Procédures modérées

Les 1 800 souris reçoivent toutes une injection de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse, puis 900 sont gavées une à deux fois par jour pendant 28 jours et 900 autres portent une pompe osmotique implantée dans le dos, agrafes retirées une semaine plus tard. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, toutes les souris étant tuées à la fin pour l'analyse moléculaire de leurs tumeurs, et la croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur écrit veiller à ce que les molécules testées ne portent pas atteinte aux "libertés individuelles de l'animal", définies comme l'absence de douleur, de lésion, de maladie, de peur et de détresse, dans un protocole qui commence par greffer une tumeur. Il ne décrit par ailleurs que des lots de cinq animaux en phase exploratoire puis quarante pour la démonstration d'efficacité, sans expliquer comment l'effectif atteint 1 800.

Objectifs

Les mutations non sens sont responsables d’environ 10% des maladies génétiques. La conséquence d’une mutation non sens est la dégradation rapide de l’ARNm porteur de la mutation par un mécanisme de surveillance des ARNm appelé NMD (pour nonsense-mediated mRNA decay). Certaines molécules sont capables de restaurer l’expression d’un gène porteur d’une mutation non sens. Ce type de molécules représente des candidats médicaments pour le traitement de certains patients atteints de maladie génétique. Nous recherchons au laboratoire des molécules capables de corriger les mutations non sens. Pour cela nous criblons des chimiothèques puis validons les molécules sur des lignées cellulaires. Une étude est ensuite entreprise pour déterminer la toxicité des molécules sélectionnées et leur mode d’action. L’étude préclinique est achevée après avoir démontré que les molécules sont capables de corriger les mutations non sens in vivo au sein d’un organisme complexe tel qu’une souris. L’étude in vivo consistera à déterminer la voie d’exposition, la concentration la plus efficace et la cinétique d’action de la molécule. Pour cela, les voies d’exposition qui seront testées sont la voie orale en gavant la souris avec différentes quantités de molécules et la diffusion sous-cutanée au moyen d’une pompe osmotique. Pour évaluer l’efficacité des molécules, nous effectuerons des mesures de croissance tumorale puis une analyse moléculaire sur les tumeurs après mise à mort des animaux.

Bénéfices attendus

La validation de l’efficacité de molécules permettant de corriger des mutations non-sens (entraînant la production de protéines généralement non-fonctionnelles) dans un organisme complexe comme la souris permettra à terme le développement de futurs médicaments pour traiter l’Homme souffrant de maladies génétiques telle que le cancer.

Procédures

L'ensemble des animaux (1800) seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l'injection des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l'anesthésie : 10 minutes). L’ensemble des souris seront pesées 1 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (2 minutes). Deux voies d'administration de traitement seront ensuite évaluées. - Traitement par voie orale : une partie des animaux (900) recevront une à deux fois par jour un traitement ou son placebo par voie orale (30 secondes). Le traitement durera au maximum 28 jours. - Traitement par voie sous-cutanée : une partie des animaux (900) auront une implantation au niveau du dos d’un système permettant la délivrance en continu du traitement ou de son placebo (Chirurgie pour implanter une pompe osmotique : 10 minutes). Une semaine après l’intervention, les agrafes sont retirées sous anesthésie gazeuse (1 minute). Le traitement durera au maximum 28 jours.

Impact sur les animaux

Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Au cours des procédures, les animaux seront soumis à un stress léger de courte durée lors des anesthésies (par voie gazeuse ou par injection). De même, le traitement par voie orale, bien accepté par l'animal, pourra générer un stress léger et de courte durée lors de la contention. L'implantation de la pompe, réalisée sous anesthésie, ne devrait pas générer de gêne au mouvement de l'animal (placée sous la peau dans le dos) mais pourrait conduire à une douleur post-opératoire qui sera gérée par analgésiques. L'injection des cellules tumorales sera réalisée de manière à ne pas entraver les mouvements de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience afin de pouvoir procéder à l’analyse moléculaire des tumeurs et d’autres tissus.

Remplacement

Dans la première partie du projet, nous disposons d’un programme de caractérisation des nouvelles molécules que nous identifions et sélectionnons basé sur le criblage cellulaire. Cette étape in vitro préalable est essentielle afin de déterminer la dose efficace en culture cellulaire (ce qui nous permet d'extrapoler pour définir une fenêtre de doses qui seront utilisées chez la souris), la toxicité cellulaire et le mode d'action. Cette étape permettra de remplacer l'animal dans la phase de sélection des molécules et d'évaluation des conditions optimales d'utilisation. Cependant, bien qu’une grande partie de l’étude se réalise in vitro remplaçant ainsi le modèle animal, l’expérimentation in vivo demeure nécessaire afin de pouvoir étudier l’effet de ces molécules sélectionnées avec soin dans un modèle physiologique pertinent reflétant la mutation étudiée à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un "student test" qui est le test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.

Raffinement

Enfin, concernant le raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (la voie orale plutôt que sous-cutanée) et une anesthésie sera effectuée lorsque cela est compatible avec l'expérience. Des analgésiques seront utilisés pour pallier toute douleur pouvant survenir à la suite de l'implantation du système de diffusion sous-cutané. Les conditions d'hébergement seront telles que les animaux pourront bénéficier d'un enrichissement de leur environnement permettant une réduction de leur stress.

Choix des espèces

La souris présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés étudié dans notre projet semblable à celui de l'Homme. De plus, la souris a un cycle de vie compatible avec le test in vivo sur plusieurs semaines de molécules à visées thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de la quatrième semaine après la naissance et jusqu'à 6 mois maximum après la naissance. La limite inférieure correspond à l'âge de maturité du système immunitaire chez la souris et la limite supérieure a été fixée à 6 mois car après, nous les considérons comme trop âgées ce qui pourrait compliquer l'interprétation des résultats.

Une biopsie de l'endomètre et du placenta réalisée sur animal vigile, sans sédation ni anesthésie, en profitant de l'ouverture du col juste après la mise bas : vingt des soixante brebis gestantes du projet subissent ce prélèvement. 120 ovins au total, brebis et agneaux, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois prises de sang pour les mères et cinq pour les descendants. Les brebis sont placées en conditions de vague de chaleur durant le dernier mois de gestation, ce qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés de thermorégulation et un risque d'avortement ou de mise bas précoce, l'enjeu déclaré étant de mesurer l'effet du dérèglement climatique sur la fertilité des descendants. 90 animaux, les mères et leurs filles, rejoindront le troupeau pour le renouvellement des générations, et les 30 descendants mâles seront abattus pour prélever leurs testicules et leur prostate, leur "reproduction" étant déclarée "compromise".

Objectifs

Le déreglement climatique et plus particulièrement l’intensification des vagues de chaleurs imposent une adaptation pour toutes les filières animales. Chez les ruminants, déjà peu adaptés à la chaleur du fait des fermentations du rumen, l’aptitude à produire est corrélée négativement à la résistance à la chaleur. Des effets délétères d’un index combinant la température et le taux d’humidité (THI), ont ainsi été démontrés sur la santé, la production ou la fertilité des individus touchés. Si l'effet de la température et de l'humidité peut être direct sur les animaux en croissance ou adultes, il pourrait également s'appliquer durant le développement fœtal, perturbant l’organogenèse et la fonction placentaire. Le stress thermique, réduit en effet la croissance d'organes spécifiques chez les veaux mâles et femelles et en particulier la taille des ovaires. Mais à l'heure actuelle, l'impact sur la construction du phénotype de fertilité des descendants et sur leurs performances de reproducteur à l’âge adulte reste inexploré. De tels impacts, s’ils étaient avérés, pourraient fortement limiter la diffusion du progres génétique des troupeaux et réduire les performances globales de l’élevage. Des perturbations épigénétiques pourraient être le socle soutenant toutes les modifications phénotypiques observées après un stress thermique. Le projet vise à étudier les effets d’un stress thermique en environnement contrôlé, appliqué durant le dernier mois de gestation chez la brebis, sur la construction du phénotype chez les descandants et leur performance à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier les effets du déreglement climatique (et plus particulièrement l’intensification des phases de pics de chaleurs) sur la construction du phénotype de la descendance et sur leurs performances de reproduction à l’âge adulte. Les bénéfices attendus à court termes porteront sur la caractérisation des effets physiologiques et moléculaires d’un choc thermique subi in utero sur le devenir des animaux afin d’améliorer nos connaissances scientifiques sur les mécanismes épigénétiques qui soutendent la construction des phénotypes. A long terme, ce projet devrait fournir des bases de compréhension sur les mécanismes d’adaptation des animaux aux changements environnementaux, ce qui permettrait de développer des leviers positifs attenuant les effets déletères d’un stress thermique.

Procédures

3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). Pour un sous groupe de 20 brebis une biopsie de l’endomètre et du placenta sur animal vigile sera réalisée. Nous profiterons juste apres la mise-bas de l’ouverture du col pour réaliser ce prélèvement. A ce stade physiologique, les voies femelles étant dilatées afin de permettre le passage du nouveau-né, le prélèvement pourra se faire sur animal vigile sans sédation ou anesthésie locomotrice. Concernant les descandants, 5 prises de sang seront effectuées (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois). Tous ces actes ont une durée limitée à de quelques secondes (prise de sang) à quelques minutes (biopsie).

Impact sur les animaux

Une hyperthermie sur les brebis mis en condition de vague de chaleur pourrait survenir, avec des difficultés de régulation de température corporel et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Les femelles biopsée pourraient ressentir une douleur liée au prélèvement. Enfin, le stress generé par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuissance supplémentaire.

Devenir

Les mères ainsi que leurs filles pourront rejoindre leur troupeau d’origine afin de contribuer au renouvellement des générations. Seuls les déscandants mâles seront abatus à la fin de l’expériementation afin de collecter les organes necessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du déreglement climatique. L’etude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’y a pas de remplacement possible puisque l’objectif du projet est d’étudier les impacts d’un stress thermique subit in utero sur le développement embryonnaire, la construction du phénotype et les performances de reproduction à l’âge adulte. Aucune étude ne permet d’ores et déjà de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. Nous n’avons donc pas de données fiables pour remplacer tout ou partie des animaux necessaires. De plus les développements récents d’organoïdes ou de cultures cellulaires 2D ne permettent pas de prendre en compte toute la compléxité d’un organisme biologique [placenta – fœtus – organes spécifiques] ayant subit un stress thermique.

Réduction

Aucune étude ne permet de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. En revanche, concernant le contenu spermatique en petits ARN non codants, des études chez le bovin soulignent une variabilité individuelle sans condition de stress appliquée. C’est pourquoi le nombre d’individus souhaités par groupe de stress permettant de tenir compte de la variabilité individuelle et de visualiser un effet potentiel du stress envisagé est compris entre 12 et 15 pour les deux sexes. Afin de les obtenir, 60 brebis gestantes seront utilisées dans le projet (30 pour le groupe « contrôle » et 30 pour le groupe « stress thermique »). Ces Brebis, porteuses de singleton, donneront naissance au mieux à 60 descendants en sexe-ratio équilibré, soit 15 males et 15 femelles par groupe. Ce nombre permettra de tenir compte de certains aléas de mortalité et d’entrainement à la récolte de semence. Nous choisirons les méthodes d'analyse statistique adaptés pour obtenir des résultats fiables et interprétables.

Raffinement

Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Un enrichissement adapté sera proposé dans chaque cellule (pour tous les lots) : des miroirs, cônes et un filet de foin suspendu. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Les prises de sang pourraient être alternativement faites à la veine jugulaire droite et gauche pour limiter le risque de phlébite. Un baume décongestionnant pourrait être appliqué en cas de lésions ou de thrombose. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera assurée. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisi en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et proportion des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Les premiers animaux utilisés seront les brebis Ile-de-France gestantes. Le second lot d’animaux sera constitué des agneaux (mâles et femelles) obtenus après la mise-bas. Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

Toutes tuées pour que les tumeurs soient prélevées et l'efficacité du traitement vérifiée, 1 000 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc et 640 dans le pancréas lui-même, 880 subissent deux à trois injections d'un produit d'imagerie suivies de 15 minutes d'anesthésie, environ 1 000 une injection de vecteur viral dans la tumeur et 600 une injection de lymphocytes. La croissance des tumeurs peut entraîner suppurations, nécroses, anémie légère et une perte de poids allant jusqu'à 20 % du poids maximal. Le porteur décrit les gènes thérapeutiques comme un "cheval de Troie" censé casser le "bouclier" du microenvironnement tumoral, et conclut que le recours au modèle in vivo est "indispensable" parce qu'aucune culture cellulaire ne reconstitue ces interactions.

Objectifs

Le cancer du pancréas est l’un des cancers les plus difficiles à traiter, avec un pronostic souvent très mauvais. Parmi les approches prometteuses, il y a l’immunothérapie cellulaire, une technique qui consiste à "reprogrammer" les cellules immunitaires du patient pour qu'elles puissent mieux attaquer la tumeur. Cette méthode a déjà donné d'excellents résultats contre certains cancers du sang. Mais pour le cancer du pancréas, c’est beaucoup plus compliqué. En effet, la tumeur s'entoure d'un microenvironnement (comme un bouclier) qui bloque à la fois les traitements et le système immunitaire du patient. Résultat : même les cellules immunitaires modifiées n’arrivent pas à atteindre leur cible. L'idée de notre projet est de casser ce bouclier protecteur. Pour cela, nous proposons une thérapie génique capable de transformer la tumeur de l’intérieur. Comment ? En utilisant des virus modifiés qui vont aller spécifiquement infecter les cellules cancéreuses pour y introduire des gènes thérapeutiques. Ces gènes agiront comme un cheval de Troie : ils seront portés par les cellules tumorales elles-mêmes et rendront la tumeur plus vulnérable aux attaques du système immunitaire et aux traitements. On ne cherche pas à toucher toutes les cellules tumorales (ce qui est très difficile), mais juste assez pour changer l’environnement local de la tumeur. Cela suffira pour attirer les cellules immunitaires tueuses et ouvrir la voie à l’immunothérapie. En résumé, on veut utiliser la thérapie génique pour affaiblir la tumeur de l’intérieur et permettre au système immunitaire de reprendre le dessus.

Bénéfices attendus

Les nouveaux traitements contre le cancer ne sont pas très nombreux, et ceux qui semblent prometteurs ne fonctionnent malheureusement pas pour tous les types de cancer. Le cancer du pancréas est particulièrement difficile à traiter. Seules certaines tumeurs opérables peuvent être guéries. Pour les autres, les options restent très limitées. Ce projet propose une nouvelle approche thérapeutique innovante. La thérapie génique, qui consiste à modifier génétiquement certaines cellules pour traiter une maladie, est encore très peu utilisée contre le cancer

Procédures

Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : durée 10 minutes – 1 fois par animal, 360 animaux. Greffe de cellules tumorales dans l’organe d’origine afin de reproduire plus fidèlement la tumeur , et éventuellement injection de treatment experimental : durée 10 minutes – 640 animaux. Injection de une substance permettant l'imagerie : durée 1 minute – 2 à 3 fois par animal, 880 animaux. Anesthésie gazeuse durant l’imagerie : durée 15 minutes – 2 à 3 fois par animal, 880 animaux. Injection de LV (vecteur dérivé d’un virus inactif) dans la tumeur : durée 2 minutes – 1 fois par animal, ~1 000 animaux. Injection de lymphocytes par voie intraveineuse : durée 2 minutes – 1 fois par animal, ~600 animaux.

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales et la croissance des tumeurs peuvent entraîner une altération de l’état général des animaux. Certaines complications, telles que des suppurations, des nécroses ou une légère anémie, peuvent survenir. Une perte de poids pouvant atteindre 20 % du poids maximal est également possible. Signes cliniques rares : abdomen gonflé ou apparition de micrométastases.

Devenir

Nous voulons prélever les tumeurs induites afin de vérifier la bonne intégration du traitement expérimental, et son efficacité, qui implique une infusion de cellules immunitaires dans la tumeur. Pour cela, nous devons euthanasier les animaux.

Remplacement

Des tests sur des modèles cellulaires 2D et 3D in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos LVs (vecteurs dérivés d’un virus inactif) , aussi bien en termes de ciblage que de thérapie génique. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo est indispensable, car elle permet à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, recréant ainsi des conditions proches de la pathologie humaine. À ce jour, il reste impossible de reconstituer in vitro une tumeur avec toutes ses interactions complexes avec le microenvironnement.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot sera réduit au maximum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les experimentations se feront graduellement afin de pouvoir calculer le nombre d'animaux nécessaires en s'aidant d'outils statistiques. Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront effectués pour générer des échantillons qui pourront être utilisés dans des études ultérieures afin d'optimiser les études et de réduire le nombre d'animaux en évitant la répétition d'expérimentations pour obtenir des échantillons supplémentaires.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. . Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des points limites ont été mis en place et seront appliqués

Choix des espèces

Nous choisissons la souris parce qu’elle partage l’essentiel de nos mécanismes biologiques, ce qui permet de recréer des cancers humains et murins pour tester rapidement de nouvelles thérapies. Les animaux seront utilisés adultes à 8 semaines de vie. En effet, les cancers modélisés sont des cancers de l'adulte.

Deux injections d'agents thérapeutiques, dont une dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis 30 minutes d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement terminal du foie : 960 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie d'entre elles est dépourvue de thymus, donc sans système immunitaire fonctionnel, pour recevoir des tumeurs humaines. Il s'agit d'occuper temporairement les voies hépatiques d'élimination avec une nanoparticule lipidique, afin qu'un médicament injecté circule plus longtemps dans le sang. Le porteur présente le suivi par imagerie sur animal vivant comme un moyen de réduire les effectifs, "sans avoir à les sacrifier à chaque étape", alors que les 960 souris sont toutes tuées pour prélèvement du foie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) et de réduire leur toxicité en modifiant la biodistribution des agents thérapeutiques grâce à leur association à une nanoparticule lipidique. La circulation dans le sang des médicaments est essentielle à l’efficacité thérapeutique. Pour atteindre sa concentration maximale dans le tissu cible, comme la tumeur en oncologie, les médicaments doivent surmonter un obstacle biologique de taille : la clairance hépatique. Le rôle du foie est de filtrer le sang afin d’éliminer les composés toxiques, dont un grand nombre de médicaments. Ainsi, de nombreux candidats thérapeutiques prometteurs administrés par voie IV présentent une circulation dans le sang faible, qui se traduit par une accumulation faible ou nulle dans le tissu cible et par une toxicité hors cible potentiellement élevée. Par conséquent, si beaucoup de médicaments présentent un potentiel à l’échelle du laboratoire, la plupart n’ont pas d’avenir clinique. Afin de surmonter cet obstacle, une nanoparticule lipidique a été développée pour augmenter de façon temporaire la biodisponibilité des thérapies administrées par voie IV et pour minimiser le risque d’effets en dehors de la cible. La nanoparticule lipidique est destinée à occuper temporairement les voies hépatiques responsables de la clairance thérapeutique, afin de permettre à un médicament donné de plus fortement s’accumuler dans les tissus cibles pour augmenter son efficacité, tout en minimisant le risque de toxicité hépatique chez le patient. Cette étude a pour but de mieux comprendre comment certains médicaments se répartissent dans le foie après injection. Elle fait suite à une première recherche ayant montré que plusieurs de ces médicaments ont tendance à s’accumuler dans cet organe. Pour cela, ces médicaments vont être testés, seuls ou associés à la nanoparticule lipidique, sur des souris en bonne santé. L’objectif est d’observer comment les médicaments se répartissent entre les différents types de cellules du foie, et de voir si l’ajout de la nanoparticule lipidique permet de modifier cette répartition.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment une nanoparticule lipidique peut influencer la manière dont certains médicaments se répartissent dans le corps, en particulier dans le foie. À court terme, ces recherches permettront de faire progresser les connaissances sur les nanomédicaments et sur la façon dont ils sont éliminés par l’organisme. Elles aideront aussi à améliorer la composition des médicaments pour qu’ils soient plus efficaces et mieux tolérés. À plus long terme, la nanoparticule testée dans ce projet pourrait lever l’un des principaux obstacles qui empêchent certains traitements prometteurs d’être utilisés chez l’humain. En réduisant l’élimination rapide des médicaments par le foie, cette technologie pourrait renforcer l’efficacité de traitements déjà disponibles, et ainsi offrir de meilleurs résultats aux patients.

Procédures

Deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Prises d’images pendant 30 minutes sous anesthésie. Le prélèvement du foie est terminal et réalisé sous anesthésie générale terminale (5 min).

Impact sur les animaux

L’injection des composés thérapeutiques peuvent induire un stress bref qui diminue lorsque les souris retrouvent leur cage et leurs congénères. L’imagerie à fluorescence nécessite une anesthésie gazeuse courte qui peut entrainer dans de très rares cas un ralentissement du rythme cardiaque et de la respiration de quelques minutes (2-3 min) n’entrainant pas la mort de l’animal. Le prélèvement du foie est réalisé sous anesthésie générale et analgésie (5 min).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement du foie.

Remplacement

L’utilisation de souris dans ce projet se justifie par le besoin d’étudier la manière dont les médicaments se répartissent et sont éliminés dans un organisme vivant complet. Les tests réalisés en laboratoire sur des cellules (in vitro) sont utiles au début, mais ils ne peuvent pas reproduire la complexité du corps entier, comme la circulation du sang, le fonctionnement du foie ou les réactions du système immunitaire. Certaines étapes essentielles, comme l’élimination des médicaments par le foie ou leur distribution dans les différents types de cellules, ne peuvent être correctement observées que chez un animal vivant. Le modèle de la souris, bien connu des chercheurs et largement utilisé dans le monde, permet donc d’obtenir des résultats fiables et utiles pour mieux comprendre comment les traitements agissent dans le corps.

Réduction

Le nombre de souris utilisé dans cette étude a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le nombre d’animaux. Ce calcul permet de s’assurer que les différences observées entre les groupes sont réellement dues au traitement testé, et non au hasard. Il s’appuie sur des méthodes statistiques reconnues, utilisant des formules ou des logiciels spécialisés. Par ailleurs, les nanoparticules utilisées dans l’étude sont rendues visibles grâce à des marqueurs fluorescents. Cela permet de suivre leur évolution dans l’organisme des animaux vivants à l’aide d’images, sans avoir à les sacrifier à chaque étape. Cette méthode permet donc de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Pour garantir le bien-être des animaux, une période d’adaptation d’au moins 5 jours sera respectée avant le début des expérimentations. Pendant cette phase et tout au long de l’étude, les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans un environnement confortable et contrôlé (température, humidité, lumière, qualité de l’air), avec un système d’alarme pour signaler tout problème. Les animaux seront hebergés par petits groupes, selon les normes en vigueur, et les mêmes groupes seront maintenus autant que possible pour éviter tout stress lié aux changements. Des objets adaptés (comme des abris en carton ou des matériaux pour creuser ou s’abriter) seront ajoutés dans les cages pour enrichir leur environnement et favoriser leur comportement naturel. Les animaux seront surveillés chaque jour par du personnel formé, et un vétérinaire sera présent régulièrement pour s’assurer de leur bon état de santé. Des soins d’urgence seront également disponibles à tout moment, y compris les week-ends et jours fériés. Si un animal montre des signes de souffrance importants, il sera pris en charge rapidement et, si nécessaire, mis à mort pour lui éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées comme modèle préclinique pour étudier comment les traitements se répartissent dans l’organisme. Leur physiologie est bien connue, et il existe de nombreuses souches génétiquement définies, ce qui permet de suivre précisément l’effet des injections dans différents tissus. Deux types de souris seront utilisés dans ce projet : • Des souris qui possèdent un système immunitaire normal. Elles sont un modèle de référence pour étudier la pharmacologie. Elles permettront d’observer comment le système immunitaire peut influencer le traitement. • Des souris dépourvues de thymus et donc sans système immunitaire fonctionnel. Elles sont souvent utilisées pour tester l’efficacité de traitements contre des tumeurs humaines implantées chez la souris. Certaines des thérapies étudiées dans ce projet étant destinées à l’oncologie, ces souris permettront de vérifier l’efficacité et la distribution du traitement dans ce contexte particulier. En combinant ces deux modèles, il sera possible de mieux comprendre comment les traitements se comportent dans différents types d’organismes et s’assurer que les résultats sont fiables et transposables à des études d’efficacité. Les souris utilisées dans ce projet seront des adultes jeunes (entre 7 et 10 semaines), afin que leurs organes et leur système immunitaire soient pleinement développés. Cela permet d’étudier plus précisément comment les traitements se répartissent dans le foie.

Les souris utilisées sont des NOD Scid, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, condition posée par le porteur pour que des cellules tumorales prostatiques humaines s'implantent et se disséminent. 75 souris sont ainsi exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour collecte des tissus. Chacune reçoit une greffe de cellules PC3-GFP par ouverture de la cavité péritonéale sur cinq à six millimètres, puis un traitement de 120 secondes par torche à plasma froid par la même voie d'entrée. Le porteur écrit que les lots déjà traités n'ont présenté "aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables", tout en reconnaissant que l'implantation de cellules tumorales peut être associée à des douleurs et altérer l'état sanitaire de l'animal.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.