Troubles urogénitaux

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Le protocole, sa fréquence et sa durée dépendent du composé à tester et des recommandations d'une entreprise pharmaceutique partenaire. 960 rats vont être utilisés, tous tués à la fin de l'étude, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur vessie est irritée par instillation d'acide acétique ou chlorhydrique, avec selon les cas l'implantation d'une pompe osmotique, la pose d'un cathéter intravésical et une cystométrie pouvant durer quatre heures. Le tri de molécules candidates contre l'hyperactivité vésicale se fait donc au rythme d'un partenariat industriel, le porteur précisant que les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations formulées dans ce cadre.

Objectifs

L'hyperactivité vésicale (HV) touche 15% de la population et sa fréquence augmente avec l’âge. La compréhension de sa physiopathologie reste partielle, souvent explorée par le prisme des mécanismes de l'hyperactivité détrusorienne. Les traitements de première intention incluent les antimuscariniques, mais leur efficacité est limitée et leurs effets secondaires nuisent à l'observance. Cela souligne l'importance de développer des traitements alternatifs. Pour cela, des modèles précliniques d’hyperactivité vésicale ont été élaborés, notamment des modèles aigus utilisant une irritation chimique de la vessie. L'instillation d’acide acétique (AA) ou acide chlorhydrique (HCl) dilué est la méthode la plus couramment utilisée. Ce projet vise à sélectionner de nouveaux composés thérapeutiques en évaluant leur efficacité dans un modèle d’irritation vésicale induite par l’AA (ou HCl) chez le rat.

Bénéfices attendus

L'hyperactivité vésicale (HV) touche 15% de la population et sa fréquence augmente avec l’âge. Cependant, la compréhension de sa physiopathologie reste partielle, et l’arsenal thérapeutique disponible est resté relativement stable au cours de la dernière décennie, à l'exception de l'introduction de la nouvelle classe d'agonistes des adrénorécepteurs β3. De plus, nombre de ces traitements sont contraignants, provoquent des effets indésirables, et ont une efficacité variable. Il est donc crucial de concevoir de nouvelles molécules et de confirmer leur efficacité dans des modèles précliniques appropriés. Cela implique une recherche approfondie et une expérimentation rigoureuse pour garantir que ces nouvelles molécules sont non seulement efficaces, mais aussi sûres à l’utilisation. Les rats possèdent des similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains, ce qui permet une étude précise des mécanismes sous-jacents de l'hyperactivité vésicale. L'irritation de la vessie par l'acide acétique reproduit des conditions pathologiques semblables à celles observées chez les humains, facilitant l'analyse des voies neuronales et des réponses inflammatoires. À long terme, une meilleure gestion de l'hyperactivité vésicale peut réduire les complications, telles que les infections urinaires récurrentes et les problèmes rénaux. Les avancées dans le traitement de cette condition peuvent significativement améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes gênants et invalidants. Enfin, ces expériences permettront d’enrichir la base des connaissances scientifiques sur cette pathologie encore mal connue, et les découvertes faites grâce à ces modèles peuvent inspirer de nouvelles directions de recherche, stimulant ainsi l'innovation scientifique en général, et thérapeutique en particulier.

Procédures

Les animaux seront traités par le composé à analyser ou ses contrôles, la fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (généralement moins de 6 mois). Tout type d’administration dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min si l'administration nécessite une anesthésie. Une cystométrie peut être faite pour évaluer l'effet du composé administré, l’expérience dure 4 h au maximum, précédée de l’implantation d’un cathéter intravésical. Enfin, des prélèvements de sang, d’urines ou d'organes après sacrifice pourront être envisagés. Chaque prélèvement de sang durera moins de 3 minutes. Une collecte d’urine se fait en cage à métabolisme et en moins de 24h. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, ou bien l’implantation de pompe osmotique si le protocole le requiert. - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront traités en aigu ou en chronique par les composés à évaluer. L’efficacité des nouveaux traitements sera évaluée par analyse de la diurèse sur moins de 24h, par cystométrie, et/ou par l’analyse des différents prélèvements de sang, d’organe ou d’urine. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude. La mise à mort des animaux est réalisée par le personnel compétent, tutoré et habilité.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de la vessie hyperactive, qui est une pathologie définie par des symptômes et ainsi, difficile à appréhender hors d’une situation physiologique. De plus, l’étiologie de la vessie hyperactive est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques (système nerveux, métabolisme, hormones…etc). Ainsi, l’interaction entre les différents mécanismes impliqués nécessite un modèle animal.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. De plus, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage quand cela est possible, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. - L’implantation d’une pompe osmotique se font sous analgésie et anesthésie générale. Un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. - L’implantation d’un cathéter intraveineux, et/ou l’implantation d’un cathéter intravésical pour permettre la cystométrie, ainsi que la cystométrie elle-même, se font sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude d’une fonction physiologique complexe telle que l’hyperactivité vésicale. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien. Le choix des protocoles est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chances d’obtenir des résultats satisfaisants. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

Le choix de l'espèce et du modèle dépend des demandes des clients : 3 151 souris et 3 151 rats, soit 6 302 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement des ovaires, du cerveau, du tissu adipeux et de l'utérus. Le syndrome des ovaires polykystiques est induit par létrozole ou par exposition hormonale avant la naissance, avec régime gras jusqu'à dix semaines, ovariectomie de trente minutes, frottis vaginaux quotidiens et administrations deux fois par jour. Les nouveau-nés mâles, écartés du protocole, sont réorientés vers l'apprentissage de gestes techniques. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à dimensionner les groupes, fixés à huit animaux par comparaison avec des publications.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Pour le modèle hormonale, les femelles gestantes recevront des traitements hormonaux pendant 3-5 jours par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les nouveau-nés ne seront manipuler qu’au moment du sevrage pour pouvoir différencier les mâles des femelles. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.

Choix des espèces

Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix du modèle utilisé sera dépendant des demandes clients car les modèles SOPK induits par le létrozole ou par exposition hormonale prénatale sont bien décrits dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des animaux adultes ou prépubères (3 semaines) pour le modèle létrozole. De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé). Pour le modèle d’exposition prénatale aux hormones, nous utiliserons des femelles gestantes de 2-3 mois et les nouveau-nés femelles âgés de 21 jours minimum.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

Un rein prélevé par chirurgie ouverte, transporté par drone, puis regreffé au même animal avant l'ablation du rein restant: 9 porcs subissent cette séquence au cours d'une procédure unique de sept jours, d'un niveau de souffrance modéré, et sont tués au septième jour pour analyse histologique du greffon. Chaque animal est à la fois son propre donneur et son propre receveur, avec une heure de chirurgie pour le prélèvement, trois heures pour la transplantation, un cathéter central, des prises de sang quotidiennes et un hébergement individuel jusqu'à reprise de la diurèse. Le projet porte sur le mode de transport, le drone étant présenté comme une solution prioritaire pour ramener la durée d'ischémie sous dix heures, avec un intérêt économique et sécuritaire déclaré. Le porteur écrit que trois porcs par groupe ne permettent aucune analyse statistique, tout en jugeant cet effectif suffisant pour fonder la sécurité du dispositif avant son autorisation en clinique humaine.

Objectifs

Le plan ministériel (ministère de la santé) pour le prélèvement et la greffe d’organes et de tissus 2022-2026 en coordination avec l’Agence de BioMédecine a pour objectif de diminuer la durée moyenne de transport des organes. Le but est d’atteindre pour les transplants rénaux une durée d’ischémie au cours du transport < 10 heures. L’utilisation de systèmes d’avions pilotés à distance (drones aériens) fait partie des solutions prioritaires car il permet de diminuer significativement la durée de transport des transplants. Il présente aussi un intérêt sécuritaire en diminuant le nombre d’intervenants et travailleurs nocturnes et également un intérêt économique. Le transport de transplants rénaux par drones représente néanmoins un challenge et fait apparaitre de nouvelles problématiques non explorées (Condition non pressurisée et non thermo-régulée, avec exposition des transplants à des température décroissantes et à des vibrations). L’objectif de ce projet est d’évaluer l’utilisation d’un nouveau mode de transport par drones des transplants rénaux. Notre projet vise à réaliser une première en utilisation d’un drone développé pour le transport d’organe avant autorisation en clinique humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d’apporter des données de sécurité de l’utilisation des drones dans le transport des transplants rénaux. Les évaluations biopsiques visent à évaluer l’absence de lésion histologique. La surveillance clinique vise à assurer la reprise de fonction des transplants après transport. Ces données de sécurité permettront la mise en place des premiers protocoles de transport des transplants rénaux en clinique humaine.

Procédures

Ce projet prévoit l’utilisation de 9 porcs sur une procédure unique expérimentale de 7 jours reproduisant un processus complet de transplantation rénale avec prélèvement, transport du transplant, transplantation et suivi. - Sous anesthésie générale, un prélèvement rénal gauche sera réalisée par chirurgie ouverte. (1 heure) - Après transport des transplants rénaux selon 3 distances de références avec une phase de décollage, de vol et d’atterrissage Sous anesthésie générale, transplantation rénale puis néphrectomie droite seront réalisées par la même cicatrice de chirurgie. (3 heures) . - Un suivi des animaux sera réalisé pendant 7 jours avec une surveillance clinique, de la diurèse et par prises de sang quotidiennes sur cathéter central. - Mise à mort des sujets sous procédure d’anesthésie

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux pourraient inclure : • Anesthésie profonde et prolongée des animaux • Effets secondaires systémiques liés à l'anesthésie générale et ou aux médicaments administrés pendant les procédures chirurgicales et pour la gestion de la douleur post-opératoire. • Douleur en lien avec la chirurgie abdominale. • Risques de complications chirurgicales telles que l'infection des plaies ou les saignements. • Hébergement individuel des animaux pour surveiller la diurèse jusqu’à reprise franche de la diurèse.

Devenir

Au 7ème jour, les porcs seront euthanasiés sous procédure complète d’anesthésie générale, pour prélèvement et analyse histologique du greffon explanté.

Remplacement

L'étude de la fonction d’un organe dans sa complexité, ne peut se concevoir que dans un modèle animal pré-clinique (donneur), il n’existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. Cependant, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, les modèles porcins seront à la fois leur donneur et leur receveur pour diminuer le nombre de sujet nécessaire.

Réduction

Il s’agit d’une première étude de sécurité. L’inclusion de 3 porcs par groupe permet d’avoir des éléments de sécurité nécessaires pour passer aux groupes suivants. Bien que le nombre de 3 animaux par groupe ne permettent pas une analyse statistique des résultats, il est suffisant pour cette première étude de sécurité. En cas de lésions trop importantes des transplants, les porcs suivants ne seront pas inclus. De façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, les modèles porcins seront à la fois leur donneur et leur receveur pour diminuer le nombre de sujet nécessaire.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au raffinement dans l’hébergement individuel et dans la prise en compte des souffrances de l’animal. A leur arrivée les animaux seront hébergés en groupe durant une période d’acclimatation pré-expérimentale de 7 jours minimum. La température de la pièce sera maintenue à la même température que chez l’éleveur et l’alimentation sera poursuivie telle que chez l’éleveur de façon à établir une continuité et diminue le stress thermique et alimentaire. Une alimentation humidifiée sera apportée aux animaux en post-opératoire pour faciliter la prise alimentaire. Un pansement gastrique par Keal 1g per os sera apporté une fois par jour aux porcs pour diminuer le risque d’ulcère gastrique. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. Durant les opérations, les porcs seront installés sur des tapis chauffants. Un gilet avec une voie veineuse centrale sera installée sur chacun des animaux pour faciliter l’administration IV des antalgiques, faciliter l’hydratation des sujets et enfin faciliter le prélèvement des biologies sanguines. L’utilisation d’un cathéter central permet d’éviter l’usage itératif d’anesthésies légères nécessaires aux prélèvements veineux périphériques. Enrichissement du milieu : Des Jouets et une diversification seront à disposition pendant toute la phase d’expérimentation, conformément aux moyens disponibles dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront hébergés individuellement pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase du fait de l’utilisation de cages métaboliques associée au suivi de la diurèse et à des gilets de maintien de la voie veineuse centrale. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif. Un enrichissement et contact avec les animaliers sera alors accru pendant cette phase.

Choix des espèces

La race de porc utilisée est Landrace x Piétrain x Large White. Le modèle porcin est le modèle de référence en transplantation rénale car la physiologie rénale est proche de celle humaine. L’anatomie abdominale ainsi que la physiologie du porc de 70 kg sont proches de celles de l’homme adulte et font donc de cette espèce un excellent modèle pré-clinique pour l’analyse des transplants rénaux. Jeunes mâles, 70Kg, similitude anatomique et physiologique avec un homme adulte au niveau abdominal. Modèle de référence pour l’analyse des transplants rénaux.