Procédures modérées

Portant des modifications génétiques ciblant le récepteur CB1 ou les neurones à POMC, 1 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 696 d'entre elles reçoivent une injection de particules virales dans le cerveau, 232 se voient implanter une lentille intracérébrale au cours d'opérations de 45 à 75 minutes, et 192 sont gavées de tamoxifène cinq jours d'affilée. Le protocole repose sur un conditionnement à la peur, dont le porteur reconnaît qu'il augmente le niveau de stress, complété par des tests qualifiés d'anxiogènes sans qu'aucun ne soit nommé. Toutes sont tuées à la fin, par dislocation cervicale ou par perfusion intracardiaque après sédation, pour prélever le cerveau et d'autres tissus.

Objectifs

Notre corps réagit à la peur en utilisant ses réserves d’énergie et en modifiant certaines fonctions internes pour nous aider à faire face à la situation. La peur influence notre cerveau de différentes façons, ce qui peut changer nos émotions et notre comportement. Elle peut parfois provoquer des réactions peu adaptées, comme manger de façon compulsive. Dans le cerveau, une zone particulière joue un rôle important dans le contrôle de l’alimentation. Certaines neurones de cette zone (appeler les neurones à POMC) aident normalement à réduire la sensation de faim. Une molécule bien connue, appelée récepteur CB1, intervient à la fois dans la manière dont nous réagissons à la peur et dans la façon dont nous régulons notre alimentation. Le but de ce projet est de comprendre si ce récepteur CB1 peut influencer à la fois la réaction à la peur et le comportement alimentaire dans ces cellules qui participent à limiter la prise de nourriture. Pour cela, nous avons deux objectifs : Voir si le récepteur CB1 modifie l’activité de ces cellules lorsque les souris ont peur et déterminer si ce même récepteur influence la façon dont les souris mangent lorsqu’elles vivent une situation de peur

Bénéfices attendus

Nous souhaitons souligner la nouveauté de ce projet, puisque le rôle de la POMC dans la réponse à la peur n'a jamais encore été étudié auparavant. Les neurones à POMC ont été largement explorés dans le domaine du comportement alimentaire, mais leur rôle dans la régulation de l'anxiété et celui de la peur n'a pas encore été étudié. Il est admis que le stress ou l'anxiété altère le comportement alimentaire, ce qui peut entraîner des troubles du comportement alimentaire et l'obésité. Cependant, les mécanismes moléculaires reliant ces deux phénomènes ne sont toujours pas clairs. Dans ce contexte, les neurones à POMC et le récepteur CB1, par leur capacité à réguler à la fois l'alimentation et la réponse au stress, semblent être de bons candidats pour expliquer l’interaction entre alimentation et comportement de peur.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons des opérations chirurgicales sur des souris POMC*CB1, POMC-Cre et CRH-Cre afin d'injecter des particules virales dans le cerveau. Les souris POMC*CB1 subiront une seule injection de vecteur viral dans le cerveau (696 souris). Les souris POMC-Cre seront également utilisées pour implanter une lentille qui nous permettra d'étudier l'activité neuronale en temps réel (232 souris). Ces procédures durent entre 45 et 75 minutes et sont réalisées sous anesthésie locale et générale (traitement à la lidocaïne au site d'incision et isoflurane pendant la chirurgie). De plus, les souris recevront un traitement analgésique pendant la chirurgie et un traitement antiflamatoire 48h après la chirurgie pour éviter la douleur et assurer une bonne récupération après la procédure. L'état général des souris, ainsi que le poids corporel, seront évalués les jours suivant la chirurgie selon les points limites de définies dans l'annexe 2. Les souris POMC-Cre+ et CRH-Cre+ (96 souris) avec une injection intracérébrale de virus AAV contenant le DREADDS, 4 semaines après la chirurgie, lorsque le virus sera exprimé, nous effectuerons une injection du CNO soit 30 minutes avant le test par voie intrapéritonéale, soit 1 heure avant le test par voie sous-cutanée. Ces procédures seront effectuée seulement une seule fois par animal. Les souris POMC-vglut2 at POMC-GAD (192 souris) recevront une administration orale de tamoxifène pendant 5 jours. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Pour réduire le stress de l’animal au moment de la procédure, une période d’habituation sera réalisée 3 jours avant le début des 5 jours de gavage.

Impact sur les animaux

Pour les procédures chirurgicales, afin d'éviter toute douleur, nous utilisons des analgésiques en pre-opératoires et réalisons une anesthésie locale de la peau avant l'incision. Après la chirurgie, un traitement analgésique est administré pendant 48h, nous suivons le poids corporel quotidiennement et nous évaluons les animaux selon les points limites. Pour les tests anxiogènes, nous laisserons un intervalle de 7 jours entre les tests effectués sur les mêmes animaux pour leur permettre de récupérer. Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests chez les mêmes souris. Le test de conditionnement à la peur augmente le niveau de stress chez les souris. Les animaux ayant subi une peur conditionnée ne seront pas réutilisés pour ce même test ou pour un test anxiogène.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront sacrifiées à la fin de l'expérience pour récupérer les tissus et réaliser des études moléculaires. Nous sacrifierons les souris de deux manières différentes : la dislocation cervicale pour le prélèvement de tissus frais et la perfusion intracardiaque sur cœur arrêté afin de fixer le cerveau pour les études histologiques. La persufion intracardiaque se fait après une injection intrapéritonéale de Xylazine à une dose de 20mg/kg pour la sédation. Une injection d’euthanasiant (pentobarbital à une dose de 400mg/kg) sera ensuite réalisée 10 à 20 minutes après. Nous attendrons que la souris ne présente plus de signe de coeur battant avant de procéder à l'ouverture de la cage thoracique pour la perfusion.

Remplacement

Pour évaluer l'implication des neurones à POMC et du système endocannabinoïde dans la régulation de la peur et du comportement alimentaire, il n'existe aucune alternative à l'heure actuelle que l'expérimentation animale. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement ne serait pas approprié. Le niveau de complexité de l'étude que nous proposons de réaliser est tel qu’aucun modèle informatique ne pourrait remplacer l’animal.

Réduction

Nous avons déterminé, en utilisant un calcul de puissance statistique, que nous avons besoin de 12 à 29 animaux par groupe pour obtenir des données exploitables.

Raffinement

De manière générale, les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines, en cages collectives, et seront manipulés de façon bi-hebdomadaire pendant au minimum une semaine avant le début des expériences. Ces manipulations permettront d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. Les animaux auront une période de récupération d’au moins une semaine entre chaque expérience afin de limiter le stress et l’angoisse. Les animaux soumis à un test de peur conditionnée ne seront pas utilisés pour un autre test stressant ou anxiogène, ils seront sacrifiés après le test. L’enrichissement se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnet en bois pour ronger et de tunnel en carton pour se cacher/manipuler les animaux. Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. Les souris seront hébergées en cages collectives, sauf lorsqu'elles auront à subir une chirurgie, et que la consommation de nourriture devra être consignée.

Choix des espèces

La peur et le comportement alimentaire sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente une espèce pertinente pour ce type d’étude. La grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de réponse à la peur, ainsi que l'étude du système endocannabinoïde sont réalisées chez la souris. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, ce qui implique que les résultats obtenus chez le rongeur seront transposable à l'humain, ce qui aura pour conséquence de faire avancer les connaissances dans ce domaine et à plus long terme de trouver de nouvelles voies thérapeutiques. Par ailleurs, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour répondre à nos questions ne sont disponibles que chez la souris. Les expériences ne commenceront que lorsque les souris seront adultes (8 semaines). Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude, car il a été montré que le système endocannabinoïde du cerveau de souris femelles est différent de celui des mâles, à la fois dans les conditions basales et lorsque les souris sont dans une situation de stress.

Injectées deux fois par semaine pendant huit semaines sur animal vigile, saignées quatre fois sur la même période, puis anesthésiées pour un temps de saignement mesuré jusqu'à trente minutes, 448 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles ont été génétiquement modifiées pour développer un lupus et présentent dès huit semaines perte de poids, défaut de toilettage, gonflements articulaires et inflammation des reins. Le traitement testé cible les plaquettes sanguines, dont le nombre chute chez les personnes atteintes de lupus, et l'étude mesure son effet sur l'arrêt du saignement. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur décrivant des procédures invasives et terminales incompatibles avec un réveil, les organes étant ensuite prélevés.

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune (le système de défense de l’organisme s’attaque aux constituants normaux de l’organisme) responsable d’une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des lésions d’organes avec présence d’une inflammation généralisée. L’objectif de notre étude est de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement suite à une lésion et les fonctions des plaquettes sanguines. La thrombopénie (réduction du nombre de plaquettes) et l’activation plaquettaire sont fréquemment observées chez les patients présentant un lupus, contribuant à des complications de type formation d’un caillot sanguin et hémorragie, ainsi qu’à des atteintes de la peau et des reins. Les plaquettes activées favorisent leurs interactions avec les globules blancs ce qui amplifie la pathologie. Il est proposé aujourd’hui d’utiliser un traitement ciblant les plaquettes sanguines afin de diminuer leur capacité à former des agrégats et à interagir avec les globules blancs, prévenant ainsi l’inflammation et la réduction du nombre de plaquettes dans le cadre du lupus. Néanmoins, l’effet de ce traitement sur l’arrêt du saignement, les fonctions plaquettaires ainsi que sur la réduction du compte plaquettaire associés au lupus est à ce jour peu décrit. Comprendre l’impact du lupus sur l’arrêt du saignement et la fonction plaquettaire permettra d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour des traitements dans le cadre du lupus.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait nous permettre de mieux comprendre l’effet du lupus sur l’arrêt du saignement et les fonctions plaquettaires. Cela permettra d’identifier de nouveaux traitements qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de lupus et donc leur qualité de vie.

Procédures

Un lot d’animaux sera soumis à un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 prélèvements sanguins sous anesthésie : l’un d’une durée de 5 minutes, l’autre de 20 minutes. Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile) et un temps de saignement sous anesthésie (30 minutes maximum). Un lot d’animaux subira une injection d’un traitement 2 fois par semaine durant 8 semaines (animal vigile), 4 prélèvements sanguins sur ces 8 semaines (durée de 5 minutes chacun, animal anesthésié) et 1 prélèvement sanguin d’une durée de 20 min sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux atteints de lupus présentent, aux alentours des 8 semaines de vie, une perte de poids, un défaut de toilettage, des gonflements articulaires et ganglionnaire, ainsi qu’une inflammation des reins provoquant une présence de protéines dans les urines, ce qui est caractéristique des maladies auto-immunes. Le traitement testé pourrait réduire les signes de la maladie. Les procédures réalisées peuvent également induire des nuisances : >Anesthésie : impact sur le rythme respiratoire >Prélèvements sanguins : risque de douleur modérée et de saignement au site de prélèvement >Injection : durcissement de la peau et lésion au site d’injection

Devenir

Les procédures expérimentales réalisées sont invasives et terminales, ce qui ne permet pas le réveil des animaux sans induire une forme de souffrance incompatible avec leur bien-être. Par conséquence, à la fin de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort selon les méthodes réglementaires. Après la mise à mort, leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).

Remplacement

Les fonctions plaquettaires ainsi que l’arrêt du saignement sont des processus particulièrement complexes, faisant intervenir plusieurs types de cellules ainsi que des conditions physiques (pression artérielle, flux sanguin). Les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles cellulaires humains permettant d’étudier le lupus et capable de générer assez de plaquettes pour les analyses prévues.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum tout en permettant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, du fait d’une différence de sévérité du lupus en fonction du sexe de l’animal, les données obtenues pour les femelles et les mâles seront analysés séparément. A la fin des procédures, les souris seront mises à mort, puis leurs organes seront récupérés afin d’étudier les mécanismes de formations des plaquettes sanguines dans le cadre du lupus (étude complémentaire qui ne nécessitera donc pas d’animaux supplémentaires).

Raffinement

Une acclimatation de 14 jours ara lieu entre l’arrivée des animaux à l’animalerie et leur utilisation. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : >Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi (tissu, tunnel, …), >Par une anesthésie avant et pendant les procédures expérimentales, >Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures expérimentales > Les souris avec un phénotype impactant la qualité de vie auront accès à de la nourriture sous forme de pâté, ainsi qu’à de l’eau gélifiée. Elles seront suivies 3x par semaine pour détecter tout inconfort. Les souris atteignant un point limite seront soustraite à l’expérimentation. Durant toutes les procédures, les animaux seront suivis par un personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’un mammifère proche de l’Homme pour sa physiologie et ce modèle de souris génétiquement modifié se rapproche fortement de la pathologie humaine. Nous utiliserons dans ce projet des souris mâles et femelles de manière équilibrée, car une différence dans le développement de la pathologie est attendue entre mâle et femelles. A partir d’environ 8 semaines d’âge, les souris présenteront la maladie, associée à une thrombopénie. Le traitement testé dure 8 semaines. De plus, il est nécessaire que les individus aient un poids suffisant. Les animaux utilisés dans ce projet auront donc entre 7 et 16 semaines d’âge, ce qui correspond à un stade adulte, tout en évitant les effets liés au vieillissement.

Chaque macaque subit une trentaine d'anesthésies, autant de prélèvements sanguins et jusqu'à quatre ponctions de moelle osseuse. Ils sont 16 au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et reçoivent jusqu'à cinq injections de vaccins candidats contre l'hépatite C. Le dossier déclare les 16 animaux réutilisés, le porteur indiquant qu'ils pourraient être gardés en vie sur avis vétérinaire et versés à d'autres projets, alors que les anesthésies et prélèvements répétés peuvent entraîner anémie, hématomes, infections cutanées et pertes de poids. Le choix du macaque tient, selon le porteur, à sa proximité avec l'humain, qui permettrait une transposition "rapide et fiable" des résultats au design des essais cliniques.

Objectifs

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est une menace importante pour la santé publique mondiale, avec environ 300 000 décès chaque année. Le VHC entraîne 1,5 million de nouvelles infections par an, et en l’absence de vaccin, ce chiffre continue d’augmenter malgré l’existence de traitements antiviraux très efficaces. C’est pourquoi le développement d’un vaccin est essentiel. Le VHC est très variable. Cela rend difficile la création d’un vaccin capable de protéger contre tous les sous-types du virus. Les anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) ont la capacité de bloquer l’infection par un grand nombre de souches différentes du VHC. Dans le cadre d’un projet international, nous cherchons donc à développer un vaccin contre le VHC capable d’induire de tels anticorps. Pour cela, plusieurs stratégies sont utilisées. Les antigènes vaccinaux sont conçus en combinant une approche basée sur l’analyse de la structure des protéines du virus et une modélisation informatique. Le but du présent projet est d’étudier l’innocuité et l’immunogénicité des meilleurs candidats vaccins, identifiés in-vitro dans un modèle pré-clinique proche de l’humain.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats permettront de justifier la poursuite du développement du ou des meilleurs candidats vaccins en essais cliniques chez l’humain. A long terme, un vaccin contre le VHC permettrait d’épargner de nombreuses vies. Il permettrait aussi de diminuer l’impact économique lié à la prise en charge thérapeutique actuelle de l’infection par le VHC qui est très coûteuse.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet sont : - Administration de vaccins candidats (jusqu’à 5 administrations, tous les animaux, 10 minutes) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les animaux) - Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (30 fois environ, 5 minutes, tous les animaux) - Prélèvements de moelle osseuse sur animaux anesthésiés (4 fois maximum, 10 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Nuisances suite à l’administration des vaccins (peu attendu) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur, légère fièvre transitoire dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse et aux anesthésies répétées : Dysorexies avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement.

Devenir

Dans ce projet, les modèles animaux n’étant pas infectés, ils pourraient être gardés en vie sur avis vétérinaire et être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Remplacement

L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre l’infection par le VHC nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettent pas de construire des modèles pertinents de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire induite par une vaccination.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire avec 4 animaux par groupes. Comme il s’agit d’une étude de preuve de concept, il est prévu de détecter uniquement des différences importantes entre les groupes. L’effectif de 4 animaux permettra 1) de s’assurer qu’un vaccin est immunogène tout en prenant en compte une certaine variabilité interindividuelle et 2) de comparer la réponse immunitaire induite par les différents vaccins candidats au moyen de tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons

Raffinement

Anesthésies: Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. En cas de problème de prises alimentaires suite aux anesthésies répétées, une diversification /complémentation alimentaire sera instaurée (fruits secs, fruits frais additionnels etc.). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation: . Mise en place de point limite pour limiter au maximum la douleur suite aux immunisations.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal retenu car il est le plus efficace pour prédire la sécurité des vaccins et la réponse immunitaire induite par les vaccins chez l’humain. Sa proximité avec l’humain permet en effet une transposition rapide et fiable des résultats au design des études cliniques. La réponse immunitaire induite chez l’humain adulte par la vaccination est un des paramètres majeurs étudié dans ce projet, nous utiliserons donc des animaux disposant d’un système immunitaire mature âgés d’au moins 3 ans.

Tous tués à la fin de la procédure, 8 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux d'entre eux sont infectés par le virus influenza A porcin par voies trachéale et nasale, les six autres étant placés en contact direct ou indirect pour qu'ils s'infectent à leur tour. Chaque animal subit deux prises de sang et treize prélèvements de fluides oraux par lingette mâchée, et l'infection provoque hyperthermie, baisse d'appétit, toux et éternuements pendant la première semaine. Le porteur écarte l'alternative d'un générateur d'aérosols au motif qu'elle ne reproduit pas l'excrétion naturelle, et conclut que la production d'aérosols par les porcs eux-mêmes est "nécessaire".

Objectifs

Le projet vise à produire des connaissances sur la transmission par l’air du virus influenza A porcin provoquant la grippe du porc. L’intérêt porté à ce virus relève de sa forte contagiosité et de sa capacité à se transmettre de l’animal à l’homme. Il induit un impact économique et sanitaire important pour la filière porcine lors d’épidémies. Le protocole expérimental proposé porte sur l’exposition de porcs au virus influenza A. Il s’agit d’évaluer la quantité et la viabilité du virus présent dans l’air ambiant d’une animalerie hébergeant des porcs infectés expérimentalement ou naturellement. Dans la pratique, des collectes d’air seront effectuées quotidiennement sur une période de plusieurs heures à l’échelle de la salle hébergeant trois lots de 8 porcs au total : un lot de deux animaux infectés expérimentalement et deux lots d’animaux en contact direct ou indirect des animaux infectés.

Bénéfices attendus

Les résultats du projet contribueront à évaluer et modéliser les risques d’exposition des animaux, mais également des hommes, en cas de foyer détecté dans un élevage. Ils permettront de proposer des mesures environnementales pour limiter la propagation du virus telles que des stratégies de traitement de l’air, des préconisations organisationnelles, des recommandations quant au port d’équipements de protection individuelle, etc.

Procédures

Deux animaux seront infectés par le virus par voies trachéale et nasale : acte réalisé en moins de 2 min 30. Une prise de sang sera réalisée sur tous les animaux à 2 reprises, acte également rapide (moins de 2 min 30). Tous les animaux seront soumis sur toute la durée de l’essai expérimental à 13 prélèvements de fluides oraux à l’aide d’une lingette mâchée pendant quelques minutes. Ces procédures seront réalisées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

L’infection des porcs par le virus de la grippe provoque une hyperthermie ne persistant pas plus de 4 jours ainsi qu’une baisse de l'appétit et des troubles respiratoires très modérés (toux et éternuements) au cours de la première semaine suivant l'infection. Aucun symptome sévère n'est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Une alternative non animale consisterait à l’aérosolisation du virus influenza avec un générateur d’aérosols. Toutefois, cette technique physique ne reproduit pas totalement le processus naturel d’excrétion et d’aérosolisation qui se produit au niveau de l’animal. Le projet ayant pour objectifs d’étudier l’exposition d’animaux sains au contact d’animaux infectés et de mesurer l’infectiosité des particules virales dans l’air, l’utilisation d’une technique produisant des aérosols de manière artificielle n’est pas envisageable. La génération naturelle d’aérosols par les animaux est nécessaire dans cette expérimentation.

Réduction

Le dispositif expérimental repose sur un minimum d’animaux utilisés. Des études antérieures de transmission du virus Influenza A porcin ont montré qu’un dispositif de 2 porcs inoculés étaient suffisants pour infecter des porcs sentinelles dans une animalerie. Ainsi, 8 porcs élevés dans deux parcs distants seront utilisés : 2 porcs inoculés et 2 autres en contact direct dans un premier parc et 4 porcs dans un second parc distant. Les 2 porcs inoculés et les 2 porcs au contact direct des inoculés devraient produire suffisamment de virus pour infecter les 4 porcs sentinelles à proximité. L'objectif du projet étant de produire des connaissances sur l’exposition de porcs à un air contaminé par un virus Influenza, le dispositif ne comporte pas de lots Témoin et les données ne feront l'objet d'aucune analyse statistique du type Cas/Témoin. Le projet visant à mesurer le niveau d’infectiosité de l’air, la collecte des aérosols sera sans impact sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Le suivi de l’excrétion virale des animaux sera effectué grâce à un prélèvement de salive sans nécessité de contention. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort (cf. grille en annexe).

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus Influenza A porcin. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs Exempt d'organisme pathogène spécifié (EOPS) seront inoculés par un virus Influenza A porcin à 10 semaines d'âge, au même stade physiologique que dans un précédent essai impliquant cette souche virale dans le laboratoire. A cet âge, il est attendu que l’animal génère un volume suffisant de bioaérosols émis dans la salle pour être captés par les différents collecteurs d’air. Par ailleurs, les animaux seront suivis pendant 15 jours post-inoculation, période considérée maximale pour l’excrétion virale des 3 lots (inoculé, contact direct et indirect).

Pour caractériser les effets rénaux d'un morphinique que les protocoles d'expérimentation recommandent comme antidouleur, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des travaux antérieurs de la même équipe avaient relevé une baisse d'environ vingt pour cent de la filtration rénale et une hausse de la mortalité après opération. Toutes reçoivent deux injections sur animal vigile puis deux mesures de fonction rénale sous anesthésie générale, et une partie subit une chirurgie de 90 à 120 minutes pour la pose de deux cathéters, avec risque d'hémorragie et d'arrêt cardiorespiratoire. Douze souris sont tuées pour dosages, les 48 autres réutilisées ailleurs au motif qu'elles n'auront subi que des mesures qualifiées de non invasives.

Objectifs

Des travaux antérieurs ont mis en évidence que l’administration préopératoire d’un morphinique, à des doses usuellement considérées comme faibles et recommandées en expérimentation animale dans les protocoles douloureux, induisait une diminution de la fonction rénale (capacité du rein à filtrer le sang) en conditions physiologiques normales chez le rat et la souris. Plus spécifiquement, la capacité de filtration du rein ou débit de filtration glomérulaire mesurée de manière non invasive était diminué d’environ vingt pour cent par rapport aux valeurs normales habituellement constatées. Ces observations suggèrent que le morphinique pourrait exercer, en conditions physiologiques normales, des effets directs sur le rein, indépendamment de toute pathologie. D’autre part, dans des modèles de maladies rénales, nous avons observé une hausse de la mortalité post opératoire avec les mêmes doses administrées plusieurs fois au cours des premiers jours. Dans le but de mieux appréhender les implications de l’utilisation de morphinique dans nos protocoles expérimentaux futurs, il apparaît essentiel de caractériser plus finement ses effets sur la fonction rénale dans un contexte physiologique sain. Trois axes principaux seront explorés dans cette étude : 1. Effet dose-dépendant du morphinique sur la fonction du rein Évaluer l’impact de doses croissantes sur le débit de filtration glomérulaire, reflet de la capacité de filtration du rein, chez la souris. 2. Cinétique des effets du morphinique sur la fonction du rein Étudier la dynamique temporelle des effets du morphinique sur la fonction rénale, afin de déterminer la durée et l’intensité des effets. 3. Effets du morphinique sur la pression artérielle et le débit sanguin rénal

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces données permettra d’identifier les mécanismes par lesquels le morphinique influence la fonction rénale en l’absence de pathologie. Elles contribueront également à affiner les conditions expérimentales futures, afin de réduire les biais pharmacologiques des projets de recherche dans le domaine des maladies rénales.

Procédures

Tous les animaux recevront deux injections de morphinique, administrées à l’état vigile. Chaque injection dure environ 10 secondes. Une partie des animaux recevra deux injections supplémentaires destinées à induire une anesthésie locale. Tous les animaux seront soumis à deux mesures de la fonction rénale à une semaine d’intervalle, impliquant l’injection du traceur fluorescent sous anesthésie générale, suivie de la pose d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal. Cette première étape dure environ 5 minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie générale sera pratiquée pour retirer le capteur, cette intervention ne durant que 2 minutes. Une partie des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et locale. Cette procédure consiste à poser deux cathéters afin de mesurer la pression artérielle et le débit sanguin rénal. La durée totale de cette intervention est estimée entre 90 et 120 minutes. Une partie des animaux sera euthanasiée à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. L’autre partie sera réutilisée.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : 1.Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Les injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation. 2. La chirurgie pour les mesures de pression artérielle peut provoquer des douleurs et entraîner des saignements / hémorragies. 3. Les complications liées à l'anesthésie générale au moment de la chirurgie vasculaire et de la mesure de la fonction rénale : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Afin d’effectuer des dosages et analyses spécifiques, douze animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les 48 autres seront réutilisées car elles n’auront reçu que deux injections de morphinique et auront eu deux mesures de fonction rénale non invasive.

Remplacement

Le rein est un tissu complexe, qui comporte des dizaines de types cellulaires. Les organoïdes rénaux ne sont pas encore optimaux, notamment car il est encore impossible d'y réaliser une circulation sanguine. Ils ne permettent pas de mesurer la fonction rénale, c'est-à-dire la fonction de filtration du sang par le rein. Or, ce paramètre est le critère majeur de la caractérisation de l'effet du morphinique sur le rein. Les mesures de pression artérielle ne peuvent être envisagées que sur un modèle in vivo.

Réduction

Du fait de la simplicité du modèle et du caractère pilote de l’étude, des lots de 6 animaux sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux. Les expériences seront renouvelées une fois de manière indépendante. Pour les mesures de pression artérielle, deux lots indépendants de 6 souris suffiront à mettre en évidence les effets potentiels du morphinique en aigu. Nous utiliserons des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux est de 60 souris dont 48 qui seront réutilisées.

Raffinement

1. Raffinement de l’hébergement et de la surveillance Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité. Le bien- être des animaux est également assuré par plusieurs types d’enrichissements. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. 2. Raffinement pour les injections Les injections sont réalisées à l’état vigile avec une aiguille très fine qui limite les risques hémorragiques et la douleur. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. 3. Raffinement pour la mesure de la fonction rénale : Après anesthésie générale, les souris sont placées sur un plateau chauffant. Après application d’une goutte d’anesthésique local, les injections du traceur sont réalisées avec une aiguille très fine qui va limiter les risques hémorragiques. Le site d’injection est alterné d’une mesure à l’autre. Un gel ophtalmique est appliqué ensuite pour atténuer la gêne après l’injection. Le produit utilisé comme traceur est parfaitement toléré, il appartient à la famille des sucres. Les souris sont placées dans une couveuse à 28 degrés Celsius , installée dans une pièce d'expérimentation de l'animalerie dans des cages individuelles pour ne pas risquer d'abimer le dispositif de mesure. Les souris ont accès à l'eau et à la nourriture. Les cages individuelles sont toutes placées dans la couveuse. A la fin de la mesure, les animaux sont remis dans leur cage initiale en respectant bien les groupes initiaux avec le même enrichissement. 4. Raffinement pour les mesures de pression artérielle et de débit sanguin rénal L’antalgie pré opératoire est assurée par des injections d’un anesthésique local aux sites d’incisions, dix minutes avant. La préparation chirurgicale pour la pose des cathéters et de la sonde rénale dure environ 30 minutes. Le morphinique injecté en bolus viendra prendre le relais de l’antalgie jusqu’à l’euthanasie finale après une heure d’enregistrement. Les animaux sont placés sur un plateau chauffant pour mieux tolérer l’anesthésie. Une perfusion continue de sérum physiologique permet d’assurer la stabilité pendant toute la durée de l’expérience.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce utilisée dans ce projet. Elle constitue le modèle animal de référence pour la majorité de nos projets. Bien que des résultats similaires aient été observés antérieurement chez le rat et la souris, l’utilisation exclusive de la souris est suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le recours à une seconde espèce n’apporterait pas de bénéfice scientifique supplémentaire. Ce choix permet d’assurer la cohérence et la comparabilité des données avec les projets existants, tout en respectant le principe de Réduction en évitant l’utilisation d’une espèce animale supplémentaire. Pour toutes les procédures, les souris sont âgées entre 9 et 12 semaines car à cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système glomérulaire mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

4 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse unique d'un mélange de vecteurs viraux, puis quatre prélèvements sanguins sur animal vigile, douze pesées et sept prises de température rectale, parfois en chaise de contention. La mise à mort sert à prélever le cœur, le foie, le muscle et le cerveau pour y mesurer la diffusion des vecteurs. Le porteur affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" au développement des thérapies géniques et que seul le primate fournit des données transposables à l'humain.

Objectifs

Les virus adéno-associés recombinants (AAV) sont devenus la référence pour le transfert génique, en raison de leur efficacité, de leur sécurité favorable, de la capacité de production à grande échelle et de leur capacité à assurer une réponse durable. Cependant, certains défis, tels que le coût élevé de fabrication, parfois une faible spécificité pour la cible d’intérêt et les barrières immunitaires, continuent de limiter l’accessibilité, l’efficacité et la sécurité des traitements. De plus, la population est régulièrement exposée aux AAV. Elle peut ainsi développer une immunité dirigée contre ces AAV via la production d’anticorps neutralisants capable de détruire les produits construits avec des AAV, les empêchant d’être efficaces. La présence de ces anticorps excluent une grande partie des patients des thérapies géniques actuellement disponibles. L’objectif de cette étude est d’évaluer la biodistribution de plusieurs vecteurs AAV conçus pour éviter la réponse immunitaire chez des animaux séronégatifs ou faiblement séropositifs pour les AAV ciblés. En évaluant la transduction dans différents organes d’intérêt (muscle, le cœur, le foie, le cerveau, etc.), et en combinant ces données avec celles obtenues précédemment (non publiées) sur les capacités de production, l’efficacité de transduction et l’évitement des anticorps in vitro, le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble de ces propriétés. Si les résultats s’avèrent concluants, ces vecteurs pourraient constituer une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des maladies génétiques notamment les troubles musculosquelettiques, avec des améliorations significatives en termes d’accessibilité, de sécurité, de spécificité et d’efficacité.

Bénéfices attendus

En cas de succès, le vecteur pourra être utilisé comme « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles et ainsi traiter des maladies génétiques et notamment celles liées aux troubles musculosquelettiques. Le projet permettra de selectionner les candidats les plus prometteurs sur la base de l’ensemble des proriétés évaluées (ten particulier la transduction dans les tissus cibles).

Procédures

Tous les animaux du projet auront la même procédure. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant plus d’un mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) d'environ 2 semaines avant le début du projet. Les animaux vigiles recevront une administration unique du pool de vecteurs par voie IV (moins de 1 minutes si bolus ou moins de 30 min si IV lente sur siège). Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de moins de 3 ml, pour un volume total prélevé de 12 ml sur 4 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Le suivi des poids (12 fois) et de la température corporelle (7 fois) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance.

Impact sur les animaux

La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux pourront être placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les pesées (12 fois) ainsi que les mesures de température rectale (7 fois) peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et de mesurer la transduction des transgènes dans différents organes

Remplacement

Les études de biodistribution chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique ainsi que le taux de transduction. Cette étude aura lieu chez le primate car cette espèce apporte les meilleures données transposables à l’homme notamment concernant la transduction avec les vecteurs AAV et l’évitement de la réponse immunitaire. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro et justifie le recours à des animaux.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates répartis en 2 lots (1 lot séronégatif et un lot légèrement séropositif). Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le choix d’inclure deux animaux par groupe nous permettra d’apprécier la variabilité interindividuelle tout en gardant le statut préliminaire de l’étude. L’utilisation de deux animaux par groupe permet également de distinguer un effet lié au traitement d’un événement isolé ou accidentel, limitant ainsi le risque de devoir refaire l’étude et, in fine, à l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation specifique au projet d’environ 40 jours sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, chaise à contention si besoin). Durant les administrations, les animaux pourront être assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

Les singes cynomolgus constituent un modèle animal privilégié pour l'optimisation des protocoles d'administration de gènes par les vecteurs viraux avant les essais cliniques chez l’homme. En effet, la proximité anatomique, physiologique et immunologique des primates avec l’être humain signifie que les profils de biodistribution, de tropisme des tissus, de réponse immunologique aux capsides AAV et d’efficacité de transduction sont plus prédictifs de ce qui pourrait être observé chez l’humain, comparés aux modèles rongeurs. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux. Aussi l’utilisation d’animaux jeunes est justifiée par une probabilité plus élevée de séronégativité ou faible séropositivité vis-à-vis des virus adéno-associés (AAV). En effet, l’exposition naturelle aux AAV et le développement d’anticorps neutralisants augmentent avec l’âge, ce qui rend les animaux plus âgés plus susceptibles d’être séropositifs.

4 800 rongeurs, 4 200 souris et 600 rats, vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut enchaîner jusqu'à cinq tests sur animal vigile, tapis de course, roue, équilibre, agrippement, analyse de la marche et de la respiration, puis jusqu'à deux séries d'électrophysiologie et d'échographie musculaire sous anesthésie. La mesure finale de force musculaire est pratiquée sur la totalité des animaux sous anesthésie sans réveil, avant le prélèvement des muscles pour l'histologie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité physiologique de l'animal vivant, et présente sa combinaison de techniques comme une contribution aux 3R.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est d’améliorer la compréhension fonctionnelle et mécanistique des maladies neuromusculaires en analysant différents paramètres du système neuromusculaire, notamment la coordination motrice, la fonction respiratoire et la fatigue musculaire. Plus spécifiquement, ce projet vise à : – caractériser les altérations neuromusculaires associées à différentes pathologies à l’aide d’approches expérimentales complémentaires ; – explorer le rôle de gènes et de protéines d’intérêt impliqués dans le fonctionnement et la maintenance du muscle et des motoneurones ; – développer et caractériser de nouveaux modèles murins pertinents de maladies neuromusculaires ; – évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de stratégies thérapeutiques expérimentales. Les études s’appuieront sur des approches in vivo et in vitro chez la souris et le rat, permettant une analyse intégrée des propriétés des fibres musculaires, des motoneurones et de leurs interactions avec les autres types cellulaires contribuant à l’homéostasie du système neuromusculaire. À terme, ces travaux ont pour objectif d’identifier des cibles thérapeutiques transposables à l’humain et de contribuer à l’amélioration des stratégies de diagnostic et de prise en charge précoce des maladies neuromusculaires.

Bénéfices attendus

Les maladies neuromusculaires constituent un ensemble d’environ 200 pathologies d’origine génétique ou acquise, touchant les muscles et/ou le système nerveux. En France, elles concernent près de 30 000 à 50 000 personnes, avec une prévalence estimée entre 4 et 7 pour 10 000 habitants. Si certaines peuvent être stabilisées lorsqu’elles sont diagnostiquées précocement, d’autres évoluent vers des formes sévères, neurodégénératives et parfois fatales. Ces affections entraînent fréquemment une perte progressive de l’autonomie (altérations de la marche, de la respiration, de la déglutition, etc.) et nécessitent une prise en charge médicale et médico-sociale lourde et multidisciplinaire. Ce projet vise à générer de nouvelles connaissances sur la fonction neuromusculaire en étudiant de manière approfondie des paramètres tels que la coordination motrice, la fonction respiratoire et la fatigue musculaire. Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des mécanismes biologiques, physiopathologiques et médicaux impliqués dans ces maladies, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques transposables à l’humain et l’amélioration du diagnostic précoce, condition essentielle pour une prise en charge efficace. Les approches expérimentales combinées (in toto, ex vivo et in situ) permettront une évaluation intégrée et fonctionnelle des atteintes neuromusculaires, maximisant la valeur scientifique des données obtenues. Cette stratégie méthodologique contribue également à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire leur impact, conformément aux principes des 3R (remplacement, réduction, raffinement), tout en garantissant des résultats robustes, fiables et reproductibles, au bénéfice de la recherche biomédicale et, à terme, des patients atteints de maladies neuromusculaires.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux pourront pratiquer un ou plusieurs exercices fonctionnels sans anesthésie permettant d'évaluer différents paramètres comme la respiration, la coordination, la marche etc... Ces tests seront faits une fois ou plus (maximum 5) avec un temps de repos imposé entre les tests de 2 jours et peuvent durer de 5 à 25 minutes. Dans un second temps les animaux effectueront des tests sous anesthésie générale et analgésie adéquate permettant l'évaluation de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs, l'enregistrement de l'activité électrique vers le muscle en passant par le système nerveux et une échographie du muscle squelettique. Les animaux subiront ces tests une fois ou deux maximums avec un temps de récupération d'un mois imposé. La durée de ces tests est comprise entre 10 et 20 minutes. Enfin, l'évaluation de la mesure de force musculaire (sans réveil) s'effectuera sur la totalité des animaux une seule fois et se fera sous anesthésie générale et analgésie adéquate. Sa durée est comprise entre 20 à 30 minutes. Ce test pourrait être associé à un prélèvement sanguin (toujours sous anesthésie générale et analgésie) qui est une procédure de courte durée (entre 1 à 2 minutes), réalisée par du personnel formé, permettant l’obtention d’un volume de sang suffisant en une seule manipulation.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles sont le stress lié à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à la mise en place des rongeurs dans les appareillages de mesure. Une fatigue musculaire peut survenir pour le tapis de course. Concernant l’évaluation des paramètres d’évaluation de la marche et de la respiration, seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir. Pour les tests nécessitant une anesthésie, les effets indésirables pouvant survenir sont l’hypothermie, la détresse respiratoire, des douleurs au réveil au site de placement d’aiguilles, et du stress au réveil de l’anesthésie le cas échéant. Les animaux présentant un phénotype dommageable pourraient être atteint musculairement (faiblesse musculaire, dégénérescence neuromusculaire, altérations motrices ou respiratoires selon la lignée).

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés en suivant la réglementation en vigueur. Tous les tissus et échantillons musculaires seront prélevés pour des analyses histologiques et moléculaires réalisées ultérieurement en laboratoire de recherche.

Remplacement

Les techniques utilisées dans le cadre de ce projet visent à évaluer la physiologie fonctionnelle de l’animal. À ce jour, aucune méthode alternative ou approche in vitro ne permet de reproduire avec une précision suffisante la complexité physiologique et les interactions systémiques observées chez l’animal vivant. Ainsi, l’utilisation de modèles murins demeure indispensable et scientifiquement justifiée pour l’évaluation de l’efficacité et des effets fonctionnels ou histologiques induits par les traitements en cours de développement. Les modèles de culture cellulaire ou tissulaire existants, bien qu’utiles pour des approches mécanistiques, ne permettent pas de récapituler l’ensemble des réponses intégrées au niveau musculaire, nerveux et systémique. Ce projet vise donc à combiner, au sein d’un protocole cohérent, un ensemble de techniques complémentaires permettant une évaluation complète, rigoureuse et transposable des effets thérapeutiques, tout en respectant les principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).

Réduction

4800 animaux seront utilisés (4200 souris et 600 rats sur 5 ans). Pour limiter le nombre, les animaux seront analysés avec un maximum 5 tests. Au total 12 actes seront testés dont 7 sont des tests fonctionnels sur animaux vigiles (roue volontaire, tapis de course, test d’équilibre, test d’agrippement, évaluation de la marche et de la coordination, évaluation des paramètres respiratoires), 3 sont des tests sous anesthésie générale pour les analyses électrophysiologiques et l’échographie des muscles squelettiques puis réemployés pour l’étude in situ ou in vitro des muscles après une anesthésie sans réveil. Ce nombre d’animaux a été déterminé grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques permettant la comparaison des groupes expérimentaux deux à deux. Des prélèvements tissulaires seront réalisés pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures

Raffinement

Si les animaux ne proviennent pas de l’établissement utilisateurs, ils pourront subir du stress dû aux mouvements des cages, ou lors du transport entre les deux animaleries, mais aussi lors du transfert dans les nouvelles cages ou encore lors d’un changement d’environnement et d’alimentation. Une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera alors effectuée dans ces cas-là. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes plastiques/cartons ou batônnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés. Un suivi quotidien sera réalisé pour détecter tout signe d'inconfort. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le nombre d’animaux par cage est réduit à 2 minimum et à 5 maximum pour la souris, les rats seront répartis 2 par cage. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettent de suivre le bien-être de l’animal : observation d'apparition de comportement anormal (hypertoilettage, prostration), posture en cas de douleurs, absence d’interactions avec les congénères, consommation d’aliments et d’eau, sommeil. Pour limiter l'expression des phénotypes dommageables, le matériel des cages est irradié, des croquettes sont mis au sol et si nécessaire de la bouillie ou de l'hydrogel seront apportés dans les cages pour faciliter la prise alimentaire et hydrique. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse et une analgésie adaptée pour les actes techniques le nécessitant. En vue de réduire au maximum le stress des animaux, un exercice d’habituation sera réalisé pour les actes ne nécessitant pas d’anesthésie.

Choix des espèces

Les espèces souris Mus musculus et le rat Ratus norvegicus ont été choisies car elles représentent deux excellents modèles pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus le rat et la souris sont des modèles de choix pour l'étude des dysfonctionnements musculaires car de nombreuses voies de régulation dans le système neuro-musculaire sont conservées entre souris, rat et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiologie et la physiopathologie de ces deux rongeurs sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ces modèles animaux. Les expériences seront réalisées sur des rongeurs (souris et rats) adultes âgés de 2 à 24 mois environ chez lesquels le système neuromusculaire est complètement développé. En fonction des phases de l’étude, de la réalisation des actes, les animaux pourraient être âgés de 3 à 24 mois lorsqu’ils seront euthanasiés pour les prélèvements.

Deux macaques à longue queue vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant onze prélèvements sanguins en cinq semaines et des contentions de trois à quinze minutes sur animal vigile. Une perfusion de trente minutes leur administre un candidat anticancéreux à ARNm encapsulé, à une dose dix fois plus faible qu'une étude précédente où les paramètres sanguins avaient signalé une réaction inflammatoire. Quinze jours après l'injection, ils sont tués sous anesthésie pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur explique que deux animaux suffisent parce que l'étude est préliminaire et non réglementaire, donc dispensée de tests statistiques, la comparaison se faisant entre les deux individus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la toxicité et le profil de sécurité d’un candidat thérapeutique oncologique. Après administration, l'élément d'essai entraîne la production de cellule immunitaire dans la circulation générale. Cet élément d'essais a déjà été évalué lors d’une étude préalable, conduite à une dose dix fois supérieure à celle prévue ici. Cette étude avait révélé une augmentation de certains paramètres sanguins, suggérant un événement associé à une réaction inflammatoire augmenté. Dans la présente étude, l'élément d'essai sera administré à une concentration dix fois plus faible. L’objectif est de démontrer que les effets observés précédemment étaient liés à la dose élevée – susceptible d’avoir induit une réaction inflammatoire importante – et non à la composition de l'élément d'essai lui même. Le profil de sécurité de cet élément d'essai sera donc évalué à des doses alignées avec celles envisagées pour le développement clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont à terme la validation et la mise sur le marché du traitement innovant en oncologie. Ce médicament permettrait de cibler un type cellulaire précis et de d’augmenter l’activation immunitaire anticancéreuse proche des tumeurs. Cela permettrait d’améliorer significativement la qualité de vie des patients avec un traitement plus ciblé, qui permettrait d’injecter des doses plus faibles et de ce fait permettrait de réduire les effets secondaires.

Procédures

Après plus de deux semaines d’acclimatation et d’habituation, les 2 animaux inclus dans le projet recevront une injection lente de l’élément d’essais (perfusion durant 30 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile afin d'étudier la concentration de l’élément d’essais dans le sang au cours du temps et de mesurer certains paramètres physiologiques des animaux (11 prélèvements sanguins seront réalisés sur une période de 5 semaines). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée sera réalisée chaque semaine. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x le jour de l’administration, et 1x/jour 3 jours après administration. Le projet prendra fin 15 jours après administration de l’élément d’essais et les 2 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration intra-veineuse par perfusion lente peut provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 2 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la toxicologie éventuelle de l’élément d’essais.

Remplacement

En l’état actuel des connaissances, l’évaluation du profil de sécurité d’un candidat thérapeutique en oncologie nécessite des études in vivo, car seule l’expérimentation animale permet de reproduire la complexité des réponses immunitaires, inflammatoires et systémique attendues, ainsi que de satisfaire les exigences réglementaires nécessaires à un développement clinique. Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, la biodistribution, la pharmacodynamie et la pharmacocinétique dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 animaux seront utilisés. Les deux animaux recevront l’élément d’essais, le nombre de deux permettra une comparaison. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, elle ne nécessite pas d’utiliser de grandes cohortes d’animaux pour réaliser des tests statistiques.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant minimum deux semaines avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’utilisation du primate non humain est nécessaire car il s’agit de la seule espèce capable de reproduire fidèlement les réponses immunitaires, inflammatoires et physiologiques humaines requises pour évaluer la sécurité d’un candidat thérapeutique oncologique. Leur système immunitaire réagit de façon très semblable au nôtre, ce qui permet de prévoir d’éventuelles défenses du corps contre l'élément d'essai. Leur grande proximité génétique et physiologique avec l’Homme les rend aussi très utiles pour étudier comment l'élément d'essai agit et dans quels organes il se diffuse. Ainsi, son emploi est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. À ce stade de développement, les animaux présentent un système immunitaire pleinement fonctionnel, comparable à celui d’un patient adulte, ce qui est indispensable pour évaluer la réponse du corps vis-à-vis de l'élément d'essai testé. Leur organisme a atteint la maturité physiologique et métabolique, mais ne subit pas encore de variations néfastes liées au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes permet de réduire les facteurs associés à des pathologies liées à l’âge qui pourraient interférer dans l’analyse des résultats et la qualité des échantillons prélevés. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Porteuses par construction génétique d'une mucoviscidose, les souris de ce projet développent un amaigrissement, des difficultés respiratoires et une constipation qu'un laxatif administré en continu dans l'eau de boisson doit atténuer. 128 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingts subissent une injection intrapéritonéale par jour pendant six semaines, une mesure de glycémie hebdomadaire par coupe de l'extrémité de la queue, et des tests métaboliques de deux heures comportant cinq prélèvements sanguins. Une perte de poids supérieure à 15 % déclenche la mise à mort, les autres étant tuées en fin de procédure pour le prélèvement du pancréas et des tissus enflammés.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique qui touche environ une naissance sur 3 500 en France. Elle est causée par une anomalie d’un gène qui perturbe le fonctionnement d’une protéine essentielle à la régulation des sécrétions dans l’organisme. Cette anomalie rend le mucus trop épais et collant, ce qui provoque principalement des atteintes respiratoires et digestives chroniques. Grâce aux importants progrès médicaux, l’espérance de vie des personnes atteintes de mucoviscidose a fortement augmenté : elle est passée d’environ 7 ans dans les années 1960 à plus de 50 ans aujourd’hui. Cette avancée permet aux patients de vivre plus longtemps, mais elle s’accompagne aussi de l’apparition de nouvelles complications liées au vieillissement, appelées comorbidités. Parmi elles, le diabète associé à la mucoviscidose est l’une des plus fréquentes. Il concerne près de 50 % des adultes atteints. Ce diabète est dû à un mauvais fonctionnement du pancréas, l’organe qui produit l’insuline et régule le taux de sucre dans le sang. Dans la mucoviscidose, les canaux du pancréas peuvent se boucher, entraînant une inflammation persistante qui abîme progressivement l’organe et favorise l’apparition du diabète. Des travaux réalisés dans notre laboratoire suggèrent que certains mécanismes impliqués dans l’inflammation du pancréas pourraient jouer un rôle important dans l’apparition de ce diabète. Sur la base de ces observations, nous souhaitons mieux comprendre comment ces mécanismes participent à la dégradation progressive du pancréas dans la mucoviscidose. Ce projet de recherche vise donc à étudier l’état inflammatoire du pancréas dans des modèles de la maladie et à évaluer si certaines approches thérapeutiques pourraient permettre de réduire cette inflammation et de préserver le fonctionnement du pancréas. Cette étude contribuera à améliorer les connaissances sur les mécanismes responsables des complications métaboliques associées à la mucoviscidose et pourrait, à terme, aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de construire une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans le diabète associé à la mucoviscidose et d'identifier des cibles potentielles afin de proposer une stratégie thérapeutique plus complète, capable de limiter la progression du diabète chez les patients atteint de mucoviscidose, améliorant, ainsi leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux de la procédure 1 (48 souris) subiront un prélèvement de la durée de quelques secondes d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie et un prélèvement de 70 microlitres de sang à la queue pour le dosage d’insuline plasmatique. Ce prélèvement dure moins d'une minute. Les animaux de la procédure 2 (80 souris) subiront plusieurs prélèvements d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant toute la durée du traitement (6 prélèvements sur 6 semaines). Ce prélèvement dure quelques secondes et engendre une douleur légère. Ils subiront 2 prélèvements de sang pour les dosages d'insuline (70 microlitres) : - un prélèvement avant et un prélèvement à la fin du traitement. Ce prélèvement dure moins d'une minute. Les animaux de la procédure 2 subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (1 injection par jour pendant 6 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, la 80 souris subiront une injection et 5 prélèvements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont principalement dues au phénotype dommageable des souris mutantes. Dans les 2 lignées utilisées, les mutations touchent le gène impliqué dans la mucoviscidose (2 modifications génétiques différentes) induisant des symptômes proches de ceux des patients atteints de la mucoviscidose : amaigrissement, difficultés respiratoires ou constipation. L’utilisation d’un laxatif dans l’eau de boisson en continu permet de réduire les symptômes de constipation et donc d’amaigrissement. La mise à jeun des animaux constitue une nuisance, correspondant à une privation alimentaire temporaire, susceptible d’entraîner un inconfort transitoire. De plus, des légers effets indésirables seront liés à la piqure lors de l'injection répétée intrapéritonéale du traitement (ou de la solution saline), mais également à la piqure lors de l'injection du glucose, de l'insuline et du pyruvate pendant les tests métaboliques in vivo, ainsi qu'à la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans ce projet, puisque l’étude de la mucoviscidose et du DAM ne peut se faire que sur un organisme vivant dans son intégralité afin d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme au traitement. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes qui présentent une inflammation importante (pancréas, poumon, intestin), aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou ex vivo.

Réduction

La stratégie expérimentale visera à étudier les mécanismes impliqués dans l'inflammation du pancréas. Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. Pour les tests in vivo des différences significatives pourront être démontrées à partir de groupes de 8 animaux (en référence à nos études précédentes et en accord avec les résultats de tests statistiques).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilé en groupe pour respecter leur comportement social naturel. Pour les souris mutantes, en raison de leur symptômes digestif, un laxatif doux sera administré en continu dans l'eau de boisson, ce qui permet de réduire l'inconfort digestif. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique (manque de toilettage, poils ébouriffés, dos arrondi), le comportement (modification de la prise alimentaire, prostration) et les modifications de poids. Une grille de scoring et des points limites seront mis en place. L'inconfort généré par la piqure d'aiguille sera limité en alternant le coté d'injection. Le traitement pharmacologique pourrait engendre une perte de poids. Si celle-ci est supérieur à 15% l'animal concerné sera mis à mort. Les tissus seront prélevés après la mise à mort qui sera effectuée selon les procédures recommandées pour assurer leur confort et limiter la souffrance

Choix des espèces

Nous développerons notre projet en utilisant deux lignée de souris transgéniques qui présentent des symptômes similaires à la mucoviscidose humaine avec une maladie intestinale chronique aboutissant à une obstruction intestinale en absence de traitement. Les grandes similitudes que ces modèles présentent dans sa physiopathologie avec la maladie chez l’homme, les rendent un modèle de choix pour étudier la mucoviscidose et les maladies associées, telle que le DAM. L’utilisation conjointe des deux modèles murins se justifie par l’absence de caractérisation pancréatique détaillée de ces deux modèles, en particulier concernant l’inflammation et la fonction endocrine. Leur comparaison est nécessaire pour déterminer si les altérations pancréatiques sont liées à l’absence complète ou à une dysfonction partielle du gène impliqué dans cette maladie. Cette approche comparative permet d’optimiser les informations obtenues tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte et seront âgés de 4 à 6 mois au moment du traitement car nous étudions les effets de l'inhibition à l'âge adulte.