Troubles urogénitaux

Une injection déclenche une fibrose rénale, puis deux à six injections ou gavages de molécules suivent, avec des collectes d'urine obtenues par contention. 280 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et les injections enflammer le site de piqûre, alors que le porteur écrit que ces souris "ne présentent aucun phénotype dommageable". Sur la réduction, il indique avoir dimensionné les groupes avec un plan d'expérimentation, sans donner un seul chiffre justifiant les 280 animaux.

Objectifs

La fibrose est une augmentation anormale de la quantité de tissu conjonctif fibreux dans un tissu ou un organe. Cette fibrose entraine des défauts d'organes puisque les cellules spécialisées de l'organe sont remplacées par des fibres non fonctionnelles d’où le nom de fibrose. Les maladies fibrotiques, telles que la fibrose rénale associée à l’insuffisance rénale chronique (IRC), constituent des enjeux thérapeutiques majeurs en raison de l’absence de traitements curatifs. Des résultats récents suggèrent que des récepteurs cellulaires de molécules présentes dans le rein lors de l'IRC jouent un rôle prépondérant dans l’initiation et la progression de la fibrose rénale. Dans ce projet, nous allons tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant ces facteurs pro-fibrotiques dans un modèle murin de fibrose rénale. L’évaluation du degré de fibrose rénale après traitement avec les molécules innovantes permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet permettront d’envisager la mise en place en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la fibrose rénale et ainsi d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’insuffisance rénale chronique.

Procédures

Les animaux recevront une injection pour induire la fibrose rénale. Les molécules thérapeutiques seront ensuite administrées par injections (2 à 6 maximum) ou par gavage. Durée des injections : 3 à 5 secondes. Durée des gavages : environ 10 secondes. Les collectes d’urines permettant de suivre la fonction rénale se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. Le produit injecté en début d'étude va entrainer une fibrose rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Les injections répétées des produits thérapeutiques peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les gavages répétés peuvent induire une gêne et une irritation de l’œsophage. Les contentions pour traitement et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques de leurs reins.

Remplacement

Les composés thérapeutiques innovants que nous testerons dans ce projet on fait l’objet d’études in vitro préliminaires. Néanmoins, le but de ce projet est de définir le potentiel thérapeutique de ces molécules dans l’apparition de la fibrose rénale. La complexité des processus cellulaires responsables de la fibrose ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs.

Réduction

Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultat pertinents biologiquement et exploitable tout en minimisant le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Ainsi nous accélèrerons la fréquence de suivi de animaux et de pesé dès la deuxième semaine après traitement afin de s’adapter à la cinétique réelle d’apparition de la maladie. Un examen clinique sera réalisé 2 à 3 fois par semaine dès le début des études et le remplissage d'une grille de score lors de ces examens cliniques permettra de déterminer de façon objective le devenir de l'animal.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant la fibrose rénale. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.

Cinq jours d'administration orale par canule, une injection qui déclenche un état septique ou un sérum toxique pour les reins, puis pour un quatrième groupe un mois de régime hypergras : 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traceur fluorescent leur est ensuite injecté et un capteur fixé sur le dos, avec deux anesthésies successives pour la pose et le retrait, et quelques heures d'isolement. Le porteur annonce les atteintes attendues, irritation de la gorge, saignements, œdème, péritonite, prise de poids massive et pelage gras pour les souris rendues diabétiques, risque d'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, les prélèvements post-mortem étant présentés comme le seul moyen d'obtenir les tissus recherchés.

Objectifs

Les maladies rénales, aigues ou chroniques, sont un problème majeur pour la santé publique, affectant des millions de personne dans le monde. Même si des progrès significatifs ont été réalisés dans l’identification des mécanismes responsables de leur progression, il n’existe aucun traitement spécifique permettant à l’heure actuelle de diminuer ou d’arrêter la progression des maladies rénales de manière probante. Par conséquent, la détection de la maladie à des stades très précoces ainsi que la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques sont d’une importance cruciale pour mettre au point un traitement efficace Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d'une protéine impliquée dans la mort de cellules de petits vaisseaux sanguins dans la maladie rénale. En effet, la surexpression de cette protéine est associée à une dégradation de la fonction rénale dans différents modèles de maladies rénales expérimentales. Plus précisément, nous avons récemment montré que cette protéineest fortement surexprimée dans des cellules qui assurent la fonction de filtration du rein et que cette surexpression conduit à une mortalité de ce type cellulaire dans des cultures de ces cellulesin vitro. L’objectif principal de ce projet est de définir le rôle de la protéine dans l’adaptation fonctionnelle et structurelle du rein en réponse à des agressions aigues et chroniques, glomérulaires ou vasculaires, en utilisant desmodèles de souris transgéniques pour lesquelles une surexpression ou bien une inhibition de la protéine d'intérêt est inductible dans le temps et de manière tissu spécifique. Ces expériences permettront de répondre à ces questions : La surexpression de la protéine peut elle induire ou aggraver la maladie rénale dans plusieurs modèles expérimentaux? A l'inverse, est ce que l’inhibition de la protéine peut ralentir la progression de l’insuffisance rénale ? Peut on mettre en place une stratégie thérapeutique bloquant la surpression de la protéine afin de préserver la fonction rénale dans un contexte pathologique ?

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies rénales chroniques est en constante augmentation, affectant environ dix pour cent de la population mondiale, bien que beaucoup de cas restent non diagnostiqués en raison de leur évolution silencieuse. Une prise en charge précoce et une sensibilisation accrue sont essentielles pour prévenir leur progression vers l'insuffisance rénale terminale, nécessitant dialyse ou transplantation. Nous espérons que notre étude permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur cette protéine et la proposera comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance rénale. Nous effectuerons durant et après ces protocoles différentes analyses fonctionnelles, histologiques, cellulaires et moléculaires afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés . Ainsi, nous espérons faire un pas supplémentaire vers le développement de stratégies thérapeutique ciblant cette protéine afin de ralentir la progression des maladies rénales voire la faire régresser.

Procédures

Un premier lot reçoit une administration orale une fois par jour pendant cinq jours, chaque session durant environ 30 secondes par animal. Ensuite, une administration unique est effectuée à l’état vigile, afin d’induire le modèle septique, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un deuxième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Deux administrations par voie veineuse sont ensuite effectuées sous anesthésie, afin d’induire le modèle, chacune prenant 10 secondes par souris. Un troisième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Une seule administration d’une molécule est ensuite effectuée à l’état vigile, pour induire le modèle, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un quatrième lot reçoit un régime hyper gras. Un inhibiteur génétique leur est administré deux fois par semaine pendant un mois, (30 sec par souris) à l’état vigile. Alternativement, un stimulateur sera ajouté à l’eau de boisson et administré durant 30 jours. Une mesure de la fonction rénale est réalisée sur les trois derniers lots grâce à une nouvelle technique nécessitant une anesthésie gazeuse. Cette procédure inclut l’administration d’un traceur fluorescent et l’installation d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal, pour une durée totale de cinq minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie est nécessaire pour retirer le capteur, ce qui prend environ deux minutes. En fin de protocole, les quatre lots font l’objet d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie (une minute par souris), suivi de l’euthanasie des animaux selon une méthode règlementaire, en vue des analyses et prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Un premier lot d’animaux subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique pour induire le modèle septique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le modèle pourra induire une perte d’activité et de poids et une élévation de la température. Un second lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique de sérum toxique pour les reins associé à un risque de saignement et œdème. Cette administration étant effectuée sous anesthésie générale courte, les nuisances de l’anesthésie sont ici très limitées. Un troisième lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration d’une molécule toxique pour les reins pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Un quatrième lot d’animaux diabétiques sera exposé à un régime riche en lipide qui s’accompagne d’une prise de poids massive, d’un soin altéré avec un pelage gras, d’une activité réduite avec un risque infectieux plus important. Une partie des animaux seront traitée par administrations répétés pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Il y a aussi un risque de péritonite et de saignements liés aux administrations répétées. Une autre partie sera traitée via l’eau de boisson pouvant conduire à une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie des souris. Les trois derniers lots subiront une mesure de la fonction rénale incluant deux anesthésies de courte durée pour la pose et le retrait du capteur pouvant induire un stress, un risque de saignement et d’œdème associé à l’administration du traceur fluorescent nécessaire à la mesure et un stress social lié à l’individualisation durant quelques heures. Tous les animaux subiront un prélèvement sanguin en fin de période de maintien sous anesthésie. L’anesthésie générale pourra conduire à des complications telles que : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de notre protéine cible sur le rein est la modification de la fonction rénale, qui est mesurée soit pas dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter individuelle du phénotype étudié dans nos modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique dédié aux calculs de puissance statistique avec comme paramètre principal la mesure de la fonction rénale. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 620 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour les souris diabétiques il y a des mesures de raffinement supplémentaires, change plus régulier à cause de la polyurie, nombre réduit de souris par cages et bâton à ronger à cause des croquettes molles riches en gras. En dehors d'une courte période d’hébergement individuel limité à deux heures pendant une mesure, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière. L'administration orale aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, la prostration, l'hérissement du pelage. Administration : Il existe aussi un risque de saignement qui sera limité par l’utilisation d’aiguille fines et leur réalisation par du personnel expérimenté. L’anesthésie permet de limiter la douleur pour certaines administrations, qui seront suivies d’une application de gel ophtalmique pour limiter l’inconfort. Pour diminuer les risques de détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique liés à l’anesthésie, les souris seront placées sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce: modèles bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique , plus que dans d'autres espèces. possibilités de tester l'implication de la voie de signalisation de la protéine cible dans l'insuffisance rénale grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. Concernant le stade de développement: Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système rénal mature, tout en ne présentant pas encore des signes de vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

Valider une voie d'administration en vue d'un dossier d'essai clinique, telle est la finalité affichée de ce projet, pour lequel 20 cochons de trois mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre à cinq prises de sang sous sédation, une injection intramusculaire hebdomadaire d'immunorégulateur, des comprimés quotidiens et une à deux urétéroscopies sous anesthésie générale de une heure trente à deux heures. Après trois à quatre semaines, une dernière anesthésie sert à ouvrir l'animal, prélever ses organes et le tuer. Le porteur présente le porc comme la seule espèce possible et l'urétéroscopie comme une voie non invasive, voie que des chirurgiens viennent aussi apprendre sur des porcs.

Objectifs

--- La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. Bien que l'incidence de la cystinurie soit faible (≈1/7000), les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie rare, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Une information du patient et un suivi diététique pour réduire les aliments riches en méthionine, à boire >3L/j. Malheureusement, malgré un régime diététique efficace, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais, ces médicaments sont associés à des effets secondaires. --- Dans le contexte du développement thérapeutique de maladies rares, et notamment rénales, nous avons identifié un vecteur viral de thérapie génique qui permet le transfert de gène dans les parties malades du rein grâce à une injection dans les voies urinaires, en direction des reins. Dans le cadre d’une preuve de concept, le mode opératoire pour une telle administration a été réalisé chirurgicalement. Nous souhaitons dès lors, nous pencher sur des indications thérapeutiques et commencer par explorer l’usage atraumatique de la voie endourologique, c’est-à-dire en passant par les voies naturelles. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’un urétéroscope flexible (endoscope souple, fin, équipé d’une microcaméra et d’instruments à son extrêmité) ammené jusqu’au centre des reins pour délivrer le vecteur de thérapie génique. Cette méthode est cliniquement pertinente et peut-être réalisée en ambulatoire – couramment utilisée en clinique pour détruire des calculs ou retirer des tumeurs rénales. Cette validation préclinique est indispensable pour la constitution à terme d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique et nécessitera donc l’utilisation du modèle porc étant donné la similitude anatomique des voies urinaires avec l’Homme. En conclusion, notre projet repose sur l’usage du porc pour la validation du protocole d’administration en vue de la constitution d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique dans une indication en néphrologie. --- Modification: une extension de la durée du projet a été demandée pour terminer l'étude en cours.

Bénéfices attendus

****Opportunités thérapeutiques : La confirmation que l’emploi d’un urétéroscope flexible permet d’atteindre ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie ou encore la polykystose rénale. ****Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration par urétéroscope permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible (ici les reins) limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. ****Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.

Procédures

Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -4 à 5 prises de sang (selon les groupes d’animaux) sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme d’une injection intramusculaire par semaine (durée moins d’une minute) et de la prise de comprimés quotidienne qui seront mélangés à un aliment ou une boisson appétente. -1 à 2 procédures d’administration de vecteur de thérapie génique (selon les groupes d’animaux) qui se déroulent sous anesthésie générale. L’anesthésie inclut une injection intramusculaire pour la sédation (durée de moins d’une minute). L’animal est ensuite inconscient pour le reste de la procédure. La procédure totale sous anesthésie dure entre 1h30 et 2h, selon qu’un seul rein ou deux sont traités. -A la fin du projet (au bout de 3 à semaines selon les groupes) : les animaux feront l’objet d’une dernière anesthésie générale (injection intramusculaire de moins d’une minute), la suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale. Au cours de celle-ci une chirurgie sera réalisée afin de réaliser des prélèvements d’organes. L’animal sera ensuite mis à mort, toujours lors de cette anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La plupart des actes se dérouleront sous sédation ou sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire. Nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. Lorsqu’une anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur fiable permettant de nous assurer de l’absence de toute souffrance. Pour les injections intramusculaires du traitement immunomodulateur, là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. La prise de comprimés ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin d’étudier l’effet de la thérapie génique sur les reins post mortem.

Remplacement

Compte tenu que le but du projet est de démontrer l’emploi d’un urétéroscope flexible pour délivrer un vecteur viral de thérapie génique par les voies naturelles, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration intra-rénale du vecteur de thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer l’utilisation d’un animal vivant.

Réduction

****Stratégie de réduction: Ce projet se découpe en une Phase pilote incluant 6 porcs suivie d’une Phase de Consolidation incluant 14 porcs. La Phase Pilote aura la particularité d’injecter les 2 reins d’un même animal permettant ainsi de diviser le nombre d’animaux par 2. En fonction des résulats obtenus à l’issue de la Phase Pilote, la Phase de Consolidation n’injectera qu’un seul rein sur les deux afin de disposer d’un rein contrôle non exposé au vecteur de thérapie génique. Cependant, compte tenu qu’au cours de la Phase Pilote, les injections seront restreintes soit à la partie supérieure soit inférieure du rein, il est possible que le pôle rénal non directement exposé puisse servir de tissu contrôl interne. Auquel cas, là également, nous pourrons exploiter les 2 reins chez un même animal et ainsi diviser le nombre total d’animaux par 2. Il faudra donc attendre l’issue de la Phase Pilote avant de pouvoir décider la meilleure option pour promouvoir la Réduction du nombre d’animaux. ****Statistiques: cette étude ne prévoit pas d'analyse statistique des résultats. Il s'agit d'une étude qualitative qui est destinée à tester quelques paramètres d’injection car nous sommes en mode exploratoire. Une fois nous aurons identifiés les paramètres et conditions clés, une seconde session incluera des ‘n’ plus conséquent pour confirmer et valider les conditions optimales d’injection.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les porcs sont réceptionnés au sein de l’animalerie où ils sont acclimatés et hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, avec des conditions d’ambiances contrôlées. Ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses facilite les interactions avec les soigneurs et réduit leur stress lors des manipulations. Un programme musical apaisant est diffusé pour couvrir les bruits d’ambiance aversifs. Conditions expérimentales : L’urétéroscopie par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, l’urétéroscopie ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cette abord chirugical non-invasive. Les animaux sont anesthésiés et recevront des analgésiques pour toutes les procédures et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou stérilisable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant 3 à 4 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et posopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Choix des espèces

Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocol adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. Il faut également que l’anatomie de l’espèce animale et de l’organe ciblé soient similaires à l’homme. Le porc est donc la seule espèce qui nous permettra une validation préclinique de la procédure d’injection. Des porcs de 3 mois environ (soit 40-50 kg) seront utilisés. A ce stade de développement, le système urinaire du porc est très proche de celui de l’humain tant du point de vue anatomique que du point de vue de sa taille, permettant ainsi de se positionner dans les mêmes conditions que celles de la thérapie chez l’Homme.

Tester les molécules de clients industriels sur des reins malades occupe 2520 rats et 1620 souris, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux développent une néphropathie spontanément, par diabète ou par lupus, ou bien par induction chimique, puis reçoivent les composés à évaluer au fil de 55 études étalées sur cinq ans. Chaque semaine, ils passent jusqu'à vingt-quatre heures isolés en cage à métabolisme pour la collecte d'urine, subissent une vidange manuelle de la vessie, deux heures d'anesthésie gazeuse pour la mesure de la filtration rénale, des prises de sang et parfois l'implantation d'une pompe osmotique. Le porteur écrit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles" des molécules testées, et retient un modèle de lupus dont la littérature annonce 50 % de mortalité à six mois, en gardant les animaux en vie jusqu'à sept mois.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de néphropathie. Nous pensons réaliser 55 études dans ce projet sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de néphropathie.

Procédures

Les animaux vont développer naturellement une néphropathie (animaux diabétiques ou ayant le lupus) ou celle-ci sera induite chimiquement. Les animaux vont recevoir des administrations de composés chimiques (inducteur de pathologie ou de candidats médicaments à tester). Ces gestes seront très rapides (moins d’1 minute) et seront réalisés par du personnel compétent pour diminuer tout stress. Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme et isolés temporairement de leurs congénères (24H maximum 1 fois par semaine) afin de récolter de l’urine. Une vidange manuelle de la vessie pourra aussi être réalisée (environ 30 secondes pour ce geste sans douleur). Les animaux auront une anesthésie gazeuse afin de pouvoir leur « scotcher » un capteur afin d’évaluer la filtration glomérulaire pendant 2 heures et seront remis avec leurs congénères ensuite. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours de l’expérimentation ainsi que des dosages de glycémie à l’aide d’un glucomètre (nécessité d’avoir 1 goutte de sang, geste durant 30 secondes). Les animaux auront une procédure chirurgicale rapide (10 minutes) que s’il y a implantation de pompes osmotiques.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés développant spontanément des néphropathies selon le modèle étudié ou nous induirons chimiquement cette pathologie rénale. Les animaux vont donc ressentir les symptômes de cette pathologie à savoir des troubles rénaux (douleur possible) et par conséquent des troubles urinaires.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort et des prélèvements d’organes seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des néphropathies. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres (récolte d’urines via des cages métaboliques, mesure de la filtration glomérulaire qui sont des méthodes non invasives). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et pour ces différents modèles, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 10-15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables selon les modèles. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux (aspect général de l’animal, pâleur, poils hérissés, sales ou toilettage, prostration ou non, difficulté à se mouvoir, plaie…) sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Les procédures sous anesthésie seront réalisées sur plaque chauffante thermorégulée afin d’éviter toute hypothermie de l’animal. Des analgésiques seront administrés selon les protocoles expérimentaux. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, soigné, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et réaliseraient une mise à mort.

Choix des espèces

Tous les modèles sont bien décrits dans la littérature chez le rat ou la souris. Certains modèles nécessitent l’utilisation d’animaux particuliers : Modèle de néphopathie lupique : Le modèle choisi pour cette étude est un modèle murin génétiquement modifié. Elles vont développer de manière spontanée une néphropathie cliniquement similaire à ce qui est observé dans la pathologie humaine. Dans la littérature, il est précisé qu’il y a un taux de mortalité de 50 % chez des animaux âgés de 6 mois. A moins que les animaux présentent des signes cliniques nécessitant leur mise à mort, nous les garderons en vie maximum jusqu’à l’âge de 7 mois. Modèle de néphropathie diabétique : Il existe plusieurs modèles diabétiques développant une néphropathie chez le rongeur : certains chez le rat, d’autres chez la souris. Les modèles de néphropathie diabétique chez les souris génétiquement modifiées que nous avons choisis sont largement décrits dans la littérature et leurs caractéristiques sont très proches de la pathologie humaine du diabète de type II. En accord avec ces données et avec l’objectif de notre étude, nous avons choisi ces modèles pour évaluer l’effet de candidats médicaments sur la fonction et les dommages rénaux induits par cette pathologie. Toutefois, la réalisation de ce projet avec des rats rendus diabétiques chimiquement est tout à fait envisageable et dépendra des demandes des clients et de leur préférence. Selon les modèles, différents animaux seront utilisés : - animaux âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines (lupus) - des rats de 100 -125 g ou 5 semaines au début de l’expérimentation seront utilisés pour un modèle induit chimiquement en accord avec la littérature et notre expérience. - des rats de 90-100 g ou 4 semaines au début de l’expérimentation seront utilisés pour un autre modèle induit chimiquement en accord avec la littérature et notre expérience. - des animaux d’au moins 6 semaines, stade auquel les animaux ont initié un diabète de type II avec une hyperglycémie ainsi qu’une albuminurie, principales caractéristiques de la néphropathie diabétique. Cependant, selon les demandes du sponsor, l’âge des animaux pourra être différent.

Anesthésiés pour une mesure de filtration rénale de deux heures quinze, puis soumis à l'insertion d'un ballonnet dans l'artère rénale gonflé trente minutes pour interrompre la circulation sanguine, 11 porcs de 60 kg subissent ensuite trois biopsies rénales chacun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une douleur légère à l'insertion du ballonnet, une douleur modérée aux biopsies, une perte de poids et une déshydratation. L'objet immédiat se limite à mesurer combien de temps dure la multiplication des cellules rénales après une interruption de circulation, première étape d'un travail sur le délai optimal de prélèvement des greffons. Les 11 porcs sont tués à la fin pour que leurs reins soient prélevés et leur structure examinée.

Objectifs

La transplantation est le meilleur traitement de l'insuffisance rénale terminale. Le nombre de patients sur la liste d'attente d'une greffe de rein augmente constamment et le nombre de greffons reste largement insuffisant. Entre 2017 et 2021, seulement 41% des personnes sur la liste d'attente ont été greffées. Il est donc indispensable d'augmenter la qualité des greffons disponibles afin de diminuer le risque de reprise retardée de fonction, qui survient rapidement après transplantation. Malgré les améliorations apportées dans la prise en charge, cette reprise retardée de fonction survient dans 30% des reins greffés. Entre le prélèvement chez le donneur et la greffe chez le receveur, le rein subit une ischémie, c'est-à-dire un arrêt de la circulation sanguine, qui provoque des lésions rénales. Un tiers des donneurs en état de mort cérébrale subit un arrêt cardiaque récupéré, qui entraîne une ischémie. Un rein provenant d'un donneur ayant fait un arrêt cardiaque subit donc deux ischémies au lieu d'une. Ces reins devraient donc avoir un risque plus important de reprise retardée de fonction mais aucune étude n'a jamais confirmé cette hypothèse. Des facteurs intervenant entre l'arrêt cardiaque et le prélèvement du greffon modifieraient donc les conséquences de l'ischémie sur sa reprise de fonction. En accord avec cette hypothèse, nous avons montré qu'un intervalle entre arrêt cardiaque et prélèvement inférieur à 3 jours est associé à un risque plus élevé de reprise retardée de fonction. Nous cherchons maintenant à identifier les mécanismes sous-jacents. Notre première piste est celle de la prolifération cellulaire, c'est-à-dire la multiplication des cellules. En effet, l'ischémie provoque la mort d'une partie des cellules du rein, qui vont être remplacées grâce à la prolifération des cellules survivantes. Nous avons montré que les cellules épithéliales rénales en prolifération meurent plus lorsqu'elles subissent une ischémie que des cellules qui ne prolifèrent pas. Un prélèvement (2ème ischémie) pendant la phase de prolifération induite par l'arrêt cardiaque (1ère ischémie) pourrait donc avoir des conséquences négatives sur le greffon. Afin de démontrer cette hypothèse, nous allons utiliser le modèle porcin. Une transplantation rénale sera réalisée pendant ou après la phase de prolifération induite par une ischémie rénale. La première étape de ce projet est de déterminer la durée de la phase de prolifération induite par une ischémie.

Bénéfices attendus

L'insuffisance rénale chronique est un problème majeur de Santé Publique, et son meilleur traitement, la greffe rénale, est limité par la durée réduite de fonctionnement du greffon. Le nombre de patients sur la liste d'attente d'une greffe de rein a augmenté de 6% en 2020. Cependant, le nombre de greffons n'augmente pas de la même façon, demeurant ainsi largement insuffisant. Il est donc indispensable d'augmenter la qualité et la survie des greffons disponibles afin de diminuer le risque de non-reprise de fonction, qui survient rapidement après transplantation. Si notre projet confirme notre hypothèse de travail, il pourra permettre d'améliorer la qualité des greffons en recommandant un intervalle de temps optimal pour le prélèvement après un arrêt cardiaque récupéré. Le délai entre arrêt cardiaque et prélèvement du rein pour greffe est un paramètre modifiable qui n'a jamais été étudié auparavant.

Procédures

Les 11 animaux seront soumis aux interventions suivantes : (1) mesure du débit de filtration glomérulaire sous anesthésie générale. Cette partie de la procédure dure 2h15. (2) Toujours sous anesthésie générale, induction d'une ischémie rénale par insertion d'un ballonnet dans l'artère rénale par voie vasculaire à partir de la région inguinale. Le ballonnet est maintenu gonflé pendant 30 minutes puis dégonflé et retiré. Cet acte dure 50 minutes. (3) Injection par voie intraveineuse de marqueurs de prolifération sous sédation. Cet acte dure 10 minutes. (4) Biopsie rénale sera effectuée sous sédation pour maintenir l'animal immobile et anesthésie locale. Trois biopsies seront effectuées sur chaque animal. Cette procédure dure 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont les suivants : (1) douleur légère provoquée par la procédure nécessaire pour insérer et retirer le ballonnet (perforation de la peau et du plan musculaire sous-cutané); (2) douleur modérée provoquée par la biopsie (ponction à travers la peau); (3) altération modérée de l'état général : perte de poids, déshydratation; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes. Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à la réalisation des procédures sous anesthésie générale balancée (hypnose et analgésie) et l'utilisation de mesures de raffinement appropriées.

Devenir

Les 11 animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever les reins pour étudier leur structure.

Remplacement

Des études préliminaires réalisées sur des biopsies humaines et des études in vitro ont permis de confirmer nos hypothèses de travail. Seul l’animal entier et vivant, et possédant une masse corporelle et un système rénal proche de l’homme, permettra de déterminer si un prélèvement du rein au moins 3 jours après l'arrêt cardiaque permet de réduire le risque de reprise retardé de fonction du greffon.

Réduction

Nous avons choisi de réaliser des biopsies successives sur le même animal afin de limiter le nombre d'animaux. L'autre alternative aurait en effet été d'euthanasier 9 porcs à chaque temps choisi après ischémie. Le nombre de porcs nécessaires à notre étude a été calculé de sorte à réduire au maximum l'utilisation des animaux tout en ayant un effet statistique significatif. Il tient compte des variations inter-individuelles de la pathologie rénale, et de la nécessité d’utiliser des tests non paramétriques (la quantification de la division cellulaire ne suivant pas une distribution normale).

Raffinement

Le bien-être des animaux est assuré grâce à un environnement adapté de façon à réduire l’angoisse des animaux : - Hébergement en groupe pour contact régulier entre congénères - Enrichissement de l’environnement des animaux avec des copeaux (activité de fouissement) - Activités avec plusieurs dispositifs d’enrichissement (medecine ball, planche à gratter ...) - Pesée hebdomadaire réalisée sous forme de jeux avec récompense (portion de fruit). De plus, avant de démarrer le protocole expérimental, les animaux auront une semaine minimum d’acclimatation dans l’animalerie et feront l’objet d’un contrôle quotidien par un zootechnicien. Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. L'évaluation du bien-être animal sera réalisée de manière quotidienne pour chaque animal, pendant la période d'acclimatation et durant la phase expérimentale jusqu'à son euthanasie. Ces différents éléments seront évalués à l'aide d'une grille d'évaluation émanant de la cellule du bienêtre animal. L’atteinte d’un point limite sera déterminée par l’observation de signes comportementaux, d’apparence générale permettant de quantifier la souffrance de l’animal selon un score spécifique à l’espèce porcine. Les interventions longues sont réalisées sous anesthésie générale balancée (narcose, analgésie et curarisation) combinant hypnotiques et analgésiques. Les interventions de courte durée et peu douloureuse seront réalisées sous sédation et anesthésie locale.

Choix des espèces

Nous utilisons des porcs de type charcutier adultes de 60kg qui possèdent des caractéristiques anatomiques permettant l'ischémie rénale par ballonnet (taille des vaisseaux par rapport au dispositif).

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

2 680 souris et 2 680 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une surcharge d'hormones androgènes leur est administrée chaque jour pendant une à vingt-quatre semaines, par voie orale, par injection ou par implant sous-cutané à libération prolongée, pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques. Les femelles subissent en plus un frottis vaginal quotidien pendant quatorze à vingt-huit jours consécutifs, des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires, et pour certaines une mise à l'accouplement de deux semaines suivie d'une gestation menée à terme. Provoquer l'infertilité ne devrait pas, selon le porteur, entraîner d'autres effets indésirables, et tous les animaux seront tués parce que le prélèvement des ovaires est jugé "indispensable" pour établir l'effet d'un traitement.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise à développer des modèles animaux de SOPK spontané (certaine souche de rat) ou induit par surcharge androgénique, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques. Ces modèles animaux chez les rongeurs sont décrits comme mimant le SOPK chez la femme, et répondant aux critères diagnostic de la maladie (critères de Rotterdam).

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.

Procédures

Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs (28 jours au maximum) afin de déterminer la présence de SOPK. Un test de fertilité par accouplement peut être réalisé afin d’observer le déroulement de la gestation. Les femelles seront mis en accouplement pendant 2 semaines au maximum et la gestation sera mené à terme (environ 3 semaines). Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes

Impact sur les animaux

L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux. Le test d'accouplement peut engendrer un léger stress et anxiété au début, lors de l'acclimatation avec le mâle.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.

Réduction

La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Si un test d’accouplement est réalisé, les rats mâles seront réutilisés dans la mesure du possible afin de limiter leur nombre. Une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.

Un sérum toxique pour le rein, obtenu en immunisant des moutons contre des composants du glomérule de souris, est injecté sous anesthésie à toutes les souris du projet. 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec selon les protocoles un gavage ou une injection quotidienne pendant dix à quatorze jours et un recueil d'urine deux fois par semaine. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une protéine de stress freine la formation des croissants cellulaires qui détruisent le filtre du rein. Le porteur décrit une prise de poids par ascite et par œdèmes après l'injection du sérum, puis conclut que les protocoles sont "relativement courts" et qu'il ne devrait pas observer de complications trop sévères.

Objectifs

Les maladies rénales affectent dix pour cent de la population mondiale avec une incidence croissante et elles représentent de nos jours un véritable enjeu de santé publique. Si ces maladies ne sont pas prises en charge, elles peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale (IRCT). L'IRCT est associée à une importante mortalité cardiovasculaire et à un coût élevé pour la société (environ 4 milliards d'euros par an en France). L'une des causes les plus sévère d'IRCT sont les glomérulonéphrites extracapillaires (GEC). Les GEC sont associées à une prolifération anormale de cellules rénales : les cellules épithéliales pariétales formant un "croissant" cellulaire dans le glomérule, unité de filtration du rein. Des données suggèrent l'implication des protéines de stress dans le développement de ces croissants. Il a été démontré que l'une de ces protéines de stress aurait un rôle délétère dans la GEC faisant de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Le principal modèle murin de GEC est caractérisé par l'injection d'un sérum toxique pour les reins (sérum obtenu après immunisation de mouton contre des composants du glomérule de la souris). Dans ce modèle, les animaux développent une atteinte rénale rapide dès le dixième jour, caractérisée par des lésions de croissants (reproduisant les caractéristiques histologiques et fonctionnelles des GEC humaines). Pour préciser le rôle in vivo de cette protéine de stress et l'intérêt thérapeutique éventuel de son inhibition, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs : 1/ Etude de l'expression de la protéine de stress au cours du développement de la GEC expérimentale pour affiner le rôle in vivo de cette dernière 2/ Inhibition pharmacologique de la protéine à visée thérapeutique 3/Inhibition génétique de la protéine de stress dans plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées pour déterminer quelles cellules rénales sont impliquées dans la signalisation de cette protéine.

Bénéfices attendus

Les maladies glomérulaires représentent la première cause d'insuffisance rénale terminale. Le développement de thérapies ciblées agissant spécifiquement sur les cellules épithéliales glomérulaires (cellules locales) est donc essentiel afin de contrôler ces maladies glomérulaires. Ces travaux pourraient permettre de proposer la protéine de stress (étant déjà la cible de différents traitements) comme une cible thérapeutique prometteuse dans diverses maladies glomérulaires rénales. Comme nos premiers résultats l'indiquent, cette protéine pourrait être impliquée dans le développement de pathLaologies dévastatrices comme la glomérulonéphrite extracapillaire (GEC) aboutissant dans la majorité des cas à l'apparition d'une Insuffisance Rénale Chronique (IRC). De nos jours, l'insuffisance rénale chronique à des conséquences socio-économiques majeures. Son traitement représente l'un des couts les plus importants du budget de la santé pour une petite fraction de la population : il est urgent de disposer de davantage de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques. De plus, actuellement, le traitement de la GEC repose principalement sur une thérapie qui a des effets nefastes importants pour les patients concernés. Ce projet a l'ambition de proposer des stratégies thérapeutiques inhibant les mécanismes physiopathologiques clés impliqués dans le développement des croissants.

Procédures

(1) Tous les animaux recevront une injection de sérum sous anesthésie environ 3 minutes par souris sur un plateau thermostaté à 37degrés. (2) Pour les protocoles, certains animaux recevront un gavage par jour sur les périodes de traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minutes par souris. (3) Pour un autre protocole, certains animaux recevront une injection d'un traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minute par souris. (4) L'ensemble des souris auront un recueil des urines pendant le protocole deux fois par semaines environ 1 minute par souris. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (1 minute environ/souris).

Impact sur les animaux

Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1.les différentes injections des medicaments. Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent developper une inflammation et un stress lors de la contention pour la bonne administration. 2. Les manipulations quotidiennes en particulier pour les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent developper un stress lors de la contention pour le recueil d'urines quand elle est nécéssaire. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum toxique pour le rein, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des oedemes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement cours, nous ne devrions pas observer de complications trop sévères pour les reins (perte de poids, baisse de la température corporelle).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 760 souris. De plus, nous utiliserons des tests statitiques adaptés.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses conformément à la réglementation en vigueur.Enfin, pour la mesure de certains paramètres, des efforts seront faits pour réduire au maximum le stress lié à la contention, garantissant ainsi le bien-être des animaux tout au long de la procédure

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans cette étude est bien maîtrisé par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Cette étude bénéficie également de la possibilité de tester l'implication de voies de signalisation spécifiques à certaines cellules, grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.