Troubles cardiaques

184 souris vont être utilisées et toutes tuées, 160 sous anesthésie sans réveil et 24 dans des procédures de souffrance sévère. Les souris porteuses d'une mutation du canal sodique cardiaque, qui provoque des arythmies et une mortalité de 50 % dès sept semaines, sont euthanasiées à quatre semaines après un électrocardiogramme sous anesthésie, pendant lequel des peptides dérivés de venins sont testés. Le porteur reconnaît que la mutation entraîne un "phénotype dommageable" et justifie la mise à mort précoce par des raisons éthiques liées à la sévérité de la maladie. Les souris reproductrices, génétiquement modifiées, sont elles aussi tuées à quarante semaines.

Objectifs

Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations gain-de-fonction du gène codant le canal sodique cardiaque Nav1.5. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG) est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à partir de la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, qui sont très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de peptides dérivés de toxines extraites de venins sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients, la souris knock-in hétérozygote Scn5aWT/DelQKP1510-1512 (souris Scn5aWT/DelQKP). Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal Nav1.5 lui-même, en inhibant le courant sodique persistant induit par la mutation, et le récepteur de la ryanodine de type 2, Ryr2 (canal calcique du réticulum sarcoplasmique), dont nous avons montré l'implication dans le déclenchement des arythmies in vitro sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris Scn5aWT/DelQKP.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'identifier : 1. au moins un inhibiteur du courant sodique persistant induit par la mutation de Nav1.5, capable de normaliser la durée de l'intervalle QT sur l'ECG et de prévenir la survenue des arythmies ventriculaires, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, et 2. au moins un peptide stabilisateur de Ryr2 susceptible de prévenir la survenue des arythmies malgré l'allongement de l'intervalle QT, permettant ainsi de confirmer in vivo que Ryr2 participe effectivement au déclenchement des arythmies, et offrant là aussi une solution thérapeutique possible.

Procédures

Elevage pour l'obtention de souris Scn5aWT/delQKP, à phénotype sévère. Les souris Scn5aWT/delQKP seront euthanasiées à l'âge de 4 semaines, à l'issue d'un enregistrement de leur électrocardiogramme, limitant ainsi le risque de mort subite et d'insuffisance cardiaque, dont l'incidence augmente fortement après 4 semaines. Examen électrocardiographique. L'enregistrement d'un électrocardiogramme sera réalisé sous anesthésie en conditions contrôles et pendant l'injection de doses croissantes des peptides thérapeutique à tester. Cet examen durera 35 minutes sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les souris lors de la procédure expérimentale (procédure 2) mise en œuvre lors de ce projet sont leur contention et leur anesthésie par isoflurane. En effet, cette procédure consiste en l'enregistrement d'un ECG sous anesthésie avec euthanasie de l'animal en fin d'examen (classe sans réveil). En revanche, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, deux décisions ont été prises : (1) pour l'entretien de la lignée (procédure 1), nous n'utilisons pas de souris porteuses de la mutation (voir paragraphe 5.10.3), et (2) notre étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès.

Devenir

Tous les souriceaux Scn5aWT/delQKP et contrôles inclus dans l'étude seront euthanasiés à l'âge de 4 semaines à la fin de la procédure 2 pour des raisons éthiques compte-tenu de la sévérité du phénotype cardiaque au delà de cet âge. Les souriceaux surnuméraires des portées seront également euthanasiés à 4 semaines à l'exception des souriceaux Scn5aWT/Neo-delQKP et Flp qui seront conservés pour renouveler les souris utilisées pour la reproduction. Les souris reproductrices sont euthanasiées à l'âge de 40 semaines et remplacées, dans la mesure où elles sont génétiquement modifiées et ne peuvent être utilisées pour d'autres études.

Remplacement

Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle in vivo. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant la durée de l'intervalle QT à l'ECG et/ou en prévenant les arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos deux cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.

Réduction

Un maximum de 20 souris (10 souris sauvages et 10 souris mutées) par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 2 souris mutées par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 16 animaux (8 souris sauvages et 8 souris mutées). Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Les effets des molécules le rythme sinusal, la conduction de l'influx électrique cardiaque et la repolarisation ventriculaire seront évalués par analyse de variance à une voie pour mesures répétées, complétée par un test de Tukey pour comparaisons multiples. Les effets des molécules sur la survenue des arythmies ventriculaires sera évaluée avec un test de Fisher.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG sera réalisé sous anesthésie. Comme mentionné précédemment, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Les souris mutées sont obtenues par croisement de souris porteuses de la cassette de recombinaison FRT-neomycin-FRT-delQKP (souris Scn5aWT/Neo-delQKP), qui n'expriment pas la mutation, avec des souris exprimant la flipase, permettant ainsi l'excision de la cassette neomycin et l'expression de la mutation chez 25% des souriceaux résultant de ces croisements. Les souris Scn5aWT/Neo-delQKP et les souris flipase n'ont pas de phénotype dommageable.

Choix des espèces

La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine, avec cependant une sévérité plus importante des arythmies par rapport aux patients. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent très tôt, avant l'âge adulte, ce qui est d'ailleurs observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, la mortalité des souris mutées devient très élevée.