Procédures modérées

Les tests sont interrompus dès qu'une souris cherche à s'échapper. 864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire leur est provoquée chimiquement par instillation d'un conservateur, une à deux fois par jour pendant cinq semaines, avec jusqu'à neuf tests de sensibilité oculaire sous contention et six anesthésies générales par animal. Le porteur présente ce travail comme la preuve de concept qu'exige la phase de prématuration d'une molécule déjà brevetée, conçue pour faire sécréter de l'eau par les glandes lacrymales.

Objectifs

La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’œil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons un modèle pharmacologique de souris validé pour l’étude du DED, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans le modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée le potentiel thérapeutique de notre molécule pour le DED.

Bénéfices attendus

La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique, fréquemment associée à des troubles visuels et à une hypersensibilité à la lumière, et constitue l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. Elle altère significativement la qualité de vie, près de 60 % des patients rapportant une gêne dans leurs activités quotidiennes, et demeure insuffisamment prise en charge, 80 % des patients estimant que leur douleur est sous-évaluée. Malgré une prévalence croissante, liée notamment au vieillissement de la population, à l’usage accru des écrans et à la chirurgie réfractive, les options thérapeutiques actuelles restent limitées, peu efficaces et souvent invasives, faisant de la sécheresse oculaire un véritable désert thérapeutique. Dans ce contexte, nos travaux visent au développement d’une solution thérapeutique originale et plus performante que les traitements actuellement disponibles. Le projet proposé a pour objectif de contribuer à une amélioration significative de la prise en charge de la sécheresse oculaire et d’ouvrir la voie au développement d’un futur médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des applications oculaires de solutions liquides, réalisées sur animaux vigiles sous contention légère, consistant en l’instillation de petites gouttes dans chaque œil. Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales recevront des applications oculaires quotidiennes, une à deux fois par jour selon les groupes et la procédure considérée, pendant une durée maximale de cinq semaines. Chaque application durera environ une minute. Dans la procédure n°1, les mêmes animaux sont suivis tout au long de l’étude. En plus des applications oculaires, ils participeront à des tests fonctionnels oculaires non invasifs réalisés à l’état vigile, sous contention douce, afin d’évaluer la sensibilité oculaire. Ces tests pourront être réalisés jusqu’à neuf fois par animal (habituation comprise) sur une période maximale de six semaines, avec une durée de trois à cinq minutes par session. À chaque temps de mesure, ces mêmes animaux subiront ensuite des examens oculaires non invasifs réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation, sans intervention chirurgicale. Chaque animal pourra être anesthésié jusqu’à six fois au cours de la procédure n°1, avec une induction inférieure à deux minutes et une durée totale n’excédant pas quinze minutes. Les examens dureront environ une à deux minutes par œil. La procédure n°1 ne comporte pas de mise à mort systématique : les animaux sont réveillés après chaque anesthésie et retournent dans leurs cages. En fin de suivi de la procédure n°1 (J42), une partie des animaux sera réutilisée dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux. Ces animaux subiront alors une seule fois une anesthésie générale brève permettant la réalisation de prélèvements biologiques oculaires, immédiatement suivis de la mise à mort. La procédure n°2 est distincte de la procédure n°1 et réalisée sur des animaux dédiés, utilisés une seule fois à un temps expérimental donné (J7, J14, J21, J28 ou J35). Les animaux sont brièvement anesthésiés afin de permettre la collecte d’échantillons biologiques oculaires, puis immédiatement mis à mort. Il n’y a pas de suivi longitudinal des mêmes animaux et les résultats obtenus ne sont pas appariés.

Impact sur les animaux

Inconfort voire douleur d’intensité légère à modérée résultant de la sécheresse oculaire induite chimiquement par l’application d’un conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l’Homme. Très léger inconfort produit par les contentions nécessaires aux gestes expérimentaux, léger inconfort lors du test comportemental de douleur, très léger inconfort résultant d’une anesthésie générale. Ce modèle murin sera donc soumis, de par la génération du syndrome des yeux secs et des procédures appliquées, à des nuisances/effets indésirables d’intensité légère à modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.

Remplacement

De précédents travaux ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.

Réduction

Les effectifs minimaux permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes ont été calculés selon la méthode statistique de référence. Nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8 . Le nombre de prélèvements effectués par animal a été maximisé afin de limiter les effectifs d’individus nécessaire à la collecte des données.

Raffinement

Notre expertise nous permet de mettre en œuvre des mesures de raffinement directement liées aux procédures expérimentales de ce projet, afin de limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux. Des séances d’habituation sont mises en place en amont des tests afin de familiariser les animaux avec l’expérimentateur, la contention manuelle douce et les gestes expérimentaux. Cette habituation progressive permet de réduire les réactions de stress lors des manipulations et d’améliorer la tolérance des procédures répétées. Les évaluations fonctionnelles oculaires réalisées à l’état vigile sont choisies pour leur caractère non invasif et sont systématiquement interrompues dès l’apparition d’un comportement d’échappement, permettant de limiter l’inconfort des animaux. Lorsque cela est nécessaire, les examens oculaires sont réalisés sous anesthésie générale brève par inhalation d’isoflurane, afin d’éviter toute douleur ou stress liés à l’immobilisation. Cette anesthésie est utilisée pour la réalisation des tests de Schirmer, du temps de rupture du film lacrymal (tBUT) et du marquage cornéen à la fluorescéine. L’état des animaux est évalué tout au long de la procédure sur la base de critères cliniques et comportementaux, permettant une adaptation immédiate des manipulations, l’espacement des tests ou la mise en œuvre de points limites précoces lorsque cela est nécessaire.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Le modèle murins reproduisant le syndrome de l’oeil sec (DED, Dry Eye Disease) est un modèle validé et classiquement utilisé dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.

Cinq gavages et cinq injections dans l'abdomen chaque semaine, jusqu'à ce qu'un point limite soit atteint : 5 898 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou, par chirurgie, directement dans le tube digestif, puis des injections hebdomadaires de bactéries dans la veine de la queue ou dans la tumeur, avec des prélèvements de sang à l'œil et au cœur. L'objet est de comparer des souches de bactéries probiotiques modifiées pour libérer des anticancéreux à l'intérieur des tumeurs colorectales. Le porteur décrit ces procédures comme des "expériences pilotes" dont les données "ne seront pas utilisées pour tirer des conclusions définitives", et annonce ensuite d'autres études, avec un effectif statistiquement pertinent.

Objectifs

Notre équipe travaille sur le développement de bactéries probiotiques modifiées afin d’agir comme agents thérapeutiques contre le cancer. Grâce à leur capacité naturelle à cibler spécifiquement les tumeurs et à stimuler la réponse immunitaire, ces bactéries constituent des candidats particulièrement prometteurs pour les thérapies contre le cancer. Notre projet consiste donc à introduire différentes thérapies dans ces bactéries dont la libération peut être contrôlées par l’administration de produits. Sur la base d’études antérieures, nous avons déjà déterminé les doses optimales de bactéries à administrer par différentes voies de manière à assurer une bonne tolérance sans induire de mortalité. Nous poursuivons désormais nos recherches en comparant plusieurs souches, incluant différentes thérapies, sur diverses lignées cellulaires de cancer colorectal. Pour ce faire, les différentes bactéries thérapeutiques seront tout d’abord testées dans des modèles de greffes sous cutanées ce qui permettra d’identifier le candidat le plus performant. Ce dernier sera alors ensuite testé dans un modèle de greffe dans le tube digestif afin d’évaluer leur efficacité et leur potentiel clinique dans un contexte plus proche de la réalité.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif de développer de nouvelles approches de thérapies antitumorales. Plus précisément, nous visons à valider l’efficacité de nos bactéries thérapeutiques sécrétant des anti-cancéreux dans des modèles de cancer colorectal. Un second objectif est d’approfondir la compréhension des mécanismes de colonisation tumorale des bactéries thérapeutiques et de la réponse immunitaire en les testant sur des souris porteuses de greffes tumorales bilatérales. Enfin, l’élargissement du projet à un modèle de tumeur greffé directement dans le tube digestif permettra d‘approfondir nos connaissances des bactéries thérapeutiques dans un contexte clinique plus proche encore de la réalité médicale.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules sous la peau (30 secondes par souris) / Une fois par semaine et jusqu’à l’apparition de point limite, une injection de bactéries par la queue (30 secondes par souris) / une fois par semaine et jusqu’à l’apparition de point limite, une injection de bactérie à l’intérieure de la tumeur (15 secondes par souris) / un prélèvement de sang par l’oeuil (15 secondes par souris) / un prélèvement de sang par le coeur (30 secondes par souris) / 5 gavages par semaines jusqu’à l’apparition d’un point limite (5 secondes par souris) 5 injections par semaine dans l’abdomen par semaine jusqu’à apparition d’un point limite (5 secondes par souris) / une injection de cellules dans le tube digestif par chirurgie (30 minutes par souris)

Impact sur les animaux

Nous avons classé l’ensemble des procédures décrites dans cette DAP en niveau de gravité modéré. Les greffes, le développement tumoral et l’administration des bactéries thérapeutiques peuvent entraîner différents effets indésirables, tels qu’une diminution de l’activité des animaux, une perte de poids, ou encore des troubles du transit (diarrhée, constipation, présence de sang dans les selles, prolapsus, abdomen dur ou distendu, etc.). Les tumeurs sous-cutanées peuvent également présenter des zones d’irritation. Pour la procédure impliquant des chirurgies, des douleurs postopératoires sont possibles, se manifestant notamment par un dos voûté, une pilo-érection ou des signes de déshydratation. Enfin, sur la base d’études antérieures, la dose optimale de bactéries a déjà été déterminée, ce qui permet d’écarter tout risque de septicémie liée à leur administration.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour effectuer des analyses complémentaires sur les prélèvements réalisés.

Remplacement

L’efficacité des bactéries thérapeutiques a déjà été largement démontrée au laboratoire, dans des systèmes cellulaires simplifiés. Cependant, pour valider leur potentiel thérapeutique, il est indispensable de passer à une évaluation sur l'animal afin d’établir une première preuve de concept de l’utilisation de différentes souches bactériennes comme agents thérapeutiques anticancéreux. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique de ces souches nécessite un système biologique complexe, reproduisant les interactions tumorales, immunitaires et microbiennes présentes dans un organisme entier. Cette complexité ne peut être reproduite de manière fiable au laboratoire ou sur modèles alternatifs à ce jour, ce qui justifie le recours à un modèle murin pour cette étape cruciale de validation.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons choisi des modèles murins bien caractérisés, permettant de réduire la variabilité expérimentale. Par ailleurs, des tests préliminaires ont permis de sélectionner les souches bactériennes les plus prometteuses, évitant ainsi l’utilisation d’animaux pour des souches moins efficaces. Enfin, l’ensemble de ces procédures correspond à des expériences pilotes : ces expériences préliminaires permettront d’observer l’existence d’une tendance d’effet en testant plusieurs bactéries dans différentes conditions. Le recours à un effectif réduit permet de limiter le nombre d’animaux utilisés à ce stade exploratoire. Les données obtenues serviront uniquement à estimer la taille d’échantillon nécessaire et à optimiser le design expérimental. Elles ne seront pas utilisées pour tirer des conclusions définitives. En fonction des résultats de ces expériences pilotes, de nouvelles études pourront être mises en place avec un effectif d’animaux statistiquement pertinent.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, un suivi clinique quotidien et minutieux des animaux sera assuré afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Si des signes de mal-être sont observés, alors ils seront reportés dans une fiche de suivi clinique. Les résultats de scoring de la fiche de suivi clinique pourront conduire à la mise en place de soin ou une décision d’euthanasier l’animal. Le suivi tumoral sera réalisé trois fois par semaine. Si le volume tumoral dépasse 1500 mm³, l’animal sera euthanasié immédiatement. Par ailleurs, une grille d’évaluation des nécroses à quatre niveaux sera utilisée : des soins pourront être réalisés et si la nécrose atteint un niveau 3, cela déclenchera également une euthanasie immédiate. En cas de perte de poids ou de signes de déshydratation, une alimentation riche gélifiée ainsi que de l’eau gélifiée seront mises directement à disposition dans la cage pour faciliter l’accès. Si nécessaire, des injections sous-cutanées de sérum physiologique seront administrées pour prévenir la déshydratation. Enfin, pour limiter la douleur, notamment après chirurgie, une analgésie sera assurée 2 fois par jour, pendant une durée maximale de 5 jours. Si au bout de 5 jours, aucun signe d’amélioration n’est visible, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris comme modèle expérimental se justifie par sa proximité biologique et génétique avec l’homme, ce qui en fait un organisme de choix pour l’étude des mécanismes du cancer. Cela va nous permettre d’évaluer la complexité des interactions cellulaires, immunitaires et tissulaires dans un contexte physiologique complet qui ne peut pas être reproduit par des modèles in vitro. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines. Elles seront receptionnées à l’âge de 6 semaines puis greffées une semaine plus tard (temps d’acclimation). Nous utilisons des souris jeunes adultes car leur croissance est stabilisée et leur système immunitaire est pleinement développé et fonctionnel ce qui nous permettra d’obtenir des résultats fiables.

Toutes tuées pour prélever leur foie et d'autres organes, 1 749 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une opération au cours de laquelle des cellules tumorales lui sont injectées dans la rate, dont la moitié est parfois retirée, la peau du flanc étant refermée par des agrafes gardées sept à dix jours. Suivent jusqu'à vingt et un traitements intraveineux, quinze séances d'imagerie sous anesthésie précédées chacune d'une injection de luciférine, et neuf prises de sang à la queue sur animal maintenu éveillé. Le porteur renvoie l'amélioration de la prise en charge des malades du cancer colorectal au long terme, et annonce comme retombée immédiate des "données de haute qualité" sur l'ingénierie cellulaire in vivo.

Objectifs

Lorsque les cancers métastasent, ils deviennent beaucoup plus difficiles à traiter et la mortalité augmente. Le foie est un site fréquent de métastases et 30 à 50 % des patients atteints d'un carcinome colorectal présenteront des métastases hépatiques. Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde, et son incidence est en augmentation. Lorsque le cancer colorectal se propage au foie, la résection des lésions est une bonne option thérapeutique, mais seuls 10 à 20 % des patients sont éligibles. Pour ceux qui ne sont pas éligibles à la chirurgie, le taux de survie à 5 ans est inférieur à 10 %, ce qui indique que les options thérapeutiques actuelles ne sont pas suffisamment efficaces. Par conséquent, les métastases hépatiques du cancer du côlon restent un enjeu médical majeur non satisfait qui nécessite des recherches supplémentaires. Grâce aux récentes avancées dans le domaine de la technologie de l'ARN messager (ARNm), de nouvelles options thérapeutiques voient le jour. L'administration d'ARNm à des cellules spécifiques permet de modifier les cellules immunitaires ou même les cellules tumorales à l'intérieur de l'organisme, ce que l'on appelle également l'ingénierie cellulaire in vivo. Nous souhaitons ici explorer différentes possibilités d'ingénierie cellulaire in vivo afin d'améliorer l'activité antitumorale des cellules effectrices immunitaires, telles que les cellules NK et les cellules T. À des fins d'ingénierie in vivo, nous utiliserons des nanoparticules lipidiques (LNP), dans lesquelles l'ARNm peut être encapsulé et délivré spécifiquement aux cellules tumorales ou immunitaires, respectivement. En résumé, notre objectif est de développer des approches pour traiter le cancer du côlon métastatique, une maladie difficile à traiter et dont le pronostic est mauvais, en utilisant l'ingénierie cellulaire in vivo avec des LNP ciblées à ARNm.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles perspectives dans le domaine des traitements innovants contre les métastases hépatiques du cancer du côlon, qui font cruellement défaut. L'ingénierie cellulaire in vivo offre des possibilités que les traitements conventionnels ne permettent pas, comme la modification spécifique des cellules tumorales afin d'altérer leur immunogénicité. Nos recherches pourraient donc améliorer à long terme la prise en charge des patients atteints de cancer, mais elles aideront également la communauté scientifique en fournissant des données de haute qualité sur l'ingénierie cellulaire in vivo à court terme.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules tumorales seront injectées dans la demi-rate (cellules tumorales MC38) ou dans la rate (cellules tumorales AKTPF). Dans le cas de la procédure sur la demi-rate, la moitié de la rate sera retirée, tandis que l'autre moitié restera en place pour continuer à remplir sa fonction. Afin de mesurer la charge tumorale, les souris seront imagées par bioluminescence, ce qui comprend une injection péritonéale de luciférine sur animaux vigiles et une anesthésie gazeuse pour immobiliser les souris pendant l'imagerie (2x/ semaine). Pour les groupes témoins, le jour prévu pour l'euthanasie est le jour 28, ce qui correspond à 7 imageries. Pour les souris ayant reçu une injection de ARNm-LNP, le jour maximum pour l'euthanasie est le jour 56, ce qui correspond à un nombre maximum de 15 imageries. Le traitement par ARNm-LNP ou les traitements témoins seront administrés par injection intraveineuse (3x/ semaine). Le nombre prévu est 10 injections intraveineuses pour les groupes témoins (PBS, ARNm-LNP constructions contrôles) et un nombre maximal de 21 traitements ARNm-LNP pour les groupes traités par ARNm-LNP. Les animaux vigiles subiront un prélèvement sanguin dans la veine caudale (100 µl 1 fois par semaine) en contention. 5 prélèvements sanguins pour les groupes témoins et un nombre maximum de 9 pour les groupes traités ARNm-LNP seront ainsi réalisés.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales sera effectuée dans l'hémi-rate (MC38) ou la rate (AKTPF). Cette injection est réalisée au cours d'une intervention chirurgicale, ce qui constitue une contrainte importante, mais de courte durée. L'intervention chirurgicale peut être douloureuse pour les animaux ; elle est donc réalisée sous anesthésie gazeuse et les souris recevront des analgésiques avant, pendant et après l'intervention. Le développement de métastases hépatiques est une contrainte qui peut entraîner des douleurs ou une perte de poids. Après l'intervention chirurgicale, la peau du flanc droit est refermée à l'aide d'agrafes, ce qui peut causer une gêne aux animaux. Les agrafes seront retirées une fois l'incision cicatrisée (entre le 7e et le 10e jour après l'intervention). Les ARNm-LNP ou les traitements témoins seront injectés par voie intraveineuse (3 fois par semaine) sur animaux vigiles en contention, ce qui peut engendrer un stress et une douleur modérée de courte durée. Afin de mesurer la charge tumorale des cellules tumorales exprimant la luciférase (2 fois par semaine), les souris recevront une injection intrapéritonéale de luciférine. Ensuite, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane et imagées par bioluminescence. Cette procédure peut entraîner une douleur et un stress modérés de courte durée. Pour le prélèvement sanguin dans la veine caudale (1 fois par semaine) réalisé sur animaux vigiles en contention, les animaux pourront ressentir un stress et une douleur modérée de courte durée. Pour induire l'expression transgénique de lignées cellulaires tumorales transduites in vitro (système d’expression inductible activable par ajout d’un antibiotique), les souris recevront l’antibiotique dans leur eau de boisson, ce qui peut générer un goût amer.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou lorsque les critères terminaux seront atteints. L'euthanasie est nécessaire pour prélever le foie et autres organes des animaux.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons modéliser les métastases hépatiques, mais également le ciblage de cellules spécifiques par les LNP. Le microenvironnement tumoral des métastases hépatiques est complexe et se compose d'une variété de cellules parenchymateuses ainsi que de cellules immunitaires résidentes et infiltrantes. Bien que des modèles in vitro avancés tels que les organoïdes puissent modéliser certains aspects des métastases hépatiques, la complexité des cellules impliquées et d'autres facteurs nécessite un modèle animal. En ce qui concerne le ciblage des LNP sur des types de cellules spécifiques, nous réaliserons des expériences in vitro initiales afin d'optimiser autant de facteurs que possible avant de passer aux expériences in vivo, afin d'éviter des expériences in vivo inutiles. Cependant, des expériences in vivo sont nécessaires pour évaluer la toxicité, la biodistribution et la spécificité des types de tissus et de cellules.

Réduction

Nous réalisons des expériences d'optimisation in vitro initiales afin d'identifier les constructions de protéines thérapeutiques et les formulations LNP les plus prometteuses avant de passer aux expériences in vivo. Avant l'évaluation expérimentale des traitements avec les candidats ARNm-LNP, nous réalisons des expériences de recherche de dose. Grâce à cette approche, nous pouvons éviter d'appliquer plusieurs doses dans les expériences d'évaluation expérimentale, ce qui participe à la réduction du nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris bénéficient d'une période d'adaptation au minimum de 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie avant le début des expériences. Les animaux sont hébergés conformément aux normes requises par la réglementation, en groupes sociaux, dans un environnement approprié et enrichi. Les souris seront manipulées à l'aide de la méthode « cup handling » dans la mesure du possible. Les souris sont surveillées régulièrement par le personnel selon la fiche de score. Cela permet de détecter rapidement les signes de douleur ou de souffrance et de mettre en place les traitements appropriés (analgésique pré et post opératoire, traitement analgésique si signe de douleur, nourriture humide si perte de poids importante, administration de sérum physiologique si déshydratation, ponction de l’ascite si trop important). L’antibiotique est administré dans l'eau de boisson plutôt que par injection afin de réduire le stress et la douleur et pour atténuer générant son goût amer, du saccharose sera ajouté à l'eau. Dans les procédures impliquant des tumeurs, les cellules tumorales sont porteuses de luciférase afin de permettre le suivi in vivo de la charge métastatique hépatique par bioluminescence, ce qui permet d'acquérir des points de données sans avoir à euthanasier les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle très couramment utilisé pour étudier l'immunologie en raison de la grande similitude entre les systèmes immunitaires murin et humain. Malgré les différences entre les systèmes immunitaires des deux espèces, les souris ont été d'une aide précieuse pour de nombreuses découvertes qui ont pu être transposées à l'être humain. Les outils que nous utilisons, tels que les cellules murines MC38 et la génération de métastases hépatiques, sont très bien établis et caractérisés. Les souris seront utilisées dans les expériences entre 7 et 16 semaines. À cet âge, leur système immunitaire est pleinement développé.

1 400 poissons sauvages de treize espèces vont être capturés, anesthésiés trois à cinq minutes, incisés sur trois à cinq millimètres et maintenus hors de l'eau jusqu'à une minute, le temps qu'une puce leur soit implantée dans l'abdomen. Tous sont ensuite relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de vérifier qu'une passe à poissons construite sur un grand fleuve fonctionne, donc de contrôler sur ces animaux un aménagement humain qui les a d'abord empêchés de circuler. Sept individus sur dix seront pêchés en amont puis transportés en aval avant d'être relâchés, pour ne retenir que des poissons enclins à migrer, et le porteur prévient que certains perdront leur puce dans les semaines qui suivent, sans qu'aucun calcul ne vienne étayer le chiffre de 1 400.

Objectifs

Suite à différents aménagements au niveau des fleuves et des cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 1400 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (70%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Les analyses porteront sur le nombre et le pourcentage de franchissement de la passe à poissons par espèce marquée.

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. L’eau des bacs dans lesquels seront conservés les poissons le temps des différentes opérations fera l’objet d’attention pour le suivi de sa température et de son niveau d’oxygénation. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac d’eau de rivière oxygénée et refroidie. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 20 minutes, pour éviter que la température du bain augmente et permettre qu’elle soit toujours suffisamment fraiche pour ne pas stresser les poissons. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures (taille, poids) et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé sur la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus (couche protectrice recouvrant les écailles des poissons). Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application des mesures prises (retrait du poisson de l’expérimentation, mise en surveillance, mise à mort) en cas d’apparition de points-limites rigoureusement définis à l’avance (exemples : changement de position de l’animal dans l’eau, respiration irrégulière,…) limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

13 espèces de poissons sont ciblées car elles sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine - Poissons d’eau calme : brème, gardon, spirlin, ablette - Carnassiers : Brochet, silure, perche - Migrateurs : alose, mulet porc, anguille 1 stade de développement est retenu pour la plupart des espèces (subadultes-adultes), excepté pour l’anguille dont la migration vers l’amont des cours d’eau s’effectue au stade juvénile. Les subadultes-adultes seront prioritairement marqués, la configuration de la passe étant inadaptée à la franchissabilité par les juvéniles (vitesse de courant d’attrait trop élevée). Les adultes migrent généralement avant ou après leur reproduction. Seules les anguilles juvéniles seront marquées du fait de leur écologie (montaison au stade juvénile).

Les souris utilisées portent une mutation déclenchée par gavage, sur une lignée déjà détenue par l'établissement. 2 496 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un perturbateur endocrinien par voie orale, puis deux injections sous anesthésie leur déclenchent une thyroïdite ou une myasthénie auto-immune, avant cinq prises de sang sur animal éveillé, cinq tests cliniques et une évaluation de la fonction musculaire. Le porteur indique que le gavage répété peut blesser l'œsophage et faire perdre du poids, et que ces modèles entraînent une perte de mobilité, les tissus étant prélevés après la mise à mort pour des analyses biochimiques et histologiques.

Objectifs

Dans les pays développés, les maladies auto-immunes touchent 5 à 10 pour cent de la population et représentent la troisième cause de morbidité. Elles sont dues à une déregulation du système immunitaire, qui ne discrimine plus le soi du non soi. L'exposition (via alimentation, air, eau) à des perturbateurs endocriniens s'accroit. Ce projet a pour but de comprendre le rôle joué par ces molécules dans le développement de pathologies auto-immunes. Ce projet va décrypter, au sein du thymus, les modulations cellulaires et moléculaires induites par ces molécules qui participeraient à altérer la tolérance immunitaire au soi et au développement de pathologies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Les maladies auto immunes telle que la myasthénie sont des maladies chroniques invalidantes. Les causes de développement de ces pathologies demeurent inconnues. Dans ce projet, nous souhaitons démontrer qu’un facteur de l’environnement peut induire des perturbations au niveau de la mise en place de la tolérance immunitaire et par conséquence serait à l’origine de dysfonctionnement thymique conduisant au développement d'une pathologie auto-immune. Aussi, la compréhension des mécanismes étiologiques est donc importante pour proposer des mesures de prévention et adapter les traitements des personnes affectées par une pathologie auto-immune.

Procédures

Des animaux seront soumis à une induction de la mutation génique par voie orale (3 fois, 1 minute sur 5 jours). Des animaux seront exposés à l’état vigile au perturbateur endocrinien ou une solution contrôle par voie orale (1 fois, 1 minute). Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections sur animal anesthésié (2 fois par animal sur 21 à 30 jours, 10-15 minutes pour les injections). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile (5 fois pendant le projet, moins d’une minute). Les tests cliniques de suivi des pathologies seront réalisés sur animal vigile (5 fois -15 minutes). L’évaluation de la fonction musculaire se fera sur animal anesthésié (1 fois-15 minutes)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : Premièrement, pour le gavage, a- une possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. b- Une perte de poids pour les animaux recevant le perturbateur endocrinien. Deuxièmement : Les animaux incluent dans le modèle de pathologie auto-immune pourraient subir a-Un risque d’hypothermie ou de détresse respiratoire suite à l’anesthésie générale pour l’immunisation. b-sensation d’irritation ou la gêne induite par le produit immunisant. c-un risque de douleur et un inconfort post-immunisation. d-Un stress lié à l’analyse comportementale et une perte de mobilité inhérente aux modèles. Troisièmement : une légère et brève douleur lors du prélèvement sanguin et une perte de sang ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention des animaux.

Devenir

A l’issue de l’expérience, les animaux sont euthanasiés par une euthanasie réglementaire et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

Des etudes, au préalable, sur des modèles cellulaires ont été ménées. Nous souhaitons valider nos observations avec des modèles in vivo, afin de démontrer l’impact d’une exposition aux molécules identifiées comme perturbateurs endocriniens sur la physiologie thymique et les conséquences sur la susceptibilité au développement de pathologie auto-immunes.

Réduction

Le nombre total d'animaux dans ce projet est 2496. Pour chaque procédure 1248 animaux seront utilisés pour permettre une analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Le nombre de souris par condition expérimentale est déterminé pour permettre une bonne analyse statistique des données tout en utilisant le minimum d'animaux. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous analyserons les variances et différences entre les groupes testés.

Raffinement

Les animaux obtenus par le fournisseur agrée observeront une période d’acclimatation/adaptation de 7 jours. Tous les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton, bâton en bois) et un accès à l’alimentation et un abreuvement à volonté. Une litière en aoute pour limiter l’inconfort des animaux au niveau des coussinets plantaires. Lorsqu'il y a apparition de signe clinique de la maladie, de la nourriture humidifiée est mise dans la cage pour éviter aux souris, si elles sont faibles, d'aller chercher la nourriture en hauteur. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie et d'une analgésie pré et post immunisation. Les souris sont surveillées quotidiennement par les animaliers. Les souris sont pesées 2 à 3 fois par semaine et regardées attentivement par la personne menant le projet. Les points limites ont été préalablement définis pour limiter la contrainte et permettre une prise de décision rapide en cas de nécessité.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car il est bien caractérisé pour les maladies auto-immunes. Il permet d’étudier dans un organisme global, les effets de composés sur les différentes populations cellulaires immunes et leur interaction et conséquence sur la physiologie globale de manière fiable. Ces observations sur organisme entier ne sont pas possibles sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, une lignée murine pour le gène d’intérêt est disponible à l'établissement. Les modèles de thyroïdite et myasthénie auto-immune sont maitrisés par l’équipe et reconnus par la communauté scientifique. Ces modèles sont comparables sur certains points avec la pathologie humaine. Les expériences seront effectuées sur des souris ayant 4 à 7 semaines et 10 à 12 semaines au début de l’expérience ce qui correspond à l’adolescence et au stade adulte, périodes d’apparition des maladies auto-immunes chez l’homme.

Pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie, des maladies métaboliques ou l'insuffisance hépatique, des souris immunodéficientes reçoivent des cellules du foie humaines à la place des leurs, parfois avec des cellules souches qui leur donnent un système immunitaire humain. 8800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 étant déclarées réutilisées, notamment pour une formation interne aux gestes techniques, et les autres tuées parce qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé", selon le porteur. Chez les souris humanisées, les cellules du foie sont détruites par une mutation de leur souche et par quatre à sept injections d'un composé, avant la greffe de cellules humaines, notamment par la veine porte, puis viennent selon les protocoles l'induction de maladies, l'administration des candidats médicaments, des prises de sang et des jeûnes pouvant atteindre 6 heures d'affilée et 12 heures par semaine. Le porteur indique avoir fixé l'effectif sans approche statistique, d'après le nombre d'études des années antérieures et une croissance annuelle anticipée "en accord avec le plan commercial", en comptant sur une humanisation réussie chez la moitié environ des souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Dans certains cas, la présence d’un système immunitaire humain, en complément d’un foie humanisé, est indispensable pour étudier des processus physiopathologiques spécifiques, comme dans les maladies métaboliques (ex. : MASH) ou virales (ex. : dengue). Dans ces cas, une double humanisation, incluant à la fois le foie et le système immunitaire des souris, sera envisagée afin de répondre de manière optimale aux besoins scientifiques et aux questions posées. Les cellules hépatiques humaines (et immunitaires, le cas échéant) pourront ensuite, par exemple, être infectées par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable et plus acceptable sur le plan éthique que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. En cas de besoin, il sera également possible d’humaniser simultanément le compartiment immunitaire et hépatique. Cette double humanisation constitue un atout majeur, car elle permet de modéliser plus fidèlement les interactions entre le foie et le système immunitaire humain, particulièrement dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. De plus, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, éthiquement plus acceptable que les primates non-humains, et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée pourront également être exploitées pour l’étude des mécanismes d’insuffisance hépatique et des thérapies ciblant cette condition. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’évaluer les réponses immunitaires humaines face à des pathologies complexes, notamment dans le contexte de traitements antiviraux ou de maladies impliquant des dysfonctionnements immunitaires.

Procédures

[MODIFICATION] 4 à 7 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale, ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par [MODIFICATION] l’identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection, la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de [MODIFICATION] 4 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de la PE2, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum [MODIFICATION] sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les fréquences des prélèvements sanguins sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique induisant la mort sélective des hépatocytes murins, ce qui permet de greffer simultanément en plus des cellules souches des hépatocytes humains. Cette approche vise à humaniser à la fois le système immunitaire et le foie. Cette double humanisation offre la possibilité d’évaluer des solutions thérapeutiques pour des maladies métaboliques et virales impliquant le système immunitaire, ainsi que pour les cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

306 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles, dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées, reçoit d'abord 90 secondes de rayons X, puis toutes sont injectées dans la veine de la queue avec des cellules leucémiques humaines et suivies trois mois durant par douze séances d'imagerie, chacune précédée d'une injection dans l'abdomen. Quand l'imagerie n'est pas possible, le suivi passe par quatre prélèvements de moelle osseuse dans les pattes postérieures et neuf prises de sang à la joue sur animal éveillé. Le porteur affirme avoir mené le maximum d'expériences sur cellules, puis conclut que le recours à un "organisme vivant entier" est "indispensable" pour reproduire les conditions observées chez l'être humain.

Objectifs

La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL-T) et le lymphome T sont des cancers du sang caractérisés par la multiplication incontrôlée d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées cellule T. Ces cellules une fois entrées dans ce processus de multiplication incontrôlé, ne remplissent plus leur fonction protectrice. Les traitements actuels reposent principalement sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien qu’ils aient permis d’améliorer la survie des patients, certains malades répondent mal à ces approches. Avec les avancées technologiques actuelles, de nouvelles stratégies thérapeutiques ont été mises en place. Elles ont pour objectif de réorienter les défenses immunitaires spécifiquement contre les cellules cancéreuses. Dans notre projet, nous modifions les globules blancs afin qu’ils expriment à leur surface des molécules spécialement conçues pour reconnaître et éliminer les cellules tumorales. Ces molécules sont capables de cibler deux marqueurs importants présents sur les cellules cancéreuses. En combinant ces deux molécules à la surface d’un même globule blanc, nous visons à rendre le traitement plus efficace et plus spécifique, tout en réduisant les risques d’effets indésirables. Cette approche pourrait ainsi offrir une nouvelle option thérapeutique pour les patients résistants aux traitements classiques.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à développer une nouvelle approche d’immunothérapie cellulaire ciblant deux types de cancers du sang (LAL-T et Lymphome T). Ce type de traitement a déjà montré de très bons résultats dans d’autres types de cancer, notamment chez des patients qui avaient rechuté après les traitements habituels. Avec ce projet, nous souhaitons offrir de nouvelles solutions plus sûres et plus efficaces, afin d’améliorer la prise en charge et les chances de guérison des personnes touchées par ces maladies.

Procédures

Pour mettre en place les modèles d’étude, une partie des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à un prétraitement par rayon X de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules humaines injectées. L’ensemble des souris seront injectées avec soit des cellules cancéreuses humaines ou des cellules souches humaines en une fois par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée : 30 secondes). Le traitement avec les cellules immunitaires modifiées est administré à l’ensemble des animaux en une fois par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 10 secondes). Pour suivre le développement du cancer et l’efficacité des traitements (3 mois de suivi), les cellules cancéreuses auront été modifiées génétiquement afin de pouvoir convertir en lumière une molécule (non toxique) qui sera administrée aux souris au moment du suivi par imagerie. Ces sessions d’imagerie sont non invasives et réalisées sur souris anesthésiées (nombre de session : 12 ; durée de la session : 10 min ; fréquence : tous les 7 jours). Les souris recevront une injection (1 injection par session soit 12 injections pour un suivi de 3 mois, durée 10s) dans la cavité abdominale d’une molécule permettant la visualisation des cellules cancéreuse. Dans le cas où le suivi de la maladie ne pourra pas se faire par imagerie (impossibilité de modifier génétiquement des cellules cancéreuses), des prélèvements de moelle osseuse au niveau des pattes postérieures seront réalisés sous anesthésie et analgésie (4 prélèvements en alternant la patte prélevée, durée : 5 minutes,1 fois toutes les 3 semaines) et par des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris éveillées (9 prélèvements en alternant le site de prélèvement, durée 10s, 3 fois par mois). Pour le suivi du développement d’un système immunitaire humain et évalué la toxicité des traitements chez la souris (lot de souris exclusivement utilisé pour cette évaluation), 3 prélèvements de sang (durée :10s) au niveau de la veine de la joue des souris éveillées seront réalisés sur la totalité de l’étude soit 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le prétraitement par rayon X des souris peut provoquer des diarrhées et une perte de poids. Il rend aussi la souris encore plus fragile aux infections. Les différentes sessions d’injection et de prélèvements sanguins sur souris éveillées peut causer une douleur légère et brève au niveau des sites d’injections et de prélèvements. Les prélèvements de moelle osseuse peuvent entrainer sur une très courte durée et dans des cas très rares une perte de mobilité partielle. Les animaux pourront ressentir un stress : - lors des différents changements d’environnement (passage de leur salle d’hébergement aux salles de manipulation), les souris peuvent ressentir un mal-être au cours du développement de la maladie se manifestant par une modification de leur comportement, de leur apparence physique d’une perte de poids, et dans certains cas l’apparition de paralysie.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les différentes populations de cellules du système immunitaire et les traces de cellules tumorales résiduelles après traitement.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences sur les cellules en laboratoire, afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle vivant entier, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie sur animaux vivants permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une structure répondant aux normes sanitaires requises avec de l’eau et de la nourriture à volonté. Des enrichissements sont mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger) afin que les animaux puissent répondre à leurs besoins primaires. Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux. Un suivi hebdomadaire de signes cliniques renforcés sera réalisé à l’aide d’une grille d'évaluation comprenant différents critères comme l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. Les critères sont répartis en 4 catégories allant de 1 à 4. En fonction de la présence et de la catégorie du critère observé différentes actions seront mises en place. (Augmentation du suivi clinique 2 fois par semaine puis quotidien, accessibilité de la nourriture facilité, réhydratation de l’animal avec des injections de sérum physiologique et euthanasie de l’animal en cas d’attente de point limites). De plus le suivi hebdomadaire de la croissance des cellules cancéreuses, est une donnée prédictive précieuse qui nous permet d’agir en amont de l’apparition des signes cliniques délétères pour l’animal (exemple paralysie).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement et les signes de bien-être clinique sont bien connus. Ainsi, l’évaluation du bien-être et du mal-être liés à l’expérimentation peut être effectuée aisément permettant une prise en charge rapide et adaptée. De plus, les modèles de cancer du sang sur des souris adultes dépourvues de système immunitaire sont bien décrits dans la littérature scientifique et reste le meilleur modèle pour la greffe de cellules humaines (cancéreuse ou saine). C'est pourquoi, nous utilisons des souris adultes âgées de 2 à 3 mois.