des animaux non infectés sont bien tolérés et de quelle manière ils sont éliminés. Si une bonne tolérance est mise en évidence, l’efficacité pourra ensuite être évaluée (dans le cadre d’une autre demande d’autorisation de procédure) pour le traitement d’infections respiratoires par des bactéries résistantes aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Les composés mis au point pourraient avantageusement compléter les antibiotiques actuellement disponibles, lesquels tendent à perdre en efficacité du fait du développement de résistances chez les bactéries. Le mécanisme d’action des nouveaux composés développés est différent de celui des antibiotiques dits classiques. Il repose notamment sur une activation par la lumière causant de nombreux dommages aux bactéries, limitant ainsi leur possibilité d’adaptation et d’échappement au traitement. Au-delà de ce projet, la stratégie envisagée pourrait être adaptée pour traiter divers pathogènes responsables d’infections graves dans différents tissus et organes, en particulier chez les patients atteints de pneumonie, les grands brûlés, ou les personnes hospitalisées contractant une infection au cours de leur séjour dans un établissement de soins. Ce projet a donc le potentiel d’importantes répercussions économiques et sociales, au profit des patients, de leurs proches et plus généralement de la société dans son ensemble.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à un traitement unique par aérosol dont la durée peut varier entre 30 et 45 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus seront : - Lors des pesées : les animaux pourront subir un stress dû à la contention pour procéder à la pesée laquelle sera effectuée tous les jours pendant 7 jours avant le traitement. Ce stress sera d’environ 30 secondes à chaque fois, son intensité étant estimée légère. - Lors du traitement par aérosol : les souris pourront éprouver un stress lors de l’étape d’aérosolisation dont la durée sera d’environ 30 minutes. Le traitement par aérosol est de gravité prospective modérée.
Devenir
Tous les animaux seront sédatés avant d’être mis à mort à différents temps afin de pouvoir procéder aux prélèvements post-mortem.
Remplacement
De nombreuses études préliminaires ont été menées au laboratoire (en condition dites in vitro) afin de s’assurer, autant que possible, que les composés pourront fonctionner en exerçant les effets souhaités chez la souris. Cependant, les études in vitro ne permettant pas de reproduire la complexité d’un organe tel que le poumon ni de récapituler tous les paramètres d’une infection, l’expérimentation animale (en ayant recours à un modèle pertinent reproduisant la pneumonie survenant chez l’homme) demeure une étape incontournable et irremplaçable.
Réduction
Les études in vitro menées au préalable ont permis de sélectionner des candidats et d’optimiser leur formulation, réduisant ainsi fortement le nombre d’évaluations à conduire chez l’animal. En effet, partant d’une collection de près de 50 composés, 4 composés ont été sélectionnés à ce stade pour être évalués in vivo. En outre, le nombre d'animaux est fixé au minimum en veillant à ne pas mettre en péril l'obtention de résultats exploitables ni compromettre les objectifs et chance de succès du présent projet.
Raffinement
La procédure sera enrichie par une phase d'habituation réalisée avant la nébulisation. Pour cela, une semaine avant le traitement par aérosol, les souris seront chaque jour transférées dans la boite d’exposition pendant 10 à 15 minutes, le temps d’être pesées avant d’être remises dans leur cage d’hébergement. Ceci permettra d’établir leur courbe de croissance avant traitement tout en habituant les animaux à la boite d’exposition. Un renforcement positif (par récompense de nourriture (beurre de cacahuète)) sera effectué après chaque pesée dans le but de réduire le stress pour les animaux. Des points limites ont été définis afin d'observer d’éventuelles nuisances et mettre en place un traitement analgésique approprié.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent en première approche pour cette étude. Des animaux âgés de 8 à 10 semaines (poids 20-25 g) seront utilisés, comme dans d'autres études sur la pneumonie aigue. Les affections respiratoires humaines peuvent affecter des sujets jeunes comme plus âgés. Les effets du vieillissement sur le système respiratoire entraînent une diminution progressive des performances fonctionnelles, notamment une baisse du débit expiratoire de pointe, de l’échange de dioxyde de carbone et d’oxygène, ainsi que de la capacité vitale. Cependant, les jeunes peuvent également être touchés par des infections respiratoires telles que la pneumonie. La pneumonie est l’une des premières causes de mortalité infantile dans le monde. Il est donc essentiel de prendre des mesures pour toutes les tranches d’âge. Par la suite, selon les résultats obtenus avec cette DAP, il pourra être envisagé des expérimentations sur une espèce animale plus proche de l’humain du point de vue de son système respiratoire, en particulier le cochon.
Alphavirus : Etude de la réponse immunitaire en modèle murin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Les alphavirus étudiés n'infectent pas naturellement les rongeurs et les souris immunocompétentes ne développent aucun symptôme, aussi le protocole commence par les priver de leur immunité innée par injection d'un anticorps, ce qui les rend capables de développer des pathologies sévères. 1 614 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune est anesthésiée pour l'injection de l'anticorps, puis 24 ou 48 heures plus tard pour l'inoculation du chikungunya, du virus Mayaro ou du O'nyong-nyong, parfois réinfectée à distance, et subit deux prélèvements sanguins à un jour d'intervalle. Toutes les survivantes sont tuées à la fin de chaque procédure parce que les manipulations se font avec un virus infectieux, et le porteur annonce que ces résultats serviront d'abord à monter des expériences chez le primate non humain.
Objectifs
Les alphavirus causent des pathologies aiguës et chroniques chez l'homme, incluant des formes persistantes et débilitantes dans le cas du virus Chikungunya (CHIKV) qui s’est récemment répandu en Amérique et affecte des millions de personnes dans le monde. CHIKV est un virus qui co-circule avec des alphavirus autochtones antigèniquement proches, notamment le virus Mayaro (MAYV) en Amérique Latine et le virus O’nyong nyong (ONNV) en Afrique. Les connaissances sur les relations immunitaires liant ces alphavirus sont actuellement limitées mais pourtant nécessaires à la mise en place de programmes vaccinaux. Ce projet permettra, à travers l’utilisation de modèles murins d’infections maîtrisées, d’obtenir des données sur l’immunité croisée entre ces alphavirus.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet amélioreront profondément la compréhension de l’immunité croisée entre ces alphavirus. Ils seront dans un premier temps utilisés pour mettre au point des expériences chez le primate non humains et, à plus large échelle, seront précieux pour la mise en place et la sécurité des futurs programmes de vaccination contre ces menaces émergentes pour la santé humaine.
Procédures
Les animaux, anesthésiés au préalable, seront immunodéprimés transitoirement grâce à l’injection d’un anticorps. Cette intervention durera en moyenne 3 minutes pour chaque animal (anesthésie + injection de l’anticorps). 24 ou 48h plus tard, les animaux anesthésiés seront soit infectés par un alphavirus (Chikungunya, Mayaro ou O’nyong-nyong) soit injectés par du sérum convalescent. Dans les deux cas, cette intervention durera en moyenne 3 minutes pour chaque animal (anesthésie + injection virus ou sérum). Dans certains cas, les animaux seront de nouveau infectés par un alphavirus à distance de la première infection (ou de l’injection de sérum), selon les mêmes modalités techniques et temporelles. Enfin, certains animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin, qui durera en moyenne 4 minutes (anesthésie + prélèvement). Sur chaque animal, au total 2 prélèvements sanguins seront réalisés à un jour d’intervalle (1 seul prélèvement par jour).
Impact sur les animaux
Les alphavirus CHIKV, MAYV et ONNV utilisés dans cette étude n’infectent pas naturellement les rongeurs. Les souris immunocompétentes ne développent pas de symptomes lors d’une injection de ces virus. Ainsi, l’injection d’anticorps anti recepteurs de l’Interféron (IFNAR1) qui entraine une suppression transitoire de l’immunité innée. Les souris ayant reçue ces anticorps peuvent développer des pathologies sévères.
Devenir
Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les études sur la protection immunitaire, notamment dans le cadre de la production de vaccins, necessitent de recueillir des sérums immuns pour étudier l’immunité contre certains virus. Ainsi l’utilisation d’êtres vivants (animaux de laboratoires) est indispensable à ce type d’études. Ils permettent de reproduire l’infection naturelle par un virus et d’évaluer l’immunité croisée induite par celle-ci chez un animal vivant notamment via la réalisation d’expériences de challenge.
Réduction
Les effectifs ont été calculés grâce au logiciel de statistiques, ainsi nous avons déterminé les effectifs suivants : - 4 souris par lot pour les groupes non infectés - 6 souris par lot pour les groupes infectés - 8 souris par lot pour les groupes infectés par deux virus pour les expériences de challenge
Raffinement
Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront anesthésiés avant toute inoculation de virus, administration d’anticorps ou prélèvement sanguin. D’autre part, un traitement analgésique sera administré chez les souris présentant une altération sévère de l’état général (évaluée grâce à une grille de score). Par ailleurs des points limites adaptés ont été choisis afin de détecter précocement ce type d’atteinte. Après une période d’acclimatation de 6 jours, les animaux seront hébergés en cage enrichie par un « aspen brick » et des « paper shaving » et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation.
Choix des espèces
Au vu de l’état de l’art rapporté dans la littérature, Mus musculus est le modèle de référence pour l’étude des alphavirus (via l’utilisation d’anticorps anti recepteurs de l’Interféron). Les expériences seront réalisées sur des souris adultes pour minimiser la variabilité due à l’immaturité du système immunitaires des jeunes animaux. Les souris seront reçues entre 6 et 8 semaines de vie.
Etude de la réponse immunitaire induite après administration nasale d’un candidat vaccin anti-paludique en modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vigiles et maintenues en contention, 350 souris reçoivent trois instillations nasales et subissent quatre prises de sang en six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le candidat vaccin nasal testé cible le paludisme, l'enjeu étant de mesurer la réponse immunitaire déclenchée dans la rate et le foie. Le porteur affirme qu'aucune vaccination ni aucune prise de sang n'a jamais produit d'effets indésirables au laboratoire, avant d'admettre dans la même rubrique que la contention peut stresser les souris et les prélèvements provoquer un hématome et une douleur. Toutes sont tuées au bout de six semaines pour prélever les organes où se joue cette réponse.
Objectifs
Le paludisme est une maladie parasitaire responsable de 241 millions de cas et de 627 000 décès estimés dans le monde en 2020. Les deux vaccins candidats recommandés par l'OMS, affichent une efficacité modérée et un calendrier de vaccination contraignant nécessitant le développement de nouveaux candidats vaccins affichants une efficacité protectrice d'au moins 75 % d'ici 2030 (OMS). Le paludisme a un cycle de vie complexe impliquant l'invasion et le développement à l'intérieur des hépatocytes et des érythrocytes de l'hôte mammifère. A chaque étape de son cycle de vie, le parasite à travers ses différentes formes exprime de nombreuses protéines qui peuvent être la cible de candidats vaccins contre le paludisme. Ces dernières années, l'équipe a développé un candidat vaccin sous-unitaire administré par voie nasale en utilisant des nanoparticules. Celui-ci induit des réponses immunitaires humorales et cellulaires aux niveaux systémique et muqueux assurant une protection. L’équipe souhaite sur la base de cette expertise développer un vaccin contre le paludisme qui induit des réponses humorales et cellulaires au niveau systémique, et hépatique. Des travaux récents, en modèle d’hépatite B, ont montré que seule la vaccination nasale avait la capacité d’induire une réponse cellulaire hépatique en comparaison d’une immunisation systémique renforçant l’intérêt de la voie nasale comme une solution pertinente. Pour ces raisons, nous proposons de développer un vaccin nasal contre le paludisme, et valider l’induction d’une réponse immunitaire protectrice systémique au niveau splénique et hépatique.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre le paludisme actuellement les plus avancés et recommandés par l'OMS montrent une efficacité d'environ 45 % et 66% respectivement qui reste insuffisante notamment pour protéger les enfants âgés de 5 à 17 mois au cours de la première année après la vaccination. Il est donc urgent de développer un vaccin plus efficace, éventuellement pour compléter ces deux vaccins. Dans ce but, nous proposons d'utiliser une nouvelle plateforme vaccinale qui a montré des résultats prometteurs. La capacité du candidat vaccin à induire une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire systémique et hépatique forte spécifique de Plasmodium pourrait être d'un grand avantage pour un vaccin antipaludique. De plus, si notre calendrier vaccinal à trois immunisations par voie intranasale montre des réponses immunitaires robustes, ce sera une grande avancée dans la recherche sur le vaccin antipaludique. En effet, les vaccins dénommés RTS,S et R21/Matrix-M™ sont proposés sous la forme d'un schéma à quatre doses chez l'enfant à partir de 5 mois ce qui est une organisation difficile dans les pays endémiques (aiguille stérile, personnel médical). De plus, cibler différentes étapes du cycle de vie du parasite pourrait aider à compléter des candidats vaccins plus avancés et permettre d'augmenter la protection si peu de parasites parviennent à échapper à l'immunité hépatique.
Procédures
Les animaux subiront tous 4 prises de sang à J0, J14, J28 et J42. 3 instillations par voie nasale à J0, J14 et J28. Les prises de sang et les instillations/injections ne durent que quelques secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
A ce jour dans le laboratoire, aucune des expériences de vaccinations utilisant des antigènes, ni aucune prise de sang n'a produit d'effets indésirables sur les animaux d'autant plus que les gestes sont très bien maitrisés. Cependant, il est possible que les contentions engendrent du stress, les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur légère au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à J42 de façon à pouvoir étudier les réponses immunitaires induites par les différents types de vaccination notamment les réponses immunitaires hépatiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Les résultats obtenus précédemment avec un extrait total du parasite supporte la preuve de concept qu'une immunisation par voie nasale est capable d'établir une réponse immunitaire hépatique. Afin de poursuivre cette étude, dans une stratégie de vaccin sous-unitaire nous allons dans un premier temps tester plusieurs protéines du parasite pour savoir lesquelles sont les plus immunogènes. Pour chaque protéine utilisée nous constitueront un groupe de 10 souris (5 mâles + 5 femelles). Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données, notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Des tests statistiques ainsi qu'une analyse de normalité seront effectués.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Une surveillance accrue sera effectuée à la suite de chaque procédure afin de détecter au plus tôt les points limites définis pour chaque procédure. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Un enrichissement positif ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid.
Choix des espèces
Le modèle d'étude d'un candidat vaccin administré par voie nasale est déjà établi chez la souris dans le laboratoire. De plus, l'espèce de souris retenue est décrite dans la littérature comme le modèle de référence permettant l'étude des réponses immunitaires hépatiques. Tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Des souris adultes sont utilisées car leur système immunitaire est complètement développé. Ce modèle murin permettra la preuve de concept de l’induction d’une réponse immunitaire systémique splénique et hépatique suite à une vaccination par notre candidat vaccin sous-unitaire par voie nasale avant de passer sur un modèle d’infection adapté.
Impact d’une infection secondaire bactérienne ou fongique chez la souris immunodéprimée suite à un sepsis.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux injections de Busulfan pour détruire la moelle osseuse, une injection de bactéries dans l'abdomen, cinq jours d'antibiotique, sept jours de gavage, puis une instillation de staphylocoque ou d'aspergillus directement dans la trachée : 714 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une perte de poids et un score de grimace augmenté après l'induction du sepsis, puis un nouvel affaiblissement après l'infection pulmonaire. L'objectif est d'observer la réponse immunitaire d'animaux déjà immunodéprimés face à une seconde infection, et d'évaluer un complément alimentaire. Il affirme que l'accès aux organes est "indispensable", ce qui exclut de garder les souris en vie, et retient un modèle murin d'immunodépression chimique qu'il décrit comme "connu et bien caractérisé".
Objectifs
Les infections abdominales sont fréquentes et appelées en fonction de la gravité sepsis ou choc septique. Ces infections sont responsables de nombreuses hospitalisations en soins intensifs. Cet état de sepsis entraîne une dysfonction du système immunitaire propice à l’acquisition d’infections nosocomiales. Ces dernières sont responsables de la majorité des décès observés en réanimation pouvant survenir plusieurs jours voire semaines après l’admission des patients. Une grande majorité des patients hospitalisés en réanimation présente une altération du système immunitaire pouvant être provoqué par des traitements pré-greffe de type chimiothérapie, les exposant ainsi aux infections d’origine digestive. Ces infections sont généralement liées à une diminution du nombre de lymphocytes à l’origine d’une translocation bactérienne dans le sang. Une connaissance plus approfondie des modifications immunologiques induites par le sepsis au long cours chez des souris préalablement immunodéprimées permettrait de reproduire au mieux ce qui se produit chez l’Homme et ainsi de mettre en place des stratégies thérapeutiques chez les patients immunodéprimés hospitalisés en soins intensifs pour sepsis ou choc septique afin d’améliorer leur pronostic. Ainsi ce projet de recherche a pour but d’évaluer, chez des souris préalablement immunodéprimées, la réponse du système immunitaire lors d’une infection secondaire plusieurs semaines après la résolution du sepsis ainsi que d’évaluer le rôle d’un complément alimentaire sur la restauration du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient déboucher sur une meilleure compréhension des liens entre immunodépression induite et infection secondaire plusieurs semaines après traitement d’un sepsis abdominal.
Procédures
L’induction de l’immunodépression induite chimiquement par injection de Busulfan nécessitera une injection une fois par jour pendant deux jours en intrapéritonéal (i.p.) sur animal vigile après contention, ce geste sera réalisé en moins d’une minute. L’induction du sepsis sera réalisée sur animal vigile après contention par une seule injection en i.p. d’une quantité de bactéries commensales bien définie, ce geste sera réalisé en moins d’une minute. Les animaux vigiles après contention recevront un traitement antibiotique en i.p. une fois par jour pendant 5 jours, l'injection durera moins d'une minute. L’immunonutrition sera réalisée sur animal vigile après contention à l’aide d’une canule de gavage une fois par jour pendant 7 jours, ce geste est réalisé en moins d’une minute. Les animaux vigiles recevront en s.c. une fois par jour une injection permettant leur réhydratation seulement quand cela est nécessaire, cette injection durera également moins d'une minute et sera réalisée en même temps que l’injection d’antibiotique évitant ainsi une double contention de l’animal le même jour. L’induction de la pneumopathie par Staphylococcus aureus ou Aspergillus fumigatus, nécessitera l’anesthésie des animaux par anesthésie gazeuse d’environ 5 minutes durant lesquelles les animaux recevront une suspension bactérienne par instillation intratrachéale.
Impact sur les animaux
L’injection de Busulfan et le sepsis seront réalisés par injection intrapéritonéale sur animal vigil après contention. Ces gestes peuvent induire du stress chez l’animal. L’injection de Busulfan va induire un affaiblissement de l’animal dû à la myéloablation provoquée par ce traitement qui se traduit par une perte de poids de l’animal durant 2 jours avant reprise progressive de la masse perdue. Aucun autre signe clinique n’est visualisé après ce traitement. Le sepsis va induire un affaiblissement de l’animal se traduisant par une perte de poids et un score de grimace augmenté. L’immunonutrition sera réalisée par gavage sur animal vigil après contention. Ce geste peut induire du stress chez l’animal. L’instillation de la suspension bactérienne ou fongique va engendrer un affaiblissement et une perte de poids de l’animal.
Devenir
Afin d'évaluer les conséquences de l'infection induite sur les animaux immunodéprimés, l'accès aux organes d'intérêts ainsi qu'aux fluides biologiques est indispensable, nous ne pouvons donc pas garder les animaux en vie.
Remplacement
L'évaluation de l'impact du sepsis chez la souris immunodéprimée nécessite l’accès aux organes d’intérêt pour évaluer les conséquences de cette infection. Ceci n’est absolument pas reproductible in vitro et c’est pourquoi le recours à des animaux est indispensable pour le développement de ce type de modèle.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos précédents projets ayant eu pour objectifs de caractériser les dysfonctions immunitaires suite à un sepsis nous ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise à la fois sur le développement d'infections abdominales et sur le développement de modèle murin d’immunodépression, ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux pour la mise en place de cette étude. Les tests statistiques utilisés seront des tests non pairés non paramétrique (Mann-Whitney) pour les comparaisons de groupes deux à deux et de la réalisation d’un test ANOVA (Dunn’s test) lorsque plus de deux groupes seront comparés.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. L'utilisation d’analgésiques permettra d’éviter toute souffrance aux animaux. De plus, l’évaluation régulière du score de grimace des animaux et le suivi de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé.
Choix des espèces
Ce modèle de souris permettra de caractériser l’affaiblissement du système immunitaire induit par une infection abdominale chez des souris immunodéprimées au long cours et ainsi d’étudier la réponse du système immunitaire face à une seconde infection. Ce modèle nous permettra ainsi de caractériser la paralysie du système immunitaire survenant sur plusieurs semaines. Le développement d'une immunodépression suivi d’une infection abdominale puis d’une infection pulmonaire n'est pas reproductible in vitro car il touche le système immunitaire dans son ensemble. De plus, le modèle murin d’immunodépression induite par traitement chimique est un modèle animal connu et bien caractérisé et le développement d'infections abdominales et pulmonaires ont récemment été développées et caractérisées au sein de notre laboratoire. La très grande majorité des travaux scientifiques réalisés utilise des souris de 9 à 10 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature.
Activité in vivo de copolymères synthétiques dégradables dans des modèles de souris de pneumonie et de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant au moins neuf gestes : trois administrations directement dans la trachée, une injection intraveineuse sous anesthésie générale et cinq injections dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, l'infection déclenchant une pneumonie ou un sepsis avec une perte de poids que le porteur annonce inférieure à 10 % et limitée à deux jours. Des copolymères synthétiques dégradables sont testés là comme candidats antibiotiques, dans un contexte de résistance bactérienne croissante. Le porteur écrit que les procédures n'entraînent aucune douleur résiduelle, tout en prévoyant jusqu'à quatre injections de morphinique selon l'état des animaux.
Objectifs
Les infections restent la 3ème cause de mortalité dans les pays développés et la 2nde au niveau mondial. En pratique clinique, on assiste au déclin inexorable de l’activité des antibiotiques disponibles en raison de la capacité des bactéries à développer des mécanismes de résistance contre l’ensemble des molécules disponibles à l’heure actuelle. L’augmentation continue de la résistance bactérienne implique de poursuivre le développement de nouvelles options thérapeutiques en favorisant la création de nouvelles classes de molécules antibactériennes. Les objectifs de ce projet sont donc : 1) d’évaluer l’activité de nouveaux copolymères synthétiques dans un modèle expérimental de pneumonie (infection locale). 2) d’évaluer l’activité de nouveaux copolymères synthétiques dans un modèle expérimental de sepsis (infection systémique). 3) d’identifier un composé appartenant à une nouvelle classe d’antibiotiques possédant une activité prometteuse in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : 1. Il permettra de mieux appréhender la corrélation entre l’activité in vitro et in vivo de copolymères synthétiques dégradables. 2. Il permettra d’évaluer l’activité in vivo de nouveaux composés antibactériens dans un modèle d’infection locale et dans un modèle d’infection systémique. 3. La finalité de ce projet est d’identifier une molécule candidate afin de poursuivre son développement pré-clinique. 4. Enfin, l’ambition de ce projet est de démontrer l’intérêt d’une nouvelle classe de molécules antibactériennes (copolymères dégradables synthétiques) dans un contexte de combat contre la résistance antibactérienne.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à trois administrations intra-trachéales, une administration intraveineuse sous anesthésie générale, et à 5 injections intrapéritonéales. En fonction de l’état général des animaux et si nécessaire, une ou plusieurs injections (de 1 à 4) sous-cutanées de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Toutes ces interventions ont une durée inférieure à une minute.
Impact sur les animaux
Les modèles aigüs d’inflammation (locale ou systémique) sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse bactériologique.
Remplacement
Dans ce projet, une présélection rigoureuse des molécules candidates a été réalisée à l’aide de différentes techniques in vitro afin de limiter au maximum le nombre de molécules à tester in vivo. Malgré tout, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre activité in vitro (paramètres contrôlés) et in vivo (paramètres variables) après l’infection nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une validation approfondie de l’activité de nouvelles options thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Un test statistique sera utilisé et une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale (modèle de pneumonie), la sonde de gavage est préalablement enduite d’un analgésique afin d’anesthésier localement la trachée. De même, lors de l’injection rétro-orbitale, une administration de morphinique sera réalisée afin de prévenir tout risque de douleur et de stress.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une bonne corrélation des résultats à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser et valider l’activité de nouvelles options thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 2 mois). À ce stade, le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.
Etude de l’effet d’une infection bactérienne sur une voie de l’immunité innée chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une sonde de température est implantée sous la peau de chaque souris, qui reçoit ensuite dans la veine de la queue une injection de bactéries pathogènes. 176 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatorze jours d'infection sont résumés à une "variation de température", alors que le raffinement prévoit d'administrer des analgésiques en cas de baisse trop forte de la température corporelle. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur donnant pour seule raison qu'elles auront été infectées par des bactéries pathogènes.
Objectifs
La pyrine est un composant de l'immunité. La pyrine est activée lors de certaines infections bactériennes et déclenche une réaction inflammatoire (variation de température) qui permet de lutter contre ces infections. A ce jour, les mécanismes d'activation et de régulation de la pyrine lors d'infections est peu compris. Le but de ce projet est de mieux décrire les mécanismes d'activation et de régulation de pyrine lors d'infections bactériennes dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices scientifiques de ce projet : progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de pyrine et sur l’utilisation d’un modèle murin pour modéliser l’activation de pyrine lors d’une infection. L'inflammasome pyrine étant associé à des maladies génétiques chez l'homme (la fièvre méditerranéenne familiale entre autres), l'utilisation d'un modèle murin humanisé pourra nous permettre de développer de nouveaux traitements pour ces maladies génétiques.
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse qui durera 30secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée qui durera 30 secondes d'une sonde de température, certains animaux pourront recevoir une injection sous cutanée de qui durera 30secondes d'analgésique.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles, mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Pendant les 14 jours d’infection, les souris pourront ressentir les effets de l’infection (variation de température).
Devenir
Les animaux auront été infectés par des bactéries pathogènes, ils seront donc euthanasiés
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaire déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. Les modèles in vitro étudient la réplication de bactéries dans un seul type cellulaire dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôtes-pathogènes rencontrées lors d’une infection.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Nous prévoyons 5 animaux par lot de génotype et de souche d’infection, 3 animaux par lot contrôle pour les analyses post-mortem. Les nombres d’animaux sont calculés au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Utilisation d’implants pour prendre la température (la pose de l’implant est plus invasive mais cela permettra de rendre les prises de température moins intrusive) 3) Anesthésie gazeuse lors de la pose de l'implant de température 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) L'utilisation d'analgésiques en cas de trop forte baisse de température corporelle des animaux suite à l'infection. Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées humanisées, KO (délétion de gènes) et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Par ailleurs, les animaux portant un gène humanisé nous permettront de savoir si les réponses observées in vitro sont transposable à l’échelle de l’organisme. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.
Évaluation de substances à visée thérapeutique contre l’infection par Klebsiella pneumoniae.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Les souris prostrées, anorexiques plus de deux jours ou ayant perdu 20 % de leur poids sont mises à mort. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, infectées par Klebsiella pneumoniae par voie intranasale sous anesthésie. Le porteur écrit que la nuisance résultera principalement de l'infection, une broncho-pneumonie avec fièvre "dont l'issue sera fatale après une phase de septicémie", et que le suivi guette le poil ébouriffé, les yeux collés et la prostration. Une partie des animaux reçoit quatre jours d'injections de peptides antimicrobiens mis au point par des partenaires, l'efficacité se mesurant à la survie des souris infectées, et toutes sont tuées à la fin parce qu'elles ne seront plus, écrit-il, "naïfs immunologiquement".
Objectifs
Klebsiella pneumoniae est une bactérie responsable de la Klebsiellose, une maladie potentiellement mortelle prenant la forme d’infections nosocomiales et communautaires (entre autres des pneumonies, infections urinaires, septicémies). K. pneumoniae fait partie des bactéries présentant un fort taux de résistance aux antibiotiques et est considéré comme une plaque tournante dans l'acquisition et la transmission de résistances aux antibiotiques. Elle fait partie des pathogènes identifiés critiques par l'OMS pour lesquels de nouvelles solutions thérapeutiques sont nécessaires. La résistance aux antibiotiques des bactéries représente un problème majeur de santé publique en France et à travers le monde. La progression du nombre d’infections est plus rapide que celle du développement d’antibiotiques nouveaux. Face à ce risque d’impasse thérapeutique, il est essentiel de chercher et développer de nouvelles approches antibactériennes. Nous allons utiliser un modèle établi de Klebsiellose pulmonaire pour évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux peptides antimicrobiens développés par nos partenaires D’une part leur capacité thérapeutique sera évaluée en suivant la survie d’animaux infectés mais traités par injection de peptides. La dose optimale sera déterminée. Pour compléter cette approche, la charge bactérienne dans les poumons sera mesurée dans une 2ème procédure afin de préciser l’activité bactéricide des peptides in situ.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques efficaces contre la bactérie Klebsiella pneumoniae. Le travail sera fait chez la souris pour qu’ensuite les agents thérapeutiques puissent être développés pour l’homme. Le besoin est important avec l’émergence de nombreuses Klebsiella résistantes aux antibiotiques.
Procédures
- Instillation intranasale sous anesthésie (5 minutes par animal, une seule fois). - Infection par voie intranasale (une fois par animal, suivi sur plusieurs jours) - Injection des agents testés par voie intrapéritonéale / intra-veineuse (2 minutes, une fois par jour/animal pendant 4 jours).
Impact sur les animaux
La nuisance résultera principalement de l’infection, une broncho-pneumonie avec fièvre, dont l’issue sera fatale après une phase de septicémie. Les animaux sont aussi susceptibles de ressentir une légère douleur, liée aux injections de peptide sans impact significatif sur leur bien-être ou leur état général.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne seront plus naïfs immunologiquement, et présenteraient un risque de porter la klebsiellose et ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Les tests préliminaires in vitro sur cellules permettront de réduire l’usage des animaux aux agents intéressants : tous les peptides antimicrobiens testés auront montré une capacité à tuer la bactérie in vitro. Toutefois, les infections bactériennes induisent des processus pathologiques complexes impliquant de multiples organes et le système immunitaire dans son ensemble (organes divers, relations entre organes, circulation sanguine et lymphatique, multiples populations cellulaires et mécanismes effecteurs). L'action des agents antibactériens ne se limite donc pas à une action simple sur la bactérie et doit tenir compte de la complexité de la pathologie. C'est pourquoi aucun modèle non-animal ne peut remplacer l'animal pour évaluer des agents thérapeutiques.
Réduction
Les procédures seront optimisées : - regroupement des expérimentations de façon à limiter les groupes d'animaux témoins nécessaires. - étude simultanément du sang et des poumons sur chaque animal, Les groupes (traité, non traité) seront comparés par différents tests. Le test exact de Fisher sera utilisé pour comparer la survie des groupes (naïf, vacciné) exposés à la Klebsiellose. Des modèles statistiques pourront être utilisés afin de prendre en compte d'éventuels effets techniques liés à la cage et aux répétitions. Le détail des statistiques est décrit dans les procédures. Le nombre d’animaux indiqué a été obtenu par un calcul de puissance statistique en collaboration avec un biostatisticien, et est basée sur le nombre minimum d'animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement robustes et reproductibles. Les tests préliminaires in vitro permettront de réduire l’usage des animaux aux agents intéressants.
Raffinement
Des points limites spécifiques et précoces sont mis en place afin de minimiser la douleur et la souffrance. Durant les infections, un suivi quotidien des animaux sera opéré tout au long de l’expérience pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précède généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales (dépôt jaunes collants fermant en partie les yeux, possiblement liés à la fièvre et la déshydratation), comportement prostré. Dès l’apparition des signes cliniques des actions seront mises en place : mise à disposition de nourriture gel hydrique, réhydratation sous-cutanée. Des points limites spécifiques et précoces sont mis en place afin de minimiser la douleur et la souffrance : les animaux présentant un état pathologique (prostration/ absence de réactions, anorexie >2 jours) ou perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial) seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont sensibles à l’infection pulmonaire par Klebsiella pneumoniae et l’infection se développe chez la souris avec des cinétiques, signes cliniques et léthalités comparables à celles de l’infection humaine. C’est donc le modèle d’étude pré-clinique le plus utilisé pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les souris sont utilisées à l'âge de 7-14 semaines afin d’être représentatifs de l’espèce à l’âge adulte. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.