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Mécanismes l’infection et de la transmission de Plasmodium
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 125
Quinze à trente minutes de piqûres de moustiques sur un animal profondément anesthésié, une ponction cardiaque, ou une perfusion du foie qui tue: 5 025 souris et 125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 d'entre eux anesthésiés et tués avant tout réveil. Infectés par une injection unique, ils subissent ensuite une ponction quotidienne de la queue pendant sept jours au maximum, jusqu'à ce que la parasitémie voulue soit atteinte. L'objet est d'amplifier un parasite du paludisme murin pour étudier ses formes dormantes dans le foie, le porteur écrivant que la souris et le rat servent de "simples flacons de culture cellulaire" à une étape du cycle parasitaire, et reconnaissant que le projet "ne comporte pas de considérations statistiques". Les rats sont retenus pour le volume de sang qu'ils fournissent, et les animaux sont inoculés à trois ou quatre semaines parce qu'ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de comprend la biologie du parasite Plasmodium et de ses interactions avec l'hôte, en particulier dans le foie. Le foie est le premier organe humain ciblé par les parasites du Paludisme dès leur entrée dans le corps par la piqûre de moustiques Anopheles infectés, où une première phase d'amplification massive aura lieu avant que les parasites matures ne soient libérés dans le sang pour causer la maladie. Le foie est également le réservoir des formes dormantes du parasite, qui provoquent des rechutes et maladie chronique. Malgré son importance reconnue pour les stratégies d'éradication, le développement de médicaments antipaludiques ciblant les formes hépatiques du parasite est entravé en raison de l'accès limité aux échantillons de parasites et aux moustiques infectés avec des souches humaines. Le modèle murin de paludisme surmonte ces limitations et permet de recréer l'ensemble du cycle de vie du parasite dans un environnement in vivo. Le projet concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons : 1) identifier les mécanismes moléculaires codés par les parasites impliqués dans l'induction et le maintien de la dormance, de l'activation et de la conversion sexuelle dans le foie, et 2) établir les relations bidirectionnelles entre le métabolisme de l'hôte et les développements cellulaires distincts du parasite et leur impact sur les résultats des traitements. Ce projet révélera les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dormance, aux rechutes et à la transmission des parasites du paludisme, et posera les bases du développement futur de biomarqueurs et nouvelles thérapies ciblant les réservoirs d'infection hépatique.
Procédures
Les animaux vigiles sont infectés par une injection unique. Une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue par ponction avec une aiguille à usage unique. Ce prélèvement est effectué quotidiennement, sur animal vigile, généralement à partir du troisième jour après l’injection et pour une durée maximale de 7 jours et nécessite moins d’une minute pour être réalisé. Lorsque la parasitémie désirée est atteinte, les animaux pour des prélèvements sanguins (par les moustiques pendant 15 à 30 minutes ou par ponction cardiaque). Les animaux non infectés utilisés pour la perfusion de foie sont profondément anesthésiés avant de procéder à la perfusion qui est létale.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences, les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à des injections ou à des prélèvements sanguins. Ces effets indésirables sont de sévérité légère de courte durée. Le rongeur vigile ne souffrira que de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineuse), ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue. Ces effets seront limités par l’utilisation d’aiguilles à la taille adaptée et à usage unique pour chaque animal. De plus, des analgésiques et un anesthésique local seront utilisés pour réduire les effets indésirables liés à l’injections. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par des méthodes validées par le CEEA avant que l'infection palustre ne devienne symptomatique. Un prélèvement de sang sans réveil par piqûre des moustiques ou par ponction cardiaque sera réalisé dans l’animal profondément anesthésié. La perfusion hépatique sera réalisée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés et constitue une classe sans réveil.
Devenir
Les animaux injectés avec le parasite ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux utilisés pour le repas sanguin des moustiques sont anesthésiés puis mises à mort par dislocation cervicale avant leur réveil. Les animaux non infectés utilisés pour fournir des hépatocytes sous mis sous analgésie et profondément anesthésiés avant d’être perfusés ce qui est un acte létal.
Remplacement
Le modèle animal ne sera utilisé qu'à trois fins : 1) démontrer la transmission précoce des formes parasitaires sexuelles issues du foie, 2) générer des lignées de parasites transgéniques exprimant les régulateurs de la dormance ou de l'activation, et 3) produire des cellules hépatiques sauvages et transgéniques exprimant des biosenseurs métaboliques. Dans le cas où une nouvelle méthodologie est établie et devient disponible pour produire des lignées de parasites transgéniques dans le parasite du paludisme humain causant des rechutes (Plasmodium vivax), le modèle animal sera remplacé par des modèles de foie humain in vitro infectés par les lignées de parasites transgéniques humaines.
Réduction
Les animaux seront utilisés uniquement dans les situations où les expériences sur les animaux sont inévitables. Les protocoles de ce projet sont optimisés pour minimiser l'utilisation d'animaux et réduire au maximum la souffrance pendant les procédures expérimentales. Nous sommes conscients de l'impératif de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la recherche scientifique et la majeure partie de nos activités de recherche est réalisée in vitro. Cependant, certaines étapes nécessitent encore l'utilisation d'animaux, car il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium berghei in vitro. Ce projet ne comporte pas de considérations statistiques, car l'utilisation des animaux se justifie principalement par la nécessité d'amplifier les populations de parasites Plasmodium chez les rongeurs. En termes simples, la souris ou le rat sont utilisés comme de simples "flacons de culture cellulaire" pour accomplir une étape très spécifique du cycle de vie du parasite – la réinfection des globules rouges – qui ne peut être réalisée ni in vitro ni ex vivo. Mis à part cette étape, toutes les autres phases du cycle de vie du parasite seront effectuées in vitro, en accord avec le principe de réduction. Des procédures similaires sont approuvées pour d'autres équipes de recherche à l'Institut Pasteur ainsi que dans des laboratoires à travers le monde. Nous adopterons des protocoles expérimentaux issus de publications largement citées et nous travaillerons à les améliorer en réduisant le nombre d'animaux nécessaires grâce à l'utilisation de nouvelles technologies plus efficaces pour éditer le génome du parasite.
Raffinement
La conception des protocoles prendra toutes les mesures appropriées pour éviter ou soulager la souffrance, la douleur, la détresse et l'inconfort. Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés, ainsi les animaux sont mis à mort avant l'apparition des symptômes et des complications physiologiques potentiellement mortelles. De plus, nous surveillons le comportement des animaux tous les jours en utilisant une échelle de détresse pour détecter d'éventuels problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. Si nécessaire, du dietgel ou un enrichissement supplémentaire seront fournis. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont réalisées sous anesthésie générale profonde et analgésie, et les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort sera utilisée. Le poids sera enregistré une fois avant de démarrer l'expérience et ensuite tous les jours dès qu'un score dans l'Apparence ou le poids corporel est >0. Prises de décision : dès qu'un score est à 2, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages telles que Grammomys et Thamnomys, originaires d'Afrique centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et aux rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est largement reconnu dans la communauté scientifique que l'infection des rongeurs par ces parasites constitue un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l'homme. Ainsi, la valeur d'une recherche rigoureuse sur les rongeurs pour éclairer ou orienter la recherche chez l'homme est désormais solidement établie. L’utilisation de rats, tout aussi susceptibles à l’infection que les souris, a essentiellement pour but d’obtenir un volume sanguin important tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour préparer de grandes quantités d’érythrocytes infectés. Les animaux sont acclimatés pendant une période de 7 jours. Les inoculations de parasites seront effectuées sur des souris et des rats jeunes adultes âgés de 3 à 4 semaines, car ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite.
Utilisation de vecteurs dérivés de phages pour modifier génétiquement des bactéries toxigéniques responsables d’infections intestinales sévères
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue parce qu'aucune ne peut sortir de l'animalerie pour raisons de sécurité biologique, 3 697 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 455 d'entre elles en gravité sévère. Leur microbiote est d'abord détruit par cinq jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson et une injection intrapéritonéale, avant le gavage de bactéries toxinogènes puis des candidats médicaments, avec jusqu'à six prélèvements de fèces par jour pendant deux jours. Les diarrhées décrites, la déshydratation et les douleurs intestinales peuvent durer plusieurs jours, jusqu'à guérison ou atteinte d'un point limite. Le hamster, modèle historique de cette infection, a été écarté parce qu'il est "extrêmement sensible" et présente une forte mortalité, la souris offrant une colonisation intestinale stable et des données déjà accumulées au laboratoire.
Objectifs
Certains agents pathogènes bactériens ont la capacité de coloniser l’intestin humain et de s’y reproduire très efficacement, entraînant des symptômes sévères (diarrhées violentes, perforation de la paroi intestinale…) pouvant engager le pronostic vital du patient. La sévérité de ces infections tient à la production par ces bactéries pathogènes de toxines qui ciblent et détruisent les cellules de la paroi intestinale et du côlon. Pathogènes opportunistes, ces bactéries intestinales entraînent rarement des infections chez les personnes en bonne santé car leur développement est inhibé par les nombreuses bactéries qui colonisent naturellement l’intestin et constituent le microbiote (encore appelé flore intestinale). En revanche, ces pathogènes prospèrent dans l’intestin de personnes affaiblies et/ou dont le microbiote a été perturbé par un traitement antibiotique, les rendant ainsi particulièrement sensibles à l’infection. Malgré la pression considérable que ces bactéries pathogènes exercent sur les systèmes de santé, avec des coûts globaux annuels estimés à plusieurs milliards de dollars, il n’existe à ce jour aucune approche pleinement satisfaisante pour les traiter. En effet, les antibiotiques restent le standard thérapeutique contre ces infections, or ils participent à la perturbation du microbiote intestinal favorisant le développement même de ces pathogènes et sont responsables de l’augmentation continue de l'antibiorésistance, deux facteurs clés favorisant le risque de récurrence des infections. Dans ce contexte, nous développons 2 approches thérapeutiques inédites permettant, après administration par voie orale, de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de les éliminer de manière spécifique sur la base de leur séquence génétique, ou bien de les modifier génétiquement afin d’abolir leur production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont l'avantage unique d’être extrêmement spécifiques : contrairement aux antibiotiques elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et préservent ainsi le reste du microbiote, limitant ainsi le risque de récurrence des infections. L'objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de ces deux approches thérapeutiques dans des modèles murins d’infection par ces pathogènes bactériens intestinaux afin de sélectionner la plus prometteuse en vue d’en faire un médicament et d’organiser des essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour aucune approche thérapeutique pleinement satisfaisante pour soigner les infections causées par les bactéries pathogènes intestinales productrices de toxines. En effet, si les antibiotiques demeurent le standard thérapeutique contre ces infections, ils perturbent grandement le microbiote intestinal, un point clé favorisant le développement de ces pathogènes intestinaux. De plus, ils sont responsables de l’augmentation continue du phénomène d’antibiorésistance. De ce fait, les antibiotiques peuvent paradoxalement être contre productifs et favoriser le risque de récurrence des infections chez les patients. Dans ce contexte, ce projet vise à tester l'efficacité de 2 modalités thérapeutiques inédites et permettant de combler les lacunes des antibiotiques. La première modalité consiste en un antimicrobien extrêmement spécifique capable de reconnaître et d’éliminer les bactéries pathogènes dans l’intestin sur la base de leur séquence génétique. La seconde fonctionne à la manière d’un produit de thérapie génique et permet de cibler les bactéries pathogènes dans l’intestin et de le modifier génétiquement afin d’inactiver les gènes responsables de la production de toxines, les rendant ainsi inoffensives. Ces deux approches ont en commun leur spécificité sans précédent: elles ne ciblent que les bactéries pathogènes et n’engendrent aucune perturbation du microbiote intestinal. Elles se démarquent donc très nettement des antibiotiques et réduisent le risque de récurrence des infections à ces pathogènes intestinaux. En utilisant des modèles murins de colonisation et d’infection intestinale, ce projet vise à démontrer la capacité de ces 2 approches à éliminer les bactéries pathogènes ou à les rendre inoffensives tout en préservant le reste du microbiote intestinal. Le principal bénéfice en découlant sera le développement d’une stratégie thérapeutique alternative plus performante, plus sûre et plus adaptée au traitement clinique des infections intestinales aux bactéries productrices de toxines que les antibiotiques.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont les suivantes : - Une administration d’antibiotiques via l’eau de boisson (biberon) pendant 5 jours - Une administration d’antibiotique par injection intrapéritonéale (quelques secondes par animal) - Une administration orale par gavage de bactéries puis des candidats médicaments que nous testons (quelques secondes par animal) - Prélèvements de fèces: ils seront effectués au maximum une fois par jour (sauf procédure spécifique: 6 fois par jour pendant 2 jours), en récoltant les fèces excrétées naturellement par les animaux, en les plaçant dans une boite pendant quelques minutes. Il est également attendu que certains animaux infectés présentent une diarrhée et une perte de poids associées à la maladie que nous étudions.
Impact sur les animaux
La piqûre d’aiguille pour l’injection d’un antibiotique entraîne une douleur légère de courte durée. Le gavage oral avec les bactéries ou avec le traitement à tester entraîne une gêne et un stress légers et de courte durée. Les prélèvements de fèces entraînent un stress physique léger et un isolement de courte durée (5 minutes maximum). La maladie étudiée entraîne des symptômes tels que de la diarrhée, et donc une déshydratation légère à modérée, ainsi que des douleurs intestinales légères à modérées pouvant durer plusieurs jours (jusqu’à guérison ou atteinte d’un point limite, tel que décrit dans la section dédiée).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, la quasi-totalité de ces animaux seront infectés par des bactéries pathogènes, empêchant toute sortie de l’animalerie pour des raisons de sécurité biologique. Les quelques animaux qui ne seront pas infectés seront tout de même hébergés dans l’enceinte de la même animalerie, et doivent donc aussi être considérés comme potentiellement contaminés.
Remplacement
Les bactéries cibles colonisent l’intestin, où elles produisent des toxines qui entraînent notamment des diarrhées. Un traitement efficace doit donc être capable d’atteindre l’intestin afin d’agir sur ces bactéries. Bien que des modèles in vitro permettent de simuler les conditions gastrique et intestinale et seront utilisés en première intention au laboratoire, seule l’utilisation d’animaux permet de récapituler à la fois les obstacles physico-chimique qui seront rencontrés par notre traitement chez l’homme, mais aussi les conditions physiologiques dans lesquelles ces bactéries cibles seront retrouvées chez l’homme. De plus, bien que la réduction/abrogation de la production des toxines sera montrée préalablement in vitro au laboratoire, un modèle récapitulant les symptômes causées par l’infection avec ces bactéries est nécessaire pour évaluer l'efficacité de notre traitement dans la réduction/abrogation de ces symptômes chez l’homme.
Réduction
Nous effectuerons un grand nombre de tests préliminaires in vitro au laboratoire avant de passer chez l’animal. Ainsi, la diminution et l’abrogation de la production de toxines par les bactéries confrontées à notre traitement seront mesurées in vitro; la stabilité de notre traitement en conditions physico-chimiques physiologiques (acidité de l’estomac, présence d’enzymes digestives) sera mesurée in vitro; la capacité de notre traitement à tuer les bactéries ciblées sera évaluée par culture microbienne au laboratoire. Ces tests préliminaires permettront de réduire au strict minimum les tests devant absolument être effectués sur animaux en les effectuant que sur les candidats médicaments les plus prometteurs. De plus, toutes nos procédures sont construites autour de calculs de puissance statistique, afin de garantir au maximum que les résultats produits puissent répondre aux questions scientifiques, tout en utilisant le juste nombre d’animaux. Nous allons vérifier la colonisation bactérienne (un des indicateurs principaux) dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; cette stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place précédemment, nous permettra de procéder ) des études longitudinales sur un même individu, réduisant ainsi le nombre d’animaux à euthanasier sans perdre des informations essentielles pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront celles classiquement admises, notamment en termes de socialisation (jamais moins de 3 animaux par cage) et d’enrichissement (stick de coton pour nidification); la nourriture et l’eau seront fournies ad libitum (sauf exception la veille au soir d’une administration de traitement oral). Il n’est pas prévu d’isoler des animaux ou de restreindre leur environnement au cours du projet. L’infection par nos bactéries toxinogènes cibles entraînera sous quelques jours des diarrhées dont la sévérité peut évoluer rapidement. C’est pourquoi dans toutes les procédures impliquant des animaux infectés par des bactéries produisant des toxines, nous prévoyons une surveillance accrue des animaux (au minimum 1 fois par jour; voire 2 fois par jour dans les cas des animaux ayant perdu du poids ou peu mobiles), afin d’anticiper l’aggravation des symptômes et le cas échéant de procéder à la mise à mort des animaux pour éviter toute souffrance inutile. Des blocs d’hydrogel et des morceaux de nourriture pourront être fournis au fond de la cage pour les souris pouvant présenter des symptômes les empêchant d’accéder aussi librement que possible à l’eau et la nourriture présents dans le capot de la cage. Un autre moyen de limiter la souffrance animale est d’effectuer les tests de notre traitement en 2 jours maximum (sauf exception). Ainsi, l’expérimentation pourra être terminée avant que les symptômes n’atteignent des niveaux trop élevés. Enfin, nous avons prévu d’utiliser pour la plupart de nos procédures une souche ne produisant pas la toxine majeure de cette bactérie cible; des telles bactéries possèdent encore une toxine mineure avec le même mécanisme d’action, mais dont la dose toxique est 1000 fois moindre que la première. La majorité de nos procédures utiliserons cette souche comme alternative, moyennant certains changements dans la nature de notre traitement, à l’exception des procédures évaluant l’effet du traitement sur les symptômes eux-mêmes, par définition, où l'efficacité devra être démontrée contre les souches sauvages impliquées dans la maladie chez l’homme.
Choix des espèces
De nombreux animaux ont été infectés expérimentalement par la bactérie pathogène que nous étudions tels que hamsters, souris, rats, lapin et cailles, mais aussi des cochons et des singes. Le modèle historiquement utilisé pour étudier la pathologie est le hamster, cependant ce modèle est extrêmement sensible et présente une forte mortalité. Dans ce projet, nous limitons au maximum les souffrances éprouvées par les animaux, en travaillant majoritairement avec des versions fortement atténuées de ces bactéries. Ainsi, la souris devient le modèle le plus simple pour lequel il existe des données de littérature confirmant une colonisation intestinale stable. Nous disposons également de nombreuses données antérieures générées dans notre laboratoire chez la souris sur des candidats médicaments similaires, ce qui bénéficiera au projet. Le modèle souris récapitule également certains des symptômes clés de ces infections bactériennes chez l'Homme; cela nous permettra d'évaluer l'impact de notre traitement sur l'évolution de la maladie. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, typiquement âgés de 6 à 9 semaines en début d’expérimentation. L’âge des animaux en fin d’expérimentation ne dépassera pas 12 semaines, du fait de la durée maximum des expériences prévues dans les différentes procédures. Il faut noter que cet âge maximum n’est pas une limite scientifique, mais simplement un fait lié à la durée de nos expériences. Les individus plus jeunes ou beaucoup plus âgés pourraient être plus sensibles aux toxines produites par nos bactéries cibles, et ainsi développer des symptômes plus sévères, ce qui n’est pas nécessaire pour notre projet, et serait même contre-productif en termes d’obtention de colonisation intestinale stable avec ces bactéries.
Rôle du microbiote cutané dans la transmission précoce de la borréliose de Lyme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dix tiques déposées sur chaque souris, un repas sanguin de cinq à sept jours, et pendant ce temps un isolement en cage privée de litière : 175 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dès le cinquième jour de vie, les souriceaux reçoivent au coton-tige des bactéries de la flore cutanée, en trois applications, en présence de leur mère. L'objet est de savoir si ce microbiote cutané bloque la transmission de la borréliose de Lyme au moment de la piqûre, une question que le porteur juge inaccessible aux organoïdes et aux explants de peau, où une tique ne peut pas se nourrir. Le choix de la souris tient à son rôle d'hôte naturel des larves et des nymphes de tiques, et celui de nouveau-nés au fait que la colonisation par le microbiote commence dès la naissance.
Objectifs
Des travaux préliminaires in vitro réalisés dans notre laboratoire ont montré que des espèces bactériennes appartenant à la flore cutanée normale possèdent un effet immunomodulateur sur les cellules résidentes (fibroblastes et kératinocytes) et initient une réponse inée rapide en présence de Borrelia. L’objectif principal de ce projet de recherche est désormais d’analyser in vivo le rôle du microbiote cutané dans la transmission précoce de la borréliose de Lyme.
Bénéfices attendus
La borréliose de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue de l’hémisphère Nord. En France, l’incidence annuelle est de 30 à 90 cas/100 00 habitants. Lors de la piqûre d’une tique infectée par Borrelia, l’infection est avortée dans environ 90% des cas. Le microbiote cutané, par la production de bactériocines ou par immunomodulation cutanée, est suspecté d’être un acteur majeur de ce processus. Des intéractions de ce type ont été décrites chez le phlebotome et le parasite Leishmania mais à l’heure actuelle, aucune étude ne s’est intéressée à ces interactions dans les maladies transmises par les tiques. La compréhension des bactéries impliquées et des mécanismes sous jacents peut permettre la production à terme de composés à visée protective par modulation transitoire du microbiote cutané lors de piqûres de tiques, ou à l’utilisation de molécules sécrétées par les bactéries elles mêmes.
Procédures
Souris nouveau nés : manipulation pour application de bactéries (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables concomitants au repas sanguin correspondent à des réactions locales inflammatoires à la piqûre des tiques. A noter que lors des repas sanguin (5-7 jours), les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri (absence de litière). La manipulation des souriceaux nouveau nés sera le plus rapide possible (
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure. La réalisation de prélèvements multi-organes étant incompatible avec la survie de l'animal.
Remplacement
Nous avons déjà réalisé les expérimentations in vitro sur ce qui était faisable. L’utilisation d’organoides ou d’explants de peau n’est pas réalisable car la piqure de tique et son maintien y sont impossibles. Concernant les systèmes de gorgement artificiel pour tiques, ils ne permettent ni de répondre scientifiquement à la question posée, ni à l’étude de la dissémination du pathogène sur organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce protocole à été calculé au minimum des exigences de publications internationales, à savoir 5 souris par point de cinétique
Raffinement
Durant la procédure du repas sanguin des tiques, les souris sont isolées pour un maximum de 7 jours, avec des contrôles réguliers pour évaluer leur état et collecter les tiques gorgées, tout en maintenant un contact olfactif avec leurs congénères. Les souris sont obligatoirement séparées pour éviter le toilettage mutuel ne permettant pas un gorgement complet des tiques. Elles disposent d'un tunnel, d'un barreau à ronger et de coton. L'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques, même si un inconfort lié à l’inflammation de la piqûre peut être oberservée à la suite de celle-ci . Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Les souris sont euthanasiées après la collecte des tiques, sans dépasser 15 jours. Concernant l’application des bactéries sur souris nouveau nées, celle-ci se fait à l’aide d’un écouvillon doux non abrasif en coton et la manipulaton sera la plus rapide possible (
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et des nymphes de tiques. La souris est sensible à l’infection par Borrelia et est classiquement utilisée en recherche scientifique sur ce sujet. Colonisation par S. epidermidis ou C. acnes ou C. striatum : Nouveau nés (J5 de vie). La colonisation par le microbiote se réalise dès la naissance, il est donc important de respecter le même mode opératoire que dans la nature. Repas sanguin de tiques infectées ou non : Animal sevré (taille suffisante pour manipulation)
COVIDentification : étude de la réponse immunitaire mise en jeu lors de l’infection au SARS-CoV-2 sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Infectées par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, 2 327 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles développent une inflammation et une atteinte pulmonaire qui tue 30 à 50 % d'entre elles en sept à dix jours, celles qui survivent recevant jusqu'à dix administrations intrapéritonéales d'anticorps ou d'inhibiteurs avant leur mise à mort. L'objectif déclaré est d'identifier une signature immunitaire précoce de la gravité de la COVID-19 et de tester des traitements. Le porteur détaille l'enrichissement des cages en papier kraft et le suivi journalier de l'état de santé, et précise qu'aucun traitement antidouleur ne sera appliqué aux souris infectées, au motif qu'il fausserait l'étude de la réponse inflammatoire.
Objectifs
Depuis les premiers rapports indiquant l'apparition d'un syndrome respiratoire aiguë sévère (SRAS) induit par le coronavirus-2 (SARS-CoV-2) en Chine en 2019, la COVID-19 a déjà infecté plus de 700 millions de personnes à travers le monde et a causé près de 7 millions de décès. L'infection à la COVID-19 constitue donc un réel problème de santé publique impliquant des enjeux économiques et sociétaux forts pour les années à venir.
Bénéfices attendus
L'ensemble de nos investigations vise à apporter des pistes pour répondre aux questions rencontrées en clinique chez les patients infectés par le SARS-CoV-2. Nous espérons identifier une signature immunitaire spécifique et précoce de la sévérité de la maladie. Nous souhaitons contribuer à une meilleure compréhension de l'impact de comorbidités sur la réponse immunitaire mise en place lors d'une infection. Et enfin tenter de trouver différents traitements permettant de lutter contre l’infection par le SARS-CoV-2.
Procédures
Les animaux seront soumis aux actes suivants: Une infection en intra-nasale avec le SARS-CoV-2 (ou une solution contrôle) sur animal anesthésié : une seule fois (une à deux minutes). Ensuite, pour les animaux traités avec un anticorps ou un inhibiteur : une administration thérapeutique en intra-péritonéale sur animal vigile (quelques secondes, 1 à 10 fois maximum). Puis, avant l'euthanasie, une injection intra-veineuse d'une solution permettant de réaliser un suivi des cellules immunitaires sur animal anesthésié : quelques secondes, une seule fois. Puis, un prélèvement de sang sur animal anesthésié : 30 secondes, 1 seule fois. Et enfin, l'euthanasie des animaux par méthode réglementaire, quelques secondes, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les animaux impliqués dans ces expérimentations seront tous soumis à un suivi régulier (pesée, suivis journaliers) pouvant induire un stress chez les animaux. Les animaux infectés par le SARS-CoV-2 développeront une inflammation et une atteinte pulmonaire pouvant conduire dans 30 à 50 pourcent des cas au décès de l’animal sous 7 à 10 jours post-infection. Les animaux seront anesthésiés afin de pouvoir procéder aux infections par le SARS-CoV-2 par voie intranasale, cette anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire.. Plusieurs approches thérapeutiques susceptibles de réduire les symptômes de l’infection par le SARS-CoV-2 (administration de traitements anticorps, administration de traitement inhibiteur) seront testées afin d'entraver le développement de l’infection, toutefois l'administration des traitements pourra induire du stress et de la douleur légère chez les animaux.
Devenir
L'infection au SARS-CoV-2 est une infection évolutive au cours du temps et multi-systémique. Ainsi, pour comprendre au mieux les réponses immunitaires et inflammatoires mises en place par l'animal (sang moelle osseuse), celles spécifiques de certains organes (poumons, rein, rate, cerveau) il nous est nécessaire d'avoir accès à un maximum de prélèvements afin de mieux appréhender l'ensemble des modifications survenues au cours de l'infection. L'euthanasie de tous les animaux est donc requise pour répondre aux enjeux scientifiques de ce projet.
Remplacement
Le développement d’une infection par le SARS-CoV-2 fait intervenir une réponse immunitaire de l’hôte qui est évolutive au cours du temps. Nous infecterons les animaux par voie intranasale, ainsi, la fonction pulmonaire sera la première atteinte. Cependant, dans ce type de modèle infectieux, les animaux montrent également à minima des atteintes rénales et cérébrales ce qui impliquent que plusieurs organes et grandes fonctions physiologiques soient mises en jeu. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de la réponse immunitaire dans ce contexte pathologique rend l’étude in vivo indispensable. Toutefois, nous développons en parallèle, un maximum d’approches in vitro (mesures de paramètres biochimiques sur du sang de patients, extraction de cellules du sang périphérique de sang de patients atteints du virus de la COVID pour mise en culture puis stimulation-inhibition) dans le but de répondre à l’ensemble des questions posées dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un total de 2327 animaux. Nous avons limité au maximum nos groupes d’animaux. Pour exemple : un seul groupe contrôle pour l’ensemble de chacune des cinétiques. Nos études portent sur l’analyse de différents paramètres (réponse immune dans différents organes, histologie, dosage protéique). Ainsi pour chaque animal euthanasié, nous prélèverons un maximum d’organes afin de collecter les données pour l’ensemble des tissus. Nous nous organiserons afin d’appliquer une multi-approche expérimentale en utilisant un même organe pour différentes techniques d'évaluations cellulaires. Nous utilisons maintenant des approches d'analyse à haute dimension permettant d'obtenir un très grand nombre d'informations sur un seul animal, et pouvant même ne pas avoir été anticipées à l'avance. L'utilisation de ces technologies innovantes nous a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nos animaux seront placés en acclimatation pendant un minimum de 7 jours avant d'entrer en procédure expérimentale. Les souris seront stabulées en portoirs avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. La température et l'hygrométrie seront contrôlées. Le cycle d’éclairage sera de 12h par jour. Afin de stimuler les activités cognitives et exploratrices des animaux tout en satisfaisant leurs instincts naturels, le milieu des cages sera enrichi avec des nidifications biodégradables en papier kraft. Un suivi journalier de l’état de santé des animaux sera réalisé par du personnel compétent. Une pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine dès que la procédure expérimentale sera engagée. Nous réaliserons les infections de nos animaux par voie intranasale sous anesthésie générale. Les animaux auront alors subi une infection au SARS-Cov-2, malgré tout, aucun traitement anti-douleur ne leur sera appliqué car celui-ci risquerait d'interférer avec les mécanismes biologiques que cette procédure vise à révéler (étude de la réponse immunitaire et inflammatoire mises en place).
Choix des espèces
Le modèle murin pour l’infection par le SARS-CoV-2 est un modèle d’étude largement utilisé et décrit comme présentant une physiopathologie proche de celle observée en clinique chez le patient (symptômes cliniques, atteintes pulmonaire, rénale et cérébrale). De plus, la souris représente le modèle animal le plus riche en outils pour l’étude du système immunitaire : nombreux anticorps de cytométrie, modèles murins génétiquement modifiés (porteurs de fluorescences endogènes). Cela nous permettra d’étudier la réponse immune induite après l’infection par le SARS-CoV-2 via différentes techniques. Les animaux seront utilisés entre 3 et 24 mois afin d'étudier l’impact de facteurs de comorbidités tels que l’âge.
Evaluation de l’effet antiparasitaire de nouvelles molécules ou actifs naturels contre Cryptosporidium dans un modèle expérimental murin.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Une partie des souris utilisées est privée d'interféron gamma, donc incapable de contrôler le parasite qu'on lui inocule, et une autre partie est constituée de souriceaux de sept jours. 1 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inoculation de Cryptosporidium et l'administration des molécules candidates passent par un à cinq gavages par animal, sans anesthésie ni analgésie, le porteur indiquant qu'un anti-inflammatoire modifierait la réponse immunitaire et donc la prolifération du parasite. Les adultes immunodéficients peuvent se retrouver prostrés au bout d'une dizaine de jours, et toutes sont tuées en fin d'expérimentation, l'hébergement en zone confinée avec un pathogène transmissible à l'humain interdisant selon le porteur toute autre issue.
Objectifs
Le présent projet vise à évaluer (1) l’efficacité de molécules candidates anti-cryptosporidiennes présélectionnées in vitro sur des modèles murins (adulte et nouveau-nés) selon plusieurs schémas de traitements, (2) à vérifier si un mécansime de resistance vis-à-vis de celles-ci peut se produire rapidement et si ces traitements impactent le microbiote intestinal. La voie orale représente la voie privilégiée pour que la molécule soit en contact direct avec le parasite qui se développe dans la partie apicale des cellules épithéliales intestinales et qui n’est jamais plus invasif. Nous fixons comme prérequis aux expérimentations in vivo l’obtention d’un index de sélectivité (IS) qui soit supérieur à celui de la molécule de référence ie un antiparaistaire connu soit un index de sélectivité IS faible entre 2 et 3. A titre d’exemple, une molécule que nous avons identifié a un IS élevé et publié.
Bénéfices attendus
Le besoin de posséder des molécules efficaces et sures est un besoin fort que ce soit pour traiter la cryptosporidiose humaine ou animale. Nous attendons de ce projet l’identification de quelques molécules candidates capables d’entrer dans la suite du processus de validation de nouveaux composés, ie des essais de non toxicité- non carcinogène fins réalisées par des partenaires externes et après avoir pris contact avec un industriel intéresssé pour mettre ce produit sur le marché (la demande est forte). Ces étapes voient nombre de composés recalés. Il est donc important d’avoir un arsenal de composés pour qu’in fine quelques uns aient la chance de passer toutes les étapes et d’entrer sur le marché afin d’améliorer le bien être et la santé des animaux et de l’homme. L’objectif à moyen terme est bien de disposer d’un nombre suffisant de molécules pour traiter la cryptosporidiose et faire face à certains mécanismes de résistance. Leur repositionnement vers d’autres parasites apicomplexes sera envisagé avec nos collaborateurs afin d’en accroitre encore la portée thérapeutique.
Procédures
Inoculation et/ou traitement par gavage par voie orale des souris vigiles contentionnés, 1 à 5 fois et moins de 5 min.
Impact sur les animaux
L’infection par C. parvum conduit à des diarrhées chez l’homme et les ruminants. Chez les rongeurs, on n’observe pas de diarrhée mais un ramolissement des fèces. Pour les animaux témoins immunodéficient en interféron, on peut observer des prostrations des animaux après une dizaine de jours. Un suivi quotidien est réalisé et si un ou plusieurs points limites sont obervées. L’infection n’induit jamais de mortalité chez les souriceaux. Les animaux post-traitements sont suivis régulièrement pour observer si un effet indésirable est observé (baisse d’appétit, allergie au produit...), et s’il est constaté une atteinte des points limites tels que définis dans le protocole experimental. Un stress léger est attendu lors de la contention par gavage.
Devenir
Les animaux sont entrés dans des protocoles expérimentaux en zone confinée avec des pathogènes zoonotiques (risque pour l'homme) de classe II. Ils sont donc euthanasiés en fin d’expérimentation et des prélèvements seront réalisés (sang, tissus...) afin de comprendre l'efficacité thérapeutiques des différents traitements.
Remplacement
Nos protocoles expérimentaux sont programmés pour que les essais in vivo ne soient réalisés qu’une fois l’effet démontré de la molécule in vitro sur des lignées de cellules épithéliales ainsi que sa toxicité (test de mortalité cellulaire), sa solubilité dans un tampon compatible avec une administration orale et que la molécule à évaluer démontre un meilleur potentiel que la molécule de référence. L’utilisation d’organoïde n’apporte que peu d’informations supplémentaires. En effet nos cibles thérapeutiques sont localisées dans le parasite lui-même et pas au sein de la cellule hôte. De plus, les organoides n’intègrent pas l’environnement enzymatique agressif du tube digestif qui est susceptible de modifier la biodisponibilité et engendrer une modification chimique du composé. Les composés administrés in vivo peuvent en effet être modifiés par l’environnement complexe du tube digestif (pH, enzymes, etc.) ce qui est difficilement prédictif.
Réduction
Le criblage initital in vitro (efficacité, toxixité, solubilité) permet de réduire considérablement l’utilisation du nombre d’animaux. D’autre part notre organisation chronologique des expériences types est mis en place pour réduire à nouveau substantiellement (petits échantillons, non paramétriques), le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est d’autre part calculé au minimum pour pouvoir garantir l’utilisation de tests statistiques considérant le modèle cryptosporidium chez les rongeurs (modèle de souris sadulte immunodéficientes, modèle de souriceaux de 7 jours). Ces calculs sont basés sur notre longue expérience accompagnée d’une analyse de la littérature réalisée en amont notamment dans le cas ou le composé est repositionné par exemple, et sur un calcul de test de puissance sur nos données.
Raffinement
Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Points limites pour les souris selon l’âge de l’animal pendant au plus 24 à 48h, conduira de fait à l’euthanasie des animaux. Cela s’applique à toutes expériences et procédures citées dans ce document. Adulte (IFNg-/-) : Points limites = au moins un des points suivant en sus des poils hérissés : dos arqué, prostration, mobilité hésitante et aléatoire, yeux mi-clos. Souriceaux : Points limites = mobilité réduite, ou mise à l’écart du nid de façon prolongée par la mère. Toute atteinte du point limite déclenche l’euthanasie de l’animal Les animaux sont hébergés au minimum par 2 dans des cages sur litière et un enrichissement avec des feuilles de papier cellulose, bâtonnets de bois et maison rigide rouge. Et en plus des fils fins de papier kraft non blanchi sont mis pour que les femelles gestantes constituent leurs nids adin de positionner les souriceaux. Ils créent ainsi un tapis doux, élastique et confortable, ce qui en fait un matériau de nidification idéal. L’eau et l’aliment sont ad-libitum. On a une procédure légère à modérée et l’utilisation d’anti-inflammatoires agirait sur la réponse immune et donc sur la prolifération du parasite. Il est décrit dans la littérature, que l’anesthésie peut modifier la réponse immunitaire, le développement du parasite et leur voie de signalisation ce qui serait incompatible avec la finalité de la procédure et l’objectif du projet. Des interactions médicamenteuses peuvent aussi avec lieu entre les antiparasitaires testés et les des anesthésiants et analgésiants déjà décrits des études similaires. Une récompense positive, telle que popcorn ou graine de tournesol, est prévue après un acte.
Choix des espèces
Tout comme les chercheurs internationaux sur ce modèle, nous utilisons en première intention le modèle murin (avant les ruminants) qui reproduit bien l’infection et permet d’évaluer efficacement l’efficacité des drogues. Deux modèles sont utilisés, le modèle de souriceaux de 7 jours qui reproduit la susceptibilité des jeunes ruminants à cryptosporidium et le modèle de souris déficientes pour l'interféron gamma (une cytokine clé dans le contrôle du parasite) qui reproduit la susceptibilité des patients immunodéprimés. Le même parasite zoonotique, C. parvum infectant ces différentes espèces (ruminants, rongeurs, Humain) et nos antiparasitaires ciblant le métabolisme du parasite et non pas l’hôte, tous les modèles animaux susceptibles sont pertinents ; seules les conditions gastrointestinales varient ce qui nous conduit à une validation, en deuxième intention sur l’espèce d’intérêt ruminant. Nous utilisons des souris adultes entre 6 semaines et 15 semaines (souris déficientes pour inteféron gamma) et des souriceaux de 7 jours au démarrage de l’expérimentation (âge qui a été défini pour mimer celui des jeunes ruminants touchés par la cryptosporidiose et celui des jeunes enfants affectés par la maladie. Au-delà de 15 jours les souriceaux conventionels sont naturellement résistants à l’infection grâce au développement rapide de leur système immunitaire digestif.
Mise en place d’un modèle primate non humain de peste pulmonaire et étude d’un vaccin anti-peste.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Exposés au bacille de la peste par aérosol ou par sonde endotrachéale, 104 macaques à longue queue subissent des procédures dont 82 classées au niveau de souffrance le plus élevé. Ils reçoivent jusqu'à quatorze prélèvements sanguins, autant de prélèvements nasopharyngés, rectaux et de fèces, jusqu'à trois scanners du thorax, un ou deux lavages broncho-alvéolaires, et entre dix et trente anesthésies chacun. Le porteur attend une fièvre dès le deuxième jour, des signes de pneumonie dès le troisième, une anorexie et un état léthargique, et prévoit un hébergement individuel après l'exposition au bacille. Cent d'entre eux sont tués parce que la bactérie représente un risque pour la santé humaine, les quatre restants, qui n'auront reçu que le vaccin ou une bactérie non pathogène, pouvant être réutilisés dans d'autres protocoles après avis vétérinaire.
Objectifs
Au cours de l’histoire, les trois grandes épidémies de peste ont fait jusqu’à 100 millions de morts. Le bacille à l’origine de la peste, Yersinia pestis, est responsable des différentes formes de peste (bubonique, pulmonaire, septicémique, méningée et digestive), selon la voie d’entrée du bacille (bactérie de forme allongée)) dans l’organisme du patient. La peste reste mortelle de nos jours dans le monde, les derniers décès reportés datant de moins d’un an. Bien qu’il existe des traitements antibiotiques relativement efficaces contre la plupart des formes de la peste, le risque d’émergence de bacilles multirésistants aux antibiotiques posent des problèmes de santé publique. Il existe un vaccin commercial, mais celui-ci n’est pas homologué en France du fait de ses nombreux effets secondaires. À ce titre, le développement d’un nouveau vaccin oral contre Y.pestis est primordial. Les objectifs du projet sont donc de : *mettre en place un modèle de peste pulmonaire avec Y. pestis chez le primate non humain *déterminer la dose optimale de vaccin requise pour induire une réponse immunitaire maximale pour un bon niveau de sécurité, *Démontrer l’innocuité et l’efficacité du vaccin contre la peste pulmonaire
Bénéfices attendus
La recherche d’un vaccin efficace et sûr contre la peste est un enjeu de sécurité et de santé majeur. A court terme, ce projet permettra de disposer d’un modèle pertinent pour évaluer l’efficacité d’un vaccin contre la peste. A plus long terme, le vaccin développé dans ce projet sera utile non seulement pour lutter contre les épidémies récurrentes et peut s’avérer être la seule alternative possible face à l’émergence de bactéries multirésistantes.
Procédures
*Prélèvement de sang, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine puis une fois par semaine pendant 7 semaines (max : 14). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. *Prélèvement de fluides nasopharyngés et rectaux et prélèvement de fèces, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine puis une fois par semaine pendant 7 semaines (max 14). Ces prélèvements prennent environ 5 minutes en tout. *Imagerie de type scanner du thorax seront réalisées (maximum 3/animal). Ceci prend environ 20 minutes. *Suivi quotidien des animaux (incluant un suivi vigile, un suivi anesthesié, une pesée, les contrôles des paramètres de santé de l’animal (respiration, fréquence cardiaque, oxymétrie etc…). Jusqu’à 5 fois par semaine. Ce nombre pourra être adapté si l’animal montre des signes de mauvaise santé. Ceci est réalisé sur animal anesthésié et prend environ 5 minutes. *Exposition des animaux par voie aérosol : une fois par animal. Ceci est réalisé sur un animal anesthsié à l’aide soit d’un masque positionné sur la bouche et le nez de l’animal ou soit à l’aide d’une boite d’aérosolisation dans laquelle est positionnée la tête de l’animal. Ceci prend environ 20 minutes. *Exposition par voie endotrachéale : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié à l’aide d’une sonde à ballonnet. Ceci prend environ 15 minutes par animal. *Vaccination orale : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié à l’aide d’une sonde gastrique utilisable en clinique humaine. Ceci prend environ 10 minutes par animal. Toutes ces manipulations seront effectués sur des animaux anesthésiés. Le nombre d’anesthésie est variable car les animaux ne seront pas observés pendant le même temps à différentes étapes du projet. Cela peut varier entre environ 10 et 30 fois par animal répartis sur des temps allant de quelques jours à plusieurs mois. Le temps que dure l’anesthésie est également variable et ira de 10 minutes (prélèvements habituels + contrôles de l’état de santé) à 30 minutes environ (imagerie).
Impact sur les animaux
La peste pulmonaire chez le modèle primate non humain est proche de ce qui a été documenté chez l’homme et est donc potentiellement mortelle si elle évolue sans traitement. Dans les deux jours post infection, il est attendu que les animaux développent une fièvre. Dès le troisième jour, des symptômes semblables à une pneumonie (sans toux) seront détectables. Une anorexie et un état léthargique pourront accompagner ce stade. Des atteintes du foie et de la rate sont possibles et seront surveillées. Les animaux vont également subir des anesthésies répétées qui pourront se traduire par une légère déshydratation qui sera surveillée et compensée au besoin. Enfin, un ou deux lavages broncho-alvéolaire pourront être réalisés chez les animaux anesthésiés afin de suivre la présence de la bactérie directement dans le poumon. Afin de limiter l’inconfort lié à cette procédure le nombre de ces procédure a été limité au minimum et un traitement symptomatique pourra être utilisé le cas écéhant. Par ailleurs, l’hébergement individuel des animaux, qui aura lieu uniquement après exposition au bacille pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement par l’enrichissement de leur milieu de vie. D’après les résultats obtenus chez la souris, il n’est pas attendu que le vaccin provoque de nuisance.
Devenir
Du fait que la pathologie a des conséquences importantes pour les animaux et que le bacille représente un risque pour la santé humaine, tous les animaux qui recevront la bactérie seront euthanasiés. Les animaux ayant reçu soit une bactérie non pathogène, soit le vaccin mais n’ayant pas reçu la bactérie pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour réaliser ce projet. L’objectif est de mettre en place un modèle cliniquement cohérent d’infection par Y. pestis pour évaluer la protection induite par un vaccin. Ce type d’évaluation nécessite un organisme entier car les atteintes sont multiples et réparties sur plusieurs organes. Le modèle choisi doit permettre d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire). Enfin, la recherche d’effets secondaires indésirables consécutifs à la vaccination demande un modèle suffisamment proche de l’homme pour espérer une bonne représentation de ce qui sera observé. A ce titre, et en l’état actuel des connaissances, ces différents éléments ne peuvent pas encore être étudiés in vitro, in silico (à l’aide d’une modélisation mathématique) ou ex vivo (en dehors de l’organisme). Toutefois, cette phase préclinique de test du vaccin ainsi que l’établissement du modèle reposent sur l’analyse d’un ensemble de publications scientifiques reconnues et dont une bonne partie repose sur des résultats obtenus chez la souris.
Réduction
L’établissement de la dose vaccinale suit une méthode éprouvée dans la littérature scientifique ce qui permettra une approche statistique robuste en utilisant le moins d’animaux possible. La mise en place du modèle d’infection par Y. pestis repose sur une méthode déjà publiée. Cette méthode permettra de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire car nous attendrons d’avoir les résultats d’une étape avant de passer à la suivante. De ce fait, le nombre d’animaux inclus pourra être revu à la baisse. Cette méthode a été démontrée comme statistiquement robuste en utilisant le minimum d’animaux. Enfin, lors de la vérification de la réponse vaccinale, le nombre d’animaux retenu par groupe a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus par l’utilisation de tests statistiques bien établis et démontrant ainsi l’efficacité du candidat vaccin testé.
Raffinement
L’ensemble des procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie en plus des mesures de température toute les deux heures grâce à la puce implantée à l’animal avant le début de l’expérimentation. Des points limites basé sur la bibliographie ont été établis par les vétérinaires de l’installation et le responsable de la cellule locale du bien-être animal avant le début des expérimentations animales. Ceux-ci seront adaptés au fur et à mesure de l’établissement du modèle afin de suivre de près l’évolution clinique des animaux et de proposer une approche prédictive qui servira d’aide à la décision de mise en place de mesure limitant la souffrance et à la décision d’euthanasie.
Choix des espèces
Considérant toutes les contraintes énumérées ci-dessus, le primate non humain a été choisi comme modèle d’étude pour ce projet. Les macaques cynomolgus ont été sélectionnés pour plusieurs raisons : • Leur sensibilité à l’infection par Y.pestis. • Ils réunissent les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : leurs réponses immunitaires et vaccinales sont similaires à celles de l’homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le rat ou la souris. • Ils ont déjà fait l’objet de quelques publications scientifiques qui détaillent des symptômes et des atteintes semblables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux devront être adultes: les objectifs du projet sont de mettre en place un modèle de peste pulmonaire et d’étudier la protection par un candidat vaccin contre Y. pestis. De ce point de vue, il est donc primordial que les animaux disposent d’un système immunitaire et d’un système respiratoire pleinement mature. Le système immunitaire et le volume des poumons évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Nous utiliserons donc des animaux adultes d’âge et de poids semblables.
Inoculation de biopsies à l’animal pour identification et production d’un pathogène (renouvellement de projet)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
Cochons d'Inde : 50
450 souris et 50 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent dans le péritoine une préparation issue de prélèvements humains ou animaux, sang, biopsies, liquide céphalo-rachidien, insectes, pour que les micro-organismes qu'elle contient s'y multiplient, avant une anesthésie terminale et le prélèvement du sang et des organes. Le laboratoire indique n'utiliser que deux animaux par échantillon, le second au cas où le premier ne répondrait pas à l'inoculation. Leur corps tient lieu de milieu de culture, et le porteur affirme que produire ces germes hors d'un organisme vivant reste hors d'atteinte, les organoïdes n'étant "pas encore au point".
Objectifs
Le but de ce travail est double : isoler des micro-organismes dont la culture est fastidieuse, voire impossible et les produire en grande quantité ce qui permettrait d’une part la confirmation de diagnostic, et d’autre part la mise au point d’un milieu de culture axénique (stérile et exempt d’autres microorganismes).
Bénéfices attendus
Le laboratoire reçoit plusieurs milliers de prélèvements (sang, biopsies, LCR- Liquide Céphalo-Rachidien, arthropodes, insectes…) effectués par des vétérinaires ou des médecins dans le cadre de consultations ou de projets de recherches. Certains de ces prélèvements contiennent des micro-organismes en petite quantité qui n’ont jamais été décrits ou dont la culture n’a jamais été mise au point, d’où l’intérêt d’amplifier les pathogènes en les inoculant à un animal de laboratoire sensible. A partir des prélèvements de l’animal infecté il sera possible d’ensemencer une gamme variée de milieu afin d’identifier et de mettre au point une culture axénique. Des souris ou des cobayes seront utilisés en fonction de la nature du germe à isoler.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront les injections en intrapéritonéal (IP) de la préparation issue du prélèvement et in fine, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements post-mortem.
Impact sur les animaux
La première nuisance sera celle de l'injection en intrapéritonéal (IP) de la préparation issue du prélèvement. Au niveau local, une rougeur et/ou gonflement peuvent apparaitre suite à l’injection. Si ces signes diminuent ou disparaissent dans les 48heures post-inoculation, la procédure sera poursuivie jusqu’à la fin du protocole. En revanche, si des complications et des signes extérieurs d’inconforts décrits dans la grille de scores des points limites sont observés, les mesures décrites dans la grille seront appliquées. Une deuxième nuisance peut être liée à l’injection en IP des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. L’anesthésie ayant un effet rapide, aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.
Remplacement
Il n’existe pas toujours de milieu de culture pour certains micro-organismes et un animal sensible à l’infection est utilisé d’une part pour l’isolement et d’autre part pour maintenir un stock de ces pathogènes afin de les étudier ultérieurement. En outre, la mise au point d’un milieu de culture axénique (stérile et exempt d’autres microorganismes) nécessite la disponibilité d’un nombre important du pathogène à étudier pour tester ses conditions de culture (test de composés de culture différents) d’où la nécessité d’utiliser un animal pour produire les pathogènes à tester. La mise au point d'organoïdes par exemple n'est pas encore au point afin d'amplifier des microorganismes ex-vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux est de 2 maximum par prélèvement potentiel. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet reste faible. Lorsque nous recevons un échantillon « précieux », il est en général en faible quantité et la concentration en microorganisme est assez faible aussi. Nous utilisons 2 animaux par échantillons au cas ou une injection ou un animal ne répondrait pas favorablement à l’inoculation.
Raffinement
Les deux individus de la même espèce sont hébergés ensemble dans la même cage avec une surface suffisante ainsi que des éléments de raffinement appropriés (igloo, carrée de nidification, bois à ronger). Pour limiter toute souffrance et/ou angoisse des animaux, nous mettons en oeuvre des mesures d’acclimatation en zone d’hébergement d’une semaine avant de commencer les manipulations. Les animaux seront observés par un personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) quotidiennement et pesées (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. La température corporelle sera prise si des signes extérieurs correspondant à la grille de score sont observés. De la nourriture et de l'eau sont disponibles ad libitum. Un analgésique sera administré en cas de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplée à ce projet. L’analgésique que nous utiliserons sera de la buprénorphine en SC (sous-cutané) toutes les 12 heures pour la souris et toutes les 6 heures pour le cobaye. Un anesthésique sera administré avant l'euthanasie finale en injection IP pour les 2 espèces.
Choix des espèces
Certains pathogènes ne peuvent être produit qu'en utilisant un modèle animal. Selon le pathogène suspecté soit la souris soit le cobaye sera l'hôte approprié/ sensible pour sa multiplication. Par exemple: Le cobaye Dunkin Hartley pour cultiver Borrelia hispanica Les souris BALB/c: autres Borrelia, Coxiella, Bartonella et Rickettsia Le stade choisi sera le stade adulte : souris 6 à 8 semaines et cobaye 4 à 5 semaines. La volémie chez l’adulte est plus importante (un volume de sang plus important pourra être collecté).
Isolement et revivification des souches de Toxoplasma gondii en modèle murin
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour isoler et caractériser les souches de Toxoplasma gondii circulant chez l'humain et dans la faune, 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit dans l'abdomen une inoculation de l'échantillon à tester, puis un ou deux prélèvements de sang et de sécrétions sous anesthésie. Le porteur reconnaît que la culture cellulaire permet de cultiver le toxoplasme, tout en la jugeant moins sensible, et la réserve aux prélèvements qu'il ne considère pas comme précieux. Il écrit que dans la majorité des cas les souris ne présentent aucun effet indésirable, tout en décrivant une fièvre de quelques heures et "parfois mort rapide durant la nuit en cas d'infection sévère".
Objectifs
La détection et l'étude des souches de toxoplasme circulant chez l'humain et au sein de la faune sauvage et domestique se justifie par un intérêt épidémiologique (caractérisation génétique permettant de connaître la circulation des souches du parasite dans le contexte d'une seule santé : One Health). Dans ce cadre, l'isolement de ces souches ne peut se faire de manière satisfaisante que sur modèle murin en laboratoire, la culture cellulaire étant significativement moins sensible, et plus sujette aux contaminations.
Bénéfices attendus
Un des objectifs du projet est de mieux connaître l’épidémiologie des souches de toxoplasmes en France métropolitaine et DOM-TOM et d’étudier ainsi la biodiversité de T. gondii à des fins de santé publique. Pour cela, ce projet vise à collecter les souches issues des prélèvements cliniques, de les caractériser (d’un point de vue phénotypique et génotypique), les comparer aux souches circulant dans le monde et le cas échéant, alerter les autorités sanitaires de la survenue de cas groupés dus à des génotypes identiques ou voisins. Ces travaux incluent également une comparaison des souches humaines avec celles isolées dans l’environnement (notamment les souches isolées des animaux impliqués dans la transmission de la maladie).
Procédures
Les interventions qui peuvent causer des nuisances sont: (1) l'inoculation en intrapéritonéale de l'échantillon, qui peut causer une gêne sur un laps de temps très court; (2) et le prélèvement sanguin et autres sécretions en lien avec l'infection, réalisé sur l’animal sous anésthésie, qui peut causer un stress de quelques secondes lié à la contention. Ces interventions sont réalisées une seule fois, à l'exception des sécretions en lien avec l'infection, qui peuvent etre réalisées jusqu'à deux fois.
Impact sur les animaux
Dans la majorité des cas, les souris ne présentent aucun effet indésirable. Dans une minorité de cas où les souris présenteraient des symptomes, les seules nuisances sont liées à l'infection (animal fièvreux durant quelques heures maximum et parfois mort rapide durant la nuit en cas d'infection sévère).
Devenir
Les animaux ayant été infectés par un agent pathogène, les souris devront être systèmatiquement euthanasiées en fin de procédure.
Remplacement
La culture cellulaire est possible pour le toxoplasme, mais elle est de moindre sensibilité que l’isolement chez la souris. Elle sera réalisée lorsque les prélèvements auront été réalisées dans des conditions proches de l'asepsie et que les prélèvements n'auront pas été considérés comme précieux (prélèvements précieux : prélèvements humains et prélèvements d'animaux pour lesquelles peu de données existent).
Réduction
L'optimisation du protocole a permis de réduire le nombre de souris utilisées de 6 à 3 sans nuire à la réussite de l’isolement de souches.
Raffinement
Les 2 à 3 souris inoculées en fonction de la procédure sont hébergées dans des cages pouvant contenir 5 à 6 souris d’après les normes en vigueur. Les souris font l’objet d’un enrichissement dès leur mise en cage et jusqu’à la fin de l’expérimentation. Dans les cas où la souche infectante montre des signes de virulence, une grille de score de la douleur, établie dans le cadre du projet, est suivie pour définir les interventions ou point limites à appliquer. Ces interventions incluent, le cas échéant, l'administration d'un traitement antidouleur, l'augmentation de la fréquence d’observation (deux à trois fois par jour au lieu d’une seule) et l'euthanasie des animaux si le score de la douleur correspond au point limite atteint. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont l’animal de choix pour l’isolement du parasite. Mis à part le chat domestique, la souris représente l'espèce animale de laboratoire la plus adaptée pour l'isolement de souches de toxoplasmes (le modèle rat par exemple ne permet pas cet isolement). Elle est utilisée par l'ensemble des équipes de recherche internationale qui travaille sur l'isolement du toxoplasme. Des souris femelles à partir de 4 à 8 semaines sont utilisées afin de permettre l'inoculation des prélèvements. L’âge des animaux utilisés dans nos procédures correspond à une taille et un poids de l’animal minimums pour lequel l’injection du volume d’inoculum envisagé est bien toléré.
Etude d’une nouvelle formulation d’un candidat vaccin anti-Klebsiella pneumoniae chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
21 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour sept d'entre eux et modéré pour les quatorze autres. Ces quatorze reçoivent trois injections d'un candidat vaccin contre Klebsiella pneumoniae et jusqu'à six prises de sang, maintenus éveillés cinq minutes par prélèvement dans une cage de contention. Le porteur attend de la nouvelle formulation une production d'anticorps supérieure, l'objectif à terme étant de vacciner des populations à risque faute d'antibiotiques efficaces. Les quatorze sont tués au bout de soixante-dix jours, la mise à mort étant justifiée par le volume de sang à prélever, tandis que les sept lapins écartés après la phase de sélection restent disponibles pour d'autres études.
Objectifs
S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin à usage humain, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin en étudiant cette fois une nouvelle formulation (proportions de vaccin et d’adjuvant différentes des études précédentes) dans le but de déterminer quelle formulation est capable d’entrainer la plus grande production d’anticorps spécifiques.
Bénéfices attendus
La nouvelle formulation du vaccin devrait entrainer une meilleur réponse immunitaire. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.
Procédures
Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 3 injections sur animal vigile 3 secondes par injection - 1 à 6 prélèvements sanguins sur animal vigile 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale suivie d’un prélèvement sanguin terminal (2 minutes) qui se terminera par une injection d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - 3 injections Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’a montré aucun signe de toxicité. Nous n’attendons donc aucune toxicité lors de l’administration de cette nouvelle formulation. - 1 à 6 prélèvements sanguins sur animal vigile en cage de contention Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale suivie d’un prélèvement sanguin terminal qui se terminera par une injection d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. Le prélèvement sanguin terminal étant réalisée sous anesthésie générale, il ne sera associé à aucune douleur particulière.
Devenir
A l’issue de la phase 1 (sélection) , 7 animaux sur 21 seront exclus de l’étude. Ils n’auront subit qu’un prélèvement d’1 à 2 mL de sang à l’oreille (douleur légère) et pourront donc être réutilisés pour des études ultérieures. Les 14 animaux de la phase 2 (immunisation) seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.
Remplacement
La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour l’étude de la production d’anticorps suite à une vaccination.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. La sélection des animaux durant la première phase du projet permettra de réduire le nombre d’animaux qui participeront à la phase d’immunisation. Ainsi un tiers des animaux du projet subiront uniquement un prélèvement sanguin.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la phase d’immunisation. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations des traitements et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration des traitements n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Les injections et prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles et ne nécessiteront pas d’anesthésie ou d’analgésie particulière (comme chez l’homme). Seul le prélèvement terminal nécessitant un grand volume de sang sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Également, l’efficacité du candidat vaccin sera ultérieurement testé dans un modèle d’infection chez le lapin. Des lapins mâles et femelles de 3-4 mois seront utilisés de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.
Evaluation de l’innocuité d’une souche de Bacillus cereus
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune suivie vingt et un jours après une injection sous-cutanée unique de bactéries dont on ignore si elles rendent malade. Elles sont observées toutes les quatre heures le premier jour, puis chaque jour. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles ne sont plus naïves immunologiquement et pourraient porter l'agent pathogène. Le bénéfice annoncé est de "préciser les conditions de manipulation" de cette souche au laboratoire, alors que le RNT reconnaît qu'en cas de virulence la mort peut survenir en quelques heures et qu'"aucun point limite ne peut donc être défini".
Objectifs
Les bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato rassemblent de nombreuses souches appartenant à des espèces de mieux en mieux caractérisées - 24 espèces actuellement. Dans ce groupe la dénomination ne renseigne pas sur la pathogénicité d’une souche. Les facteurs de virulence sont souvent portés par des plasmides. Chez l’humain, les souches les plus virulentes possèdent des caractéristiques génétiques proches d’une bactérie pathogène, Bacillus anthracis. Plusieurs projets menés ont permis de séquencer et analyser les génomes d’environ 200 souches de Bacillus cereus sensu lato Parmi ces génomes séquencés, celui de la souche B93 ou CRBIP3.5817 a retenu notre attention. La souche est positionnée comme une souche a priori non-virulente. Cependant, il n’est pas connu si par des mécanismes encore inconnus, cette souche pouvait produire des molécules lui conférant une virulence supérieure à la souche, ne correspondant pas au niveau habituel de l’espèce. Ce projet permettra de préciser les conditions de manipulation de cette souche.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont de préciser les conditions de manipulation de la souche B. cereus B93 et, en cas d'expression d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate, les mécanismes encore inconnus mis en oeuvre. Dans le cas où un certain degré de virulence serait observé, les conditions de manipulation seraient réévaluées et les facteurs bactériens en cause seront étudiés, faisant alors l'objet d'un nouveau projet scientifique spécifique.
Procédures
- Injection sous-cutanée (quelques secondes par animal) unique de bactéries, dont la capacité à causer une maladie n’est pas encore connue. Le suivi est de 21 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances seront : - Injection des bactéries (une fois par animal, par voie sous-cutanée ventrale peu douloureuse). - Les données actuelles sur cette souche de B. cereus permettent d'envisager l'absence de virulence, donc de maladie. - En cas de virulence détectable, les symptômes pourront aller jusqu’à ceux de la maladie du charbon, c’est-à-dire que la mort des animaux survient de façon foudroyante, quelques heures au maximum après l'apparition de signes cliniques (prostration); aucun point limite ne peut donc être défini, seule la mise à mort des animaux présentant des signes cliniques lors de l'observation est retenue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne seront plus naïfs immunologiquement, et présenteraient un risque de porter l’agent pathogène et ne peuvent donc être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Afin de satisfaire aux exigences de Remplacement, Réduction, Raffinement, nous avons mené des tests préliminaires in vitro, mais seuls les tests in vivo permettront de confirmer l'absence ou la présence d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate et d’apprécier son impact éventuel sur l'innocuité de la souche. Le projet porte sur des interactions entre l'hôte et une bactérie, et ne peut pas être remplacé par d’autres méthodes. Par exemple, l'expression d'une capsule pseudoprotéique de polyglutamate ne peut être évaluée que dans les conditions très complexes du milieu intérieur de l’hôte (composition complexe, compartiments, etc.) où la bactérie est confrontée à des conditions réelles complexes et encore non maîtrisées in vitro dans l’hôte. Les tests préliminaires in vitro ont évoqué une présence possible de capsule pseudoprotéique de polyglutamate à la surface des bactéries. Les facteurs de régulation connus pour la synthèse d'une telle capsule ne sont cependant pas présents dans la souche étudiée, les stimuli à l’origine de cette expression sont encore inconnus. Le milieu intérieur de la souris est complexe, avec l'existence de nombreux paramètres physiologiques pouvant induire l'expression de facteurs bactériens. S'il existe de telles conditions, leur caractérisation lors d’une suite au présent projet permettra de reproduire ces conditions in vivo dans des modèles in vitro, permettant de s'affranchir à terme des animaux.
Réduction
Le projet a été élaboré dans le souci de réduire le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation à une valeur minimale et de valoriser chaque animal. Avec le raffinement des méthodes d’analyse, le nombre d’animaux a été défini et donc réduit au minimum nécessaire par usage des statistiques et l’usage d’une approche progressive d’évaluation afin d’exclure rapidement les tests inutiles. Le nombre d’animaux indiqué dans ce projet ponctuel résulte de l'expertise acquise dans le domaine de la virulence des bactéries étudiées pour l'évaluation de la virulence d'une souche. Il est réduit au minimum tout en permettant d'obtenir des données significatives quant au niveau de virulence de la souche. Dans la mesure du possible les animaux générés en trop par l’animalerie d’élevage de l’institution seront utilisés. L'optimisation des procédures et protocoles sera effectuée au cas où une certaine virulence serait observée initialement afin de coller au plus près à la réalité expérimentale et diminuer in fine le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux objectifs.
Raffinement
Durant les expériences, un suivi strict des animaux sera opéré tout au long de l’expérience via une observation régulière (aux 4 heures le premier jour puis chaque jour) pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précède généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (identifié via une grille de score) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques, des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de nourriture en gel hydrique, réhydratation sous-cutanée.
Choix des espèces
Les souris sont très sensibles à l’infection par le pathogène étudié. Les souris sont utilisées à l'âge de 7-14 semaines afin d’être représentatives de l’espèce à l’âge adulte et par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. Les infections étudiées ne dépendent pas de l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.
Essai in vivo d’anticorps neutralisant contre le virus SARS-CoV-2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie, après implantation d'une puce de télémétrie dans le dos et trois prises de sang à la joue, 70 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend des symptômes généralisés et une perte de poids, sans mortalité, avec une guérison en quatre jours. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever les poumons, la rate et le sang, l'essai visant à confirmer in vivo trois anticorps neutralisants identifiés par séquençage de répertoires immunitaires et intelligence artificielle. Leur pouvoir neutralisant équivaut, écrit-il, à celui du seul anticorps encore efficace sur les variants circulants, dont la vente est restreinte aux États-Unis.
Objectifs
L’utilisation d’anticorps monoclonaux issus de patients ciblant les protéines de surface d’un virus a déjà fait ses preuves dans la lutte contre le SARS-CoV-2. Cependant, l’émergence de nouveaux variants viraux d’intérêt dont le variant Omicron, compromet la bonne efficacité des anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique. Ainsi, il est nécessaire d’apporter régulièrement des évolutions thérapeutiques avec le développement d’anticorps à activités neutralisantes plus larges. Nous avons identifié des anticorps dirigés contre le SARS-CoV-2 à partir de séquençages de répertoires immunitaires de patients infectés et guéris de la COVID-19 combinés aux technologies d’Intelligence Artificielle développées par une entreprise. Nos travaux se focalisent particulièrement sur l’obtention d’anticorps neutralisants de large spécificité qui conservent leur efficacité sur les nouveaux variants d’intérêt du SARS-CoV-2 en circulation ou à venir. Dans ce cadre, trois anticorps à très forte affinité et à haut pouvoir neutralisant ont été identifiés, avec la capacité de neutraliser différents variants du SARS-CoV-2, et ciblant chacun des épitopes différents de la protéine virale S. Leur capacité neutralisante est équivalente à celle d'un autre anticorps commercialisé (unique) encore efficace sur les variants circulants actuels et dont la vente est restreinte aux USA. Ainsi, le fort pouvoir neutralisant de ces 3 anticorps en fait de bons candidats à visée thérapeutique. Il nous semble nécessaire de renforcer ces résultats obtenus in vitro par des essais in vivo. Ainsi, nous nous attendons à ce que ces 3 anticorps injectés à des souris préalablement infectées par le SARS-CoV-2 initient une protection chez l’animal face à l’infection, diminuant voire empêchant l’apparition de symptômes, comme attendu avec un anticorps thérapeutique à visée clinique.
Bénéfices attendus
La validation des anticorps thérapeutiques testés dans le cadre de cette étude servira de base pour amorcer leur développement clinique dont l’utilisation finale sera d’ameliorer la prise en charge des patients atteints de formes sévères de la COVID-19. Cela permettra également de confirmer le processus d’identification rapide in silico d’anticorps thérapeutiques développé par notre groupe d’étude lors d’une nouvelle émergence virale de coronavirus ou d’une virose inconnue (virus X) comme soutenu par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS).
Procédures
Tous les animaux, soit 70 souris. Une puce dorsale d’identification et de télémétrie sera injectée en sous-cutané pour une souris (12 minutes par animal, une fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire seront effectuées sur chaque animal tout au long de l’expérience à l’aide d’une aiguille (5 minutes par animal, 3 fois soit une fois par semaine). Inoculation des anticoprs thérapeutiques ou placebo par voie intra-péritonéale sur animaux en contention. L’objectif est de mesurer l’efficacité thérapeutique neutralisatante des anticorps. (5 minutes par animal, 1 fois). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale en voie intra-péritonéale. L’objectif est d’induire une infection pulmonaire. (10 min par animal, 1 fois). Prélèvements nasaux sous anesthésie gazeuse. L'objectif est d'analyser la réponse immmunitaire mucosale (5 min, 2 à 3 fois par animal).
Impact sur les animaux
Le protocole développé dans cette étude consiste à infecter des lots de souris avec du virus SARS-CoV-2. Les souris utilisées sont sensibles à ce virus et vont développer des symptomes généralisés mais sans mortalité au vu des doses inoculées. Une perte de poids temporaire est attendue suivi d’une guérison totale au bout de 4 jours. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations du sensor télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, rate, swab, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour remplacer ce modèle murin qui permettra de restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie thérapeutique et pour mimer une clinique proche de l’humain. Ce modèle de souris transgéniques a été mis au point spéicifiquement afin de pallier les difficultés rencontrées avec les précédents modèles animaux et en absence de méthode alternatives . Le modèle de souris transgénique est bien décris dans la littérature développant la pathologie attendue et induisant une réponse immunitaire, afin répondre aux attentes du projet sur la protection antivirale.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base de l’étude de la réponse immunitaire et virale.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, aus sein d'une animalerie confinée, en isolateur durant l'infection infection expérimentale. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Les souris sont anesthésiées par injection par voie intra-péritonéale avant chaque instillation intranasale. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type graines de Tournesol sera réalisée.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par l’inoculation d’anticorps post-infection dans l’étude du COVID. Le modèle de souris est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux COVID. Adulte et immunocompétent (6 semaines). Le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents en vue de passer à une étude clinique.
Fonctions favorisant la persistance des bacilles de la tuberculose chez la souris en présence d’un traitement antibiotique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Quinze minutes le nez maintenu au contact d'un aérosol de bacilles de la tuberculose, puis un gavage d'antibiotique cinq jours par semaine pendant quatre semaines : 5940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes. L'objet réel du projet est bactérien, il s'agit de savoir quelles fonctions permettent au bacille de survivre à la fois au traitement et à la réponse immunitaire, la souris fournissant le lieu de l'infection. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit les granulomes des phases tardives et que le modèle animal reste "incontournable". Les bénéfices annoncés, des traitements plus courts et plus efficaces, restent au conditionnel, l'infection de près de six mille souris étant, elle, planifiée sur cinq ans.
Objectifs
La tuberculose reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier. Cette maladie se caractérise par la persistance des bacilles de la tuberculose chez l’hôte et la longueur des traitements antibiotiques. Plusieurs résultats suggèrent un lien entre la tolérance bactérienne aux médicaments, c'est-à-dire la capacité à supporter certains niveaux d'antibiotiques pendant un certain temps, et la capacité bactérienne à résister à la réponse immunitaire de l'hôte. Cependant, les études qui font le lien entre ces deux domaines manquent cruellement. Nous proposons ici d'explorer les fonctions et les adaptations importantes pour survivre au traitement médicamenteux et à la réponse immunitaire de l'hôte chez les bacilles de la tuberculose. Notre objectif est d’évaluer si cibler des fonctions importantes pour la persistance chez l’hôte et la tolérance aux antibiotiques permet une meilleure efficacité des traitements et une élimination plus rapide des bacilles. Dans des travaux antérieurs, nous avons sélectionné des mutants de bacilles de la tuberculose présentant une persistance accrue chez la souris. Nous avons constaté que la tolérance à l’isoniazide et la rifampicine, deux antituberculeux utilisés en clinique, était également accrue chez ces mutants. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser les mutations responsables et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous construirons ensuite des souches recombinantes de bacille de la tuberculose dans lesquels les gènes identifiés seront soit inactivés soit placés sous contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline. Enfin nous évaluerons dans le modèle souris l'effet synergique des médicaments et de l’inactivation de ces gènes. Les résultats attendus devraient mettre en lumière les caractéristiques mycobactériennes expliquant la pandémie actuelle de tuberculose et fournir des perspectives intéressantes pour le contrôle de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez les bacilles de la tuberculose et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre la tuberculose dans le but de réduire la durée des traitements et d’augmenter leur efficacité.
Procédures
Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose. Pour cela, les souris seront maintenues dans des chambres individuelles de contention permettant de maintenir le nez de la souris en contact avec l’aérosol. Cette opération dure 15 minutes. Certains groupes d'animaux recevront 5 jours par semaine pendant 4 semaines maximum une dose d’antibiotique donnée par gavage.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques . Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (contention) d’une durée d’environ 15 min. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une contention de quelques minutes 5 jours sur 7 pendant 2 ou 4 semaines. L’impact de cette manipulation sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que les bacilles de la tuberculose. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission. Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire les granulomes rencontrés dans ces phases tardives et d’étudier la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans ceux-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour ces études. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain. Dans ce projet, les souches mutantes de Mycobacterium tuberculosis seront testées au préalable in vitro et dans des modèles cellulaires mimant les étapes précoces de l'infection. Le modèle souris sera utilisé en cas de résultats positifs pour mimer les étapes tardives.
Réduction
Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.
Raffinement
Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et administration des antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. L’expérience implique un traitement antibiotique quotidien (5 jours sur 7). Nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux et choisir la voie d’administration la moins contraignante pour les animaux tout en permettant d’observer l’effet des antibiotiques. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons aussi le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer le lien entre tolérance aux antibiotiques et persistance chez l’hôte par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie , ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.