Procédures modérées

Pour étudier comment le cerveau perçoit le temps, 512 souris sont entraînées une à trois semaines dans des enceintes expérimentales, motivées par des récompenses alimentaires obtenues au prix d'une réduction contrôlée de leur ration. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Jusqu'à deux chirurgies de deux heures sous anesthésie générale servent à implanter le système d'imagerie que les animaux portent ensuite pendant les tests, encombrement dont le porteur reconnaît l'inconfort. Les souris qui ne peuvent pas être incluses dans les tests comportementaux seront, écrit le porteur, "valorisées" dans une expérience de mise au point d'outils d'analyse.

Objectifs

Dans notre vie quotidienne, nous évaluons constamment le temps : combien de temps avant que le feu passe au vert ? Quand avons-nous voyagé la dernière fois ? Ces processus sont fondamentaux pour notre mémoire, nos prises de décision et nos capacités d’adaptation. En effet, la perception du temps est une fonction cognitive essentielle permettant aux organismes d’interagir efficacement avec leur environnement. Que ce soit pour anticiper un événement imminent ou pour structurer des actions ou des expériences vécues sur des périodes étendues, la capacité à percevoir et encoder le temps joue un rôle clé dans la survie et l’adaptation. Des perturbations de ces processus peuvent altérer les capacités d’adaptation face au stress et contribuer à des troubles psychiatriques tels que la dépression, les troubles anxieux et de stress post-traumatique. La manière dont le cerveau représente et stocke les informations temporelles reste encore mal comprise. La perception et l’encodage du temps reposeraient sur des réseaux cérébraux complexes impliquant des régions comme l’hippocampe et le striatum. Cependant, ces régions n’encodent pas le temps comme un simple chronomètre : leur activité fluctue, se transforme au fil du temps et s’adapte en fonction de l’expérience, de l’apprentissage et de l’âge. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes associés, ceux permettant notamment d’estimer la durée de stimuli ou l’horodatage et les caractéristiques temporelles des expériences vécues. Ainsi, ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cérébraux impliqués dans la perception du temps, à des échelles courtes (dizaines de secondes) et longues (heures à semaines), à travers l’étude du comportement des animaux dans différentes situations expérimentales . En outre, nous testerons dans une dernière expérience, les effets d’un mélange gazeux d'oxygène et de protoxyde d'azote, utilisé pour ses effets analgésiants, qui est actuellement développé comme alternative thérapeutique à action rapide dans certaines pathologies psychiatriques comme la dépression. Il est établi que le mélange gazeux affecte les états de conscience mais ses effets immédiats et différés sur la perception et l’encodage du temps ne sont pas connus alors qu’ils pourraient avoir un rôle important à jouer dans ses effets bénéfiques comportementaux et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le premier objectif de ce projet est d’apporter des connaissances essentielles sur les mécanismes cérébraux sous-tendant l’encodage du temps à court-terme et dans la mémoire à long terme. Une meilleure compréhension de ces processus fondamentaux est cruciale pour comprendre les bases neuronales de la mémoire et les capacités d’adaptation cognitive. L’approche par imagerie calcique offre une précision inatteignable pour observer en temps réel le fonctionnement des populations neuronales du cerveau lors de la réalisation de tâches liées à la perception du temps et à la mémoire, permettant d’analyser des mécanismes auparavant inaccessibles. Ces découvertes seront d’autant plus précieuses que les zones du cerveau impliquées jouent un rôle central dans de nombreuses autres fonctions cognitives et sont affectés dans troubles comme la dépression, l’anxiété et les troubles de stress post-traumatiques. En outre, ce projet implique également l’évaluation des effets d’un mélange gazeux d’oxygène et protoxyde d’azote actuellement utilisé pour ces propriétés analgésiantes mais en cours de développement et d’évaluation comme alternatives thérapeutiques à action rapide dans la dépression.

Procédures

Les animaux seront soumis à des phases d’entrainement et de tests comportementaux sur des périodes allant de 1 à 3 semaines, selon l’expérience concernée. Ces phases correspondent à des explorations libres ou dirigées quotidiennes, dans différentes enceintes expérimentales (avec des récompenses alimentaires), d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes par session et qui pourront être répétées selon l’expérience. Afin de maintenir la motivation pour la récompense alimentaire, certaines phases expérimentales incluront un contrôle alimentaire léger, consistant en une réduction contrôlée de l’apport alimentaire avant la session expérimentale sur une période de 1 à 3 semaine. La distribution est quotidienne et ajustée individuellement. Dans certaines expériences, les souris seront également soumises au maximum à 2 interventions chirurgicales, chacune d’une durée approximative de deux heures, réalisées sous anesthésie générale. Les animaux pourront être hébergés en cage individuelle de manière ponctuelle, notamment après les interventions chirurgicales (pendant 24 à 72 heures) et lors des périodes nécessitant un contrôle alimentaire individualisé (1 à 3 semaines)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations/contentions ainsi que l’hébergement isolé en cage, l’isolement lors des tests de comportement et la restriction alimentaire peuvent engendrer du stress pour l’animal. L’intervention chirurgicale peuvent induire des douleurs post-opératoires légères avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les souris seront encombrées d’un système d’imagerie lors des tests, ce qui peut engendrer de l’inconfort.

Devenir

La totalité des animaux de l’étude seront mis à mort. Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever le cerveau pour vérification histologique et investigation de l’expression de protéines d’intérêt.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée : l’étude des bases comportementales et neurales de la perception et l’encodage du temps et de leur mémoire à différentes échelles d’analyse. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale de fonction cognitive complexe comme dans notre étude repose sur l’observation directe du comportement de l’animal et de ses performances mnésiques tout en effectuant l’enregistrement de l’activité neuronale lors de la réalisation de ces tâches comportementales et de mémoires.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques.

Raffinement

Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous anesthésie générale afin de garantir l’absence d’inconfort pendant les gestes réalisés. Des constantes physiologiques sont suivies pendant l’intervention et des précautions sont prises pour maintenir l’animal dans les meilleures conditions. Des mesures sont mises en place avant et après les interventions afin d’assurer un confort et une récupération rapide des animaux. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière pendant plusieurs jours afin de vérifier leur bon état général et leur reprise d’activité normale Les expériences comportementales incluent une phase d’habituation progressive à l’expérimentateur, aux dispositifs et conditions de test afin de réduire le stress. Les manipulations ne nécessitent pas de contentions. Lorsqu’un hébergement individuel est requis, il est limité dans le temps. Des enrichissements supplémentaires sont apportés (matériel de nidification, abris, des tubes et objets à mordiller). Les animaux sont regroupés dès que les conditions le permettent. Les animaux ne pouvant pas être inclus dans les expériences comportementales seront valorisés, en intégrant une expérience permettant la création de nouveaux outils d’analyses sans recourir à des animaux supplémentaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologiques de la mémoire, de la formation des souvenirs et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des stades plus spécifiques du développement par rapport à l'objectif scientifique de l'étude.

2 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales ou l'implantation d'un fragment de tumeur, subissent une intervention de vingt minutes pendant laquelle la tumeur est brûlée par radiofréquence, puis quatre injections de médicaments et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit des douleurs modérées, des infections locales, des saignements et des douleurs persistantes après l'opération. L'effectif de 2 744 souris n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant seulement que le nombre réellement utilisé sera probablement inférieur, les conditions jugées non optimales étant abandonnées en cours de route.

Objectifs

Le cancer colorectal est le 3e cancer le plus fréquent dans le monde, les métastases hépatiques qui apparaissent chez 50% des patients, sont responsables de la forte mortalité. Le traitement chirurgical de référence, la chimiothérapie et les biothérapies ciblées, ont une efficacité limitée par leur toxicité et par l’acquisition d’une résistance au traitement. Depuis quelques années, les traitements thermiques comme les radiofréquences sont très utilisés pour traiter métastases hépatiques. Ce traitement a l’avantage d’augmenter également la réponse immunitaire chez des patients mais insuffisamment. Dans ce projet, nous évaluerons, chez la souris, des formulations gélifiantes immunomodulatrices associées aux radiofréquences. Les résultats de ce projet permettront d’optimiser et de choisir la formulation, la plus efficace pour stimuler la réponse immune antitumorale et ainsi réduire le risque de récidive.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus chez la souris seront le socle d’un essai clinique de phase I ; qui a terme pourrait offrir une alternative thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer colorectal métastatique en combinant radiofréquences et immunothérapie.

Procédures

Injection de cellules tumorales ou implantation de fragments tumoraux après analgésie – durée 1min. Intervention chirurgicale sous anesthésie application des radiofréquences et injection des formulations des médicaments -durée 20 min. 4 Injections des médicaments - durée 1 min. Imagerie sous anesthésie – durée 5 min.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales peut induire un léger inconfort ou une irritation locale. Les implantations de fragments entraînent des douleurs modérées. L’intervention chirurgicale peut induire une réaction inflammatoire locale entraînant des douleurs modérées. Il existe un risque de complications post-opératoires telles que des infections locales, des saignements ou des douleurs persistantes. Les radiofréquences peuvent entraîner des douleurs locales et un inconfort au site d’intervention. Les Injections peuvent provoquer une douleur modérée ou de légères irritations, pouvant provoquer une gêne temporaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour étudier l’effet du traitement sur la survie et analyser son impact sur les organes.

Remplacement

L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car elle constitue un organisme modèle fiable pour mimer le cancer colorectal humain. Il n’existe actuellement aucune alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Le recours aux modèles animaux demeure dans notre cas essentiel pour garantir la validité et la transposabilité des résultats avant toute application clinique potentielle.

Réduction

Afin de maximiser la significativité et la robustesse de notre étude, les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les expériences sont conçues de manière à ce chaque étape nous donne des informations permettant de réduire le nombre de souris utilisées dans l’étape qui suit. De plus, il est fort probable que le nombre de souris réellement utilisées soit inférieur à celui initialement prévu, car si certaines conditions ne sont pas optimales, elles ne seront pas retenues, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une grille d'évaluation du bien être des souris spécifiques a été élaborée pour assurer un suivi rigoureux de l’état général des animaux. Une surveillance quotidienne sera réalisée. Cette grille comprend la détermination de points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter le stress et la douleur à son minimum. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise à mort anticipée de l'animal.

Choix des espèces

La souris représente le modèle le plus adapté à l’étude de la réponse immunitaire en raison des nombreuses données disponibles dans la littérature et des travaux antérieurs du laboratoire. Nous utiliserons de souris de 7-8 semaines chez lesquelles le système immunitaire est mature et permet de refléter ce qui se passe chez l’Humain.

400 souris reçoivent une implantation chirurgicale de cellules tumorales dans le pancréas, dix minutes d'opération, puis huit injections dans l'abdomen réparties sur quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour des prélèvements terminaux. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des traitements, la croissance tumorale et la perte de poids figurant en revanche parmi les conséquences annoncées, sans qu'aucun seuil de taille de tumeur ne soit indiqué. Le bénéfice espéré, une inhibition totale de la tumeur grâce à un organisme unicellulaire produisant des molécules d'immunothérapie, reste au conditionnel.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (PDAC) est l'un des cancers les plus agressifs, présentant un très mauvais pronostic et étant prévu pour devenir la deuxième cause principale de décès liés au cancer dans la prochaine décennie. L'échec des traitements standards ou des études cliniques récentes à guérir la majorité́ des patients est dû (i) à un diagnostic tardif, (ii) à l’hétérogénéité de la tumeur et (iii) à la présence d’un micro-environnement riche et dense. Notre équipe cherche de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contourner cette résistance aux traitements notamment en ciblant les cellules du mico-environnement.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une inhibition totale du développement tumoral en associant la chimiothérapie déjà utilisée en clinique avec un organisme unicellulaire qui sécrétera une ou plusieurs molécules immunothérapeutiques d’intérêt contre le carcinome pancréatique. Ceci laisse envisager une nouvelle issue thérapeutique pour les patients.

Procédures

Tous les animaux serons soumis à une procédure chirurgicale, afin d'implanter des cellules tumorales, d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections dans l’abdomen par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux peut générer du stress et de l'inconfort. Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection dans l’abdomen lors des traitements ou associé à la chirurgie lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.

Remplacement

Toutes les alternatives sans recours aux animaux comme les modèles 2D, les modèles 3D ou organoïdes ont été explorés. L’utilisation de ces derniers reste très complexe et limitée en termes de données obtenues (car ne reproduisent pas encore totalement la complexité de la tumeur). La suite du travail nécessite maintenant d’utiliser un modèle vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement (5 souris par cage de 484 cm2, le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque). Les animaux sont hébergées en portoir ventilé et l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. Une grille de scoring ayant été établi, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation/développement de tumeur est déjà établi et maîtrisé chez la souris qui est un modèle adapté à la greffe de cellules tumorales syngéniques. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.

Le rat est retenu parce qu'il consomme spontanément la plupart des drogues d'abus et apprend vite les tâches qui lui en donnent accès. 800 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré: pose d'un cathéter intraveineux sous anesthésie, chirurgie crânienne de deux heures, puis jusqu'à vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration d'héroïne de trois heures ou dix séances de cocaïne de six heures. Ils vivent seuls dès la première opération et jusqu'à la fin, isolement que le porteur présente comme reproduisant les conséquences négatives de la consommation de drogues. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour que deux régions de leur cerveau soient analysées.

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie chronique, marquée par un risque important de rechute, c’est-à-dire la reprise de la consommation après une période d’abstinence. Ces rechutes sont souvent déclenchées par des situations, des lieux ou des contextes associés à la consommation passée. Elles seraient liées à des modifications durables du cerveau provoquées par les drogues. Des études chez l’animal montrent que le métabolisme du cholestérol dans le cerveau joue un rôle important dans les comportements addictifs et que manipuler le métabolisme du cholestérol dans le cerveau permettrait de réduire la recherche de drogue après une période d’abstinence. Cependant, les mécanismes précis à l’origine de cet effet restent mal compris. Une hypothèse est que cette diminution de la recherche de drogue serait liée à une baisse de la sensibilité aux contextes associés à la consommation, qui sont connus pour déclencher l’envie de consommer. Ce projet de recherche a trois objectifs principaux : 1. L’objectif est de déterminer le rôle respectif de deux zones cérébrales dans les effets bénéfiques de la manipulation du cholestérol, afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués. 2. Le projet vise également à déterminer si la modification du métabolisme du cholestérol dans ces régions du cerveau influence la réactivité aux contextes associés à la consommation de drogue. 3. Enfin, l’étude examinera si des effets similaires sont observés avec l’héroïne, une drogue appartenant à une classe différente de la cocaïne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et comportementaux expliqués dans la vulnérabilité à la rechute dans le cadre d’une addiction à la cocaïne ou à l’héroïne. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire les taux de rechutes (nouvelles consommations) de cocaïne ou héroïne, en particulier celles déclenchées par le contexte.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale pour moduler l’expression d’un gène : 1 fois (2 heures par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection d'antalgiques et 1 injection d’analgésique - après la chirurgie, 2 injections d’antalgiques par animaux - 10 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session / jour, 6 heures par session) - 10 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 6 heures par session, contrôle de la cocaïne) - 25 sessions d’auto-administration d’héroïne (1 session / jour, 3 heures par session) - 25 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 3 heures par session, contrôle de l’héroïne)

Impact sur les animaux

Chirurgies : inconfort transitoire au réveil minoré par des antalgiques et une surveillance renforcée Implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons Auto-administration de drogue (cocaïne ou héroïne) et abstinence : induction d’un stress léger à modéré Effets liés à la cocaïne : L’administration contrôlée de cocaïne peut induire des effets secondaires comportementaux (hyperactivité, stéréotypies, anxiété), sans atteinte somatique attendue à court terme. Une surveillance comportementale est prévue pour prévenir toute dérive. Effets liés à l’héroïne : L’administration contrôlée d’héroïne peut induire des effets secondaires comportementaux tels que sédation, hypoactivité locomotrice et modifications transitoires de la vigilance, sans atteinte somatique attendue à court terme dans les conditions expérimentales prévues. Une surveillance comportementale est mise en place pour prévenir toute complication. Isolement : peut induire un stress modéré, qui fait partie intégrante du protocole utilisé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases comportementales, cellulaires et moléculaire du comportement de recherche de drogue et de l’apparition de nouvelles consommations chez les personnes addictes peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Les effectifs sont optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Chaque animal sera valorisé : il participe à des mesures comportementales, et son cerveau sera analysé à l’issue de l’étude, ce qui permet de combiner des données fonctionnelles et biologiques sans duplication des effectifs.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide à surveiller l’atteinte éventuelle des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée journalière pendant 3 jours après les chirurgies, journalière pendant les sessions de consommations et 1 fois par semaine pendant l’abstinence. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Lors de l’entrée en procédure (première chirurgie, les animaux seront séparés pour être exposés à des conditions de vie reflétant les conséquences négatives de la consommation de drogues isolement social et ce pendant toute la durée de la procédure. Un contact visuel sera maintenu. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire pour une couverture totale de 72heures. Les animaux seront manipulés à partir du cinquième jour pour une habituation à l’expérimentateur.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces les plus pertinentes et les plus utilisées pour l’étude des mécanismes d’addiction. Il présente une pharmacosensibilité aux substances addictives proche de celle observée chez l’humain, et consomme spontanément la plupart des drogues d’abus, dont la cocaïne et l’héroïne. Le rat apprend facilement des tâches opérantes complexes et développe des comportements addictifs reproductibles, ce qui n’est pas le cas d'autres espèces. Ceci en fait un modèle de choix pour étudier l’addiction et les rechutes. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Maintenus par contention manuelle, 250 chiens reçoivent des administrations par voie orale ou injectable, puis jusqu'à seize prises de sang en vingt-quatre heures, dans la limite de vingt-deux par semaine. Une semaine de récupération au moins suit chaque série, avant la molécule suivante, sur les cinq ans que le porteur annonce pour le projet. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et la modification déposée y ajoute deux administrations destinées à homogénéiser le pH gastrique des animaux. Aucun chien n'est tué à l'issue: tous restent en vie, disponibles pour les études suivantes.

Objectifs

MODIFICATION: UNE ADMINISTRATION SUPPLEMENTAIRE POURRA ÊTRE REALISEE AVANT ET APRES L'ADMINISTRATION DE L'ELEMENT TEST. CELA EST NECESSAIRE POUR HOMOGENEISER LE PH GASTRIQUE DE TOUS LES ANIMAUX POUR EVITER DES BIAIS DANS LES RESULTATS DE L'ETUDE ET METTRE TOUS LES ANIMAUX DANS LES MÊME CONDITIONS. L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs ainsi que différents excipients chez le chien et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chiens sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce cible) mais aussi dans les domaines de santé humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir identifier de nouveaux principes actifs candidats pour de futurs médicaments, de déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.

Procédures

Les animaux seront soumis a des administrations. Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. LES ANIMAUX POURRONT AVOIR DEUX INJECTIONS SUPPLEMENTAIRES AU MAXIMUM. DUREE DES ADMINISTRATIONS INFERIEURES A LA MINUTE AVEC UNE CONTENTION LEGERE. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 22 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 16 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire. Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ( contention manuelle légère). Durée de l'ordre de la minute. Une seule cathétérisation maximum pour les chiens males sur une semaine. Dans le cadre de recueil d'urine l'animal sera dans des conditions d'hébergement individuel pour une durée maximale de 24h avec de l'enrichissement autant que possible et un contact visuel et auditif entre ses congénères. Les protocoles avec collecte d'urine sont trés peu fréquents. Généralement les animaux sont mis en condition individuelle pour de l'observation, en box avec contact visuel et auditif entre les animaux, avec présence de tablette systématiquement , et jouets autant que possible.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques réalisés dans ce projet seront: - des administrations : cela peut engendrer du stress lié à la contention et peut être une gêne au niveau du site d'injection, OU PETITE DOULEUR juste aprés administration. LES ADMINISTRATIONS SUPPLEMENTAIRES (MAXIMUM 2 ) ENGENDRENT UNE AUGMENTATION DE LA MANIPULATION DES ANIMAUX QUI PEUT ENGENDRER DU STRESS - Des prélèvements sanguins. Cela pourra engendrer du stress à la contention. Il peut y avoir également des douleurs au niveau du site de prélèvement. Le recueil d'urine par miction spontannée doit se faire via l'utilisation de cage à métabolisme, cela peut engendrer un incorfort de l'animal, un stress lié à l'hébergement.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.

Réduction

250 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. cela représente environ 50 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.

Raffinement

Les chiens seront hébergés par groupe entre 2 et 4 animaux par groupe. De l'enrichissement (exemple: tablettes, jouets: balles, cordage) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress. Des points limites sont mis en place, il peut s'agir de : - problème de comportement général. Cela peut être des secousses au niveau de la tête, des temblements, des troubles de la fréquence cardiaque, de la prostration. En fonction de l'intensité et de la fréquence du ou des signes observés l'animal sera exclu du projet et un traitement ( antispasmodique, antiarythmique par exemple) pourra être prescrit par le vétérinaire responsable. - forte fièvre ( à partir de 40 °C) Possibilité d'administrer des antipyrétiques - douleur au niveau des sites de prélèvements. De la glace pourra être appliquée si besoin. La période de repos entre 2 phases pourra être augmentée. - forte diarrhée et vomissement à répétition seront considérés comme points limites. Possibilité d'administrer des antivomitifs ou antidiarrhéiques.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Pour les produits humains, l'utilisation des chiens est bien décrite et caractérisée dans la littérature et leur utilisation est conseillée pour les essais de produits pharmaceutiques. Chiot, jeune adulte ou adulte cela dépendra de la molécule à tester et de la cible thérapeutique.

Les souris dont l'état général se dégrade au-delà de seuils fixés à l'avance sont mises à mort avant la fin du protocole. 173 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Chacune subit jusqu'à deux opérations du cou de quinze minutes sous anesthésie, la seconde retirant la ou les glandes parathyroïdes rendues malades, avec des douleurs cervicales attendues pendant les cinq jours suivants, et une prise de sang à la queue toutes les quatre semaines pendant six mois. Le porteur affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble du retentissement de l'hyperparathyroïdie et qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'animal dans ce domaine.

Objectifs

L’hyperparathyroïdie primaire est la troisième maladie hormonale en termes de fréquence après le diabète et les pathologies thyroïdiennes. Elle est due à un défaut de sécrétion de parathormone (PTH) et se manifeste sur le plan biologique par une augmentation de la concentration en calcium sanguin. Ses conséquences cliniques sont nombreuses : osseuses, rénales, métaboliques, cognitives. L’ablation de la ou des glandes malades est le seul traitement curateur de cette maladie. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle d’hyperparathyroïdie primaire réversible après chirurgie chez la souris (élimination de la/des glandes atteintes), afin d’étudier les conséquences de cette pathologie et de sa guérison.

Bénéfices attendus

Les retombées attendues de notre projet au-delà du modèle murin sont de mieux comprendre les conséquences et mécanismes impliqués : 1) dans le développement de cette maladie et 2) les bénéfices de l’ablation chirurgicale de la glande malade. Ces informations nous permettront de mieux soigner les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis au maximum à deux procédures chirurgicales (Durée : 15 minutes) sous anesthésie générale gazeuse et analgésie. Un prélèvement de sang à l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sera réalisé avant la première chirurgie, une fois toutes les 4 semaines pendant 24 semaines jusqu’à la seconde chirurgie, puis une fois toutes les semaines pendant 4 semaines (durée par prélèvement : 1 min). Enfin, un prélèvement de sang par ponction cardiaque lors de l’euthanasie (animal sous anesthésie générale pendant le prélèvement : durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Il s’agit de procédures modérées, et aucune mortalité n’est attendue après les différentes chirurgies. Les principaux effets indésirables attendus pourraient concerner : une douleur faible au site d’incision réalisé pour les prélèvements sanguins ; des douleurs au niveau du cou pendant les cinq premiers jours après chirurgie.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés sera mis à mort à l’issu des expérimentations pour collecter des échantillons sanguins et tissulaires nécessaire à la mesure de l’efficacité de la transduction et des conséquences de l’hyperparathyroïdie primaire.

Remplacement

L’hyperparathyroïdie induit de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus. Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. ll n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de l’hyperparathyroïdie.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal, une visite quotidienne des animaux par les zootechniciens formés permettra de prévenir les risques de stress et de souffrance. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées, notamment un protocole péri-opératoire afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, basé sur nos précédentes expériences de chirurgie chez la souris. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours une analgésie. Les souris reprendront une alimentation normale dès le jour de la chirurgie. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis et un dôme ou un tube tunnel en polycarbonate rouge. Afin de limiter les souffrances post-expérimentales, une surveillance attentive des animaux sera réalisée par l'expérimentateur (toutes les 2 heures pendant premières heures post-chirurgie, 2 fois par jour pendant les 5 jours, puis une fois par jour jusqu'à la fin de l’étude). Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, ont été fixés.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix, il est utilisé depuis de longue date dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale et les études précliniques en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Les procédures débuteront chez des animaux à 8 semaines de vie, pour travailler sur des adultes jeunes mais matures sexuellement.

Exposés à de la lumière bleue la nuit dès le sevrage, à trois semaines, 558 rongeurs diurnes reçoivent des injections dans l'œil, subissent des électrorétinographies d'une heure et des chirurgies cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun vit seul en cage à partir de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures. Le porteur range cet isolement parmi les nuisances attendues, puis parmi ses mesures de raffinement, en précisant que les animaux se voient et s'entendent d'une cage à l'autre. Six tests comportementaux qu'il dit validés sont annoncés sans être nommés, et l'espèce n'est jamais précisée, désignée seulement comme un rongeur diurne de laboratoire, avant que tous soient tués pour prélever la rétine et le cerveau.

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'humain. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme à travers la rétine et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques et l’humeur. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit de manière chronique, et ce dès l’adolescence, va contribuer au développement de troubles affectifs et visuels sur le long terme. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne la rendant plus pertinente que celles menées habituellement sur les modèles de rongeurs nocturnes utilisés en laboratoire tels que les rats ou les souris. Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur l'humeur à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant l'humeur. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition aberrante à la lumière bleue de manière chronique et sur le long terme, sur le développement direct de troubles affectifs et visuels chez un rongeur diurne. En effet, les études actuelles se concentrent davantage sur l’étude de la lumière bleue en se basant sur des modèles de rongeur type souris ou rat, en débit de leur physiologie nocturne et donc, éloignée de celle de l’humain. Les données obtenues sur le modèle diurne pourront donc permettre une réflexion translationnelle plus pertinente.

Procédures

Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte différents types d'interventions. Dans un cas, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur humeur. La durée d'un test est variable, mais dure environ 10 minutes pour un animal. Afin d'étudier les effets de l’exposition lumineuse sur les cellules à mélanopsine de la rétine, les animaux seront soumis à des injections oculaires, qui se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’exploration de la fonction visuelle se fera par électrorétinographie (ERG), sous anesthésie. Les ERG durent environ 1h et auront lieu à 3 reprises : avant l’exposition, et à 2 âges post-nataux pertinents pour les cinétiques des autres expériences : P50 et P80. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulation de l'humeur, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, La totalité de la procédure dure environ 1h. Une chirurgie terminale sera réalisée sous anesthésie générale afin de prélever les tissus d'intérêts.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien et de l’humeur (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupes. 3) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 4) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière à partir de l’adolescence et sur le long terme chez l’adulte, sur l’humeur et la vision. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base de notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L’effet sur la vision sera évalué par une approche longitudinale à différents stades de l’exposition à la lumière. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification, tunnel et bâton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement, état des yeux) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur un modèle de rongeur diurne de laboratoire. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères à long terme d'une exposition aberrante à la lumière bleue commençant dès l’adolescence, afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'humain. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (dès le sevrage, c'est à dire à 3 semaines) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur l’humeur et la fonction visuelle.