Procédures modérées

Douze semaines sans aucun enrichissement physique dans la cage, pour installer un état d'anxiété-dépression : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 924 subissent quatre semaines de stress chronique léger, 564 reçoivent quatre séances d'ultrasons crâniens sous anesthésie, et chacune passe deux séances d'imagerie pouvant durer deux heures. Six tests comportementaux mesurent ensuite la motricité, la dépression et l'anxiété ainsi induites. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier que les signaux vus en imagerie correspondent bien à des altérations réelles de la barrière hémato-encéphalique.

Objectifs

Les traitements actuels contre la dépression restent insuffisants pour une partie des patients, et les rechutes sont fréquentes. Pour développer de nouvelles approches plus efficaces, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans cette maladie. Notre projet de recherche s’intéresse à un élément encore peu exploré dans ce contexte : la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est une structure qui agit comme un filtre protecteur, en contrôlant les échanges entre le sang et le cerveau. Des études récentes suggèrent qu’elle pourrait être altérée dans certaines maladies psychiatriques, comme la dépression, et ainsi contribuer à certains symptômes. De plus, des travaux montrent qu’il est possible de moduler temporairement la perméabilité de cette barrière, ce qui permettrait de faire passer dans le cerveau des substances actives susceptibles d’agir sur les symptômes dépressifs. Ces découvertes ouvrent des perspectives nouvelles, à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour envisager de nouvelles voies d’administration de traitements ciblés. Notre projet repose donc sur deux grands objectifs complémentaires : 1. Étudier l’état de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle animal (des souris) présentant des caractéristiques proches de la dépression humaine. Pour cela, nous utilisons des techniques d’imagerie non invasives permettant d’observer le cerveau (IRM) et son fonctionnement (TEP). 2. Tester la possibilité d’agir sur la barrière, en modifiant transitoirement sa perméabilité. Cela permettra d’évaluer si des composés potentiellement utiles contre la dépression peuvent franchir cette barrière et avoir un effet thérapeutique. Cette modulation sera testée par deux méthodes : l’utilisation d’ultrasons ciblés (FUS) et l’administration de substances spécifiques. L’ensemble de ces investigations vise à mieux comprendre le rôle de la BHE dans la dépression et à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques en s’appuyant sur l’imagerie et la modulation ciblée de cette barrière.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression afin d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces et mieux ciblés. À court terme, il s’agit : • d’évaluer l’état de la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre naturel du cerveau, chez des animaux présentant des comportements similaires à la dépression, pour identifier d’éventuelles altérations ; • d’étudier comment des ultrasons ciblés ou certaines substances influencent la perméabilité de cette barrière et le passage de composés vers le cerveau, afin d’optimiser l’administration de médicaments ; • d’analyser les effets cellulaires de ces modulations pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ; • d’explorer un éventuel effet bénéfique des ultrasons sur le comportement de ces animaux ; • et de renforcer l’usage de l’imagerie TEP pour étudier, de manière non invasive, la BHE et les processus cérébraux associés à la dépression. À long terme, ces recherches devraient permettre : • une meilleure compréhension des mécanismes complexes de la dépression, essentielle au développement de traitements plus performants et durables ; • l’évaluation d’une approche innovante reposant sur les ultrasons ciblés, potentiellement capable d’agir à la fois sur la BHE et sur les symptômes dépressifs ; • des avancées vers des stratégies thérapeutiques non invasives, précises et personnalisables ; • une meilleure connaissance des effets des ultrasons sur le cerveau, nécessaire à leur future utilisation clinique ; • et des retombées méthodologiques utiles à la recherche en imagerie et en neuropharmacologie. En résumé, ce projet combine neurosciences, imagerie et technologies innovantes pour explorer de nouvelles voies thérapeutiques dans la dépression, avec l’ambition d’améliorer à terme la prise en charge des patients.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie (2 imageries par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum ; 1224 animaux) • Induction du modèle dépressif : la dépression sera induite par un protocole standardisé de stress chronique léger, réalisé sur une période de 4 semaines (924 animaux) • Réalisation de sessions d’ultrasons (4 sessions d’ultrasons par animal) sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes au maximum ; 564 animaux) • Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux (6 tests par animal) afin de mesurer l'activité motrice (durée = 30 minutes), la dépression (durée = 5 minutes) et l’anxiété (durée = 5 minutes). • Administration 2 fois par semaine d’un candidat médicament par injection i (réalisée en 10 secondes ; 528 animaux) pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Induction d’un phénotype dépressif • Administration de médicaments par injection, ce qui induit une douleur suite à la piqure inférieure à 3 secondes. • Absence d’enrichissement physique dans les cages afin de favoriser le modèle d'anxiété-dépression (12 semaines), les enrichissements environnementaux de type sensoriel et social sont maintenus. • Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue lors de l’examen d’imagerie. Afin de minimiser ce stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • Stress possiblement induit par les tests de comportement mais tests réalisés sous étroite surveillance et interrompus en cas de stress trop important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les organes, d’en analyser leur composition aux niveaux cellulaires et tissulaires. Ces analyses permettront d’obtenir des informations supplémentaires sur les mécanismes biologiques en jeu, notamment la distribution des biomarqueurs d’intérêt. Elles serviront surtout à valider et à interpréter les résultats obtenus par imagerie, en s’assurant que les signaux observés reflètent bien des altérations réelles et spécifiques de la barrière hémato-encéphalique. Cette étape est essentielle pour confirmer la pertinence de l’imagerie comme outil fiable d’investigation de la BHE.

Remplacement

En amont de ce projet, des études ont été menées en laboratoire, notamment en utilisant des matériaux simulant le cerveau (des "fantômes") et des cultures de cellules. Ces travaux préliminaires ont servi à tester et à ajuster les paramètres techniques, en particulier ceux liés à l'utilisation des ultrasons et à l'effet de certaines substances sur la barrière qui protège le cerveau (la Barrière Hémato-Encéphalique ou BHE). L'objectif était précisément de limiter le recours aux animaux. Cependant, ses recherches portent sur des pathologies complexes comme la dépression et sur les interactions fines entre le cerveau, sa barrière protectrice, et des interventions comme les ultrasons ou l'administration de substances. Actuellement, la complexité d'un organisme vivant, avec son environnement cérébral unique et l'interaction de ses différents systèmes, ne peut pas être reproduite fidèlement par des études en laboratoire sur des cellules isolées, des organoïdes ou par des simulations informatiques. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour étudier ces maladies complexes et pour évaluer la variabilité de la réponse à des approches potentielles de traitement.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie longitudinale non invasive : nous utiliserons la tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les différences pharmacocinétique au sein de nos groupes. Cette méthode non invasive permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. En suivant les mêmes animaux à différentes étapes de l'étude, nous réduisons considérablement le nombre total d'animaux nécessaires. - Analyse statistique : l'analyse choisie permet de maximiser la précision des comparaisons entre groupes tout en tenant compte des variations individuelles. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures concrètes seront mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et toute forme d'inconfort chez les animaux, conformément au principe de Raffinement. Les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de 1 à 4 semaines avant toute procédure, afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles seront logées en groupe pour favoriser leur bien-être social, et manipulées de manière douce et progressive pour réduire leur stress. Un suivi quotidien sera assuré par du personnel formé, qui observera leur comportement, leur aspect général, leur poids, ainsi que leur consommation d’eau et de nourriture. Ce suivi permet de détecter rapidement tout signe de mal-être. Toutes les procédures pouvant causer une gêne (examens d’imagerie, injections…) seront réalisées sous anesthésie générale. Pendant l’anesthésie, leur respiration et leur température seront surveillées. Le réveil se fera dans leur cage habituelle ou avec leur propre litière pour limiter le stress. Un système d’observation rigoureux des animaux a été mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance, bien que toutes les précautions soient prises pour les éviter. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires. Enfin, les différentes étapes expérimentales sont espacées dans le temps pour permettre aux animaux de récupérer entre les procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de cette étude, il a été décidé d'utiliser des souris. Ce choix repose sur des raisons scientifiques importantes. Premièrement, le modèle de dépression utilisé dans ce projet, qui est induit en donnant une substance (la corticostérone) dans l'eau de boisson pendant une certaine période, a été spécifiquement développé et validé chez la souris. L'utilisation de cette espèce nous permet donc de travailler avec un modèle dont les caractéristiques liées à la dépression sont bien établies. De plus, un type particulier de souris présente des avantages techniques pour les méthodes d'imagerie non invasives que nous allons utiliser, comme une meilleure transmission des ultrasons à travers le crâne. Ces souris sont également très similaires les unes aux autres, ce qui rend les résultats plus fiables et reproductibles. Concernant le stade de développement, nous utiliserons uniquement des animaux adultes. Ce choix est essentiel car la dépression est une maladie qui se manifeste principalement chez l'adulte. En travaillant sur des souris adultes, nous nous assurons que les mécanismes biologiques et les comportements que nous étudions sont pertinents par rapport à la maladie chez l'homme. Enfin, certaines des techniques d'imagerie non invasives employées nécessitent que le crâne soit complètement développé pour obtenir des données précises et comparables. Cela est généralement atteint à l'âge adulte chez la souris. En résumé, l'utilisation de souris adultes est la plus appropriée et la plus pertinente pour étudier les mécanismes de la dépression et évaluer de nouvelles approches dans ce projet.

Des cellules tumorales sont greffées dans le cerveau de 250 rats, qui reçoivent ensuite trente minutes de traitement par une source laser, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit aussi une administration par voie orale sous contention et deux prélèvements sanguins sous anesthésie. Dix rats par groupe sont gardés jusqu'au bout pour mesurer leur survie, quatre autres subissent des prélèvements à trois temps, et tous sont tués pour récupérer organes et sang. Le porteur affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo et que les reconstructions de tumeurs en trois dimensions restent "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle de tumeur intracrânienne (tumeur implantée dans le cerveau des animaux, = tumeur stéréotaxique), déjà mis en place dans nos laboratoires chez le rat afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer une nouvelle approche thérapeutique pour traiter ce type de cancer. L’évaluation de ce traitement potentiel chez l’animal permettra d’étudier cette nouvelle approche thérapeutique, dans un contexte physiologique le plus proche possible de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à réaliser une réelle évaluation de l’efficacité de cette molécule et du dispositif d’activation par la lumière destinés à traiter les cancers chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité d’évaluer l’efficacité d’une molécule thérapeutique associée à un dispositif thérapeutique innovant grâce à un modèle préclinique le plus prédictif possible afin de pouvoir transposer leurs utilisations chez l’homme lors d’essais cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, représentant un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent la première évaluation de l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de ces nouvelles approches. Au cours des expériences, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur ou mimer l’apparition de sites métastatiques dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance/échappement après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme des moyens de défense.

Procédures

-Greffe des cellules tumorale dans le cerveau, sous anesthésie et antalgie (fréquence :1 fois, durée : 30 minutes) -Traitement par une source photonique type laser (fréquence :1 fois, durée : 30 minutes) -Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention (fréquence :1 fois, durée : 5 minutes). -Prélèvements de sang, sur animaux anesthésiés, par ponction dans : la veine jugulaire ou veine caudale (fréquence :2 fois, durée : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Une douleur sera induite par la procédure de greffe des cellules tumorales, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Une douleur modérée sera ressentie lors de la mise en place du dispositif d’activation par la lumière, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Les gestes techniques suivants induiront un stress léger (et de courte durée, moins de 1 heure) à l’animal, aucune analgésie n’étant donc requise : -Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention -Suivi des animaux (poids) Au début de l’étude avant le début des traitements, les animaux seront randomisés et donc mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress pendant 1 à 2 jours. Les traitements et les procédures chirurgicales pourront induire une perte de poids. Le modèle pourra également induire des signes neurologiques. Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress modéré chez l’animal : -Prélèvements de sang, sous anesthésie, par ponction dans la veine jugulaire ou la veine caudale.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de sang, nécessaires pour évaluer la spécificité des composés sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments En effet, les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D peuvent être utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes a été ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie des animaux entre les différents groupes de l’étude seront comparées pour évaluer l’efficacité des composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter individuelles. Ce projet sera composé de 6 groupes de 14 animaux dont 10 animaux dédiés à l’évaluation de l’activité antitumorale (critère d’évaluation principale : augmentation de l’espérance de vie des groupes traités par rapport au groupe contrôle) et 4 animaux satellites qui seront prélevés (prélèvement de sang) à 3 temps cinétiques pour le suivi de marqueurs biologiques. Ces animaux satellites seront euthanasiés au dernier temps cinétique. Chaque groupe est composé de 14 rats donc 10 rats seront gardés en survie après le traitement afin d’évaluer l’efficacité des traitements et 4 rats satellites par groupe seront prélevés (prélèvement de sang) au cours de l’étude afin d’acquérir des données pharmacologiques (cinétique des cytokines et de l’infiltrat immunitaire). Le nombre d’animaux engagés dans cette étude a été ajusté au minimum nécessaire afin de garantir une robustesse et la significativité des résultats obtenus.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées, par des techniciens formés et qualifiés, selon les modes opératoires validés. L’induction tumorale et les traitements par un dispositif d’activation type laser seront réalisés sous anesthésie et analgésie pour limiter la douleur induite. Les animaux bénéficieront d’un suivi post op (réveil sous tapis chauffant pour éviter l’hypothermie, poursuite de l’analgésie tant que nécessaire). La réorganisation liée à la randomisation induira un stress léger, mais l’enrichissement présent limitera fortement l’impact sur les animaux. Le suivi des poids des animaux induira un stress léger. La fréquence de ce suivi sera quotidienne dès l’apparition des premiers symptômes de développement de la tumeur. Cela permettra de prodiguer des soins adaptés aux animaux dès que nécessaire. Les prélèvements de sang réalisés induiront un stress de l’animal. C’est pourquoi, ils seront réalisés sous anesthésie. Le développement tumoral entrainera une perte de poids. De même, des troubles du comportement, indiquant des troubles neurologiques, constitueront un point limite. Toute autre anomalie décelée sur un animal indiquant une quelconque souffrance de celui-ci sera rapportée à la SBEA et au directeur d’étude, et ce pour que la meilleure décision soit prise dans l’intérêt de l’animal.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau de l’emplacement cérébral souhaité. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau de l’emplacement cérébral souhaité, ceci pouvant donc induire des effets neurologiques néfastes.

Chaque souris reçoit six injections d'immunogènes espacées de trois semaines, six prélèvements sanguins, puis trois injections supplémentaires dans les cinq jours précédant sa mise à mort. 100 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des nanocorps dirigés contre la protéine prion. Le porteur décrit ces quinze interventions comme de "légères gênes temporaires" qui ne devraient entraîner "ni douleur importante ni effet durable", quand la gravité déclarée du projet est modérée. Toutes sont tuées dès que la réponse en anticorps est jugée correcte, pour prélever la rate.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire un type particulier d’anticorps appelés VHH ou nanocorps. Ces anticorps sont beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur petite taille est intéressante car elle leur permettrait, en théorie, de franchir plus facilement la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre la possibilité d’imaginer un jour des traitements pour des maladies qui touchent directement le système nerveux. Nous voulons produire ces anticorps contre la protéine prion (PrP). Cette protéine est responsable des maladies à prion, qui touchent l’animal et l’Homme, et qui sont toujours fatales car il n’existe actuellement aucun traitement. Les nanocorps obtenus pourraient servir à mieux comprendre comment ces maladies se développent, à améliorer leur diagnostic et à explorer de nouvelles pistes de traitement. Nous cherchons aussi à produire des nanocorps capables de reconnaître non seulement la forme « normale » de la protéine prion, mais aussi certaines formes anormales associées aux maladies. Cela permettrait d’obtenir des anticorps plus spécifiques et plus utiles que ceux dont nous disposons aujourd’hui. Enfin, la protéine prion est également impliquée dans d’autres maladies, comme certains cancers ou encore la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. La production de nanocorps dirigés contre la protéine prion pourrait donc avoir un intérêt bien au-delà des seules maladies à prion, et bénéficier à un domaine plus large de la recherche biomédicale.

Bénéfices attendus

Les anticorps de type VHH, aussi appelés nanocorps, sont des outils innovants qui possèdent plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Leur petite taille leur permet de se fixer sur des cibles difficiles d’accès et, en théorie, de franchir la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre des perspectives uniques pour envisager un jour des traitements de maladies qui touchent directement le système nerveux. Ils sont aussi très stables, faciles à produire en laboratoire et peuvent être utilisés sous différentes formes pour la recherche, le diagnostic ou le traitement. Ces nanocorps sont déjà étudiés dans d’autres maladies humaines, par exemple certains cancers, des maladies infectieuses, ou encore des maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Leur potentiel d’application est donc très large. À ce jour, il n’existe aucun nanocorps dirigé contre les maladies à prion. Ce projet vise à combler ce manque en développant une nouvelle génération d’anticorps contre la protéine prion. L’intérêt dépasse les maladies à prion elles-mêmes, car la protéine prion est aussi impliquée dans d’autres pathologies. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples : - fournir de nouveaux outils de recherche pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion, - permettre un diagnostic plus précoce et plus précis des maladies à prions, - et à plus long terme, ouvrir des pistes thérapeutiques innovantes grâce à la petite taille des nanocorps, qui pourrait leur permettre d’atteindre le cerveau et de cibler spécifiquement les formes anormales de la protéine prion.

Procédures

100 souris sont prévues pour le projet. Pour chaque animal, les gestes techniques seront les suivants : - injection d’analgésique avant injection des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigile. Il faut compter 30 secondes par intervention. - Injections des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigiles. Il faut compter 1 minute maximum par intervention (contention et injection) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles 1 prélèvement avant la première injection puis toutes les 2 semaines après chaque immunisation, soit 6 prélèvements. Il faut compter 2 minutes par intervention (contention, prélèvement puis massage de la joue) - Cinq jours avant la mise à mort, 3 injections toutes les 24h d’immunogènes sur animaux vigiles. Il faut compter environ 1 minute par intervention (contention et injection).

Impact sur les animaux

Les interventions prévues (injections et prises de sang) peuvent provoquer de légères gênes temporaires chez les souris, mais elles ne devraient pas entraîner de douleur importante ni d'effet durable. Les effets observés peuvent être une petite rougeur ou un léger gonflement à l'endroit de l'injection ou de la prise de sang ; une sensibilité locale passagère ; un léger inconfort dans les heures suivant la manipulation. Il peut arriver que certains animaux soient un peu moins actifs ou mangent un peu moins pendant un jour ou deux, ou qu'ils perdent légèrement du poids. Ces effets disparaissent généralement rapidement, sans conséquence sur leur état général.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la campagne d’immunisation quand les réponses en anticorps seront correctes afin de prélever la rate.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes permettant de produire des anticorps sans utiliser d’animaux, par exemple des techniques de sélection réalisées uniquement en laboratoire., Cependant, ces approches n’aboutissent pas encore à des anticorps de même qualité que ceux produits par le système immunitaire d’un animal. En effet, l’organisme possède un mécanisme naturel qui « améliore » progressivement les anticorps pour qu’ils se fixent très efficacement à leur cible, un processus qui ne peut pas être reproduit artificiellement avec les techniques actuelles. Dans ce projet, les souris sont utilisées pour générer des cellules capables de produire durablement des anticorps. Ces cellules seront ensuite immortalisées en laboratoire et permettront de produire les anticorps sur le long terme, sans avoir à réutiliser de nouveaux animaux pour chaque antigène ou chaque série d’expériences.

Réduction

Le nombre de 5 souris par antigène a été déterminé à partir d’un calcul statistique. L’objectif est de garantir, avec une forte probabilité, que au moins deux souris par lot développent une bonne réponse immunitaire. Cela est nécessaire pour pouvoir utiliser leurs cellules et produire les anticorps sans avoir à recommencer tout le protocole depuis le début. En pratique, il est bien connu qu’une ou deux souris sur cinq peuvent ne pas répondre correctement aux immunisations. Le choix de 5 animaux tient donc compte de cette variabilité naturelle tout en évitant d’utiliser plus de souris que nécessaire. De plus, si la première tentative de production d’anticorps en laboratoire échoue (ce qui est rare), les trois souris restantes du lot servent de filet de sécurité. Cela permet de refaire un essai sans devoir réimmuniser un nouveau groupe d’animaux, ce qui contribue directement à réduire leur nombre sur l’ensemble du projet.

Raffinement

Trente minutes avant l’intervention les animaux recevront une injection d’analgésique. Après les interventions, les animaux seront surveillés et placés sur un tapis chauffant à 37°C pendant 2 heures pour favoriser leur récupération. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les lignées de souris de laboratoires sont classiquement utilisées pour l’immunisation et la production d’anticorps. Les souris transgéniques exprimant des anticorps de camélidés évitent le recours à ces espèces, protocole beaucoup plus difficile à mettre en œuvre. De jeunes adultes (6 à 8 semaines) seront utilisés au démarrage des immunisations ; ils ont en effet la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires lors des immunisations successives.

Pêchés au filet, anesthésiés trois à cinq minutes, mesurés et pesés hors de l'eau, 2 000 poissons reçoivent une puce électronique implantée dans l'abdomen par une incision de trois à cinq millimètres. Onze espèces sont concernées, dont cent salmonidés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont ensuite remis à l'eau, l'objet du projet étant de vérifier si une passe aménagée dans un grand fleuve laisse effectivement passer les migrateurs. Le porteur reconnaît qu'aucune analyse statistique n'est prévue et justifie l'effectif par les puces perdues en cours de route, certaines femelles les expulsant lors de la reproduction.

Objectifs

Suite à différents aménagements au niveau des fleuves ou de cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 2000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (50%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

11 espèces de poissons sont ciblées et sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, truite commune - Poissons d’eau calme : brème, gardon, rotengle, lote - Carnassiers : Brochet, silure, perche 1 stade de développement est retenu : subadultes-adultes.

1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Apporter la preuve qu'une prothèse biologique peut concurrencer les bandelettes synthétiques retirées de la clinique en Angleterre, au Canada et en Nouvelle-Zélande : 48 brebis sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est opérée par voie vaginale sous péridurale pendant une à deux heures pour recevoir une bandelette sous-urétrale, à raison d'une brebis par demi-journée sur six jours, puis suivie deux à six mois. Les complications attendues comprennent des saignements abondants, une dysurie, des infections et des douleurs, et chaque lot de seize compte une brebis de remplacement prévue en cas de décès après l'opération. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les organes du bassin, sauf les remplaçantes non implantées, et le porteur retient des brebis de six ans et plus ayant mis bas au moins trois fois, pour mimer le relâchement des tissus vieillissants.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’apporter des preuves expérimentales qu’un greffon entièrement biologique a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement de l’incontinence urinaire d’effort. Une comparaison avec les traitements chirurgicaux standards actuels (prothèse synthétique ou chirurgie autologue) est donc essentielle. Nous proposons un nouveau paradigme qui repose sur l’utilisation d’un matériau complètement biologique qui n’est ni chimiquement ni autrement dénaturé tel que son ultrastructure, similaire à un tissu natif, soit préservée pour favoriser son intégration dans les tissus de l’hôte.

Bénéfices attendus

L’incontinence urinaire d’effort est un problème médical important pour les femmes affectant 1 femme sur 5. Il s’agit de la fuite involontaire d’urine au cours de l’effort (sport, éternuements, toux, etc.). Plusieurs solutions chirurgicales existent. Bien que des chirurgies autologues existent, c’est-à-dire qui utilisent les tissus de la patiente (bandelettes de fascia lata ou rectus fascia) pour soutenir l’urètre, elles ont été moins favorisées en raison de la disponibilité et de la commodité des prothèses synthétiques. De plus, ces prothèses synthétiques, qui sont robustes et rigides, permettent d’apporter un soutien mécanique plus durable que les chirurgies autologues. En revanche, du fait de leur nature synthétique, elles sont reconnues comme un corps étranger et provoquent une « réaction à corps étranger » qui conduit à des complications parfois graves comme des douleurs chroniques et intenses, infections, expositions voire des perforations des organes par la bandelette synthétique. D’ailleurs, des rapports inquiétants de taux de complications élevés après l'implantation de prothèses synthétiques urogénitales pour le traitement de l’incontinence urinaire d’effort ont poussé les autorités réglementaires à renforcer leur surveillance et augmenter leur classification de niveau de risque au niveau maximal (IIb à III). Cela a conduit plusieurs pays comme l’Angleterre, le Canada et la Nouvelle-Zélande à ne plus utiliser les bandelettes sous-urétrales synthétiques en clinique. De plus, depuis 2019, les prothèses synthétiques implantables par voie vaginale pour traiter la « descente d’organes », qui est une pathologie souvent concomitante à l’incontinence urinaire d’effort, ont également été retirées du marché dans de nombreux pays comme la France, les États- Unis, l’Angleterre et la Nouvelle-Zélande. Il existe donc un besoin médical et sociétal important pour des innovations. Cette étude permettra de sélectionner les procédés de fabrication de nouvelles bandelettes complètement biologiques les plus adaptés pour produire une prothèse aux caractéristiques pertinentes pour l’utilisation clinique. Les gains attendus grâce à cette nouvelle technologie à long terme sont les suivants : (1) Pour les patientes : une grande amélioration de leur qualité de vie en limitant les risques de complications et de récidives. (2) Pour la société : une réduction des coûts en limitant les complications et les réopérations.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie loco-régionale, péridurale, sera réalisée sur les animaux. Les brebis seront implantées d’une bandelette sous-urétrale par voie vaginale pour traiter l’incontinence urinaire d’effort. Nous prévoyons un temps d’intervention d’environ 1 à 2h sur chaque animal. Les brebis seront donc opérées 1 par 1 sur chaque demi-journée pendant 6 jours (non consécutifs). Après l’opération, les animaux seront suivis pendant 2 et 6 mois. Dans le cas où des brebis venaient à décéder suite à l’intervention, nous prévoyons 1 animal supplémentaire en remplacement en cas de décès. Aucun prélèvement n'est prévu.

Impact sur les animaux

Le transport et la chirurgie peuvent générer de l'angoisse. Des risques de complications au cours de la chirurgie ou en post-opératoire peuvent être attendus comme : des saignements (abondants), dysurie (difficultés à la miction), infections, douleurs, souffrance et angoisse. La durée de ces nuisances ou effets indésirables sera réduite au maximum pour n’être que passagère en portant une attention particulière aux brebis tout au long du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort (sauf les animaux supplémentaires prévus en cas de décès d’un animal à la suite de l’opération et qui n’auraient donc pas été implantés) à l'issue de l’expérimentation puisque les organes du bassin seront prélevés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Il est possible d’étudier très largement in vitro ce matériau complètement biologique produit par culture de cellules de peau humaine. En revanche, son étude in vivo à long terme chez l’animal reste limitée. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. Des modèles animaux immunosupprimés, notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer l’anatomie ni la physiologie humaine car ils sont trop petits. D’ailleurs, ces modèles ne permettent pas d’évaluer la prothèse dans une région anatomique pertinente (région abdominale uniquement). Ainsi, le recours au modèle de gros animal permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative (indisponible chez les animaux immunosupprimés) dans un contexte de greffe pertinent (prothèse biologique produite par des cellules de brebis et implantée dans une brebis) et une région anatomique pertinente (urogénitale) simulant les conditions cliniques.

Réduction

Au total, 48 brebis sont nécessaires (3 lots de 16 brebis : 15 implantées et 1 de remplacement dans chaque lot). Nos premiers objectifs sont de démontrer l'implantabilité et l’intégration tissulaire supérieure des prothèses biologiques en comparaison avec une prothèse synthétique sur la base d'une observation directe (exposition et rétraction de la prothèse) et d’une évaluation histologique de la réponse immunitaire (innée et adaptative) dans un modèle de gros animal mimant le contexte clinique. Nous souhaitons également étudier la réponse immunitaire aux différents traitements des prothèses biologiques qui pourraient être source d’immunogénicité ce qui entraînerait une dégradation rapide du matériau in vivo. Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux (3 brebis par groupe) permettant l’obtention de résultats fiables pour répondre aux objectifs fixés. D’après la littérature, nous estimons la probabilité d’exposition prothétique avec une prothèse synthétique standard à environ 33%, avec rétraction et marqueurs de la réaction à corps étranger localisés autour des fibres synthétiques. Nous attendons des résultats similaires. En revanche, nous n’attendons pas d’exposition avec la prothèse biologique, ni de marqueurs de la réaction à corps étranger et, moins voire pas de rétraction du greffon biologique, ce qui démontrerait la supériorité de ce matériau. Selon la variabilité observée avec les premiers animaux, nous pourrons répéter l’expérience pour, par exemple, ajouter des animaux à l’étude ou confirmer certains résultats ou tester des conditions de production des greffons biologiques supplémentaires ou ajouter une condition expérimentale (Ex : chirurgie autologue).

Raffinement

Tout au long de la procédure expérimentale, une attention particulière visant à réduire douleurs, souffrance et angoisse chez les brebis sera apportée. Le transport et la chirurgie peuvent générer de l’angoisse. La durée du trajet est limitée (45 min maximum), dans un véhicule adapté, en lot de 2 brebis (minimum), pour limiter l’isolement social. La douleur, la souffrance et l’angoisse seront réduites par une prémédication et gérées par une anesthésie loco- régionale avec un suivi des paramètres vitaux durant la procédure chirurgicale. Un protocole d’analgésie post- opératoire prédéfini est réalisé pour chaque animal. En dehors de cette période, les animaux seront transportés et gérés au sein de l’établissement utilisateur assurant l’hébergement en conditions d’hébergement avec des méthodes de raffinement et d’enrichissement du milieu adéquat à son espèce : groupe social, pierre à sel et brosses dans les parcs à disposition, foin et paille, paillage régulier, jeux de mâchage... Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel dédié et expérimenté. La chirurgie est réalisée sous péridurale avec analgésie pré, per et post-opératoire par admission d’antalgiques. Des points limites ont été identifiés et se situent principalement au niveau de l’hébergement (grille d’évaluation pour la surveillance des points limites). De plus, si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points limites identifiés ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’établissement utilisateur assurant l’hébergement pour définir la conduite à tenir (prescription d’un traitement médical adapté, examens complémentaires, etc.). Si l’état de santé de l’animal ne s’améliore pas, le vétérinaire de l’établissement utilisateur assurant l’hébergement et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle ovin montre de grandes similitudes anatomiques avec l’humain au niveau de sa région pelvienne. De plus, il s’agit d’un modèle de « descente d’organes » bien établi dans la littérature, qui est une pathologie très souvent concomitante à l’incontinence urinaire d’effort. Par ailleurs, d’après nos études précédentes menées au laboratoire, les cellules ovines sont les seules cellules qui ont permis d’obtenir un matériau similaire à celui produit par les cellules humaines, en comparaison avec d’autres modèles animaux comme le chien et le cochon. Ces cellules ont été extraites, purifiées et amplifiées à partir de biopsies de peau récupérées sur des brebis post-mortem. L’espèce a donc été sélectionnée pour permettre l’étude de la réponse immunitaire complète ainsi que le remodelage des prothèses biologiques par les cellules de l’hôte. Nous souhaitons réaliser une implantation de bandelette sous-urétrales dans des brebis âgées (≥ 6 ans) et grandes multipares (≥ 3 mises bas) pour mimer le relâchement des tissus vieillissants (manque de tonus musculaire).