Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 24/12/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-426023)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Malgré la conservation évolutive dans le système immunitaire de l’immunoglobuline D (IgD), les fonctions spécifiques de cette Immunoglobuline restent une énigme. Le rôle précis de l’IgD lorsqu’elle est exprimée avec d’autres immunoglobulines à la surface des cellules immunitaire (cellules B) n’a été clarifié ni chez les poissons ni chez les mammifères. On pense que l’IgD joue un rôle important dans les muqueuses mais son rôle exact n’est pas encore bien compris. Pour mieux comprendre la fonction de l’IgD nous allons utiliser le modèle poisson zébrafish qui produit aussi ces immunoglobulines D au niveau des cellules immunitaires B. Pour cela, nous créerons deux lignées de poissons-zèbres dont le gène de l’IgD aura été inactivé grâce à la technique des ciseaux moléculaires : les Crispr/Cas9. Dans un deuxième temps et dans un autre laboratoire (nouvelle demande d’autorisation de projet), les poissons mutants seront soumis à des infections virales afin d’étudier les effets de l’absence d’IgD sur leur système immunitaire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Malgré la conservation évolutive de l’IgD, les fonctions spécifiques de cette immunoglobuline restent une énigme. C’est pourquoi la génération de mutants de poisson zèbre dépourvus de l’expression de l’IgD serait un outil extrêmement précieux pour comprendre le rôle de l’IgD à la fois lorsqu’elle est sécrétée et lorsqu’elle est co-exprimée avec l’IgM à la surface des cellules. Plus précisément, cela nous permettrait de déterminer comment l’absence d’IgD affecte la réponse immunitaire aux agents pathogènes qui pénètrent dans l’hôte par les voies muqueuses et comment elle conditionne la réponse IgM. Le fait de disposer de ces poissons sera déterminant pour clarifier le rôle immunitaire de cette immunoglobuline énigmatique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Ce projet concerne uniquement la création de 2 lignées mutantes n’exprimant pas le gène de l’immunoglobuline. Pour l’établissement de ces lignées, une procédure de génotypage (section d’un fragment de nageoire caudal) sera réalisé sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l’anesthésie et de la récupération à l’anesthie du poisson compris.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’inactivation du gène codant l’IgD peut entraîner une altération des fonctions immunitaires. Ainsi: la reconnaissance des microbes et la régulation des cellules immunitaires sont altérées.Les animaux pourraient être un peu plus sensibles aux infections ou au stress environnemental. Cependant, d’autres anticorps (comme l’IgM) peuvent compenser partiellement cette absence, donc les effets ne sont pas toujours graves, mais ils peuvent apparaître dans certaines conditions (infection, changement d’environnement, etc.). Le génotypage est invasif (prélèvement d’un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l’anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l’activité de nage. L’anesthésie pratiquée pour le prélèvement de fragment de nageoire peut aussi entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Ce projet vise à créer 2 lignées mutantes pour étudier le fonctionnement du système immunitaire après l’inactivation de l’Immunoglobuline D. Seuls les 2 x 25 animaux hétérozygotes de la première descendance seront maintenus en vue de la production de la descendance suivante.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du fonctionnement du système immunitaire. Il n’existe donc pas d’alternative à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène IgD dans la fonction des cellules B du système immunitaire et les interactions avec les autres cellules immunitaires.
2. Réduction
In fine, il s’agit de créer 2 lignées pures (dans la descendance de 2ème génération) présentant une inactivation du gène de l’immunoglobuline D. Pour cela, par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus de la porteurs de mutations intéressantes (génération fondatrice). Au maximum 150 de ces individus atteindront le stade adulte selon les chiffres habituels. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygotes (possédant des copies de gènes différentes) en descendance de 1ère génération lorsque les animaux fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype naturel. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes de la génération de 1ère descendance produira une descendance de deuxième génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif obtenu). Après validation de chacune des lignées, nous produirons et conserverons un minimum de poissons respectant dans le même temps la demande en œufs de cette descendance pure contenant 100 homozygotes mutants complets.
3. Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce. Les différents paramètres de suivi sont relevés quotidiennement. Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en densité optimale . Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique de IgD) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien-être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la SBEA sera immédiatement avertie. La procédure de génotypage (permettant d’estimer le taux de mutants) qui consiste en un prélèvement de fragment de très petite taille durera moins de 2 minutes, temps d’anesthésie et réveil du poisson compris.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La demande concerne la fourniture de 2 lignées zébrafish présentant une inactivation de gène en vue de test infectieux. Le zébrafish est un poisson osseux qui possède un système immunitaire adaptatif fonctionnel. Le zébrafish exprime les immunoglobulines communes aux mammifères. Dans le cas de zébrafish présentant une mutation de gène, cela permet de réaliser des cribles en conditions infectieuses à grande échelle, ce qui est non réalisable chez les mammifères. De plus, le poisson zèbre est une espèce chez laquelle les outils d’édition de génome peuvent être appliqués de manière simple en raison du très fort taux de fécondité chez cette espèce et du développement rapide : 1 animal mature sexuellement peut être obtenu en 3 mois. Il est possible de produire beaucoup d’individus avec un gène inactivé plus rapidement que chez d’autres modèles vertébrés. Les animaux seront utilisés au stade adulte (pour la génération fondatrice et les animaux de 1ère génération) pour la création de lignée puis les œufs de la 2ème génération seront fournis au demandeur pour la suite des expérimentations (tests ultérieurs d’infection virale non réalisés par notre laboratoire). Au préalable, une vérification du taux de transmission de la mutation sera faite sur des alevins de la 2ème génération âgés de 1 mois. Cela permettra aussi de vérifier la qualité phénotypique et comportementale des individus cette 2ème génération.