Troubles immunitaires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Une biopsie d'oreille à l'emporte-pièce, l'amputation de l'extrémité de la queue ou un prélèvement de sang sur animal éveillé : 9 600 souris vont subir ces gestes de génotypage dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces gestes ne produisent aucune donnée expérimentale par eux-mêmes, ils servent à connaître les caractéristiques génétiques des lignées transgéniques entretenues par l'établissement pour ses équipes de recherche. Le porteur compare la douleur provoquée à celle d'une injection avec une aiguille. Les souris dont le génotype se révèle sans intérêt sont mises à mort, les autres restant en vie comme géniteurs ou pour être engagées dans des expériences ultérieures.
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.
Étude des mécanismes de modification de la réponse immunitaire par l’influence de cellules mémoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.
Bénéfices attendus
Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.
Procédures
Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).
Impact sur les animaux
Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées
Remplacement
Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.
Réduction
Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.
Raffinement
Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Un modèle poisson pour tester des agents à visée thérapeutique dans le syndrome Kabuki
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.
Objectifs
Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.
Procédures
L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (
Impact sur les animaux
La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.
Remplacement
Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.
Réduction
Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.
Raffinement
Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Prélever un fragment d'oreille, un bout de queue ou du sang pour lire le patrimoine génétique de chaque animal : la finalité de ce projet est l'intendance d'un élevage de lignées transgéniques. 88 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les prélèvements se font sur animal vigile, à l'emporte-pièce métallique pour l'oreille, en moins de trente secondes. Une partie des souris est tuée pour analyses post-mortem ou parce que son génotype ne présente pas d'intérêt, les autres restent en vie pour d'autres expériences ou comme géniteurs, et le porteur qualifie ces lignées de modèles "indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage .
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.
Modèle murin de lésion de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 250 souris vont être utilisées, dont cinquante pour entraîner le geste chirurgical et quinze par donneur humain, avec des mises à mort échelonnées sur trois dates. Une partie est immunodéficiente, donc exposée aux infections et aux tumeurs, ce que le porteur nomme un phénotype dommageable. Chacune subit deux chirurgies de la moelle épinière à quarante-huit heures d'intervalle, l'une pour détruire la myéline, l'autre pour y greffer des cellules immunitaires humaines, puis des tests de traversée d'une barre crantée et de force des pattes avant. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour fabriquer le modèle animal de sclérose en plaques qui manque aujourd'hui.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central. Dans cette pathologie les macrophages et lymphocytes du sang pénètrent le cerveau et la moelle épinière et viennent détruire une composante essentielle du système nerveux : la myéline. On distingue différent type de lésions décrites chez les patients atteints de sclérose en plaques. Un type de lésion en particulier est associé à une maladie plus agressive. Mais, à l’heure actuelle, aucun modèle animal ne permet l’étude de ce genre de lésion. L’objectif de ce projet sera de développer un nouveau modèle animal de lésions chroniques actives afin d’étudier la formation et l’évolution de ces lésions que l’on observe chez les patients atteints de forme agressive de la maladie.
Bénéfices attendus
En France, plus de 130 000 personnes vivent avec la sclérose en plaques (SEP), une maladie qui touche 2,8 millions de personnes dans le monde. Elle est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans, mais peut aussi apparaître plus tôt ou plus tard. Chaque année, 5 000 nouveaux cas sont recensés en France. La SEP concerne principalement les femmes (trois malades sur quatre), mais leur progression vers le handicap est plus lente que chez les hommes, qui présentent un risque plus élevé de complications neurologiques. Il existe deux formes principales de la maladie : La forme rémittente (RR) : elle évolue par poussées, avec des symptômes qui apparaissent puis disparaissent. C'est la forme la plus fréquente et elle débute souvent entre 25 et 35 ans. Avec le temps, elle peut évoluer vers une forme plus sévère. La forme progressive (PP) : plus rare, elle se développe généralement après 40 ans et entraîne un handicap progressif, sans poussées distinctes. Les traitements actuels sont efficaces pour la forme rémittente, mais restent très limités pour la forme progressive, qui est la plus sévère. Certains types de lésions sont associés à cette forme aggressive de de la maladie, mais il manque aujourd’hui un modèle animal permettant de étudier en détail la formation et le développement de ce type de lésion. Notre recherche vise à mieux comprendre ces lésions et, à terme, à tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux auront une seule procédure chirurgicale pour optimiser le geste chirurgical menant à une lésion de démyélinisation de la moelle épinière. Les animaux participeront à deux tests comportementaux afin d’évaluer leurs capacités motrices. Dans le premier test, l'animal est placé sur une barre crantée et on mesure la durée de la traversée de la barre et le nombre d'erreurs, l'animal étant libre de ces mouvements durant le test. Dans le deuxième test l'animal est placé sur une grille sur laquelle l'animal s'accroche ce qui nous permet de mesurer la force de ses pattes avant. Ces deux tests comportementaux durent respectivement 90 secondes et 60 secondes. Les animaux réaliseront 2 procédures chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée, à 48 heures d’intervalle, l’une pour la mise en place de la lésion de démyélinisation et la deuxième pour l’injection de cellules immunitaires humaines sur le site lésionnel. Chaque chirurgie durera 15 minutes. Une dernière procédure sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour évaluer les voies sensorielles de l’animal entre une zone stimulée et le cerveau (1 fois, 30 minutes maximum par animal). Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux utilisés dans le projet sont immunodéficients (phénotype dommageable) et seront donc susceptibles de contracter des infections et des tumeurs. Les tests comportementaux pourront générer un stress aux animaux dû au changement d’environnement et aux manipulations. Les procédures chirurgicales (lésion de démyélinisation, greffe de cellules humaines) génèreront une douleur et un inconfort post-opératoire, et pourront être associées à des complications inattendues telles qu’un saignement ou une infection. L’anesthésie générale nécessaire pour leur réalisation impliquera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem nécessaires pour répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de remyélinisation endogène et de démyélinisation chronique est d’utiliser un modèle animal bien établi du processus de démyélinisation/ remyélinisation développé il y a 20 ans que nous avons réadapté pour le rendre plus proche des conditions pathologiques des patients. En ce qui concerne la souche de souris immunodéficiente utilisées, la greffe de cellules humaines nous contraint à utiliser les souris les plus adaptée pour éviter le rejet de greffe. Pour étudier le processus de développement d’une lésion chronique l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. En effet des alternatives pour étudier la remyélinisation existe (comme l’utilisation de culture ex vivo de cervelet) mais celles-ci ne peuvent pas être utilisé dans notre cas car nous étudions l’évolution d’une lésion à long terme (3mois). De plus l’étude de tissus humain ne nous permet l’étude qu’à un temps donné des lésion chronique et non l’évolution. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux
Réduction
Pour l'optimisation du geste chirurgical, des souris seront utilisées. Nous avons défini qu’un maximum de 50 souris pourrons être utilisées sur les 5 années du projet afin de perfectionner la technique d’injection dans le cordon dorsal de la moelle épinière. De plus, nous allons étudier la mise en place d’une lésion chronique en greffant les lymphocytes de deux types de patients atteints de sclérose en plaque, nous aurons 2 groupes de patients avec 20 patients par groupe et 40 donneurs sains, soit 80 sujets au total. Pour chaque patient, nous injecterons 15 souris puis nous échelonnerons les euthanasies sur 3 temps différents nous permettant ainsi d’avoir au final 5 souris par temps d’euthanasie et par patient. Par expérience nous savons que cet effectif sera suffisant pour des tests statistiques fiables. Pour les analyses statistiques nous aurons donc pour chaque temps 400 souris au total, 100 pour le premier groupe de patient avec une forme modérée de la maladie , 100 pour le deuxième groupe de patient avec une forme aggressive de la maladie et enfin 200 pour le groupe de donneurs sains. Nous aurons donc besoin au total de 1250 souris au total.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (directive européenne 2010/63/UE) soit 22Cplus ou moins 2C pour la température et entre 45 et 65 pourcent d’hygrométrie avec un cycle jour,nuit progressif de 12h. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec carré de coton et bâton à ronger) et observés quotidiennement. Ils bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à leur arrivée. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans des cages à ventilation individuelles, des précautions lors de la manipulation sont prises comme manipulation sous hotte, changement de gant et nettoyage de l’endroit de manipulation entre chaque cage. Ils seront ensuite habitués à l’expérimentateur pendant 1 semaine avant le début des procédures pour réduire leur stress. Les animaux auront une période d’acclimatation aux pièces à raison de 30min à 1h avant chaque début des expériences comportementales, acclimatation également aux tests comportementaux à raison de 3 essais/tests/jours avant d’établir la performance basale de l’animal, pour diminuer le stress de l’animal. Entre chaque essais l’animal aura un temps de repos au minimum égal à son temps passé à faire le test. De plus les animaux seront manipulés de façon à diminuer le stress Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésiques adaptée. Une surveillance renforcée sera mise en place en période post-chirurgie pendant 2 jours et puis 2 fois par semaine après la première semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et afin d’adapter la prise en charge analgésique en fonction de l’observation de signes de douleurs une grille de score (mise au point avec la structure du bien être animal est utilisée pour définir la prise en charge de l’animal. En cas de signe de mauvaise santé (stress, blessure, comportements anormaux) un avis vétérinaire sera demandé, Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Notre projet nécessitant un acte chirugical d’injection dans la moelle épinière, nous prévoyons d’optimiser le geste chirurgical des personnes (étudiants ou ingénieurs) associés à ce projet sur des souris immunocompétentes avant de réaliser ce geste ainsi que les injections de cellules humaines aux souris immunodéficiences. Notre projet nécessitant des greffes de cellules immunitaires humaines, nous utiliserons des souris immunodéprimées. En effet, ces souris présentent un système immunitaire déficient, elles sont donc de bonnes candidates pour la greffe de cellules humaines car il n’y aura pas de rejet de greffe. Les souris sont utilisées car le modèle de démyélinisation a été bien décrite chez la souris et nous avons une grande expérience de ce modèle dans notre équipe. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 8 semaines afin d’avoir une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes).
Optimisation et évaluation de l’efficacité d’une approche de thérapie cellulaire chez la souris.2/2. Amendement 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Gavées chaque jour pendant trois semaines, irradiées, greffées par injection dans le sinus de l'œil ou dans la veine de la queue, 1 048 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Un amendement ajoute à 400 d'entre elles une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, suivie de deux séances d'imagerie par semaine pendant vingt et un jours et de mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet vise à accélérer la reconstitution du système immunitaire après greffe de cellules souches chez des malades du sang, en la ramenant de deux ans à trois mois. Pour ces souris porteuses de tumeurs, le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée, sans préciser lesquels.
Objectifs
La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques. Le projet se déroulera sur deux EU différentes.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle. AMENDEMENT : Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des progéniteurs lymphoïdes qui pourront avoir un éventuel effet antitumoral.
Procédures
Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois (EU1). 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris (EU1) 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera
Impact sur les animaux
De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal. AMENDEMENT : L’injection sous-cutanée de tumeurs peut entrainer un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. La manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. Le transport entre les deux animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.
Remplacement
Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.
Réduction
La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles). AMENDEMENT : L’utilisation de l’imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort sequentielle d’animaux.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal. AMENDEMENT : Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Lors du transfert, les souris seront transférées dans des boites de transport avec de l’enrichissement et de la nourriture, les 2 établissements étant sur le même palier. Des mesures analgésiques adaptées seront mises en œuvre avec le vétérinaire pour limiter la douleur.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 2/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 214 souris vont être utilisées dans un modèle de sclérodermie, chacune pouvant recevoir 24 injections intrapéritonéales, 40 gavages, deux injections intraveineuses caudales et deux instillations oro-pharyngées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cela s'ajoutent une imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements, dont le porteur reconnaît qu'ils stressent les animaux. Les atteintes cutanées apparaissent vers la quatorzième semaine, la perte de poids et la mobilité réduite vers la dix-septième. Toutes les souris sont tuées, une partie faute de porter le génotype recherché, tandis que les bénéfices annoncés se limitent à identifier "à terme" de nouveaux candidats médicaments.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Evaluation de nouvelles thérapies dans des modèles de réponses anticorps pour le traitement des maladies auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à trente-six administrations en neuf semaines, quatre prises de sang et dix séances d'imagerie sous anesthésie par animal : 7 164 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Le porteur attend des rougeurs, des gonflements et une desquamation aux sites d'injection, et pour les réactions inflammatoires les plus fortes une perte de poids, une léthargie, un poil hérissé et de la prostration, y compris par réaction du greffon contre l'hôte chez les souris humanisées. Une partie des animaux porte un phénotype dommageable, et le porteur indique les utiliser avant quarante semaines pour que ce phénotype ne s'exprime pas. Les données recherchées doivent servir à faire entrer des composés en essai clinique et à constituer des dossiers d'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
Les maladies auto-immunes affectent environ 5 à 8 % de la population mondiale, avec une prévalence croissante au cours des dernières décennies. Les maladies auto-immunes, telles que le diabète de type 1, la sclérose en plaques, le lupus érythémateux systémique et la polyarthrite rhumatoïde, représentent un défi majeur en raison de leur complexité et de la variabilité des réponses aux traitements actuels. Ce projet vise à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies auto-immunes. Nous utilisons des modèles de souris pour mieux comprendre comment notre système immunitaire produit des anticorps, que ce soit avec ou sans l’aide des cellules T. Ces modèles sont des outils précieux pour étudier les réponses immunitaires et tester de nouvelles thérapies. Les objectifs de notre projet sont : Étudier les mécanismes immunitaires : Nous voulons comprendre comment notre corps réagit aux antigènes (substances étrangères) en identifiant les cellules et les signaux clés impliqués dans la production d’anticorps. Tester de nouvelles thérapies : Nous évaluons l’efficacité et la sécurité de nouvelles molécules thérapeutiques pour déterminer les doses optimales et les profils de sécurité, essentiels pour développer des traitements sûrs et efficaces. Identifier des biomarqueurs : Nous cherchons des indicateurs spécifiques qui peuvent nous aider à prédire la réponse aux traitements et à détecter les effets secondaires potentiels, afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques. Optimiser les protocoles expérimentaux : Nous adaptons nos méthodes pour obtenir des résultats plus fiables et pertinents, en les rapprochant des conditions cliniques humaines, ce qui est crucial pour passer des tests en laboratoire aux applications cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement de modèles de souris TDAR et TIDAR(T-dependant et T -independant antibody response ; Réponse en anticorps dépendante des lymphocytes T) vise à créer des outils robustes et fiables pour l’étude des réponses anticorps, des interactions entre les cellules immunitaires et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Ces modèles permettent non seulement de mieux comprendre les mécanismes des réponses anticorps, mais aussi d’accélérer la découverte et l’optimisation de traitements efficaces et sûrs pour les patients. Ces modèles permettront d’étudier le potentiel thérapeutique de molécule ciblant des mécanismes impliqués dans les maladies auto-immunes et la tolérance immunitaire A plus long terme, les données générées grâce à ce projet permettent d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus immunologiques ou inflammatoires impliqués dans diverses pathologies humaines et feront l’objet de publications et de partage des données collectées avec la communauté scientifique. Les données générées permettent de supporter l’entrée des composés retenus en phase clinique d’évaluation et de contribuer à la constitution des dossiers d’autorisations de mise sur le marché des nouveaux médicaments évalués. L’approche par imagerie permettra potentiellement d’envisager l’évaluation de méthodes comparables pour le diagnostic ou le suivi des pathologies citées.
Procédures
Administrations réalisées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou par application cutanée, sur animal vigile, environ 10 secondes, réalisée au maximum 4 fois par semaine sur 9 semaines (soit 60 jours d’étude.) Prises de sang sur animal vigile, environ 15 secondes, répétées 4 fois sur 60 jours P. Analyse par imagerie sur animal anesthésié : Durée : Environ 5-15 minutes par session d’imagerie sur 10 temps en longitudinal, au maximum.
Impact sur les animaux
- Rougeurs et gonflements : Des rougeurs, des gonflements et des douleurs peuvent apparaître au site d’injection, que ce soit pour les injections dans l’abdomen ou sous la peau. - Réactions cutanées : Lors de l’application d’antigènes sur la peau, notamment avec certains solvants, des rougeurs, des gonflements et une desquamation (peau qui pèle) peuvent survenir. -Réactions inflammatoires : Après l’injection d’adjuvants (substances qui renforcent la réponse immunitaire), des réactions inflammatoires et systémiques peuvent se produire. - En cas de réaction inflammatoire sévère, des symptômes comme la perte de poids, la léthargie, le poil hérissé et la prostration peuvent apparaître. Cela peut être dû à une réponse immunitaire excessive ou à une réaction de greffe contre l’hôte dans les modèles humanisés.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude.
Remplacement
L’utilisation de modèles mettant en œuvre les réponses anticorps dépendantes ou indépendantes des cellules T est essentielle pour le développement et l’évaluation de nouvelles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires et auto-immunes. Ces modèles permettent d’étudier les réponses anticorps pour comprendre les interactions cellulaires et les mécanismes pathologiques spécifiques aux maladies auto-immunes. Ces modèles permettent de surmonter les limitations des systèmes in vitro et in silico en fournissant un système plus pertinent et translatable pour la recherche préclinique. Bien que des méthodes alternatives in vitro et in silico soient explorées, elles présentent des limitations importantes. Les tests in vitro, tels que les cultures cellulaires et les organoïdes, permettent d'étudier les réponses cellulaires et les interactions moléculaires dans un environnement contrôlé. Cependant, ces systèmes ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, où les interactions entre différents types de cellules et tissus, ainsi que les influences systémiques, jouant un rôle crucial. Par exemple, les cultures de cellules B et T humaines peuvent fournir des informations sur les réponses immunitaires spécifiques, mais elles ne peuvent pas simuler les interactions dynamiques dans les organes lymphoïdes secondaires (comme les centres germinatifs) ou entre le système immunitaire et d'autres systèmes, comme les cellules épithéliales, le système nerveux ou endocrinien. Les modèles in silico, qui utilisent des simulations informatiques pour prédire les réponses biologiques, sont également limités par la complexité des systèmes biologiques et la qualité des données disponibles. Bien qu'ils soient utiles pour générer des hypothèses et réduire le nombre d'expériences animales nécessaires, ils ne peuvent pas remplacer complètement les études in vivo en raison de leur incapacité à capturer toutes les variables biologiques et environnementales. La complexité des interactions immunitaires dans les maladies inflammatoires et auto-immunes nécessite encore l’utilisation de modèles animaux pour obtenir des données pertinentes et transposables à l’humain. En intégrant des réponses anticorps dépendantes et indépendantes des cellules T, ces modèles offrent une vue d'ensemble des réponses immunitaires et des effets des traitements dans un contexte physiologique complet, essentiel pour le développement de thérapies efficaces et sûres.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est basé sur des publications scientifiques et optimisé par un biostatisticien en fonction des objectifs de l’étude Des méthodes statistiques sont appliquées pour minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats fiables et en réduisant les biais expérimentaux. Seules les molécules ayant montré en amont une activité anti-inflammatoire in vitro sont testées sur les animaux (in vivo). L’utilisation de techniques précises comme la cytométrie en flux, l’analyse de biomarqueurs, l’histologie et l’imagerie permettra d’obtenir des données détaillées à partir de petits échantillons. De plus, on pourra avoir un suivi non invasif et multiparamétrique des animaux pour mesurer la distribution des composés et l’évolution de la réponse inflammatoire, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les modèles décrits dans ce projet sont choisis pour leur pertinence clinique, réduisant ainsi le besoin de tests supplémentaires sur d’autres animaux.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe . Nous utiliserons également une litière adaptée, douce et un enrichissement qui favorise l’expression des comportements normaux de la souris ( abri, enfouissement, nidification…). Les techniques de manipulation douce, telles que l’utilisation de tunnels et la préhension dans le creux des mains, sont mises en œuvre pour réduire le stress et l’angoisse des animaux. Un apport nutritif (gel hydrique, gel boost …) pourra être mis en place 1 semaine avant le début de l’étude pour faciliter l’accès des animaux. Les animaux pourront être hébergés dans des cages spéciales capables de détecter 24h/24 toute anomalie dans l’activité des animaux (hypoactivité ou hyperactivité ou stéréotypies) permettant de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Les études sont encadrées par des recommandations internes et validées par la structure du bien-être animal relatives à l’utilisation des animaux (hébergement, soins, manipulation, expérimentations) et ayant pour objectif de prévenir toute douleur ou détresse chez l’animal. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact à l’animal et à l’observation des signes cliniques fondamentaux. Une grille de score a été mise en place afin de permettre la définition et l’application de points limites, généraux et spécifiques à la procédure, une fréquence accrue des observations et ainsi intervenir de manière anticipée pour éviter toute douleur ou dommages pour les animaux au-delà de la classe de gravité définie pour la procédure. L'âge d’utilisation des souris génétiquement modifiées permet d’éviter l’apparition du phénotype dommageable. (avant 40 semaines) Les protocoles expérimentaux seront continuellement améliorés pour minimiser la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix en pharmacologie. Elles partagent une grande partie de leur génome avec les humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. Leur petite taille et leur cycle de reproduction rapide facilitent les études à long terme et les expériences génétiques. Les souris, étant des mammifères, ont des systèmes biologiques comparables à ceux des humains, rendant les résultats plus pertinents. Les souris adultes (à partir de 8 semaines d’âge) sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. De plus le système immunitaire est complètement mature à partir de 6 semaines d’âge chez la souris.
Étude de la rythmicité circadienne du plexus choroïde et de sa contribution à la maladie d’Alzheimer et au vieillissement prématuré du cerveau.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des 2 040 souris est uniquement anesthésiée profondément puis vidée de son sang, sans jamais se réveiller, l'opération durant une trentaine de minutes. Les autres subissent une injection dans le cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes à une heure, puis quatre semaines plus tard des tests comportementaux, cinq injections quotidiennes et un prélèvement de liquide céphalorachidien avant d'être tuées à leur tour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que leur génotype leur donne, à partir de six mois, un comportement dépressif, une sociabilité réduite et de l'anxiété. Il écrit avoir envisagé les organoïdes mais conclut qu'ils ne développent pas les signatures cellulaires observées, et écarte la drosophile, le nématode et le poisson zèbre au motif que leur barrière cérébrale diffère de celle des mammifères.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Certains traitements existent pour les maladies neurodégénératives, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent qu'une dérégulation circadienne augmente les probabilités de développer la maladie, et les zones d’interface entre sang et cerveau sont connus pour être fortement régulés par le rythme circadien. Les zones d’interface entre sang et cerveau constitue l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Elles sont situées dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacentes aux zones impliquées dans la production des neurones. Structurellement, les zones d’interface entre sang et cerveau sont composés d’un réseau de vaisseaux sanguins fenêtrés entourés d’une variétés de cellules. Les principaux rôles physiologiques des zones d’interface entre sang et cerveau sont la production de liquide céphalo-rachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, et la production et le passage contrôlé du sang vers le cerveau de diverses molécules de signalisation, dont des hormones et des facteurs qui ciblent les neurones. Les molécules sécrétées par ces zones façonnent l’activité cérébrale, par exemple en modulant la production de neurones, ce qui les rend cruciales pour l’équilibre du cerveau. Des travaux préliminaires sur l’expression des gènes circadiens de ces zones ont révélé que les oscillations rythmiques sont clé dans l’organisation de son activité, qui est encore modifiée par le sexe, le vieillissement et le contexte pathologique (en particulier la maladie d’Alzheimer). Ces recherches ont également suggéré la présence d'une signature cellulaire. Notre objectif est d'étudier comment la régulation circadienne et, en particulier, un certain programme façonnent la trajectoire du vieillissement cérébral et le cours du développement de la maladie d’alzheimer dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Le cerveau flotte dans le Liquide céphalo rachidien (LCR), un liquide qui joue un rôle clé dans son entretien). Des recherches antérieures ont démontré que les changements liés au vieillissement dans la composition et le flux du LCR favorisent le vieillissement cérébral et la neurodégénérescence et que leur inversion peut inverser certaines caractéristiques du vieillissement cérébral et les propriétés et le flux du LCR sont étroitement contrôlés par l’épithélium du plexus choroïde. Des travaux antérieurs et nos données préliminaires ont montré que la fonction du plexus choroïde dépend de manière critique du rythme circadien, du sexe, de l’âge et de l’état de la maladie (en particulier de la MA). Plus précisément, en utilisant la transcriptomique, nous avons constaté que chez les jeunes souris, nous avons observé une signature neuroépithéliale dépendante du rythme circadien et nos analyses informatiques ont prédit sa dépendance à deux facteurs de transcription compétitifs. Donc, nous visons à étudier les facteurs possibles responsables de l'induction de la signature et l'impact de la modification des programmes circadiens au niveau du plexus choroïde sur le plexus choroïde,
Procédures
Certaines souris subiront uniquement une exsanguination sous anesthésie profonde et analgésie.Certaines souris subiront uniquement une exsanguination sous anesthésie profonde et analgésie; de l'injection de l'analgésie à l'exanguination complète, cette procédure prend environ 30 minutes. D’autres souris seront soumises à une injection dans le cerveau (une procédure chirurgicale) sous anesthésie générale et analgésie (durée de la procédure : 30 min à 1h sur adulte), suivie deux mois plus tard de 5 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une injection dans le cerveau (une procédure chirurgicale) sous anesthésie générale et analgésie (durée de la procédure : 30 min à 1h sur adulte). Quatre semaines après chirurgie, les animaux seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs (trois tests d'une durée de 1 à 3 jours, avec un jour de repos entre les tests.). Après, les souris recevront 5 injections (une par jour pendant 5 jours). Le jour de la mise à mort, les souris recevront 4 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes. Certaines souris recevront cinq gavages (un tous les deux jour). Quatre semaines après chirurgie, les animaux seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs (trois tests d'une durée de 1 à 3 jours, avec un jour de repos entre les tests). Après, les souris recevront 5 injections (une par jour pendant 5 jours). Le jour de la mise à mort, les souris recevront 4 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours). Les injections par voie-intrapéritonéale pourront générer une douleur légère de courte durée. Peu de stress à l’animal. Les souris étudiées peuvent présenter un comportement dépressif, un comportement social diminué et des comportements anxieux à partir de 6 mois en raison de leur génotype.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition
Remplacement
Notre objectif est d'étudier comment les cellules du programme circadien de certaines zones d’interface sang/cerveau agissent sur le cerveau dans des conditions physiologiques et dans la maladie d'Alzheimer. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui rende compte de la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composantes tissulaires et focntionnelles. Des animaux plus simples comme la drosophile, Caenorhabditis elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des organoïdes, mais à notre connaissance, ils ne développent pas les signatures cellulaires que nous avons observées in vivo et dans des explants.
Réduction
Nous souhaitons étudier les interactions entre les programmes circadiens au niveau des zones d’interface sang/cerveau et du cerveau. Les quantités d'animaux (2040 au total) utilisés pour mener à bien notre projet sont établis en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Toutes les souris seront utilisées pour mesurer plusieurs résultats d'étude. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences en triple seront réalisées pour obtenir des résultats robustes. Selon le nombre de groupes comparés : 4 groupes comparés (par exemple sains vs. Maladie d’alzheimer et traités vs. contrôle) : les nombres proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire au maximum l'inconfort des animaux. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie sur un tapis chauffant sur lequel ils seront maintenus pendant et quelques heures après le réveil. Les interventions sur les adultes peuvent provoquer des douleurs modérées pendant la cicatrisation qui seront prévenues par une injection d’analgésique, 30 min avant l'intervention, 6 heures après, puis toutes les 12 heures pendant 48 heures en cas de douleur. Un analgésique sera aussi appliqué sur les zones à inciser et un autre sera également ajouté après l'intervention dans l'eau de boisson pendant la cicatrisation. Pour améliorer la prise alimentaire, un gel alimentaire sera ajouté dans les cages en post chirurgie ainsi que le renforcement de l’enrichissement. La récupération des animaux après leur chirurgie sera surveillée régulièrement et nous suivrons les signes et les points limite définis. Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. De plus, les modifications génétiques peuvent être associés à une anxiété accrue chez la souris, pour limiter l’inconfort de ces animaux, leur suivi sera assuré selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l'étude de la physiologie des mammifères. De nombreuses souris transgéniques et outils de modifications génétiques sont disponibles, permettant d'étudier les fonctions précises de gènes et de voies sélectionnés. De plus, la souris permet l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. Les souris permettent de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la pathologie humaine. Nous avons donc choisi ce modèle pour mener notre étude de certains facteurs agissant sur le cerveau, en condition physiologique et au cours du vieillissement. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (8-12 semaines) pour étudier la physiologie de l'activité circadienne du plexus choroïde. Dans certaines procédures, nous ferons vieillir les souris jusqu'à 12 mois pour étudier l'interaction des voies circadiennes avec la neurodégénérescence. Au cours du développement typique de la maladie d’alzheimer chez la souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques dans le cerveau, à partir de 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, qui sont évidentes entre 6 et 11 mois chez les souris. Cet âge peut varier en fonction du microbiote et du sexe. Pour capturer ces fenêtres de progression de la maladie, nous induirons la modification génétique chez les souris à l'âge de 2 mois et surveillerons la progression de la maladie en termes de capacité cognitive à 6, 8, 10 et 12 mois. Nous nous attendons à ce que les modifications génétiques accélèrent ou ralentissent la courbe du déclin cognitif chez ces souris.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 1/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt-quatre injections dans l'abdomen, quarante gavages, deux instillations dans la gorge et une chirurgie de quinze minutes s'enchaînent sur deux mois pour chaque souris concernée. 1 214 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, dont une partie du seul fait qu'elles n'ont pas le génotype recherché. Le modèle repose sur une lignée génétiquement modifiée qui développe une fibrose de la peau et des poumons, à laquelle le projet ajoute des contaminants de l'environnement comme la silice, pour tester des molécules bloquant l'activation immunitaire. Les souris circulent entre trois établissements, et le porteur ne précise ni en quoi consiste l'acte chirurgical ni comment il arrive à 1 214 animaux.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Étude de l’impact des anticorps anticontactine 1 sur la fonction rénale chez le Hamster
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un rein retiré chirurgicalement en début d'expérience pour concentrer l'effet des anticorps sur celui qui reste : 42 hamsters dorés vont être utilisés pendant 77 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent six injections d'anticorps humains dans le sang, subissent des prélèvements de sang et d'urine deux fois par semaine, et sont isolés quatre heures à chaque recueil urinaire. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un syndrome néphrotique, avec œdèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension et perte de motricité. Le hamster a été retenu après le constat que souris, rats, lapins et cobayes n'expriment pas la protéine visée dans le rein, le porc l'exprimant aussi mais étant jugé moins facile à élever.
Objectifs
La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux. Des recherches ont identifié plusieurs cibles d’anticorps auto-immuns, notamment des protéines présentes à la surface des neurones, comme la contactine 1. Chez certains patients, une PIDC survient en parallèle d’une maladie auto-immune rénale appelée glomérulopathie extramembraneuse (GEM), une pathologie dont l’évolution clinique peut être variable, allant parfois jusqu’à une perte totale de la fonction rénale. Bien que la co-occurrence de ces deux maladies ait été fréquemment observée, leur lien direct n’a jamais été formellement établi dans la littérature scientifique. Récemment, la contactine 1 a été détectée dans les petits amas de vaisseaux sanguins qui participent à la filtration rénale. Par ailleurs, des anticorps dirigés contre la contactine ont été identifiés simultanément dans le nerf et le rein, renforçant l’hypothèse d’un mécanisme commun. L’objectif principal de ce projet est de confirmer, à l’aide d’un modèle hamster, le rôle des anticorps anti-contactine 1 dans le développement de cette maladie rénale. Il s’agit également d’analyser les dysfonctionnements cliniques et tissulaires provoqués par ces anticorps afin de mieux comprendre cette pathologie. Les résultats de cette étude pourraient permettre d’améliorer les outils de diagnostic et de proposer des traitements adaptés pour les patients humains souffrant de cette maladie complexe.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 77 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 77 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.
Impact sur les animaux
Les hamsters pourront ressentir un léger stress lors des injections de substances (anesthésiques, anticorps) ou des prélèvements. Les injections d'anticorps pourraient entrainer l'apparition d'un syndrome néphrotique . Ainsi, ces injections peuvent provoquer différents symptômes : fatigue, oedèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension artérielle ainsi que des atteintes neurologiques et une perte de la motricité des animaux. La chirurgie visant à réaliser une néphrectomie peut provoquer des douleurs post-opératoires, un risque d'infection, des anomalies de la coagulation, des troubles électrolytiques, une anorexie, une léthargie et une déshydratation. De plus, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.
Remplacement
L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.
Réduction
Le modèle de Hamster visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum à 14 animaux par groupe en utilisant les données publiées chez l’homme.
Raffinement
Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.
Choix des espèces
Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.
Développement d’un modèle murin induit de sclérodermie systémique (SSc) et de colonisation par la bactérie Porphyromonas gingivalis (Pg) pour évaluer l’impact de la parodontite expérimentale sur la physiopathologie de la SSc
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées de bléomycine cinq jours par semaine pour provoquer un durcissement de la peau, une inoculation quotidienne de Porphyromonas gingivalis dans la bouche, et pour une partie d'entre elles la pose de ligatures autour de quatre molaires trois fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur décrit la pose des ligatures comme non douloureuse et précise dans la même rubrique qu'aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré, ces médicaments risquant d'interférer avec les résultats. Sur le remplacement, il écrit que la règle "n'est pas applicable dans le cas de ce projet".
Objectifs
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10000 personnes en France, principalement les femmes. Elle est caractérisée par une fibrose des tissus (la peau notamment), des anomalies des vaisseaux et une dérégulation du système immunitaire. La cause n’est pour le moment pas connue. Un dérèglement du microbiote, avec un déséquilibre entre les bactéries positives et négatives de notre flore microbienne (appelé dysbiose), a été impliqué dans le développement de nombreuses maladies autoimmunes, dont la sclérodermie systémique. La parodontite est une pathologie inflammatoire d’origine infectieuse très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle se caractérise par une infection et une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Elle est la conséquence d’un déséquilibre du microbiote parodontal. La bactérie Porphyromonas gingivalis joue un rôle clé dans cette pathologie. Notre hypothèse est que la dysbiose du microbiote parodontal et en particulier la présence de la bactérie Porphyromonas gingivalis pourrait représenter un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la dysbiose du microbiote parodontal dans le développement de la sclérodermie systémique.
Bénéfices attendus
La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment certains microorganismes, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication d’une dysbiose du microbiote parodontal, et en particulier de la bactérie Porphyromonas gingivalis, dans le développement de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients
Procédures
Les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée de bléomycine (réalisée 5 jours par semaine), qui est une molécule ayant pour effet de provoquer une fibrose de la peau, afin de reproduire la sclérodermie systémique. La réalisation de ces injections est rapide (moins de 2 minutes). Pour induire la dysbiose du microbiote parodontal, une partie des souris sera soumise à une inoculation quotidienne avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui sera appliquée uniquement au niveau de la bouche à l’aide d’une canule à bout mousse. Chez l'autre partie des souris, une pose de ligatures imbibées avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis sera en plus réalisée autour des molaires maxillaires 3 fois par semaine, afin de reproduire une parodontite. La pose des ligatures au niveau de 4 molaires est un geste nécessitant un temps d'une dizaine de minutes en tout. Les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins qui seront réalisés toutes les 2 semaines et qui nécessitent un temps inférieur à 5 minutes. La plupart de ces procédures (injections initiales de bléomycine, pose des ligatures, prélèvements sanguins) sera réalisée sous anesthésie générale, à l’exception de l’inoculation buccale de la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui est une application rapide d’un petit volume de solution au niveau de la bouche de l’animal, et des injections de bléomycine après habituation de l’animal à une récompense.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées de bléomycine initiales, le placement des ligatures imbibées de la bactérie Porphyromonas gingivalis, et les prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés sur animal anesthésié (anesthésie générale par injection de kétamine/xylazine ou anesthésie gazeuse à l'aide d'isoflurane). Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes a toute anesthésie. L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser les gestes à l'état vigile. La bléomycine est glycopeptide qui induit une inflammation et une fibrose cutanée progressive lorsqu’il est injecté par voie sous-cutanée. Les animaux vont donc développer une fibrose au niveau de la zone d’injection, c’est-à-dire au niveau du haut du dos. Porphyromonas gingivalis est une bactérie qui est impliquée dans le développement d’une inflammation gingivale. L’induction de la parodontite par Porphyromonas gingivalis n’est cependant pas assez longue pour obtenir une destruction complète de l'os qui soutient les dents et donc une mobilité ou une perte de dents chez les souris. La parodontite induite n’entravera pas l’alimentation des souris. Un suivi quotidien du bien être des animaux et de leur poids sera mis en place dès le début des procédures grâce à une grille de suivi comprenant des points limites.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.
Remplacement
La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la bactérie Porphyromonas gingivalis sur la physiopathologie de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires et la production d'autoanticorps, qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. Nous nous basons sur des protocoles déjà bien établis dans la littérature. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques appropriés. Le nombre minimal d'animaux par groupe expérimental pour chaque question posée a été calculé et il est de 5 à 14 animaux par groupe. Toujours dans un souci de réduction, le nombre d’animaux exact nécessaire pour chaque procédure sera commandé auprès de fournisseurs agrées et nous ne réaliserons pas de croisements.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les groupes de souris utilisés pour les expériences seront placés dans les cages expérimentales à couvercle filtrant (6 maximum par cage) avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. Certaines procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront pesés et suivis quotidiennement à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décritz pour chaque procédure, afin de les soustraire à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites specifiques. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante (37°C) immédiatement après les anesthésies afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel au niveau des yeux sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface oculaire et de prévenir la déshydration, ainsi que l’apparition d’éventuelles lésions de la cornée. La pose des ligatures au niveau des molaires n'est pas une procédure douloureuse. Elle nécessite cependant d’être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d'une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Nous ne pourrons cependant pas administrer d'anti-inflammatoires en cas de douleur, car ces médicaments pourraient interférer avec les expériences réalisées. Cependant, les gestes réalisés et notamment la pose de ligatures ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.