Procédures modérées

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide, elles reçoivent dans la cuisse une injection de Klebsiella pneumoniae multirésistante, puis développent rougeur, gonflement et boiterie, sous une surveillance des signes locaux toutes les six à huit heures. Le muscle infecté est prélevé après la mise à mort pour compter les bactéries. Aucun traitement n'est évalué ici, le porteur mettant au point un modèle d'infection qu'il décrit comme une étape "obligatoire et règlementaire", et affirmant qu'aucune alternative ne reproduit la diffusion des antibiotiques dans les tissus.

Objectifs

La résistance des bactéries aux antimicrobiens (AMR) représente actuellement un problème majeur de santé publique, et menace notre capacité à traiter des infections potentiellement mortelles telles que les infections à Klebsiella pneumoniae, dont le taux de mortalité peut atteindre 50 %. Il s’agit d’une espèce bactérienne fréquemment retrouvée en milieu hospitalier et le traitement de ces infections requiert souvent l’usage d’antibiotiques de dernière ligne. Toutefois, l’activité de ces antibiotiques est largement compromise par le fait que les bactéries produisent des facteurs (appelés MBL pour certains) et capables de détruire ces antibiotiques, les rendant ainsi inefficaces. Dans ce cadre, des stratégies thérapeutiques innovantes sont attendues. Certains laboratoires s’intéressent au développement de médicaments capables de s’attaquer aux mécanismes de résistance des bactéries et ainsi de restaurer l’activité des antibiotiques disponibles. Aussi, de façon à évaluer ultérieurement l’activité in vivo de ces médicaments, il convient, dans un premier temps, de développer le modèle d’infection optimal et surtout requis par les autorités de santé, permettant de répondre à la question. Pour cela, l’objectif de la présente étude consiste à développer un modèle prédictif d’infection musculaire (cuisse) à Klebsiella pneumoniae multi-résistante chez la souris. Ce modèle servira, par la suite, à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux composés anti-infectieux en développement.

Bénéfices attendus

Les infections bactériennes dues à des espèces multi-résistantes comme Klebsiella pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé, en raison de leur capacité à produire des facteurs capables de détruire les antibiotiques. L’étude de ces infections est donc primordiale. Le projet permettra de mettre à disposition un modèle d’infection à K. pneumoniae précieux, utile à l’évaluation de l’efficacité de composés anti-infectieux en développement, particulièrement attendus en thérapeutique.

Procédures

- Deux injections d’immunosuppresseur (5 secondes maxi) - Une instillation intramusculaire sous anesthésie

Impact sur les animaux

Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées selon un protocole bien défini (150 mg/kg de cyclophosphamide à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux (injection de 5 secondes maximum en intrapéritonéal). A J0, l’administration intramusculaire de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté (temps d’infection 15 secondes maximum, sous anesthésie volatile). Suite à l’infection, la principale nuisance sera associée à des signes locaux au niveau du site infectieux et à un tableau inflammatoire local (rougeur, gonflement, boiterie). Des expériences antérieures menées sur un modèle similaire n’ont pas montré de signes d’infection grave à 24h de suivi post-infection.

Devenir

A l’issue de la procédure, le tissu musculaire sera prélevé, de façon à quantifier la charge bactérienne

Remplacement

Actuellement, le recours au modèle murin est justifié par l’absence d’alternatives expérimentales capables de reproduire de manière pertinente la complexité des infections multi-résistantes, intégrant l’infection et la diffusion intratissulaire des antibiotiques. Même si d’autres essais in vitro dynamiques sont en cours, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes, tout en respectant la variabilité biologique inhérente à ce genre d’étude. Aussi, des expériences précédentes sur des modèles similaires nous permettent de dire que 6 animaux par groupe (au lieu de 10) et par temps sont suffisants pour cette phase de mise au point de modèle.

Raffinement

Les injections intramusculaires seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 6 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection localement. Une surveillance accrue des signes locaux (toutes les 6-8h) sera réalisée tout au long des études. En fonction de ce score, l’administration d’un antalgique sera appliquée.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix pour la mise au point de ces modèles d’infection bactérienne (largement décrit dans la littérature) ainsi que pour l’évaluation de thérapies antibiotiques ultérieures. Des souris de 8 semaines seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédents modèles).

84 souris développent chacune une tumeur au flanc après une injection unique de trente secondes de cellules de lymphome, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées ensuite sous anesthésie pour prélever la tumeur et d'autres organes. Les atteintes attendues tiennent en une phrase, la multiplication des cellules cancéreuses au point d'injection, sans que soit décrit ce que la croissance de la tumeur fait subir aux souris ni indiqué de taille limite. Le bénéfice annoncé se réduit à comprendre le rôle d'une enzyme dans le développement du lymphome, le porteur affirmant que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est plus possible à ce stade.

Objectifs

Le lymphome est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules matures cancéreuses. Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de comprendre l’évolution de ce développement tumoral. Nous avons identifié sur plusieurs modèles in vitro (lignées cellulaires humaines) que les cellules lymphomateuses expriment une enzyme, pour laquelle le rôle n’a pas encore été établi. Une lignée cellulaire murine exprime également la Granzyme A et nous souhaitons dans ce projet, à travers l’utilisation d’un modèle murin comprendre son rôle sur la croissance tumorale et les perturbations de l’immunité intratumorale. Pour cela, nous allons utiliser des greffes de différentes cellules cancéreuses murines (lignées cellulaires de Lymphome murins déjà établies) dans des souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal concerne la compréhension du rôle d’une enzyme dans le développement du lymphome et son rôle sur l’immunité intratumorale.

Procédures

Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules de lymphome dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes par injection.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal.

Devenir

Les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences, dans le but de récupérer les tumeurs ainsi que des organes pour des analyses biologiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Nous avons d’ores et déjà testé in vitro par des méthodes alternatives, l’expression du GzmA sur des lignées cellulaires. Il nous faut maintenant valider sur une étude préclinique in vivo le rôle du GzmA sur la croissance tumorale et l’immunité anti-tumorale et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour cette étude, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin de réaliser des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles et nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupes de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Cette étude ne peut se réaliser que sur le modèle murin. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme et c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les lymphomes et l’immunité en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.

696 rats, 678 souris et 120 lapins reçoivent des injections, des perfusions et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine et par animal, gestes exécutés par des personnes en cours d'apprentissage qui ne les maîtrisent pas encore. Ces 1 494 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une session à l'autre pendant douze mois au plus avant d'être tués, parfois pour l'entraînement aux techniques de mise à mort. Le produit administré est une solution saline: rien n'est testé ici, il s'agit d'entretenir le geste technique d'une trentaine de techniciens. Le porteur mentionne des interventions invasives sous sédation ou anesthésie sans dire lesquelles, et prévoit la commande de femelles gestantes pour s'exercer aux mises bas.

Objectifs

Le but de ce projet est de permettre la formation du personnel technique (techniciens et animaliers) d’une ou plusieurs techniques sur le rat, la souris ou le lapin. On estime que l’on réalisera 8 sessions de formation par an, chacune ayant recours à l’utilisation d’un maximum de 15 rats, 15 souris ou 3 lapins, afin de maintenir les compétences techniques d’une trentaine de techniciens. Les animaux utilisés peuvent provenir : - d'animaux réutilisés provenant d’études précliniques (i.e. surnuméraires ou animaux non euthanasiés en fin de projet), ou peuvent être des animaux déjà inclus sur étude si cela n’impacte pas la qualité scientifique de l’étude en question. - dans de rare cas, d’une commande spécifique (ex : formation nécessitant des rongeurs gestants).

Bénéfices attendus

La formation du personnel est nécessaire et requise par la règlementation pour toute personne travaillant avec des animaux de laboratoire afin qu’elles disposent de compétences validées et régulièrement actualisées. En accord avec la Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (STE no. 123), nous mettons en œuvre toutes les mesures nécessaires pour affiner nos pratiques, maintenir les compétences de notre personnel et garantir un niveau élevé de qualité et de bien‑être animal. Toutes ces techniques sont décrites dans des procédures spécifiques internes revues et validées par la Structure pour le Bien-Etre Animal.

Procédures

En fonction des tâches de formation à réaliser, les animaux peuvent être traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, intra-oculaires, etc.) et soumis à des techniques de prélèvement (prélèvement sanguin, prélèvement de larmes, etc..). Le composé administré sera une solution saline. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum chez le rongeur et 30 minutes chez le lapin, dans le cas de formation à la perfusion. Les prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 3 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine en fonction des recommandations éthiques (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et un maximum de 12 prélèvements sanguins dans la semaine chez le lapin, 10 chez le rat et 6 chez la souris). Une mise à jeun pendant une durée maximale de 16h pour recueil d’urine/fécès est également possible (avec accès à l’eau). Le cumul de la douleur relative à la ré-utilisation des animaux sera pris en compte Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (de façon permanente en cas d’agressivité envers ses congénères, ou pendant quelques jours en cas de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus correspondent : - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures : prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (16h maximum), intervention invasive sous sédation/anesthésie. - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés au geste expérimental compte tenu du fait qu’il sera réalisé par des personnes en formation, ne maitrisant pas encore totalement le geste. - à l’hébergement individuel lorsqu’il ne peut pas être évité (ex : souris mâle arrivée ne pouvant pas être remis en hébergement collectif sous peine de causer des agressions et blessures à ses congénères).

Devenir

Chaque fois que cela sera envisageable, les animaux seront réutilisés dans le cadre de ce même projet, avant mise à mort pour entrainement aux techniques d’euthanasie ou réalisation de bibliothèques de tissus dans un maximum de 12 mois après sa première réutilisation.

Remplacement

La formation du personnel à des techniques d’expérimentation animale ne peut pas être remplacé intégralement par des méthodes alternatives dans la mesure où le personnel doit pouvoir s’entrainer en conditions réelles avant de pouvoir intervenir sur étude réglementaire au risque de ne pas maitriser son geste au niveau requis et causer potentiellement douleur/stress une fois au contact de l’animal tout en compromettant la qualité des données d’étude. Afin de remplacer une partie des animaux utilisés pouvant être utilisés à des fins de formations, on pourra avoir recours au visionnage de vidéos, consultation d’articles, échanges avec scientifiques, utilisation de mannequins ou test sur animaux post-mortem.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera le plus petit possible tout en ayant la certitude que le personnel a obtenu un degré d'expertise suffisant (déterminée par le formateur). On aura recours en priorité à la réutilisation d’animaux provenant de surnuméraires de projets annexes. De même, l’utilisation préalable de vidéos, consultation d’articles, échanges avec scientifiques, utilisation de mannequins ou test sur animaux post-mortem pourra permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre le niveau de maitrise attendu. Les vidéos utilisées pourront provenir d’une bibliothèque de vidéos de formation déjà existantes, ou pourront être enregistrées au cours des formations pour utilisation lors de formations ultérieures du personnel.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants sont contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture, température corporelle, signes cliniques (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au vétérinaire. Il lui incombe la décision d'apporter des soins ou d’euthanasier les animaux au vu des signes observés. Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement (3 enrichissements minimum par hébergement). Pour les rats/souris, les enrichissements disponibles comprennent (liste non exhaustive) : tunnels (plastique ou carton), jouets en bois à ronger (buchettes, boules), accessoires de nidification (coton compressé, papier compressé). Pour les lapins, de la musique leur sera diffusée à faible volume pour masquer les bruits de fond de fonctionnement du laboratoire et ainsi réduire le stress lié au bruit. Ils disposent d’une plaque de repos, d’au moins un palet de foin compressé et d’un jouet. Les lapins sont également habitués à la manipulation et au contact humain par le biais de caresses quotidiennes dès leur arrivée au laboratoire. Si l’hébergement individuel est requis; comme par exemple lorsqu'il existe des incompatibilités connues (comme dans le cas des lapins mâles ou des souris mâles entre eux), ou bien pour raison sanitaire, ce choix devra être dûment argumenté et un enrichissement supplémentaire pourra être apporté. Des contacts visuels, auditifs et olfactifs seront maintenus avec les autres animaux.

Choix des espèces

Pour les rongeurs, les animaux peuvent avoir entre 6 semaines et 15 mois. Pour les lapins, les animaux peuvent être entre 3 mois d'âge et 16 mois. Après réception en étude à l’âge de 6-8 semaines (rats/souris) ou 10-14 semaines (lapins), les animaux non utilisés en étude sont réutilisés à des fins de formation pendant une durée maximale de 12 mois avant euthanasie. Dans de rares cas, il est également possible d'avoir recours à des femelles gestantes (rongeurs uniquement, commande spécifique en fonction du besoin), accouplés par l’éleveur et mettant bas au laboratoire afin de réaliser des phases d'entrainement sur les mises bas, la sélection et le traitement des portées, qui nécessitent une technicité différente de celle nécessaire aux expérimentations sur les animaux âgés de 6 semaines ou plus. Après utilisation, les nouveau-nés seront conservés dans la colonie de stock.

Une ligature est posée chaque semaine autour des molaires supérieures de 90 souris, avec deux injections dans la gencive par semaine pendant quatre semaines, pour leur provoquer une parodontite. Elles reçoivent en parallèle, cinq jours par semaine, une injection d'un agent qui épaissit leur peau et peut fibroser leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs organes, l'objet étant de vérifier si une maladie des gencives favorise la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare dont la cause reste inconnue. Le porteur affirme que ces gestes ne sont pas douloureux et ne justifient donc aucun antalgique, et retient la souris parce que les outils d'analyse immunitaire et parodontale y sont, écrit-il, très développés.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10 000 personnes en France, principalement les femmes. La cause n’est pour le moment pas connue. Les patients atteints de sclérodermie systémique présentent fréquemment une parodontite, qui est une pathologie inflammatoire très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle est due à une dysbiose du microbiote parodontal et se caractérise par une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Notre hypothèse est que la parodontite pourrait constituer un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la parodontite dans le développement de la sclérodermie systémique.

Bénéfices attendus

La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment la dysbiose du microbiote, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication de la parodontite dans la physiopathologie de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients

Procédures

Les animaux recevront une injection d’une molécule induisant une fibrose cutanée permettant de reproduire les caractéristiques de la sclérodermie systémique. Les premières injections seront réalisées sur animal anesthésié, puis, après une phase d’habituation et la mise en place d’un système de récompense, elles seront effectuées sur animal vigile. Ces injections, réalisées cinq jours par semaine, nécessitent moins de deux minutes. Les animaux subiront une pose d’une ligature autour des molaires supérieures (une fois par semaine, durée de 10 minutes) et deux injections gingivales (deux fois par semaine, durée de 5 minutes), toutes réalisées sur animal anesthésié, pendant une période de quatre semaines. Les animaux subiront trois prélèvements de sang, réalisés sur animal anesthésié, d'une durée d’environ 5 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables liés à l’anesthésie générale sont le refroidissement corporel et une respiration un peu modifiée. Pour limiter ces effets, les souris seront placées sur une plaque chauffante et surveillées en continu jusqu’à leur réveil complet. L’anesthésie gazeuse peut être légèrement désagréable pour les animaux au moment de l’induction (du fait de l’odeur désagréable), mais elle reste moins stressante que de réaliser les gestes alors qu’ils sont éveillés. L’injection de l’agent fibrosant provoquera une fibrose (épaississement de la peau) au niveau du haut du dos, mais cela n’aura pas d’impact sur la mobilité des souris. Une réaction locale peut apparaître juste après l’injection, mais elle est généralement légère et disparaît rapidement. L’agent fibrosant peut également entraîner une fibrose au niveau des poumons, mais les signes cliniques restent en général très faibles. L’induction de la parodontite par la pose de ligatures et des injections gingivales entraînera une inflammation gingivale locale pouvant provoquer un inconfort transitoire. Toutefois, la durée limitée du protocole n’entraînera pas de mobilité ni de perte dentaire, et n’altèrera pas l’alimentation ou l’hydratation des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la parodontite sur l’évolution de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires, qui mettent en jeu la coopération de nombreuses cellulaires dans les organes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.

Réduction

Afin de respecter pleinement le principe des 3R, une réduction du nombre d’animaux utilisés a été mise en œuvre. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé à partir de protocoles déjà bien établis dans la littérature et sur la base de calculs de puissance statistique. Ce travail a permis de définir, pour chaque question scientifique, le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages expérimentales équipées d’un couvercle filtrant avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. La plupart des gestes sera réalisée sous anesthésie générale. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel ophtalmique sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface des yeux et de prévenir la déshydration. La pose des ligatures au niveau des molaires doit être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d’une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Les gestes réalisés ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique. Les animaux seront pesés et évalués cliniquement à l'aide d'une grille de scores définissant des points limites, afin de les soustraire à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.

Une première chirurgie de 35 minutes injecte dans le cerveau de 598 souris un composé qui déclenche une épilepsie, parfois complétée par la pose d'électrodes crâniennes. Deux semaines avant, cinq jours après ou quatre à six semaines après, une deuxième chirurgie d'une heure délivre les facteurs de reprogrammation, et certaines souris en subissent une troisième de 45 minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles dont les crises sont enregistrées vivent seules en cage pendant trois mois, un isolement que le porteur qualifie de stress modéré. Toutes sont tuées par surdose d'anesthésique, entre deux et soixante jours après la dernière opération, pour prélever leur cerveau.

Objectifs

La reprogrammation cellulaire, qui consiste en la conversion de cellules non-neuronales du cerveau, c-à-d les cellules gliales, en nouveaux neurones dits induits (iNs), a récemment émergé comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin de remplacer les neurones perdus et restaurer les fonctions cognitives. Ainsi, nous avons récemment démontré dans un modèle d’épilepsie chez la souris que les cellules gliales du cerveau pouvaient être reprogrammées en nouveaux neurones inhibiteurs et que les iNs ainsi générés permettaient une réduction de moitié des crises d’épilepsie. Ces résultats démontrent pour la première fois l’intérêt de la reprogrammation cellulaire pour le traitement des épilepsies. La stratégie de reprogrammation utilisée dans cette étude se basait sur l’utilisation de rétrovirus permettant de cibler l’expression des facteurs de reprogrammation spécifiquement aux cellules gliales en division lors des stades précoces du développement de la maladie. Néanmoins, une telle stratégie ne pourrait pas être envisageable pour une application clinique où une stratégie thérapeutique basée sur la régénérescence des neurones perdus devra être mise en place lors de la phase chronique, c-à-d une fois la maladie diagnostiquée. Nos premiers résultats révèlent que les cellules gliales de la phase chronique ont cessé de se diviser. Le présent projet vise donc à étudier la possibilité de reprogrammer les cellules gliales en phase chronique de la maladie à l’aide d’autres outils viraux, les lentivirus, qui ne nécessitent pas une division cellulaire de la cellule d’intérêt pour intégrer leur génome à celui de la cellule gliale. Un autre projet actuellement en cours vise à étudier si la division des glies est nécessaire à leur reprogrammation. Dans le cas où celle-ci s’avérait nécessaire, nous incluons dans ce projet des expériences visant à stimuler la division des glies en phase chronique de la maladie. Le projet s’organise en 4 axes : 1) Validation de la stratégie de reprogrammation à l’aide de lentivirus en étudiant si ces outils permettent de cibler avec efficacité les cellules gliales 2) Comparer l’efficacité de reprogrammation de rétrovirus et lentivirus en phase aigüe et chronique de l’épilepsie 3) Valider une stratégie permettant de stimuler la division des glies en phase chronique 4) Etudier l’impact de la stimulation de la division des glies en phase chronique sur l’efficacité de reprogrammation et l’impact fonctionnel des iNs sur les crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

Le cerveau adulte étant incapable de se régénérer, le développement de stratégies thérapeutiques visant à remplacer les neurones perdus en cas de traumatisme ou de maladie cérébrale pourrait avoir à terme un fort impact dans le domaine de la santé. Nous avons précédemment démontré que la reprogrammation cellulaire permettait de réduire les crises dans un modèle d’épilepsie réfractaire aux médicaments chez la souris. Ces résultats sont très encourageants et représentent une première preuve de concept de l’utilisation de la reprogrammation pour le traitement des épilepsies. Cependant, de nombreuses limites doivent être surmontées avant de pouvoir envisager une thérapie en clinique. Notamment, le présent projet nous permettra de déterminer si la stratégie de reprogrammation des glies en neurones peut aussi être adaptée en phase chronique de l’épilepsie, moment le plus adéquat pour son application chez l’homme. La démonstration que les glies de la phase chronique peuvent être reprogrammées avec efficacité, même en absence de division, permettrait également d’envisager la généralisation de la reprogrammation cellulaire à d’autres pathologies, comme les maladies neurodégénératives, où la mort neuronale n’est pas accompagnée d’une division des glies.

Procédures

Le présent projet implique un modèle d’épilepsie chez la souris générée par injection d’un composé chimique. Ainsi, la totalité des animaux impliqués dans le projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale et anesthésie locale renforcée afin d’injecter le composé (durée : 35 min). Pour certaines souris, nous profiterons de cette injection pour procéder dans le même temps à l’implantation d’électrodes pour enregistrement électroencéphalographique (EEG). Tous les animaux recevront une 2ème chirurgie sous anesthésie générale (durée : 1h) pour délivrer les facteurs de reprogrammation 2 semaines avant, 5 jours après ou 4-6 semaines après l’induction de l’épilepsie. Enfin, certaines souris impliquées dans l’étude recevront une 3ème injection (durée : 45 min), 6-8 semaines après la 2ème. Certains des animaux recevront une molécule par gavage (1X/jour sur une durée de 2-7 jours), 4 à 6 semaines après leur dernière chirurgie, afin d’induire la reprogrammation. Enfin, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique entre 2 et 60 jours après la dernière chirurgie.

Impact sur les animaux

Au sortir de la chirurgie permettant de générer le modèle d’épilepsie, les animaux sont en « état de mal épileptique » non convulsif, c’est-à-dire que des décharges sont enregistrées sur un EEG dans leur cerveau. Cet état n’est pas douloureux mais induit des périodes d’immobilisation spontanée qui peuvent entraîner une perte de poids transitoire (48h), les animaux tendant à moins s’alimenter durant cette période. Par la suite, les animaux épileptiques peuvent présenter quelques légers troubles de mémoire et une faible élévation de l’anxiété. Toutes les procédures impliquent une deuxième chirurgie, une procédure implique quant à elle 3 chirurgies successives. A la suite de chaque chirurgie, malgré les mesures de raffinement, certains animaux peuvent rarement présenter de légères douleurs, une faible perte de poids ou un risque d’infection au site d’incision. L’administration par gavage nécessite d’introduite une canule de gavage dans l’œsophage de l’animal. Le maintien de l’animal et l’introduction de la canule peuvent induire un inconfort et un stress transitoires. Les animaux chez lesquels l’enregistrement EEG des crises est prévus seront hébergés en cages individuelles. L’isolement social (durée : 3 mois) peut induire un stress modéré.

Devenir

Les expériences réalisées dans ce projet nécessitent de prélever le cerveau pour soit (1) isoler les cellules afin d’analyser quels gènes sont exprimés, soit (2) effectuer des analyses histologiques directement sur tranches de cerveau. Ces différentes analyses n’ont pas d’alternative qui éviterait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet vise à démontrer la possibilité de reprogrammer les cellules gliales de la phase chronique de l’épilepsie en neurones induits matures, capables de s’intégrer dans les réseaux neuronaux et de réduire les crises d’épilepsie. L’étude de l’impact fonctionnel des neurones ainsi générés sur les symptômes épileptiques nécessite donc de se placer dans un modèle animal. Ce projet vise aussi à identifier la capacité des glies à être reprogrammées dans un contexte pathologique, celui de l’épilepsie, et ce à différents stades de la maladie. Reproduire complètement in vitro la complexité de la structure cérébrale d’intérêt ainsi que la cinétique des changements s’opérant en conditions pathologiques est pour l’heure impossible. Par ailleurs, cette étude se situe dans la continuité directe d’expériences précédentes et nécessite de pouvoir intégrer les résultats avec ceux déjà obtenus afin de tirer des conclusions robustes. Pour ce faire, celle-ci doit donc être réalisée dans le même modèle murin que précédemment.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec le nombre minimal d’animaux permettant de garantir des résultats robustes, nombre qui a été déterminé préalablement grâce à des calculs statistiques et basé sur les données de la littérature. Ce projet implique par ailleurs des expériences permettant d’analyser les modifications de l’expression des gènes dans les glies en phase chronique selon qu’elles se divisent ou non. Ces expériences vont générer un grand nombre de données dont l’analyse s’étendra au-delà de ce projet. Des analyses comparées de ces données avec d’autres présentes dans la littérature et celles issues d’autres projets devraient permettre d’étudier un certain nombre de questions sans passer par l’utilisation de nouveaux animaux. Enfin, nous avons défini des points d’arrêt à différentes étapes du projet nous permettant d’évaluer si nous devons procéder ou non à la suite des expériences en fonction des résultats déjà obtenus. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant.

Raffinement

Toutes les chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie locale renforcée pour éviter toute douleur ou souffrance durant l’opération. Pour éviter toute douleur après l’opération, les animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’anti-douleurs. Une surveillance sera mise en place avec un suivi renforcé dans les 72h post-chirurgie. Les animaux seront scorés selon une grille d’évaluation des signes clinique adaptée à notre étude afin de mettre en place les traitements adéquats en cas de besoin (anti-douleur, nourriture liquide et enrichie pour pallier à une éventuelle perte de poids, application d’antiseptique, etc..). L’interruption des expériences et l’euthanasie des animaux interviendra pendant la chirurgie ou en postopératoire dans le cas d’apparition de signes indicatifs de gêne/douleur sévères. Conditions d’hébergement : Une fois que les animaux ont récupéré de la chirurgie, ils sont regroupés avec leurs congénères. Les animaux bénéficient d’un milieu d’hébergement enrichi (nid en fibres de coton, tunnels en carton, igloos teintés en polycarbonate). Pour pallier à la légère augmentation de l’anxiété observée chez les souris épileptiques, celles-ci seront toujours manipulées et changées par le même expérimentateur. De même, les animaux seront hébergés au calme et avec une luminosité réduite. Ces mesure de raffinement ont pour but de compenser l’augmentation des comportements de dominance entre animaux observés chez les souris épileptiques et éviter les combats qui nécessiteraient de les isoler.

Choix des espèces

Ce projet fait suite à un projet précédent réalisé dans un modèle d’épilepsie chez la souris et vise à déterminer si les glies de la phase chronique de la maladie peuvent être reprogrammées avec la même efficacité que celles se divisant en phase aigüe. Pour ce faire, et afin que les résultats obtenus soient directement comparables aux données précédemment générées, ce projet doit donc être réalisé dans le même modèle. Ce modèle d’épilepsie généré chez la souris que nous utilisons reproduit la plupart des aspects de la pathologie humaine et a été amplement validé. Les injections seront réalisées chez des souris adultes d’au moins 8 semaines afin de rester dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées dans les études précédentes, pour permettre une comparaison directe entre les résultats obtenus dans nos précédentes études et les résultats générés lors de ce projet.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant treize injections après une opération de dix minutes qui implante des cellules de cancer du pancréas dans son pancréas. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec une masse tumorale intra-abdominale, des risques d'infection et de réouverture de la plaie, et une altération possible de l'état général. Le porteur écrit que l'association chimiothérapie et immunothérapie est "totalement" inefficace contre le cancer du pancréas chez l'être humain, et cherche à comprendre cette résistance en bloquant une molécule inflammatoire, l'IL-1β. Le passage à l'humain est renvoyé au long terme, le gain annoncé à court terme étant de justifier de nouveaux tests de molécules chez la souris.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Une molécule, l'IL-1β, est impliquée dans les réponses inflammatoires et peut influencer la façon dont les traitements contre le cancer fonctionnent. Son rôle dans la réponse aux traitements est complexe et n’est pas totalement compris. Le but du projet est d’évaluer l’impact d’inhibiteurs de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique. Ainsi nous pourrons évaluer l’efficacité des traitements et déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiés en présence ou non d’inhibiteurs de l’IL-1. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas orthotopiques montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats ont été obtenu avec des souris n’exprimant pas l’IL-1β ou son récepteur et doivent être complétés par une évaluation des effets d’inhibiteurs, pour pouvoir être transposés chez l’Homme. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages, comme valider l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (court terme) et d’envisager leur utilisation chez l’Homme (long terme).

Procédures

4 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 10 minutes - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris - Traitements par inhibiteur ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 540 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, déhiscence de la plaie, douleur. -Des effets cumulés liés à la chirurgie, l’implantation des cellules tumorales, le développement des tumeurs et les traitements ne sont pas attendus étant donné la chronologie et le temps écoulé entre chaque événement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

L’adénocarcinome pancréatique est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg-une fois par jour) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, puis elles reçoivent jusqu'à cinq injections d'une combinaison de molécules activant les récepteurs TLR et jusqu'à dix injections d'un agent qui bloque l'arrivée des neutrophiles, avec quatre prises de sang à la mandibule. Les tumeurs peuvent atteindre 1 500 mm³ avant la mise à mort et se nécroser, et les molécules testées peuvent provoquer un épisode de fièvre. Le porteur affirme avoir déjà guéri des souris avec cette combinaison, et conclut que déterminer le rôle des neutrophiles "nous oblige à utiliser l'organisme vivant entier".

Objectifs

Dans une DAP précédente, nous avons pu démontrer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison de molécules activant des récepteurs (TLR) dans un modèle de cancer du côlon. Comme attendu, la réponse anti-tumorale était dépendante de l’activation du système immunitaire et nous avons pu démontrer que très rapidement après le début du traitement, les tumeurs étaient envahies par des cellules de l’immunité, les neutrophiles. Afin de pouvoir valider l’implication des neutrophiles dans l’activité anti-tumorale de cette combinaison de molécules activant les TLRs, nous devons inhiber leur infiltration tumorale et regarder si nous conservons ou non cette activité thérapeutique. Le but de ce projet consiste donc à inhiber l’infiltration tumorale des neutrophiles et d’investiguer l’efficacité thérapeutique de notre combinaison de molécules activant les TLRs.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but de mieux comprendre le mécanisme anti-tumoral de notre combinaison thérapeutique à base de molécules activant les TLRs. Connaitre le rôle des neutrophiles dans l’efficacité thérapeutique de la combinaison est essentielle pour que les oncologues puissent déterminer quels sont les patients pouvant recevoir ce traitement, le but étant de pouvoir rapidement proposer cette thérapie aux patients porteurs de tumeurs du côlon.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (1 minute – 200 µL maximum) de combinaison de molécules activant les TLRs au maximum 2 fois par semaine, 5 injections maximum. - injection pendant 1 minute maximumde 200 µL de l’agent 1 (tous les 2 jours sur 20 jours maximum) ou de l’agent 2 (2X par semaine, maximum 5 injections) inhibant le recrutement des neutrophiles dans les tumeurs. Les prélèvements de sang à la mandibulaire (100 µL maximum pendant une durée maximale de 1 minute) seront réalisés sous anesthésie générale, 4 fois sur 3 semaines et en faisant bien attention à ce qu’il y ait une alternance de côté de prélèvement.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales et lors des prélèvements sanguins , , ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le volume tumoral peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées et les prélèvements sanguins à la mandibule) pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les molécules activant les TLR sont utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. Ces molécules peuvent induire un léger épisode fébrile (

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro avant de tester notre combinaison thérapeutique chez la souris et de constater sa très grande efficacité (souris guéries). La compréhension du mode d’action de cette thérapie et plus particulièrement la détermination du rôle des neutrophiles dans celle-ci nous oblige à utiliser l’organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris. Les souris ayant un système immunitaire déficient (déplétion des neutrophiles), elles sont donc plus sensibles aux infections et seront hébergées sous couvercle filtrant. L’injection des cellules tumorales et les prélèvements de sang à la mandibule seront réalisés sous anesthésie et en tenant compte d’une alternance pour la mandibule prélevée. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids (maximum 15%), des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection des molécules activant les TLRs, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Si la tumeur atteint une taille supérieure à 1500 mm3, en cas de perte de poids supérieure à 15% ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. L’efficacité anti-tumorale de la combinaison de molécules activant les TLRs ayant été démontrée dans la souris, nous utiliserons la même souche de souris. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Une douleur chronique et un état anxio-dépressif sont installés chez 3 100 souris, qui subissent deux chirurgies sous anesthésie générale espacées de deux semaines, un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se terminent par une chirurgie terminale, tous les animaux étant tués. Le porteur écrit que cette douleur et ce phénotype "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", tout en détaillant par ailleurs habituation, enrichissement et points limites. Les cerveaux sont prélevés pour comprendre pourquoi certains patients résistent à une neurostimulation déjà en essai clinique chez l'être humain.

Objectifs

La douleur chronique est étroitement liée aux troubles émotionnels et constitue la première cause d’invalidité dans le monde, impactant fortement la qualité de vie des patients. Elle représente également un enjeu socio-économique majeur, avec des coûts estimés à plus de 800 millions d’euros en Europe. Environ 30 % des personnes souffrant de douleur chronique développent des troubles anxieux ou dépressifs, soulignant la nécessité de stratégies thérapeutiques plus efficaces et adaptées. Cette étude vise à évaluer l’impact de la neuromodulation du cortex moteur et du cortex cingulaire antérieur comme approche thérapeutique sur un modèle murin de douleur associée à un état anxio-dépressif. Le protocole de stimulation utilisé est directement inspiré d’essais cliniques en cours chez l’humain, incluant deux modalités distinctes de neurostimulation, afin de favoriser la transposabilité des résultats. Ce projet financé par l’UE vise à adopter une approche de reverse translationnelle, c’est-à-dire partir des observations cliniques pour orienter les études précliniques. L’objectif est de mieux comprendre les mécanismes d’action impliqués et, à terme, d’améliorer les stratégies thérapeutiques. Les données cliniques préliminaires obtenues par nos collaborateurs indiquent une efficacité potentielle de ces approches, bien que certains patients demeurent résistants au traitement. Le recours à un modèle animal se justifie par la nécessité d’explorer les mécanismes neurobiologiques responsables de cette variabilité de réponse, d’identifier précisément les structures cérébrales et les populations neuronales impliquées et, in fine, d’optimiser les protocoles de neuromodulation pour une application clinique améliorée. Inscrit dans une démarche de recherche translationnelle, ce projet vise à rapprocher les modèles expérimentaux des pratiques cliniques. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action, les voies de signalisation impliquées et d’affiner les paramètres de stimulation. À terme, ces connaissances contribueront à orienter les choix thérapeutiques des cliniciens et à améliorer la prise en charge des patients souffrant de douleur chronique et de troubles émotionnels.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à approfondir la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans deux protocoles de neuromodulation actuellement en phase d’essais cliniques, dans le but d’en optimiser l’efficacité thérapeutique et, in fine, d’améliorer la prise en charge des patients présentant une douleur chronique associée à des troubles émotionnels.

Procédures

- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les niamux subissent deux chirurgies espacées de 2 semaines. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1h. - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 6 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test). - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test avec un délai minimal d’une semaine entre les 2 tests. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort et le tissu cérébral est prélevé pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.

Pêchées à la ligne dans un fleuve côtier méditerranéen juste avant leur reproduction, 50 aloses feintes sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées, elles reçoivent un émetteur acoustique implanté par chirurgie et subissent des prélèvements d'écailles et de nageoire, le tout en moins de trois minutes, avant d'être remises à l'eau vivantes. L'espèce est menacée, et le porteur attend de la télémétrie qu'elle indique si le zonage des aires marines protégées la protège réellement. Il écrit que le remplacement est impossible parce que l'étude porte sur le comportement d'individus vivants dans leur milieu, et table sur une mortalité post-opératoire pouvant atteindre 3 %.

Objectifs

L’étude vise à acquérir des connaissances sur le comportement d’une espèce de poisson migratrice menacée, l’Alose de Méditerranée. Ce poisson vit en mer et remonte se reproduire dans les fleuves. Il s’agira d’évaluer la faisabilité d’un suivi des déplacements des individus entre la mer et un fleuve en utilisant une technologie de suivi à distance (télémétrie acoustique). Des émetteurs seront implantés dans les poissons avant leur reproduction, de manière à les localiser ensuite à l’aide de récepteurs répartis dans l’aire d’étude pour mieux comprendre l’écologie de cette espèce.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le comportement de l’alose de Méditerranée, avant, pendant et après sa reproduction, entre le milieu marin et le milieu continental (fleuve côtier), et d'améliorer ensuite la gestion et la conservation de cette espèce menacée.

Procédures

Les aloses capturées seront anesthésiées puis marquées par implantation chirurgicale d'émetteur acoustique (50 individus), et feront l’objet de prélèvements d’écailles et de nageoire. La manipulation n’excédera pas 3 minutes.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation, le marquage ainsi que les prélèvements d’écailles et de nageoires sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Le marquage chirurgical génère un stress supplémentaire lors de la préhension, l’anesthésie et l’incision, et un risque de douleur post-implantation.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement dans le milieu naturel.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. Nous attendons des données sur la propension des individus à se déplacer, poursuivre leur migration jusqu’aux frayères accessibles, dévaler en mer et se déplacer à proximité de l’embouchure. Il est donc nécessaire d'avoir recours à des animaux sauvages pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Le projet est prévu en principe sur une durée d’une année, mais sera reconductible l’année suivante et jusqu’à 3 ans en cas de difficultés de capture. Il prévoit le marquage de 50 aloses, ce qui est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements. Cet effectif tient compte d’un taux de mortalité post-opératoire assez faible (jusqu’à 3% généralement), de la prédation potentielle, et de la capture par la pêche. Grâce au réseau de récepteurs déployés, les détections des individus marqués seront a priori importantes, d’où une limitation à un maximum de 50 poissons. Cet objectif apparaît comme une cible réaliste au vu des effectifs en migration sur le fleuve étudié. Des analyses descriptives seront réalisées (taux de redétection, distances de déplacement, vitesses de déplacement, …).

Raffinement

Le protocole a été pensé pour tenir compte de la grande sensibilité des aloses, particulièrement aux opérations de capture-biométrie-marquage. La pêche à la ligne a été utilisée dans une autre étude sur l’alose feinte de Méditerranée et s’est révélée adaptée. Le transport des aloses sera limité et réalisé dans des conditions permettant de réduire le stress. Toutes les étapes du protocole, de la capture au réveil, seront réalisées précisément sur le même site, à proximité de la rivière. La manipulation s’effectuera à l’aide d’une épuisette non abrasive. L’utilisation d’un brancard pour l’anesthésie permet de placer le poisson dans l’obscurité, ce qui permet de réduire son stress. Le marquage est réalisé dans un bac spécifique avec recirculation de solution anesthésiante. Les poissons seront régulièrement observés et la qualité de l’eau surveillée. La méthode de marquage tient compte des spécificités et de la sensibilité de l’espèce, afin d’éviter les impacts sur la survie et le comportement de l’animal. Enfin, la phase de réveil se déroule dans des cages flottantes positionnées dans la rivière. Ceci permet de limiter les manipulations des poissons. Dès reprise de la nage, les aloses seront relâchées. Le temps de surveillance est volontairement réduit pour minimiser le stress lié à la stabulation.

Choix des espèces

L’espèce cible est l’alose de Méditerranée. Cette espèce migratrice peut être considérée comme un indicateur de la bonne connectivité des grands cours d’eau. Le projet porte plus spécifiquement sur la phase marine de l’espèce, l’idée étant d’évaluer à terme si la zonation des aires marines protégées permet une bonne protection de cette espèce. Les poissons seront marqués au stade adulte reproducteur, juste avant la reproduction (début mai).