Troubles cardiaques
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Evaluation du potentiel antiarythmique préventif et curatif d’un antioxydant dans un modèle de Fibrillation Auriculaire chez la brebis
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
50 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres projets de l'établissement. Elles subissent l'implantation chirurgicale de boîtiers de stimulation et de télémétrie, une intervention pouvant durer quatre heures, avant induction d'une fibrillation auriculaire et injections quotidiennes d'une molécule pendant plusieurs semaines. Le porteur décrit des cicatrisations prolongées, des risques d'infection ou de rejet des implants, et un stress lié à l'isolement lors des injections. Il affirme que la complexité de la maladie empêche toute simulation in silico et présente la brebis comme un modèle de "référence" proche du cœur humain.
Objectifs
La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme cardiaque le plus répandu. Cette maladie des oreillettes peut toucher 1 % de la population globale et jusqu'à 5 % des personnes âgées de plus de 65 ans et sa fréquence double à chaque décennie. La gravité de cette affection est principalement liée à ses conséquences : 30 % des accidents vasculaires cérébraux peuvent lui être imputés. Nos équipes de recherche ont identifié que la FA modifie spécifiquement le compartiment mitochondrial. Nos résultats sont en accord avec la littérature décrivant que les dommages cellulaires causés par le stress oxydant sont considérés comme un mécanisme participant à la stabilisation de la FA. Nous avons identifié une cible pharmacologique potentielle au niveau des mitochondries et nous possédons une molécule (l’ATT) spécifique de cette cible mitochondriale. Par conséquent, notre objectif est d’évaluer le potentiel antiarythmique de l’ATT dans notre modèle expérimental, et d’optimiser le traitement en adaptant la posologie.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet revêt une importance particulière dans la mesure où l’obtention de résultats positifs pourrait réellement avoir des répercussions sur le développement d’un nouveau traitement dans la FA chez l’homme. L’ATT possède une autorisation de mise sur le marché en Europe et aux États-Unis mais pas pour son potentiel effet antiarythmique. Ainsi, la démonstration que l’ATT possède un potentiel antiarythmique chez la brebis FA est une étape indispensable au développement d’un futur projet de recherche clinique. Les bénéfices attendus de notre projet sont donc (i) la démonstration du ciblage pharmacologique du compartiment mitochondrial comme stratégie thérapeutique efficace pour lutter contre le développement et la progression de la FA et (ii) l’utilisation des données collectées pour commencer le développement d’un essai clinique visant à évaluer le potentiel antiarythmique de l’ATT chez l’homme.
Procédures
Les animaux auront deux prises de sang (une lors de l’inclusion et une à la fin du projet, pour une prise de sang il faut compter 15 min) et également deux prélèvements urinaires (30 min). Les animaux auront une IRM et une cartographie endocavitaire par cathéter, les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie, ces examnes ont une durée d'environ 90 min. Les animaux auront une implantation chirurgicale d’un boitier de stimulation cardiaque, d’un boitier de télémétrie et d’une chambre de perfusion. Procédures réalisées sous anesthésie et analgésie, cette intervention, de la prise en charge de l'animal jusqu'à sont réveil complet durera maximum 4 heures. Suite à la récupération post-chirurgicale, les brebis recevront une injection journalière d’ATT pendant 10 jours ou une injection journalière pendant 80 jours (la réalisation des injections nécessite l’isolement des brebis pour une durée de 20 à 30 minutes le temps de la réalisation par les personnes en charge des animaux). Les effets du traitement seront évalués à distance grâce à la surveillance télémétrique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil (désorientation, apathie) ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens IRM et électrophysiologique sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la fibrillation auriculaire mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. L’induction de la fibrillation auriculaire chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais il est à noter que l’installation de la fibrillation auriculaire est asymptomatique chez la brebis. Ainsi les brebis saines et en fibrillation auriculaire sont indifférenciables au niveau du comportement et de l’aspect physique. Lors des tests des effets de la molécule antioxydante étudiée sur la progression de la maladie, les injections de cette molécule se feront à travers une chambre de perfusion, identique à celle utilisée chez les patients, localisée dans la zone du cou en sous-cutanée. Les effets indésirables peuvent être à ce stade : altération de la cicatrice du site d’implantation, infection dans la zone d’implantation ou rejet des équipements implantés. Pour minimiser l’inconfort de la brebis, les chambres de perfusion sont de petite taille (poids 4.7g, dimensions 30x22x11 mm). La réalisation des injections nécessite l’isolement des brebis pour une durée de 20 à 30 min, ce qui peut induire un stress. Une récompense alimentaire sera donnée par les animaliers expérimentés à chaque injection et à chaque animal afin de limiter l’angoisse liée à l’isolement mais également dans le but d’entrainer l’animal afin de faciliter la procédure et de diminuer le stress de la brebis. Concernant les effets éventuels de la molécule, les données de toxicité disponibles montrent que la dose journalière d’antioxydant utilisée de 60µg/Kg est 40 fois inférieure à la dose montrant un effet toxique chez le miniporc. Nous anticipons donc l’absence d’effet toxique chez la brebis.
Devenir
Dans ce projet, constitué d’une procédure expérimentale classée modérée, tous les animaux seront gardés en vie à l’issue de la procédure. Les animaux sont des animaux modèle d'une pathologie humiane, ils sont très précieux en terme d'obtention, de suivi et en terme scientifique, ils seront donc réutilisés au sein de l’institut soit dans des procédures classées légères, modérées ou terminales. La réorientation des animaux dans de nouveaux projets de l’institut ne pourra se faire que suite à la réalisation d’une demande d’autorisation de projet et suivant l'avis de la SBEA qui suit les projets de l'établissement.
Remplacement
Cette DAP s’inscrit dans le contexte du test de l’activité antiarythmique d’une molécule déjà utilisée pour soigner d’autres pathologies. En effet, l’ATT est un stimulant de la fonction biliaire et un substitut salivaire et lacrymal. L’évaluation de l’effet antiarythmique de l’ATT dans la FA nécessite l’utilisation du modèle expérimental de brebis en fibrillation auriculaire. Cette pathologie est trop complexe et nos connaissances insuffisantes pour que nous soyons actuellement en mesure de simuler in silico les effets de l’inhibition de la production de stress oxydatif en provenance du compartiment mitochondrial sur le développement et la progression de la FA. Bien que nos résultats collectés in vitro soient en faveur d’un effet inhibiteur de l’ATT sur la progression de la FA, la démonstration de l’effet thérapeutique passe nécessairement par l’utilisation de l’animal. Nous n’avons pas de stratégie de remplacement valable à ce jour nous permettant de répondre à la question scientifique posée dans ce projet.
Réduction
Pour favoriser la réduction du nombre d'animaux dans ce projet, chaque brebis est son propre contrôle au moins pour les paramètres de fonctions cardiaques et le profil électrophysiologique, cette approche permet de limiter le nombre d’animaux utilisé en s’affranchissant de la variabilité interindividuelle. Dans ce projet 50 brebis seront utilisées sur une durée de 5 années, soit 10 animaux par an, ce nombre a été défini de part la durée nécessaire pour la mise en œuvre du modèle et les contraintes logistiques de l'établissement. Le projet comporte un total de 5 sous-groupes de brebis pour lesquels 7 à 10 animaux seront nécessaires pour répondre aux questions scientifiques posées avec une puissance statistique suffisante. Notre stratégie de réduction repose également sur la redistribution des animaux étudiés dans cette DAP vers les autres projets de l’institut. Cette mutualisation des animaux permettra de réduire significativement le nombre de brebis en FA utilisées au sein de l'établissement tout en répondant aux demandes des différentes équipes de l'établissement Par exemple, le modèle de brebis FA est utilisé dans le développement de cathéters de diagnostic et de traitements de la FA, pour leur application chez l'Homme.
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement sont mises en place durant les phases du projet. Lors des examens et expérimentations, une anesthésie avec analgésie adaptée est mise en place et les animaux sont étroitement surveillés lors des jours suivants l'opération. Lors du suivi longitudinal, l’utilisation de la télémétrie pour surveiller la température, l’activité et le rythme cardiaque des brebis 24 heures sur 24 est une mesure de raffinement. Par exemple, lors du réveil de l’animal nous pouvons agir si nous observons que le retour de la température corporelle est trop lent. Cette surveillance renforcée permet également de mieux gérer les traitements antibiotiques et/ou analgésiques suite à une augmentation de température significative sans modification du comportement de l’animal ce qui est souvent le cas chez la brebis. Cette méthode nous permet de récolter des données sans induire de stress chez la brebis. Plus spécifiquement dans le cadre de ce projet les animaliers entraineront les animaux à rentrer dans le box d’isolement pour la réalisation de l’injection de l’ATT. Les brebis sont habituées à voir les animaliers tous les jours et par conséquent l’implication des animaliers dans le projet est indispensable à sa bonne réalisation et à la minimisation du stress des animaux. Les personnes en charge des animaux sont formés et expérimentés dans la prise en compte du bien-être de cettte espèce. L’utilisation d’une récompense alimentaire sous forme de granulés fonctionne très bien chez la brebis. L’entrainement des brebis réduira l’angoisse et le stress lors des phases d’injections. Nous savons que des brebis entraînées ont un rythme cardiaque moins élevé lors de l’arrivée dans le box d’isolement que des brebis qui découvrent cet exercice pour la première fois. L’animal est placé dans les conditions d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat à son espèce : groupe social, pierre à sel à disposition, foin et paille. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu conformément au point 3.3.3.
Choix des espèces
Le cœur de la brebis a une anatomie, une électrophysiologie et une géométrie proche de celles du cœur humain. Ainsi, les méthodes cliniques d’imagerie et d’électrophysiologie peuvent être directement appliquées dans cette espèce et extrapoler à une application à l'Homme. Le modèle de FA persistante utilisé dans cette étude a été mis au point sur le mouton au sein d'autres équipes de recherche, le modèle est donc décrit et caractérisé dans cette espèce, constituant une référence dans la communauté scientifique. Les brebis utilisées seront adultes car les dimensions du myocarde permettent l’utilisation des outils cliniques notamment les cathéters, correspondant à ceux utilisés chez l'Homme lors de la prise en charge de la maladie. De plus, la FA étant une pathologie majoritairement représentée chez les personnes âgées nous utiliserons des brebis âgées de 8 à 11 ans minimum, ce qui correspond à un âge avancé chez l'Homme.
Evaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux dispositifs innovants pour la thrombectomie chez un modèle porcin d’ischémie cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
12 cochons vont être utilisés dans une procédure unique d'environ quatre heures menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Un modèle d'ischémie cérébrale est provoqué pour évaluer deux dispositifs de thrombectomie destinés à retirer un caillot dans une artère du cerveau, deux dispositifs testés sur le même animal. Le porteur indique qu'aucune nuisance supplémentaire n'est prévue au-delà du stress de la prémédication, puisque la procédure est sans réveil. Il affirme que la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et que seul l'essai in vivo permet de la confirmer.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral ischémique (AVC) est la première cause de handicap et la troisième de décès dans le monde occidental. L’AVC résulte de l'occlusion d'une artère cérébrale par un caillot sanguin appelé thrombus. Le traitement de l'AVC consiste à retirer mécaniquement le thrombus par voie endovasculaire, c'est à dire en passant par les veines et les artères. C'est ce qu'on appelle la thrombectomie mécanique. Pour cette intervention l'opérateur utilise différents outils endovasculaires, et des techniques pour extraire le thrombus de l'artère bouchée. Ce traitement est efficace dans 80 à 90% des cas. Cependant, le temps nécessaire au rétablissement de la circulation sanguine dans l’artère est parfois excessivement long, ce qui influence négativement l'évolution clinique des patients. Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ils sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils habituels et permettront d’améliorer la procédure en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en optimisant le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs, qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro, à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone qui ont démontré leur efficacité mais n’ont pas permis d'évaluer leur sécurité d’utilisation. En effet, ils pourraient engendrer des dommages au niveau de la paroi d’une artère réelle (dissection ou rupture). Par conséquent, l'objectif de notre projet est d’étudier l’impact de l’utilisation de ces dispositifs à visée clinique sur les parois artérielles réelles, étape indispensable pour leur développement futur. Nous envisageons de reproduire des procédures de thrombectomies chez l'animal (sous anesthésie générale) en utilisant les dispositifs en cours d'évaluation et de prélever les vaisseaux pour réaliser une analyse histopathologique des différentes couches de la paroi en accord avec d'autres études animales similaires de références.
Bénéfices attendus
L'expérience proposée est essentielle pour prouver l'efficacité et la sécurité de deux nouveaux dispositifs d’aide à la thrombectomie (action de déboucher une artère) pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC). En effet, les deux dispositifs que nous avons mis au point, associés avec les outils endovasculaires utilisés pour réaliser des thrombectomies standards, ont montré une bonne efficacité et même une amélioration de la procédure. Néanmoins la sécurité de ces dispositifs ne peut pas être évaluée in vitro et l’efficacité reste à confirmer in vivo. Notre étude comparera directement une procédure nouvelle d’un côté et la procédure standard de l’autre côté sur le même animal. Le gain de connaissances attendu par cette expérience permettra d’envisager une application future chez l’homme. L’apport de ce développement est significatif car le traitement des AVC aigüs représente un nombre important d’interventions dont les résultats cliniques à moyen terme sont directement liés aux aspects techniques de la procédure. Toute amélioration bénéficiera donc à ce domaine de recherche qui est très important en termes de santé publique. L’optimisation de ces dispositifs permettra in-fine d’améliorer le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et par conséquent les résultats cliniques pour les patients.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure expérimentale d'environ 4h00 et classée sans réveil. L’animal restera sous anesthésie générale et tous les prélèvements tissulaires seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure alors qu'ils sont sous anesthésie générale.
Remplacement
Notre étude consiste en l'évaluation in vivo de la sécurité et de l'efficacité de deux nouveaux dispositifs endovasculaires conçus pour améliorer les procédures de thrombectomie cérébrale. Ces dispositifs sont conçus pour être utilisés en conjonction avec les outils couramment utilisés pour la thrombectomie, en particulier les fils guides, les cathéters et les stentrievers. Ces deux dispositifs permettront d’améliorer la procédure de thrombectomie en renseignant l’opérateur sur la localisation du thrombus et en permettant d’optimiser le retrait de celui-ci. Ces deux dispositifs qui se trouvent encore dans une phase de développement, ont déjà fait l'objet de multiples évaluations in-vitro à l'aide de modèles d'artères cérébrales en silicone. Bien que tous les tests appropriés aient été réalisés pour évaluer l’efficacité des dispositifs, il est impossible d’estimer, dans un environnement in vitro ou in silico, si les dispositifs provoqueront une lésion de la paroi de l’artère traitée (dissection, rupture de la couche musculaire). Ainsi, la seule alternative restante pour évaluer l’impact sur la paroi artérielle est d’utiliser les dispositifs dans un organisme vivant et d'évaluer ses conséquences.
Réduction
Nous évaluerons sur les animaux l’efficacité des deux dispositifs dans les conditions les plus défavorables (caillots durs) car nous avons déjà évalué in vitro l’efficacité des deux dispositifs dans les cas favorables (caillots mous). Ceci permet de réduire le nombre de tests in vivo. Le nombre d'animaux sélectionné est aussi faible que possible pour évaluer la sécurité des dispositifs comme reporté dans des études similaires. Par conséquent, nous prévoyons 24 gestes de thrombectomie par dispositifs testés ce qui représente un total de 12 cochons répartis en 6 sessions de test. Le fait d’évaluer deux dispositifs sur le même animal réduit le nombre nécessaire.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront prises pour éviter les nuisances pour les animaux. Concernant l'hébergement de ces animaux, les mesures de raffinement seront mise place en amont : période d'acclimatation d'une semaine, hébergement en groupe afin de limiter leur stress. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Au cours de la procédure, les animaux seront anesthésiés profondément, avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés pour toute la durée des expériences. L’animal sera placé sous anesthésie générale avant de procéder à l’accès artériel fémoral et durant toute la durée de l’intervention jusqu’à sa mise à mort. Par conséquent, aucune expérience douloureuse ne sera ressentie par l’animal pendant les expériences.
Choix des espèces
Le porc convient à ce type d'étude car sa taille, son anatomie vasculaire et le diamètre de ses artères sont proches de celle de l’homme et permettent d’utiliser les mêmes cathéters et dispositifs interventionnels, dans les mêmes conditions de diagnostic et de surveillance (radiologie). Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois. A ce stade de développement les diamètres de vaisseaux correspondent à ceux de l’humain et permettent donc de réaliser l'étude dans de bonnes conditions.
Evaluation de l’autotransfusion par le système i-SEP dans un modèle de saignements massifs répétés d’origine cardiaque chez le cochon : comparaison avec un appareil de référence et effet sur le comptage plaquettaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
16 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une thoracotomie avec pose d'une canule dans l'oreillette droite du cœur, puis trois cycles de saignement massif et d'autotransfusion sous une anesthésie de dix heures, pour tester un dispositif d'autotransfusion avant une étude clinique. Le porteur décrit un choc hémorragique prolongé qu'il juge incompatible avec le réveil de l'animal. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle grand format proche de l'humain est "indispensable" et "sans méthode alternative".
Objectifs
L’autotransfusion consiste à collecter le sang du patient épanché lors de la chirurgie associé à un anticoagulant, à le traiter pour pouvoir réinfuser une grande partie de la portion cellulaire du sang (globules rouges en premier). Le sang collecté est transféré dans le module de traitement, concentré et épuré des molécules contaminantes (héparine, hémoglobine libre), pour obtenir un concentré de globules rouges et de plaquettes avant transfusion peropératoire. Le projet présenté développe un nouveau dispositif d’autotransfusion basé sur la filtration, autour d’un modèle chirurgical d’hémorragie massive chez le miniporc pour évaluer la sécurité et la performance du dispositif lors de nombreux cycles consécutifs. En particulier, il est indispensable d’étudier les paramètres suivants avant une nouvelle étude clinique : performances de l’aspiration (intégrée dans le dispositif) afin de libérer le champ opératoire du sang écoulé, les vitesses de traitement du sang après de nombreux cycles permettant de rendre rapidement le sang au patient limitant la transfusion homologue, l’effet sur la physiologie du patient de la transfusion de grands volumes de sang traité. Il est particulièrement indispensable d’éprouver cette nouvelle technologie par filtration lors de nombreux cycle en conditions chirurgicales pour vérifier la durabilité de la performance de filtration.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est de s’assurer d’une utilisation optimale du dispositif d’autotransfusion chez l’humain. En effet, il s’agit de garantir les performances et la sécurité du dispositif dans les cas de multiples cycles consécutifs, et de les comparer avec un dispositif de référence déjà sur le marché. Les hémorrhagies massives sont des cas rares mais particulièrement exigeants. En effet, la perte d’un important volume sanguin peut très rapidement dégrader l’état d’un patient et engager sa vie. Dans ces cas, il est indispensable que les performances du dispositif d’autotransfusion soient maintenues afin de rapidement rendre le sang au patient. De plus, la comparaison avec un dispositif de référence actuellement déjà sur le marché permettra de s’assurer de performances au moins égales ou supérieures du dispositif testé. Il a été montré que le dispositif testé permet de récupérer les globules rouges mais aussi les plaquettes. La récupération des plaquettes est significativement supérieure pour le dispositif testé par rapport au dispositif référence. Les échantillons sanguins prévus au cours des cycles de saignement et pendant le suivi post-opératoire permettront de tester la supériorité du dispositif testé sur la numération plaquettaire de l’animal lors du saignement de 80% du volume sanguin de l’animal.
Procédures
Une injection intra-musuclaire initiale sur animal vigile Sous anesthésie générale, procédure chirurgicale (thoracotomie avec pose d'une canule de prélèvement dans l'oreillette droite du coeur), cycle de saignement massif et d'autotranfusion: Une anesthésie de 10 heures, 4 heures d'instrumentation et procédures chirurgicales incluant les saignements répétés (3 cycles saignement/autotransfusion) Prélèvements sanguins dans un cathéter en place pendant toute la procédure sur animal anesthésié Euthanasie sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
L’objectif du modèle étant d’étudier la performance de la machine et la qualité diu sang retransfusé sur un saignement massif et prolongé dans des conditions extrêmes. Pour se faire, il est nécessaire de mettre en place une réanimation minimale évitant le développement d’une coagulopathie dilutionnelle et sans transfusion de plasma ni de concentré plaquettaire pour ne pas modifier les caractéristiques du sang auto-transfusé. Pour ces raisons, les animaux seront gardés sous anesthésie générale pendant la procédure puis sédation profonde/anesthésie légère pendant l’observation des effets post-transfusionnels avant d’être euthanasié. Ainsi la douleur sera prise en charge et le potentiel état de choc hémorragique sera pris en charge alors que l’animal restera inconscient.
Devenir
Euthanasie En raison de l’induction d’un choc hémorragique prolongé et de la nécessité d’une réanimation minimale (sans transfusion d’alloproduits sanguins de type plaquettes et plasma), il est jugé que ce modèle mis au point pour tester l’appareil dans des conditions extrêmes n’est pas compatible avec le réveil de l’animal.
Remplacement
La stratégie d’évaluation du dispositif développé doit conduire à la démonstration de sa sécurité et de ses performances en vue de l’obtention des autorisations réglementaires pour sa mise sur le marché. Cette stratégie a été discutée avec les autorités réglementaires et notamment l’ANSM. Les évaluations prévues ici consistent à reproduire des situations cliniques extrêmes grâce à un modèle d’hémorrhagie. L’utilisation d’un modèle animal grand format, proche de la situation chirurgicale et conditions d’analyses rencontrées chez l’Homme est indispensable, sans méthode alternative. En effet, l’anticoagulant contenu dans les poches de sang de donneurs utilisé pour les tests in vitro (citrate) est différent de celui utilisé en clinique lors des interventions chirurgicales (héparine). De plus, le sang épanché aspiré lors d’une chirurgie rentre brièvement en contact avec le milieu extravasculaire, ce qui est suffisant pour déclencher la cascade de coagulation ainsi que des méchanismes d’inflammation, dont l’origine est impossible à reproduire in vitro avec du sang anticoagulé au citrate.
Réduction
D’importantes étapes de mise au point in vitro et ex vivo d’échantillons sanguins fournis par EFS et Oniris respectivement ont permis de lever d’importants verrous technologiques et de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire. Le nombre d’animaux est fixé au minimum, tout en assurant l’analyse statistique des résultats obtenus et la pertinence clinique du projet. Un calcul statistique de l’effectif nécessaire a été effectué en prévision de l’étude : L’effectif necessaire pour démontrer la supériorité du dispositif test par rapport au dispositif référence pour la numération plaquettaire de l’animal est calculé d’après la formule suivante : n = f(α/2, β) × 2 × σ² / (μ1 − μ2)² où μ1 et μ2 sont les moyennes attendues pour le dispositif testé et le dispositif référence, σ est l’écart-type et f(α, β) = [Φ-1(α) + Φ-1(β)]², avec Φ-1 est la fonction de distribution cumulative d’un écart normal standardisé. Considérant un niveau de signification (alpha) à 5% et une puissance (1- β) de 90%, l’effectif total nécessaire est de 16, c’est-à-dire 8 pour le groupe du dispositif testé et 8 pour le groupe du dispositif référence. Références : Pocock SJ. Clinical Trials: A Practical Approach. Wiley; 1983. Julious SA. Sample sizes for clinical trials with Normal data. Statist. Med. 2004; 23:1921-1986. Sealed Envelope Ltd. 2012. Power calculator for continuous outcome superiority trial. [Online] Available from: https://www.sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/
Raffinement
En plus du raffinement des conditions d’hébergement, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données sur la numération plaquettaire, l’évaluation de l’hémostase et la biochimie de l’animal. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. De plus, les études préliminaires in vitro ainsi que la première étude comparative ont permis de raffiner les procédures réalisées et le protocole d’échantillonnage et d’analyse.
Choix des espèces
Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Animaux de grande taille, aspect anatomique proche de l’homme ; paramètres hémato- biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50 kg) ce qui représente un avantage lors des manipulations comparativement au porc charcutier qui peut doubler de poids sur la même période et à âge égal. Animaux adultes
Le Fingolimod, inhibiteur du métabolisme de la sphingosine 1-phosphate, comme stratégie thérapeutique pour traiter les calcifications vasculaires associées à l’insuffisance rénale chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
66 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Un régime enrichi en adénine provoque une insuffisance rénale chronique, puis un régime calcique induit des calcifications vasculaires, avant l'administration de fingolimod dont l'effet immunosuppresseur entraîne souvent une baisse persistante des lymphocytes. Les rats sont tués par anesthésie terminale au pentobarbital, avec un prélèvement de sang par ponction cardiaque et une nécropsie. Le porteur affirme qu'une vérification in vivo est nécessaire pour confirmer ses résultats in vitro et espère faire du fingolimod un traitement des patients insuffisants rénaux.
Objectifs
La calcification vasculaire (CV) est un processus actif de formation osseuse par des cellules locales, notamment des cellules du muscle lisse (CML), qui se transdifférencient en cellules calcifiantes entrainant l’apparition des dépôts de cristaux de calcium dans la paroi des vaisseaux. La CV est reconnue comme une complication majeure chez les patients atteints d’une insuffisant rénale chronique (IRC) en augmentant fortement leur morbidité dû à l’apparition des complications cardiovasculaires. Malheureusement, les mécanismes moléculaires impliqués dans la CV restent largement méconnus ainsi que des thérapies ciblées pour éviter sa progression. Nos résultats préliminaires montrent que des patients IRC sous hémodialyse avec un score modéré de calcification abdominale aortique, ont la concentration sérique de la sphingosine 1 phosphate (S1P), un lidpide bioactif, significativement augmentée par rapport aux patients sous hémodialyse sans calcifications. Nous retrouvons également cette augmentation dans le sérum d’un modèle murin d’IRC avec des CV, dans un modèle ex-vivo d’aorte calcifié ainsi que dans le milieu extracellulaire d’un modèle de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. De plus, nous avons impliqué plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P, dans le processus de transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Le but de ce projet de recherche est de déterminer si l’inhibition générale du métabolisme de la S1P avec l’immunomodulateur fingolimod a des effets délétères dans la calcification des aortes de nos modèles in vivo et ex vivo ainsi que dans la transdifférenciation des CML d’origine vasculaire en cellules calcifiantes.
Bénéfices attendus
Notre objectif est d’apporter une contribution importante dans la compréhension de la physiopathologie des CV associées à l’IRC ; l’axe S1P étant potentiellement impliqué dans la transdifférenciation des CML vasculaires ainsi que dans l’apparition et l’entretien de la calcification de l’aorte. La physiopathologie des CV associées à l’IRC est toujours méconnue et peu de données sont disponibles sur les mécanismes de la néoformation osseuse qui a lieu dans les vaisseaux. Aussi, nous allons évaluer l’impact du blocage de l’axe S1P sur les CV dans notre modèle murin d’IRC et particulièrement sur l’ossification ectopique de l’aorte. Le fingolimod, que nous utilisons dans ce projet comme inhibiteur général de la voie de la S1P, pourrait agir à la fois comme un inhibiteur de la CV ainsi que comme un immunomodulateur. A terme, nos données devraient permettre de valider l’intérêt thérapeutique de l'inhibition du métabolisme de la S1P pour prévenir ou traiter les CV chez des patients IRC et fournir des pistes pour améliorer la prise en charge médicamenteuse des patients, qui n’est actuellement pas entièrement satisfaisante.
Procédures
Néphrectomie chimique : Induction d'une IRC par régime enrichi en adénine (0,75% w/w). Un régime enrichi en adénine est une méthode non chirurgicale pour induire une IRC chez le rongeur (néphrectomie chimique). Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 0,75% (w/w) d'adénine (Sigma Aldrich) Ces régimes sont produits à façon par la société SAFE (Augy, France). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance. Induction des CV chez le IRC - Les animaux seront nourris pendant 4 semaines avec un régime alimentaire A04 supplémenté avec 1% (w/w) de calcium et 0.9%(w/w) de phosphore (Sigma Aldrich). Ce régime est produit à façon par la société SAFE (Augy, France). Ce régime est bien toléré par les animaux et n'induit pas de manifestation observable. Ils recevront 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) des injections intrapéritonéales de calcitriol (1,25-dihydroxycholécalciférol ou vitamine D3) (Rocaltrol, Roche) à la dose de 80 ng/kg afin de maximiser la fixation du calcium alimentaire. Le calcitriol est dilué dans du propylène glycol (injection 0,3mL/100 g) qui est un véhicule métabolisé et dépourvu de toxicité.
Impact sur les animaux
A cause de son action immunosuppressive, l’effet secondaire le plus fréquent et le plus préoccupant du fingolimod est une lymphopénie qui s’installe chez les animaux dès le début du traitement et qui persiste, très souvent, tout au long de l’étude. Il a été démontré que dans un modèle d’arthrite induite par le collagène, 4 semaines de traitement avec le fingolimod dans l’eau de boisson à 0,1 mg/kg/jour permettent de diminuer l’incidence de la maladie et de restaurer partiellement la qualité osseuse chez le rat. En même temps, cette dose n’affecte pas le nombre de monocytes ou neutrophiles présents dans le sang périphérique. Dans un modèle murin d’Alzheimer, la même dose de 0,1 mg/kg/jour de fingolimod, également administrée diluée dans l’eau de boisson, ne modifie pas le nombre de lymphocytes par rapport au nombre total de leucocytes, même après 28 semaines de traitement. De plus, la présence du fingolimod dans l’eau de boisson, ne modifie la prise d’eau quotidienne par les animaux. Nous attendons donc du traitement avec le fingolimod à faible dose pendant 5 ou 7 semaines, des effets sur les CV, sans induction de lymphopénie. La procédure expérimentale N°1 nous servira à choisir la dose de fingolimod la plus adaptée à utiliser dans la procédure expérimentale N°2 qui ne provoque pas de lymphophénie et qui ne modifie pas a priori la prise d’eau et/ou de la norriture à cause de son gout. Dans la procédure expérimentale N°2 nous utiliserons un regime à base d’adenine pendant 4 semaines pour provoquer une IRC irreversible. Cette procédure à recemment été validé et publiée par notre équipe (Skafi et al, J Cell Physiol, 2019). Le régime adénine est bien toléré par les animaux et n'induit qu'un léger ralentissement de la croissance pondérale lié à une moindre prise alimentaire résultant d'une nette différence de palatabilité entre les aliments. A l'issue du régime adénine, les animaux récupérent ce retard de croissance.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du protocole expérimentale par anesthésie terminale au pentobarbital sodique (60 mg/kg). Nous réaliserons également un prélevement terminal de sang par ponction cardiaque et une nécropsie (prélevement de différents tissus pour des études histologiques et biochimiques).
Remplacement
Nos résultats montrent qu’il existe un lien entre le métabolisme de la S1P et les CV dans l’IRC. Plusieurs partenaires de la voie métabolique de la S1P semblent être impliqués dans la transdifférenciation des CML en cellules calcifiantes. Des manipulations dans un modèle in vivo s’avèrent nécessaires pour vérifier nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Le ciblage global du métabolisme de la S1P avec le fingolimod semble être une approche idéale pour l’inhibition de la calcification à la fois in vitro et in vivo. Si les résultats s’avèrent concluants, le fingolimod pourrait devenir un traitement de choix pour les patients IRC dans le but de prévenir, diminuer ou ralentir l’apparition des CV et en conséquence diminuer les accidents cardiovasculaires et la morbidité.
Réduction
La procédure expérimentale N°2 ne sera réalisée que si la procédure expérimentale N°1 donne les résultats attendus. La procédure N°1 nous permettra de vérifier que la présence du fingolimod dans l’eau de boisson ne modifie pas la prise d’eau/croquettes quotidienne par les animaux et n’induit pas une lymphopénie.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’entretien des rats seront adaptés pour éviter des conditions délétères pour l’animal. Les animaux sont réceptionnés des établissements Janvier, deux semaines avant le début de l’expérimentation. La surveillance de l'environnement, fournitures et équipement auxquels les rats sont exposés est essentiel à l'entretien. L’état de bien-être est évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). De la nourriture sera disposée au fond de la cage par prévention dès la période de stabulation afin de permettre aux rats de se nourrir en cas d’apparition de douleur au cours des procédures. Une couche importante de litière sera mise au fond de chaque cage, et le non enfouissement des rats étant un signe de mal-être nous y ferons attention.
Choix des espèces
Le présent protocole sera conduit sur des rats Sprague-Dawley. Les rats IRC développent en 4-5 semaines des CV lorsqu'ils sont soumis à un régime enrichi en P/Ca et qu'il recoivent des injections calcitriol. L'incidence des CV dans cette population est supérieure à 60%. Les rats Sprague-Dawley procedant de Janvier arriveront à l’animalerie avec 6 semaines et seront stabulés 2 semaines avant le début des expériences. A 8 semaines, les rats sont considerés comme jeunes adultes en ayant adquis leur maturité séxuelle à environ 6 semaines. Les rats auront un poids d’environ d’environ 200-250 g à l’arrivée à l’animalerie et de 300-350 g au début des manipulations.
Fourniture de primates non-humains équipés en vue de raffiner la réalisation d’études extérieures
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
Macaques à longue queue : 150
Macaques rhésus : 50
Singes vervets : 50
300 primates non-humains, ouistitis, macaques et singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis transférés vivants vers d'autres laboratoires. Chez un fournisseur, chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale, jusqu'à deux heures, pour implanter des cathéters ou des dispositifs de télémétrie, avec douleur et inflammation à l'abdomen et aux membres et une mobilité réduite pendant sept jours. Le porteur présente cette préparation chirurgicale comme un "raffinement" bénéfique pour l'animal et le client, destiné à limiter les ponctions lors des études ultérieures. Les usages finaux, détaillés dans d'autres autorisations, ne figurent pas dans ce résumé.
Objectifs
La préparation des animaux chez le fournisseur en vue de l’utilisation chez les utilisateurs est une étape bénéfique pour l’animal et pour le client. Elle inclut l’équipement des animaux avec des dispositifs permettant de raffiner les études des utlisateurs. En effet, les dispositifs concernés permettront le suivi des paramètres physiologiques de manière non invasive ainsi que la réalisation d’administrations et/ou de prélèvements sanguins répétés en réduisant la douleur liée aux ponctions répétées.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de certaines études, le suivi des paramètres physiologiques (température, activité, ECG, pression artérielle…) est primordial non seulement en tant que variable de mesure mais également dans le cadre de l’application des points limites. L’implant de télémétrie permet de réaliser ce suivi de manière continue et non invasive sur un animal éveillé et libre de ses mouvements et représente ainsi un raffinement de l’étude. De la même manière, certaines études notament pharmacocinétiques peuvent nécessiter de nombreuses administrations ou prélèvements sanguins. L’implantation de cathéters à demeure avec chambre sous-cutanée permet de réaliser ces actes sur animal éveillé sans provoquer de douleur liée aux ponctions répétées. Ainsi, la fourniture de primates équipés permet de raffiner la réalisation d’études extérieures.
Procédures
Tous les animaux impliqués dans ce projet subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’implantation de matériel d’administration/prélèvement (durée maximum de la chirurgie: 2h) ou de monitoring des paramètres physiologiques (durée maxmimum de la chirugie 1h).
Impact sur les animaux
Stress dû à la contention et la capture, douleur et inflammation locale au niveau de l’abdomen liées à l’implantation du dispositif permettant de suivre les paramètres physiologiques de l’animal et douleur et inflammation locale au niveau des jambes liées à l’implantation des cathéters de prélèvement et d’injection. Durant 7 jours, l’animal peut présenter une réduction de la mobilité.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie après avis favorable d’un vétérinaire pour vérifier leur état de santé et autoriser le transfert des animaux chez le client réalisant l’étude.
Remplacement
Le primate est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies, comme par exemple les fièvres hémorragiques ou encore le SIDA, mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Tous les projets des équipes partenaires dans lesquels les animaux issus du présent projet sont utilisés font l’objet d’une autre autorisation de projet où sont détaillées les raisons pour lesquelles l’utilisation des animaux et donc des primates non-humains ne peut pas être évitée.
Réduction
Le nombre d’animaux déclarés dans ce projet est seulement une estimation à la hausse mais dépendra de la demande. Notre expertise et nos compétences dans le domaine nous permettent de limiter les complications opératoires et donc le nombre d’animaux nécessaires. D'autre part, nous réutilisons des animaux issus de projets antérieurs.
Raffinement
Chaque chirurgie d’implantation est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique appropriée et est supervisée par l’un des 3 vétérinaires du site. Ce projet ne nécessite pas l’isolement d’animaux, ils seront donc hébergés au minimum par paire. Un temps de récupération post-chirurgie de minimum 7 jours est laissé aux animaux avant tout transfert pendant lequel une surveillance accrue est mise en place pour vérifier l’absence de signes d’infection et de comportements anormaux évocateurs de douleur. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires…), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises…). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal du site.
Choix des espèces
A ce jour, le primate est le modèle de choix pour de nombreuses études notament dans le domaine infectieux par exemple mais également dans le cadre des études réglementaires de mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. Le choix de l’espèce utilisée par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifiée dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Animaux jeunes sevrés et adultes (soit entre 8 mois et 30 ans), dépendant des besoins des utilisateurs. Le choix du stade de développement des animaux utilisés par les équipes partenaires dépend de leurs recherches et est dûment justifié dans chaque autorisation de projet dont elles font l’objet. Nous apportons conseil et expertise au client pour un choix pertinent face à la question scientifique posée.
Etude de validation de la diffusion d’Angiotensine II et de Phenylephrine par implantation de mini-pompes osmotiques chez la Souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une minipompe est implantée sous leur peau par chirurgie pour diffuser deux molécules provoquant une hypertension, avec des échographies sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, avant mise à mort pour analyses. Le projet ne vise pas une connaissance nouvelle mais à vérifier la fiabilité du matériel servant à modéliser l'hypertension chez la souris. Le porteur juge cette étape "indispensable" pour valider ses futures études pharmacologiques.
Objectifs
Le but de ce projet est d'analyser de manière précise une modalité d'administration d'un mélange de composés utilisé chez la Souris pour modéliser l'hypertension. En effet, afin de reproduire des conditions pathologiques sur le modèle Souris, nous utilisons une diffusion continue d'une faible dose de deux molécules (Angiotensine 2 et Phenylephrine) dans la cavité péritonéale. Cette diffusion est gérée par une mini-pompe placée en sous-cutané, qui doit envoyer durant une période de 28 jours complets une concentration continue de la solution dans l'organisme afin de soumettre le système cardiaque à une surcharge vasculaire entrainant une hypertension. Ce protocole est ensuite utilisé pour modéliser les atteintes observées chez l'Homme afin d'étudier des gênes ou des composés potentiellement utilisables pour réduire ces symptomes. Néanmoins, nous avons observé dans une étude précédente que durant la dernière semaine de traitement, après le 21ème jour de diffusion, nous observions une forte réduction de l'hypertension sur une modèle génétiquement modifié. Cela nous questionne sur la durée réelle de diffusion des composés dans l'organisme. Pour répondre à ce point, nous souhaitons réaliser une étude de validation de ce protocole.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en évidence de manière robuste la variabilité expérimentale possible due au matériel employé pour modéliser l'hypertension chez la Souris. Cette étape est indispensable pour pouvoir poursuivre nos études pharmacologiques sur le modèle Souris et conclure sans équivoque sur les données générées dans ce cadre.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs échographies pour surveiller leurs fonctions cardiaques. Elle seront anesthésiée par voie gazeuse. Des prélevements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la décision du manipulateur, afin de favoriser le bien-être de l'animal (le prélevement vigile se fait à la veine temporale superficielle et s'avère moins stressant qu'une anesthésie gazeuse couplée au prélevement au sinus orbital) Une implantation de minipompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation sous-cutanée des mini-pompes. Celles ci restent sous la peau durant l'ensemble du projet, et ont une longeur de 3 cm et un diamètre de 0.7 cm. La chirurgie est simple et maitrisée pour cette implantation et aucune complication n'a été observée dans le projet précédent. Une couverture analgésique durant l'implantation et dans les jours suivant celle-ci, couplée à des conditions antiseptiques permettent de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions optimales. Suite à cette implantation, les animaux effectueront une anesthésie gazeuse pour passer une échographie cardiaque chaque semaine. Celle-ci dure environ 30 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Durant cette anesthésie, un prélevement sanguin à la veine temporale superficielle sera effectué.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques et histologiques.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à modéliser un phénomène cardiaque complet, à savoir la mise en place d'une hypertension, nous ne disposons pas actuellement de modèles alternatifs n'utilisant pas l'animal.
Réduction
Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 14 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 12 et 14 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 28 animaux recevant une minipompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).
Raffinement
Les animaux seront hebergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté. Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. Lors des échographies, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront agés de 1 an, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente.
Utilisation de sang d’ovins pour évaluer l’hémocompatibilité d’un système d’assistance circulatoire cardiaque gauche
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 brebis vont être utilisées dans des procédures classées légères, sans être tuées à l'issue. Chacune subit des prélèvements de sang à la jugulaire, jusqu'à 400 à 450 millilitres une fois toutes les trois semaines, pendant deux ans et demi, pour tester in vitro l'hémocompatibilité d'une pompe cardiaque. Le porteur indique que les brebis seront réhabilitées, replacées ou adoptées par une association en fin de projet si leur bilan sanitaire le permet. Il affirme avoir choisi l'ovin pour sa "docilité", l'accès facile aux veines et une coagulation proche de celle de l'humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif d'utiliser du sang frais prélevé chez des brebis, afin d’évaluer et d’améliorer les interactions entre le tissu sanguin et la pompe cardiaque dévelopée par notre partenaire. Cette dernière est un dispositif médical appelé “assistance circulatoire gauche”, ou “LVAD”, destiné aux personnes souffrant d’insuffisance cardiaque grave. Il s’agit d’une pompe mécanique implantée chirurgicalement dans le corps et destinée à pallier un cœur défaillant. Le LVAD développé a pour ambition de recréer fidèlement les phases de remplissage et d’éjection du cœur natif sans pour autant exposer le sang aux dommages causés par les pompes actuellement commercialisées. Afin d’évaluer cet aspect sur des prototypes avancés de LVAD en cours de développement, puis dans le cadre de leur évaluation pré-clinique, il est nécessaire d’utiliser du sang frais prélevé dans des conditions permettant de préserver toutes ses caractéristiques biologiques.
Bénéfices attendus
Il est essentiel de caractériser les interactions des pompes LVAD avec le sang afin d’évaluer et de prévenir les risques d’hémolyse (destruction des globules rouges), de formation de thrombus dans la pompe (caillot), ou de dégradation de protéines sanguines essentielles. Les essais d’hémocompatibilité in vitro permettent de caractériser ces aspects dans des conditions contrôlées. Cependant, la qualité et la fraicheur du sang utilisé sont essentielles dans la réalisation de ces tests. Il est donc nécessaire de prélever le sang par ponction veineuse afin de minimiser les risques d’activation et de contamination extérieure. La norme en vigueur recommande l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin pour la réalisation de tests d’hémocompatibilité sur des pompes cardiaques car le tissu sanguin de ces animaux est très similaire à celui des humains. De plus l’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de ml) sans préjudice pour l’animal. Dans ce projet des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et des mécanismes de l’arrêt de l’écoulement du sang comparables à ceux observés chez l’humain.
Procédures
Un prélèvement sanguin par ponction veineuse au niveau de la veine jugulaire de moins de 10% du volume total (environ 400-450 mL) jusqu’à un maximum d’une fois toutes les 3 semaines pendant 2 ans et demi, pourvu qu’aucun point limite n’ait été atteint.
Impact sur les animaux
Les brebis pourront ressentir un peu de fatigue à la suite du prélèvement sanguin, comme tout un chacun à la suite d'un don de sang. Alimentation et abreuvement seront disponibles à volonté pour tous les animaux prélevées. Dans le cadre de ce projet le prélèvement de sang se limitera à 10% du volume sanguin total, et 3 semaines minimum de repos seront respectées entre chaque prélèvement. L'état des muqueuses des animaux ainsi que leurs numérations de formules sanguines seront controlées régulièrement afin de dépister toute survenue éventuelle d'anémie
Devenir
Toutes les brebis seront réhabilitées/replacées ou adoptées (par une association de protection animale qui gère la réhabilitation des animaux de laboratoire), dans la mesure où leur bilan sanitaire nous y autorisera, en fin de procédure.
Remplacement
L'étude des interactions biologiques entre le LVAD CorWave et le sang est réalisé in vitro mais nécessite d’avoir recours à du sang frais prélevé chez des animaux vivants. Bien que la pompe CorWave soit développée en amont à partir de simulations numériques et de tests hydrauliques in vitro de pointe, ces derniers ne permettent pas dans l'état actuel des connaissances d’évaluer les interactions biologiques complexes avec le sang.
Réduction
Les dispositifs LVAD sont conçus pour pomper 5L de sang dans un organisme humain. Le nombre d'animaux impliqués dans le projet sera réduit au minimum grâce à l'utilisation de systèmes de test in vitro des dispositifs LVAD exploitant de faibles quantités de sang. Les tests in vitro de ces dispositifs réduisent les volumes de sang nécessaires à quelques centaines de millilitres par dispositif testé, réduisant ainsi la fréquence et le volume des prélèvements sanguins à effectuer. Un volume de 2 L permet ainsi de comparer 4 designs de pompe différents en une semaine.
Raffinement
L’étude de l’hémocompatibilité du LVAD in vitro à partir de sang prélevé par ponction veineuse permet de réduire le recours à des études d’implantation in vivo de classe « sévère » ou « sans réveil ». L’utilisation d’ovins se limite ainsi dans ce projet à une procédure expérimentale de classe « légère » qui ne devrait pas avoir d’incidence sur l’état général des animaux. Aucune souffrance ou stress significatif n’est attendu dans ce projet. Des ovins ont été choisis pour leur docilité, l’accès facile aux veines jugulaires et une hémostase comparable à celle de l’Homme. Les animaux seront hébergés en troupeau et placés au maximum en situation d'éco-paturage en extérieur. Ils ne seront isolés que le temps du prélèvement sanguin.
Choix des espèces
L’utilisation des gros animaux permet d’obtenir de grandes quantités de sang (quelques centaines de mL) sans prejudice pour l’animal. Les normes en vigueur recommandent donc l’utilisation de sang bovin, porcin, ou ovin. Des brebis adultes seront utilisées afin de pouvoir prélever le volume de sang nécessaire sans affecter la santé de animaux.
Etude en IRM de l’effet d’un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines sur la formation de l’œdème cérébral chez le rat en cas d’ischémie cérébrale transitoire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
31 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, 26 dans des procédures classées sévères et 5 tués sans réveil comme témoins. Chez les 26 premiers, un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivie de deux passages en IRM, pour étudier l'œdème cérébral et un candidat-médicament. Le porteur indique un taux d'échec de 30 %, dont 25 % de mortalité, et cite parmi les atteintes l'hypothermie, des difficultés à se nourrir et une douleur liée à l'œdème. Il revendique un modèle in vivo "indispensable", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui les mécanismes entre cerveau et sang.
Objectifs
La World Stroke Organization rapporte 13.7 millions d'Accidents Vasculaires Cérébraux chaque année, dont 5.5 millions sont fatales. 80% des AVC sont d’origine ischémique (AIC) et sont causés par l’obstruction d’un vaisseau sanguin cérébral. Cette interruption de la circulation sanguine bloque l’apport d’oxygène et de glucose nécessaire à l’activité cérébrale, endommageant progressivement les cellules et formant un œdème cérébral avec une composante cellulaire et une composante vasculaire. Les premières heures qui suivent un AIC sont déterminantes quant à ses conséquences, mais les approches thérapeutiques actuelles sont limitées dans le temps et ne peuvent contrer l’œdème qui ne peut être soulagé que par une chirurgie décompressive invasive : l’hémicrâniectomie. L’objectif aujourd’hui pour la recherche est de proposer un traitement neuroprotecteur permettant d’élargir cette fenêtre thérapeutique en protégeant les cellules et en limitant l’œdème cérébral. Notre équipe travaille sur un candidat médicament répondant à ces attentes. C'est un inhibiteur de kinases cyclines dépendantes dont les effets neuroprotecteurs et anti-œdémateux à 24 et 48h post-AVC ont été montrés dans différentes études indépendantes dans un modèle d’ischémie cérébrale focale transitoire chez le rat. Nos résultats histologiques préliminaires indiquent un effet potentiel de notre molécule sur l'œdème cellulaire. D'autre part, les biomarqueurs de pathologie neurodégénératives constituent un axe de recherche aux enjeux majeurs, cependant ils ne sont pas encore appliqués aux AVC. De plus en plus de recherches suggèrent que certaines molécules anormalement présentes dans le sang en cas d'AVC pourraient être utilisées pour le diagnostic et le suivi de cette pathologie. Parmi environ 150 candidats, nous avons sélectionné l'aquaporine-4, un canal perméable à l'eau situé à l'interface entre le sang et le cerveau particulièrement impliqué dans l'œdème cérébral et dont la présence dans le sang a récemment été rapportée dans une étude pilote chez l'homme. Cette étude a 2 objectifs : 1) évaluer l'effet de notre candidat médicament sur la formation de l’œdème cellulaire cérébral à un stade précoce de l’AVC en imagerie par IRM ; 2) identifier un potentiel marqueur sanguin de l’AVC chez le rat.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra dans un premier temps d’étudier l'effet de notre candidat médicament sur l'œdème cérébral en cas d'AVC ischémique en IRM. L’impact de notre molécule sur l’œdème n’a jamais été mesurée par cette technique. Dans un second temps, la comparaison des taux d’aquaporine 4 dans le sang des différents groupes nous permettra d’identifier un potentiel marqueur de l’AVC et d’investiguer l’effet de notre traitement sur ce marqueur. A terme, ce projet pourrait mener au développement d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement des AVC.
Procédures
Au total, 31 rats mâles Sprague-Dawley adultes (6-8 semaines) seront utilisés dans cette étude, et inclus dans une procédure 1 intitulée « Etude de l’oedème cérébral en IRM après induction d’une ischémie cérébrale transitoire chez le rat ». Cette procédure comprend l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) permettant de reproduire un AVC ischémique (~30min), l’administration en aveugle du traitement ou de son placebo (~15min), deux passages à l’IRM (~30min chaque) à 6h et 24h post-AVC et la mise à mort des rats. Trois groupes de rats seront distingués au cours de cette procédure : un premier groupe de 13 rats recevra le traitement, un second groupe de 13 rats recevra le placebo, et un troisième groupe de 5 rats sera seulement mis à mort pour constituer un groupe contrôle sans AVC ni traitement. Ces rats contrôles ne passeront pas d’IRM. Par ailleurs, l’atteinte d’un point limite au cours du protocole entrainera la mise à mort immédiate de l’animal.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales ont été conçues de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. La procédure a un taux d’échec de 30% : la chirurgie du modèle d’ischémie cérébrale par occlusion temporaire de l’artère cérébrale moyenne via l’insertion d’un filament dans l’artère carotide externe est un modèle complexe qui a un taux de mortalité de 25% et un risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique de 5%. Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) Une hypothermie : au cours de la chirurgie, le risque d’hypothermie est strictement monitoré à l’aide d’une sonde rectale et d’un tapis chauffant, cependant certains rats peuvent avoir du mal à réguler leur température corporelle après la chirurgie, c’est pourquoi des mesures seront prises pour prévenir tout risque d’hypothermie jusqu’à la mise à mort des animaux. (2) Une diminution de leur capacité à se nourrir et à s'abreuver : la zone d’opération se trouvant au niveau des muscles mandibulaires, les rats peuvent avoir du mal à mastiquer et à se redresser pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau. (3) Une douleur céphalée conséquente à l’œdème cérébral apparait dans les premières heures après la chirurgie. L’intensité de cette douleur dépend du degré de sévérité de l’AVC et est évaluée lors du test de suspension par la queue. Cette douleur peut également gêner le redressement pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau, malgré l’analgésie mise en place post-chirurgie. (4) Une gêne pour se déplacer : une paralysie de la patte avant droite apparait au cours des premières heures après la chirurgie. Cette atteinte est plus ou moins importante selon le degré de sévérité de l’AVC et est mesurée dans le neuroscore via le test de rotation. (5) Un stress au cours au transport : 5h et 24h après la chirurgie, les animaux seront transportés vigiles à l’aller et au retour dans une cage de transport entre l'animalerie et l'IRM. Ces quatre trajets de 10-15 minutes en voiture peuvent engendrer un stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente selon une méthode de mise à mort réglementaire et les informations sont conservés pour les contrôles de la SBEA, du vétérinaire référent de l'établissement ou des services vétérinaires départementaux.
Remplacement
S’il existe des modèles alternatifs in vitro recréant des conditions ischémiques sur des cultures de cellules cérébrales, ils ne permettent pas d’étudier les mécanismes inflammatoires complexes et coordonnés entre différents tissus (cerveau-sang), formés de multiples types cellulaires, ni le développement de l’oedème cérébral et sont donc inappropriés à notre étude. De plus, ce projet s’inscrivant dans la continuité de notre étude de l’effet du traitement test sur le cerveau du rat en cas d’AVC, il est indispensable d’utiliser le même modèle expérimental pour intégrer et comparer nos résultats. Cependant, en accord avec les exigences de remplacement et de réduction, des tests in vitro ont préalablement permis de sélectionner la molécule traitement parmi plusieurs candidats médicaments et de définir une gamme étroite de concentrations efficace in vivo.
Réduction
Un test sur un rat mort récupéré de notre précédent projet a été effectué au préalable pour vérifier la faisabilité de l’expérience et mettre au point les paramètres de l'IRM, évitant l'inclusion de rats supplémentaires dans l'étude pour le réglage de l'IRM. La procédure n°1 d’étude de l’effet du traitement sur l’oedème est réalisée sur le nombre d’animaux minimal tout en permettant d’accomplir son objectif. D’après nos précédentes études et en se basant sur la méthode statistique d'estimation développée par Noordzij et al. (2010), un effet sur l’oedème cérébral est observable et significatif à partir de 8 rats par groupes. L’induction de l’ischémie cérébrale a un taux d’échec d’environ 30%, comprenant la mortalité (25%) et le risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique (5%), c’est pourquoi nous prévoyons 13 rats par groupes. Nous estimons que 5 rats non ischémiés seront suffisants à l’acquisition de données de « contrôle » étant donné qu’il n’y a aucun risque de perte. Les tests statistiques utilisés par la suite seront Student ou ANOVA (données paramétriques), ou Mann Whitney ou Kruskal-Wallis (données non paramétriques).
Raffinement
Pour limiter leur stress et selon les mesures de raffinement, une période d’acclimatation de 1-2 semaines sera respectée à leur arrivée. Les rats opérés seront gardés par 2 pour réduire leur stress avant et après chirurgie. Le transport en voiture entre l’animalerie et l’IRM pouvant engendrer un stress chez l’animal, un temps de calme de 20-30min sur tapis chauffant sera respecté avant toute manipulation de l'animal à l’aller et au retour. Au cours de la chirurgie, l’hypothermie est compensée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermostaté à 37°C relié à une sonde rectale et par une couverture de survie. Après la chirurgie, la cage des rats sera posée sur un tapis chauffant à l’animalerie et à l’IRM pendant les phases de calme et de réveil de l’anesthésie. Un pack de gel chauffé à 30-37°C sera placé dans le fond de leur cage pendant leur transport et sous leur ventre pendant les 30 minutes d’IRM. Pour contrer les difficultés à se nourrir et à s’abreuver après la chirurgie, des pipettes à tige longue seront mises à leur disposition et des croquettes humidifiées (pellets mélangés à de l’eau) seront placées dans le fond de leur cage. L’option des DietGels a été écartée puisqu’ils contiennent du glucose, composé influençant le volume de l’œdème ; les alternatives sans glucoses ont été testées mais les animaux ne s’y intéressent pas. En accord avec le vétérinaire référent, une stratégie d'analgésie par injection sous-cutanée de lurocaïne 0,5% (7mg/kg) préopératoire sur le site d’incision associée à la buprénorphine post-opératoire (0,03-0,05mg/kg 2x/jour) a été privilégiée. Du gel ophtalmique sera également appliqué avant la chirurgie afin de protéger les yeux des animaux. Ils bénéficieront d'un soin adapté par l'utilisation d'anesthésique et analgésique avant l’IRM et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 6-8 semaines, pesant 320g +/- 40g, notre étude principale portant sur des pathologies principalement observées chez l’adulte et visant à traiter les patients victimes d’un AVC. Nous avons choisi la même espèce de rat pour cette étude pilote que pour nos études sur l'AVC puisqu'il s'agit d'une mise au point propre à l'espèce. Nous travaillons sur un modèle d'ischémie focale transitoire chez le rat, espèce que nous avons sélectionnée pour son système vasculaire cérébral très similaire à celui de l’homme, en faisant un modèle de choix pour reproduire un AIC. De plus, ce type d’ischémie cérébrale est déjà bien décrit chez le rat et de nombreuses données sont disponibles, nous permettant d’anticiper et de comparer nos résultats. Le rat est également l’espèce de référence dans les études de pharmacologie et les études précliniques. L’utilisation du rat évite de mettre en place de nouvelles études préliminaires pour valider le modèle, et donc d’augmenter le nombre d’animaux nécessaire.
Pharmacologie : Etude de deux composés anti-obésité en développement chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
6 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une semaine d'habituation, ils reçoivent des composés par voie orale puis subissent des prélèvements sanguins rapprochés jusqu'à 24 heures par la veine caudale, avant euthanasie au pentobarbital. L'étude, commanditée par une société cliente, vise à caractériser deux candidats médicaments anti-obésité avant essais cliniques. Le porteur indique que la répétition des prélèvements est source de stress et d'angoisse, et justifie le choix du rat par un volume sanguin supérieur à celui de la souris.
Objectifs
Le projet vise à étudier deux composés en développement chez le rat sain. L'objectif est de sécuriser le développement de composés d'intérêt thérapeutique avant leur passage sur l'animal pathologique et avant le stade d'études cliniques. Cette étude est commanditée par une de nos sociétés clientes, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de préciser les paramètres pharmacocinétiques des composés en développement. Ainsi, les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination seront déterminés. Il s'agit ici de sécuriser le développement d'un candidat médicament anti-obésité, notamment en priorisant les composés les plus prometteurs avant passage aux études d'efficacité et aux études clinique. Les données obtenues permettront également de définir les doses a utiliser dans la suite des études.
Procédures
Pendant 7 jours (de D-7 à D-1), les animaux seront soumis à des administrations du véhicule (composé de référence) per os quotidiennement dans le but de les habituer à ce type d'administration. A D1, des prélèvements sanguins de 150µL par la veine caudale seront effectuées avant l'administration per os puis à 15min, 30min, 1h, 3h1 8h et 24h après.
Impact sur les animaux
La répétition rapprochée de certains prélèvements sanguins sera la source de stress et d'angoisse de l'animal même si l'animal aura été préalablement habitué au tube de contention. Aucune nuisance n'est attendu sur l'administration des composés et les animaux ayant subi une phase d'habituation seront donc acclimatés à l'administration par voie orale et au tube de contention pour prélèvement sanguin.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par injection intraperitonéale de solution de pentobarbital (Euthasol, 250mg/kg)
Remplacement
L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques se justifie ici car pour étudier l'effet de l'organisme sur le composé à visée thérapeutique, il est nécessaire d'utiliser un modèle vivant. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de déterminer ce que l'organisme fait au médicament et donc les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ainsi, le nombre d'animaux utilisé a donc été réduit en comparaison avec la souris.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les phases d'acclimatation (de D-12 à D-8) et d'habituation (de D-7 à D-1) permettent d'éviter tout angoisse de l'animal pendant la phase d'expérimentation. Les rats seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes. Les expérimentateurs en charge des administrations orales et des prélèvements sanguins sont rodés à ce type de pratique.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ce modèle a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés sont de jeunes rats adultes (201-225g à réception correspond environ 7-8 semaines). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte.
Imagerie coronaire du greffon cardiaque sur machine de perfusion ex vivo
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
22 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une coronarographie puis une ouverture du thorax, avant exsanguination et prélèvement du cœur, en une intervention d'environ 90 à 120 minutes. Le porteur cherche à valider un protocole d'imagerie des artères coronaires sur une machine de perfusion cardiaque, pour mieux évaluer des greffons avant transplantation. Il affirme que les petits animaux n'offrent pas un système vasculaire assez proche de l'humain et retient le porc, livré à environ 55 à 60 kg.
Objectifs
Les objectifs de notre étude sont les suivants : 1)Valider un protocole de coronarographie sur machine de perfusion cardiaque ex vivo ; 2)Définir un profil de biomarqueurs pour les dommages cardiaques induits par une exposition à des doses de RI faibles à modérées en caractérisant et en identifiant la cinétique des biomarqueurs circulants après irradiation du cœur perfusé ex vivo ; 3)Etudier la biodistribution du produit de contraste iodé et son impact sur la qualité de perfusion ex vivo et la viabilité myocardique ; 4)Etudier la faisabilité d’approches non invasives alternatives à la coronarographie pour le dépistage de la maladie coronaire sur le cœur perfusé ex vivo : application du coroscanner et de la micro-vasculoscopie.
Bénéfices attendus
La transplantation cardiaque est le traitement de référence de l’insuffisance cardiaque avancée avec un taux de survie >60% à 10 ans. Nous proposons dans ce projet de recherche de valider un protocole d’imagerie coronaire ex vivo par coronarographie, mais également d’évaluer la faisabilité du coroscanner dans cette indication ce qui permettrait d'évaluer correctement les greffons cardiaques préservés sur machine de perfusion ex-vivo avant la transplantation.
Procédures
L'ensemble des animaux seront soumis, sous anesthésie générale à coronarographie suivie d'une sternotomie médiane, avant exsanguination et prélèvement cardiaque. La totalité de la procédure sous anesthésie générale sera d'environ 90-120 min.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure.
Devenir
L'ensemble des procédures impliquent l'explantation du coeur ce qui rend la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux inenvisageable.
Remplacement
Nous avons pratiqué une expérimentation préliminaire sur modèle in silico simulant la position du cœur sur la machine de perfusion lors d’une exposition aux rayonnements faiblement ionisants.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire pour déterminer le protocole d’acquisition des images coronarographiques qui sera ensuite appliqué dans chacun des groupes (incidence des acquisitions, dose irradiée, quantité d’agent de contraste). Le nombre d’animaux par groupe sera fixé à 6 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Au total 22 animaux seront utilisés pour cette étude.
Raffinement
Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum. Privilégier les ponctions vasculaires (artérielles et veineuses) percutanées échoguidées afin de réduire la souffrance, le risque de saignement et le risque infectieux.
Choix des espèces
Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: -Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir un système vasculaire suffisamment proche de l'Homme (vaisseaux trop petits principalement), et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux -Le porc est un modèle de référence pour les procédure endovasculaires, bien documenté. Son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation de la coronarographie et des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour sa perfusion isolée ex vivo. La modélisation chirurgicale est facilitée par l’usage du gros animal, ce qui contribue à limiter le nombre d'aniamux nécessaire. Les porcs sont livrés à environ 16 semaines d'âge soit environ 55-60 kg afin de faciliter les abords vasculaires périphériques par voie percutanée et d'avoir des diamètres de vaisseaux compatibles avec les dispositifs à évaluer.
Contrôle optique aigu de l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
110 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une ouverture de la cage thoracique et un enregistrement de l'activité cardiaque de moins de quarante-cinq minutes, avant l'euthanasie. Le porteur indique tester des peptides rendus sensibles à la lumière pour contrôler optiquement le rythme cardiaque, et affirme que seule l'expérimentation animale permet de valider l'intérêt clinique de l'approche. Il s'agit d'une preuve de concept, les perspectives thérapeutiques étant renvoyées à des étapes ultérieures.
Objectifs
Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement et in vivo l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat sauvage en utilisant des peptides préalablement rendus photo-sensibles. Les composés sont injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm permet un clivage du groupement protecteur et donc l’activation du peptide dans les zones illuminées uniquement. Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera par la suite possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement électrocardiographique 6 dérivations. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une thoracotomie. La gestion préopératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Il s’agit d’une procédure sans réveil qui ne nécessite donc pas d’analgésie post-opératoire. Une étude précédente a démontré en aigu et chez la souris, l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégé comme réalisé dans cette étude. De plus l’ensemble de la procédure sera faite sous anesthésie avec sacrifice de l'animal en fin d'examen.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés par injectionintrapéritonéale de dose léthale de pentobarbital sodique (120 mg/kg) après sédation.
Remplacement
Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 110 rats seront utilisés dans cette étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les rats du groupe contrôle et ceux recevant une illumination apparait (une valeur de p
Raffinement
Avant la procédure, Les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (isoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables sous anesthésie, comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable ou bien une extubation de l’animal conduirait à une euthanasie de celui-ci.
Choix des espèces
Le rat constitue un bon modèle pour l’études des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 8-10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux.
Accélération de la cardiomyopathie dans un modèle rat de la glycogénose de type III et test de stratégies de thérapie génique basées sur les vecteurs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation sous la peau de pompes délivrant de l'angiotensine II pour accélérer une atteinte cardiaque, puis des prélèvements de sang, des épreuves de course sur tapis roulant et des échographies sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la glycogénose de type III. Le porteur indique attendre un possible dommage rénal lié à l'angiotensine, jugé limité par la durée courte d'administration. Il affirme que le mécanisme de défense contre les virus est "impossible à recréer en laboratoire" et que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
-Etudier l’efficacité d’une approche de thérapie génique pour la glycogénose de type III (GSD III) dans un nouveau modèle rat de la pathologie présentant une hypertrophie du ventricule gauche à 9 mois. -Administration de l'Angiotensine II pour accélérer le développement du phénotype cardiaque afin d’évaluer l’effcicacité des produits de therapie génique sur le traitement ou la prévention de l’apparition de la pathologie cardiaque.
Bénéfices attendus
Développement d’un traitement de thérapie génique pour la glycogénose de type III
Procédures
-Implantation de les pompes d’Ang II. Procédure chirurgicale légère car l’implantation se fait sous le peau. La procédure d'implantation durera 10 minutes maximum. Les pompes resteront sous le peau un maximum de 14 jours. -Prélèvements du sang sont réalisés sur animal anesthésié lors d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire ou sur animal vigile à la veine sous-maxilliare. La procédure de prélèvement de sang est rapide, 5 minutes maximum de l’endormissement de l'animal à son réveil après le prélèvement. Pour le prélèvement dans la veine sous-mandibulaire, le prélèvement durera entre 30 sec et 1min maximum. -Evaluation fonctionnelle: tapis roulant (course maximum 10 minutes) et wirehang (moins d'un minute). -Echocardiographie et ECG sur animaux anesthésiés : la durée maximale sera de 15 minutes pour chaque procédure de l’endormissement au réveil de l’animal après les examens.
Impact sur les animaux
Le dommage collatéral que pourrait causer l’administration d’Ang II pourrait être le développement d’un dommage rénal, car l’effet direct est l’augmentation de la tension artérielle. Par contre on n'éspère pas avoir un dommange rénal car le temps de dosage sera que de 15 jours.
Devenir
Ils seront éuthanasiés par surdosage d’anesthésique (0,35 ml/kg d'EUTHASOL en tant que 140mg de pentobarbital sodique par kilo) à la fin du protocole afin de prélever les tissues: coeur, foie et muscles squelettiques pour analyser en premier lieu l'accelaration de la cardiomyophatie avec l'infusion de la AngII (fibrose et hypertrophie des cardiomyocites), asin que la correction par nos produits de therapie genique de la cardiomyopathie et de la pathologie musculaire et du foie présent chez les patients GSDIII et que le modèle de rat reproduit.
Remplacement
Dans le cas particulier des maladies génétiques, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le cDNA de l’enzyme GDE (enzyme de débranchement du glycogène) jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire. Le recours à l'animal est donc indispensable pour vérifier le pouvoir thérapeutique des virus modifiés que nous utilisons. Nous testerons les virus que nous avons sélectionnés après nos premières expériences réalisées sur des cellules: tous les virus qui ne produisaient pas suffisamment d’enzyme GDE fonctionnelle ont ainsi été éliminés.
Réduction
Lors de la procédure 1, nous identifirons la dose, l’âge et le temps d’administration optimals de l’Ang II, cela nous permettra d’utiliser ces paramètres dans les procédures suivantes. Nous réaliserons une analyse statistique afin d'avoir le nombre d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée. Nous avons utilisé un test unilatéral standard de comparaison des moyennes afin d’avoir 90% de chance (Z1-β=-1.282) de détecter une baisse de la force chez le rat GSDIII avec un risque d’erreur de 5% (Z1-α =-1.645). Formule : n=2*((σ²/Δ²)*(Z1-α+Z1-β)²) - σ :déviation standard attendue (σ=0,261) - Δ : différence entre les moyennes (Δ=0,4998) D’où n=5 rats GSDIII par groupe.
Raffinement
Prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire sur rat vigile ou à la queue sur rat anesthésié pour mésurer la glycemie. L'échocardiographie est non invasive et sans douleur, mais pour réaliser cet examen dans les meilleures conditions pour les animaux, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse, ça sera aussi le cas pour l'ECG. La minipompe d’Ang II est placée sous la peau des rats anesthésiés par voie gazeuse.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle rat car dans un autre modèle rat de glycogénose de type II (maladie de Pompe), une atteinte cardiaque majeure a été identifiée. Le rat GDS III est le modèle de la glycogénose de type III, voilà pourquoi nous utiliserons ce rat et non le rat GDS II qui est le modèle pour la glycogénose de type II. De plus, le modèle rat a une taille qui permet de mieux étudier la morphologie du coeur par échocardiographie. Les procédures 1-2 nous permettront de définir la dose et le temps d'administration de l'Ang II ainsi comme la durabilite du phenotype apres l'enlevement des pompes. L'expérience que nous avons chez la souris et les rats nous a montré que les animaux accumulent du glycogène à partir de la naissance et qu'ils montrent un phénotype d'hypoglycemie à partir de 6 semaines. Donc nous utiliserons des rats de 6 semaines minimun.