Procédures modérées

20 chiennes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trois IRM de deux heures sous anesthésie générale, un prélèvement de globules blancs de trois heures sous anesthésie générale, 27 prises de sang à l'état vigile, six échographies cardiaques et six enregistrements de l'électrocardiogramme portés de douze à soixante-douze heures. Le porteur annonce une perte d'appétit, une journée de fièvre avec abattement, un risque de saignement de la vessie et un risque rare de relargage cytokinique, et prévoit d'interrompre les sorties en extérieur pendant une quinzaine de jours. Ces chiennes portent l'anomalie génétique de la myopathie de Duchenne et développent toutes une fibrose du cœur entre trois et neuf ans, ce que le porteur présente comme le seul modèle animal caractérisé pour les femmes porteuses de cette maladie.

Objectifs

En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisée est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T tueurs =sous-population de globule blanc) modifiées artificiellement pour cibler des marqueurs tumoraux spécifiques. Les globules blancs du patient sont isolés par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, puis modifiés ex vivo pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques, dont la fibrose myocardique qui accompagne de multiples maladies cardiaques. En particulier, les femmes qui peuvent transmettre la myopathie de Duchenne peuvent développer une fibrose myocardique. Il en est de même chez des chiennes qui portent une anomalie génétique dans le gène en cause dans la myopathie de Duchenne (dites "porteuses saines" car ne présentant pas d'anomalie clinique évidente) et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans le coeur de ces animaux. L'objectif de ce projet est de déterminer si le ciblage de ce marqueur par des cellules CAR-T permet de réduire la fibrose du coeur chez des chiennes porteuses de myopathie de Duchenne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept pré-clinique sur l'efficacité du ciblage d'un marqueur spécifique de la fibrose, pour réduire celle-ci dans un contexte de patiente porteuse de myopathie de Duchenne. Si cette stratégie s'avère efficace, cette étude ouvrira la voie à la possibilité d'utiliser ce marqueur comme une cible thérapeutique chez les patientes porteuses de myopathie de Duchenne, mais aussi chez des patients atteints de cardiomyopathies d'origines diverses dans lesquelles une fibrose cardiaque évolue et contribue à la dégradation de la fonction cardiaque.

Procédures

- Trois examens d'imagerie IRM sous anesthésie générale, durée approximative 2 heures/examen - Un prélèvement de globules blancs par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, sous anesthésie générale, durée approximative 3 heures - 27 prélèvements sanguins vigile, temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome. - Vigiles, les chiennes subiront également des examens cliniques, six échographies cardiaques (20 minutes) et six enregistrements de l'électrocardiogramme en "ambulatoire" (12 à 72 heures, équipement sans fil porté par le chien).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les chiennes au cours de ce projet sont de trois ordres : - Celles liées aux arythmies ventriculaires qui touchent ces animaux et qui pourraient conduire à une fibrillation ventriculaire et un arrêt cardiaque (événement rarissime) - Celles liées au protocole médicamenteux préparatoire qui a pour but de diminuer la quantité de globules blancs circulants pour permettre une meilleure efficacité des cellules CAR-T. Les principales nuisances induites sont une perte d'appétit transitoire en cours de traitement, qui répond à un traitement anti-vomitif et une journée de fièvre avec abattement associée à la baisse des globules blancs dans le sang, environ une semaine après le début du traitement. La formule sanguine et l’état général se normalisent ensuite en quelques jours. Par ailleurs, malgré les mesures préventives recommandées mises en œuvre, il ne peut être exclu qu’un épisode de cystite hémorragique (saignement de la vessie) puisse survenir, s’agissant d’une toxicité connue d’un des agents pharmacologiques utilisés - Celles liées à la survenue éventuelle mais rare d'un syndrome de relargage cytokinique (état inflammatoire aigu), complication connue chez l'Homme des traitements par cellules CAR-T. - Celles liées au stress des anesthésies générales, prélèvements sanguins et examens effectués.

Devenir

Les animaux seront mis à mort du fait de la nécessité de réaliser des prélèvements larges de tissus incluant l'organe cible du traitement qui est le coeur

Remplacement

Ce projet vise à évaluer une stratégie de thérapie anti-fibrose, ayant recours à une injection systémique de cellules du système immunitaire modifiées pour se diriger contre un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans le coeur. Il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" se dirigent bien contre d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Ces tests de fonctionalité in vitro sont renouvelés à chaque production de cellules pour valider la qualité du produit de thérapie cellulaire administré aux animaux traités. Reste à déterminer si dans le contexte d'un organisme entier, les cellules parviennent bien à migrer dans le tissu cible, à atteindre les zones de fibrose et les détruire.

Réduction

Un effectif de 10 chiennes traitées par des cellules CAR-T et 10 chiennes recevant un placebo a été sélectionné car une modélisation statistique, effectuée dans le logiciel Statistica, sur la base de données déjà disponibles dans le modèle utilisé dans ce projet, a montré qu'il s'agit de l'effectif nécessaire et suffisant pour démontrer la normalisation, dans le groupe traité, d'un paramètre clé d'imagerie cardiaque reflétant la fibrose.

Raffinement

Les chiennes seront évaluées à l'aide de mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Elles seront hébergées par groupes de deux, de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Elles seront sorties quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant une quinzaine de jours entourant le protocole de préparation et l'injection de cellules, les sorties devront être interrompues pour les protéger d'éventuelles infections opportunistes. Du temps supplémentaire sera passé avec les chiennes afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Elles bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur pathologie cardiaque ou au projet. Des points limites précis, adaptés à ce contexte pathologique, et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole médicamenteux préparatoire ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.

Choix des espèces

Cette étape préclinique de validation d'une approche thérapeutique anti-fibrose en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit actuellement du seul modèle animal caractérisé pour les femmes porteuses de myopathies de Duchenne ou Becker, et qui reproduit fidèlement la maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose, et de l'expression du marqueur de fibrose ciblé. Par ailleurs, l'espèce chien permet la mise en oeuvre des mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T (prélèvement des lymphocytes T par cytaphérèse et autogreffe en particulier). Les chiennes seront des adultes de 3 à 9 ans, tranche d'âge au cours de laquelle une fibrose myocardique est présente de manière systématique chez ces animaux.

795 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une chirurgie cérébrale de vingt à trente minutes ou une injection intracérébrale. Deux semaines de tests suivent, trois épreuves de coordination motrice de cinq minutes et une épreuve de motricité et d'anxiété de trente à soixante minutes. Le porteur prévoit que la suppression du transporteur étudié provoque chez les souris des troubles de la mémoire, de l'anxiété et une baisse de la psychomotricité, tout en écrivant qu'aucun effet indésirable majeur n'est attendu. L'objet du projet est de comprendre comment un transporteur de lactate participe à la communication entre neurones, les retombées pour les malades restant énoncées comme une possibilité.

Objectifs

Notre cerveau est fait de cellules appelées neurones, qui communiquent entre elles grâce à des messages chimiques. Ces messages, appelés neurotransmetteurs, sont fabriqués dans une partie du neurone et doivent voyager jusqu’à l’extrémité du neurone pour passer le message au suivant. Pour cela, ils sont transportés le long d’un “fil” appelé axone, grâce à de petits moteurs qui ont besoin d’énergie pour avancer. Nous avons découvert qu’une protéine appelée huntingtine, aide à organiser ce transport en contrôlant les moteurs et en aidant à produire l’énergie nécessaire, à partir du sucre. Cette énergie n’est pas produite par la voie métabolique canonique comme on le pensait, mais directement sur les petites bulles (vésicules) qui transportent les messages. Pendant ce transport, un "déchet" métabolique est fabriqué, et nous avons trouvé qu’il existe un transporteur spécial, qui aide à l'incorporer dans les vésicules avec les neurotransmetteurs. En bloquant ce transporteur, nous avons vu que le transport des messages et la communication entre neurones sont perturbés. Notre projet cherche donc à comprendre comment ce transporteur aide les neurones à bien communiquer.

Bénéfices attendus

Dans notre cerveau, certaines protéines aident les neurones à survivre et à bien fonctionner. Pour que ces protéines arrivent là où elles sont utiles, elles voyagent à l’intérieur des neurones grâce à des petits moteurs et à de l’énergie produite à partir du sucre. Nous avons découvert que l’acide lactique, fabriqué pendant cette production d’énergie, est très important pour que ce transport fonctionne bien et pour que les neurones puissent communiquer entre eux. Notre projet cherche à comprendre comment l’acide lactique circule et aide les neurones, surtout dans les parties du cerveau qui contrôlent le mouvement et la mémoire. Cela pourrait nous aider à mieux comprendre certaines maladies du cerveau et à trouver de nouveaux traitements.

Procédures

Les souris, anesthésiées, seront soumises à une chirurgie du cerveau de 20-30 minutes par souris, ou à une injection de 5 minutes par souris. De plus, des études comportementales, réparties sur une durée de deux semaines, seront effectuées pour évaluer l'effet de la suppression du transporteur sur la coordination motrice (3 tests de 5 minutes) et sur la motricité (globale) et l'anxiété avec un test d'une durée de 30 à 60 minutes.

Impact sur les animaux

Nous pouvons identifier plusieurs nuisances potentiellement attendues sur les animaux lors de l’expérimentation : 1) Un stress léger lors de la manipulation pour les injections et la chirurgie, pendant lesquelles les animaux seront anesthésiés. 2) Un risque de douleur post-opératoire ou post-injection. 3) Suite aux injections, nous pourrions voir apparaître certaines nuisances chez les animaux, qui sont difficilement identifiables à ce stade de l'étude. Nous pensons que cela pourrait provoquer des problèmes de mémoires voire de l'anxiété et une possible diminution de la psychomotricité. 4) Les tests comportementaux réalisés sont susceptibles de générer un stress chez nos animaux.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études biologiques qui permettront de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Le projet analyse des réseaux neuronaux complexes. Il nous est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques. Nos résultats sur des cultures de neurones nous ont déjà permis de valider les constructions virales et donc de réduire les nombre d'animaux testés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué précédemment, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et des matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec leurs nids et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Nous laisserons aux souris au moins une semaine d'acclimatation avant de commencer les expériences. Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. 1) Pour les individus qui vont subir une chirurgie : afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, nous injecterons un analgésique avant la procédure chirurgicale, ensuite, toutes les 24 heures si l’animal présente des signes de douleur. Ces chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale volatile en maintenant une température constante, les yeux sont protégés de la dessiccation et un anesthésique local est injecté avant incision. Suite à la chirurgie, les souris sont placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. 2) Pour les injections les animaux seront anesthésiés une première fois pour les endormir, et seront ensuite maintenus sous anesthésie volatile pendant la durée de l'injection pour leur éviter du stress. Dans la littérature, aucun signe de douleur lié directement à ce type d'injection n'a pu être observé. Des points limites suffisamment précoces et adaptés ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en place et l’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort.

Choix des espèces

Seule la souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement, d'un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle préclinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. L'utilisation de ce modèle est indispensable pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous utiliserons des animaux de 4 à 36 semaines. En effet, nous visons à étudier le rôle de cette protéine; spécifiquement dans les neurones mais aussi dans un ensemble complexe : un cerveau pleinement développé et mature.

Hébergées seules pendant toute la durée des procédures, les souris reçoivent treize gavages de matière fécale et sont isolées une heure chaque matin pour qu'on récupère leurs crottes. 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau, de l'intestin et du foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit d'établir si le microbiote intestinal cause la perte de contrôle de la consommation d'alcool, l'anxiété du sevrage et la rechute, et le porteur reconnaît que le gavage peut provoquer une fausse route ou une lésion mécanique. Il annonce une heure de tests comportementaux au total par animal pour évaluer le comportement lié à l'alcool, sans préciser lesquels.

Objectifs

Le rôle causal du microbiote intestinal (MI) dans la maladie alcoolique du foie a été démontré et est actuellement une piste thérapeutique pour améliorer la prise en charge des patients. En revanche, il existe peu de données sur le rôle du MI dans l’addiction à l’alcool. Néanmoins quelques publications et données préliminaires permettent de poser l’hypothèse que le MI a un rôle dans l’addiction à l’alcool. En particulier, des données obtenues par les déposants ont montré qu’il y a un MI spécifique lié à l’addiction chez les souris. Notre objectif est donc de mieux comprendre le rôle de ce MI et statuer sur son rôle causal. L’addiction à l’alcool ou trouble de l’usage de l’alcool est un trouble chronique récidivant qui englobe : (1) une perte de contrôle de la consommation d’alcool, (2) la compulsion, caractérisée par une consommation d'alcool en dépit des conséquences néfastes et au détriment d'autres occupations, (3) la dépendance, caractérisée par le désir irrépressible de boire de l’alcool, (4) les symptômes du sevrage après l'abstinence mimant un syndrome d'anxiété, (5) la rechute après l’abstinence. Dans cette étude, nous allons nous focaliser sur le rôle causal du MI dans la consommation d’alcool (1) l’anxiété liée au sevrage (4) et la rechute (5).

Bénéfices attendus

Cette étude examinera le rôle causal du microbiote intestinal sur différents symptômes de l’addiction à l’alcool, la consommation d’alcool, le syndrome d’anxiété lié au sevrage et la rechute post-abstinence. Les résultats de cette étude permettront de définir le rôle causal du microbiote intestinal dans les différents symptômes liés au mésusage de la consommation d’alcool qui concernent pour ce projet son rôle dans la perte de contrôle vis-à-vis de la consommation d’alcool, l’anxiété qui est liée au manque d’alcool durant la période de sevrage et la rechute. Cela permettra de proposer pour des études ultérieures de moduler le microbiote intestinal, par exemple, par des prébiotiques ou probiotiques pour restreindre ces symptômes.

Procédures

Nous effectuerons des recueils fécaux (3 crottes) sur animal vigil sur toutes les souris. Le matin (9h) les animaux seront isolés durant 1h maximum, pour la récupération des fèces (3 crottes). Les souris sont ensuite remises dans leurs cages initiales. Les souris recevront des gavages récurrents, chaque gavage dure environ 20 secondes (contention comprise), au total 13 gavages seront effectués sur un même animal. Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux afin d’évaluer le comportement lié à la consommation d’alcool. Chacun des tests sera réalisé une fois sur chaque animal. L’ensemble des tests comportementaux sera au total de 1 heure maximum pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont modérées dans la mesure où les souris sont hébergées seules durant toutes les procédures. Le gavage pour la transplantation de microbiote fécal sera fait par des chercheurs expérimentés, réduisant le risque d’une fausse route ou de lésion mécanique. Néanmoins, bien que le geste technique soit maitrisé par les expérimentateurs, il peut y avoir exceptionnellement des lésions mécaniques. Les tests comportementaux, bien qu’indolores, entraînent une sortie du cadre familier, ce qui peut provoquer un inconfort passager (anxiété légère, agitation, baisse d’exploration ou d’appétit). Ces nuisances sont transitoires et limitées.

Devenir

Au terme des procédures, les souris seront euthanasiés pour analyse post mortem des cerveaux, intestins, foie et le séquençage du microbiote.

Remplacement

Dans l’état actuel des connaissances modéliser in vitro ou in silico les mécanismes biologiques des troubles de l’usage d’alcool n’est pas possible. Dans le cadre de ce projet, il s’agit d’évaluer une consommation d’alcool dépendante du microbiote intestinal et d’analyser l’état de la barrière digestive dont le système nerveux intestinal et d’analyser l’impact de ce microbiote intestinal sur des dysfonctions d’organes tels que le foie et le cerveau. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier les interactions entre ces différents organes, le microbiote intestinal et le comportement lié à l’usage d’alcool.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique, en se basant sur la littérature précédente dans le même domaine. L'élément le plus important pour la réduction est l'utilisation des mêmes animaux est d’étudier de manière séquentielle dans les procédures, le trouble de l’usage à l’alcool, le syndrome d’anxiété lié au sevrage et la rechute après abstinence.

Raffinement

Au cours des semaines une surveillance quotidienne sera entreprise pour veiller au bien-être des animaux (quantité de boisson et de nourriture adéquats). Un suivi du poids des animaux, de la qualité de la fourrure des animaux seront pratiqués de façon hebdomadaire la quantité de boisson ingérée eau et alcool sera mesurée tous les jours. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans le trouble de l’usage d’alcool sont proches de ceux observés chez l’homme. Cette espèce est largement utilisé dans la littérature comme modèle de consommation d’alcool. L’évaluation pour l’addiction à l’alcool et les tests comportementaux seront effectués sur des souris adultes (à partir de 6 semaines), puisque nous nous intéressons à cette pathologie chez l’adulte.

Enfermées quatre jours dans des cages de 330 cm² sans possibilité de se suspendre, des souris reçoivent des chimiothérapies utilisées contre le cancer du sein, par injections espacées d'une à trois semaines. 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent des tests de force et de fonction musculaire ainsi que des tests d'effort maximal de dix à vingt minutes, avant et après le traitement. Le porteur décrit la réduction de l'espace comme une "altération mineure du bien-être animal" à "faible nuisance physiologique", alors que le projet l'organise pour aggraver la fonte musculaire provoquée par la chimiothérapie.

Objectifs

La chimiothérapie utilisée pour traiter le cancer du sein précoce entraîne de nombreux effets secondaires sur le muscle squelettique, affectant à la fois sa quantité et sa qualité. Les patientes traitées présentent diverses altérations musculaires, comme une atrophie, qui contribuent à la diminution des capacités fonctionnelles. Ces altérations, observées après un traitement par chimiothérapie, varient en fonction de la molécule utilisée. Par ailleurs, la réduction de l’activité physique, fréquemment observée chez les patientes, aggrave probablement ces altérations musculaires. En effet, la diminution des contraintes mécaniques et métaboliques exercées sur les muscles entraîne des effets similaires à ceux induits par la chimiothérapie. L'interaction entre ces deux facteurs reste difficile à dissocier chez la patiente, ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal. À l'inverse, l’exercice, qui augmente les stimuli mécaniques et métaboliques, pourrait prévenir ces altérations, bien que ces bénéfices n’aient été observés que chez des sujets sains avec des preuves scientifiques robustes. Cependant, les effets aigus, chroniques et différés de l'exercice dans le contexte de l'atrophie musculaire induite par la chimiothérapie demeurent largement méconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier, dans un modèle murin, l'impact de la modulation de l’activité physique sur l’atrophie musculaire induite par la chimiothérapie. L’étude 1 caractérisera les effets combinés de la réduction de l’activité physique et des chimiothérapies sur les altérations musculaires, tandis que l’étude 2 explorera les effets aigus, chroniques et différés de l’exercice sur ces altérations. MODIFICATION : PLUS PRECISEMENT, LE TURNOVER PROTEIQUE, QUI COMPREND LA SYNTHESE ET LA DEGRADATION PROTEIQUE), SERONT ETUDIES AFIN D’AVOIR DE COMPRENDRE LES MECANISMES QUI REGULENT LA MASSE MUSCULAIRE.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples au niveau fondamental et au niveau de l’application clinique possible. Tout d’abord, la caractérisation de l’interaction entre la réduction du niveau d’activité physique et la chimiothérapie sur les altérations musculaires permettra de proposer un modèle murin plus proche de la réalité clinique. En effet, étant donné que les patientes atteintes d’un cancer du sein ont une réduction de leur niveau d’activité physique après l’administration de chimiothérapie, il est probable que cette réduction, induite dans le modèle murin, exacerbe les effets de la chimiothérapie sur le tissu musculaire. D’autre part, l’étude des effets aigus, chroniques et différés de l’exercice permettra d’un point de vue fondamental de caractériser les voies de signalisation cellulaires sous-jacentes et d’un point de vue clinique d’adapter la prise en charge des patientes. En effet, nous pensons que de manière aigue, l’exercice pourrait prévenir une partie des altérations musculaires. Si nous montrons ces bénéfices, cela aboutira à une preuve de concept et un changement de prise en charge clinique. Il sera alors recommandé de pratiquer de l’exercice juste avant l’administration de chaque dose de chimiothérapie. Enfin, la caractérisation des effets différés de l’exercice et de la chimiothérapie permettra d’indiquer aux patientes si la pratique d’exercice spécifique doit se poursuivre au-delà du traitement.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous allons administrer des traitements de chimiothérapies. Pour l'étude avec administration aigu : une injection sur animal vigile, d'une durée de quelques secondes, sera effectuée sur les animaux. Lorsque les chimiothérapies seront administrées par injection de manière chronique, celles-ci seront espacées de 1 à 3 semaines selon le type de molécule administrée. Pour répondre aux questions scientifiques, les souris de l’étude avec administration aigue seront placées dans des cages individuelles, tandis que celles du groupe "réduction d’activité" seront hébergées dans des cages de dimensions réduites (330 cm², sans possibilité de suspension). la durée de ce maintien cage individuelle avec ou non réduction de la surface au sol disponible sera de 4 jours. Deux tests de force et de fonction musculaire seront réalisés, pour une durée inférieure à 5 minutes. Ces tests seront effectués avant et 4 jours après l’administration de la chimiothérapie dans le cadre des expérimentations aiguës, ou avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie pour les expérimentations chroniques et différées. Dans le cadre des expérimentations chroniques et différées, des tests d’effort maximaux seront réalisés, d’une durée de 10 à 20 minutes, avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie. MODIFICATION : POUR L’ENSEMBLE DES EXPERIMENTATIONS, UNE INJECTION D'UNE MOLECULE PERMETTANT DE MESURER LES FLUX DE PROTEINES DE 1 A 2 SECONDES SERA REALISEE SUR ANIMAL VIGILE.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l'administration des chimiothérapies entraîne une douleur légère à modérée au site d'injection, de courte durée MODIFICATION : ET PEUT ENTRAINER DES PERTES DE POIDS. La répétition des injections, bien qu’alternées entre les côtés injectés et espacées d’au minimum 1 semaine, pourrait induire une légère induration locale et un stress modéré lié à la contention, d’intensité croissante avec le nombre de manipulations. Les manipulations répétées pour les séances d’exercice et les évaluations (force, fonction musculaire et vitesse maximale à l'exercice) induisent un stress modéré, de durée variable selon la fréquence des manipulations. Dans l’étude 1, le placement des animaux dans des cages individuelles pendant une courte durée entraîne une altération mineure du bien-être animal, sans impact significatif sur l’anxiété ou les capacités cognitives. Le placement en cage individuelle sera limité à 4 jours, réduisant ainsi son impact potentiel. Pour le groupe de réduction d’activité, le placement dans des cages de dimensions réduites (330 cm² sans possibilité de suspension) entraîne une réduction des opportunités de mouvement, avec une faible nuisance physiologique et une intensité limitée sur le bien-être, en accord avec les études précédentes.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, il n’existe pas à ce jour un modèle in vitro permettant de réduire le niveau d’activité physique et les modèles d’électrostimulation utilisés pour mimer l’exercice sont incomplets. De plus, pour comprendre les aspects fonctionnels (force et fonction musculaire), le recours à un modèle in vivo est nécessaire.

Réduction

L'équipe de recherche bénéficie de l’expérience et de l’expertise nécessaire pour permettre la mise en place d’expérimentations de qualité avec un nombre de souris réduit au minimum mais suffisant pour les analyses statistiques. Pour rappel, l’étude 1 vise à caractériser la contribution de la réduction du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par une administration de chimiothérapie. Pour calculer mathématiquement le nombre d'animaux par groupe, le critère de jugement principal sest basé sur le degré d’atrophie mesuré au niveau histologique par la surface de section des fibres musculaires encore appelé taille de l'effet. Sur la base de la littérature, la chimiothérapie peut en moyenne induire une atrophie de 17, 9%. Les résultats obtenus seront comparés grâce à des analyses statistiques adaptées permettant de mettre en évidence l'effet de la réduction d'activité physique sur l'atrophie induite par la chimiothérapie.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont maitrisées. Le bien-être des animaux sera constamment surveillé, et toute modification du comportement, telle que la manifestation de souffrance ou d'angoisse, sera immédiatement rapportée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour mettre en place les mesures correctives nécessaires. En cas de signes de douleurs, un avis au vétérinaire sera demandé.Avant le début des procédures, les animaux seront habitués aux conditions environnementales et manipulés pour les habituer aux expérimentateurs ainsi qu'à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Pour enrichir l’environnement des souris, les cages seront équipées de matériaux et d'objets adaptés pour leur permettre de nidifier et ronger. Les souris seront maintenues en groupes sociaux et, pour une des études, individualisées uniquement lorsque cela sera nécessaire pour atteindre les objectifs et la durée du placement en cage individuelle sera de durée très limitée (4j). Nous observerons attentivement la locomotion des souris afin de détecter tout signe de boitement ou de difficulté à se déplacer, ce qui pourrait indiquer des effets secondaires inattendus de la chimiothérapie. En parallèle, nous évaluerons régulièrement l'aspect général des animaux, incluant leur posture, leur tonus musculaire, leur comportement dans la cage, l'état de leur pelage et leur poids corporel via des grilles de scoring pour lesquelles des mesures correctives ainsi que des points limites ont été définies pour interrompre les procédures et limiter la souffrance animale. Pour exemples, en cas de signes de faiblesse musculaire, affectant potentiellement leur capacité à s'alimenter ou à se mouvoir, nous fournirons de la nourriture en gel en complément de leur régime alimentaire standard. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être mise en place.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles cellulaires est impossible pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l’Homme (99% d’identité de gènes avec l’Homme), tant au niveau histologique et cellulaire qu’au niveau du type de réponses aux traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique sur le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie utilisée chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Ainsi, pour se rapprocher de la réalité clinique, nous travaillerons sur des souris adultes (8 mois post natal environ). En effet, dans nos études cliniques, aucune patiente n’était âgée de moins de 26 ans. Conformément aux équivalences entre âge souris/humain, une souris de 8 mois correspond à un humain d’âge moyen.

Réutilisées d'une procédure à la suivante à six mois d'intervalle, 200 xénopes vont être exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans qu'aucune mise à mort ne soit déclarée à l'issue. Les femelles subissent des ovariectomies, répétées sur le même individu une fois les ovaires régénérés, ou jusqu'à trois injections d'hormone chorionique gonadotrope pour être forcées à pondre, et les mâles sont prélevés de leurs testicules. Le porteur décrit pourtant trois groupes de 140 femelles, 60 femelles et 60 mâles, soit 260 individus pour 200 déclarés. Il présente le xénope comme un "modèle alternatif" qui réduit le nombre de "vertébrés supérieurs" utilisés, dans un projet dont les points limites vont de la torpeur à l'érosion des doigts jusqu'à l'os et aux saignements des yeux.

Objectifs

Les cellules répondent aux stimuli en déclenchant des réseaux de signalisation qui définissent des propriétés permettant le développement précoce. Les stress externes (exemples : les métaux lourds, les médicaments chimiothérapeutiques) dérèglent la division cellulaire et la décision du destin cellulaire, favorisant des défauts de développement et diverses maladies. L'objectif central de cette recherche est de démêler les voies de signalisation critiques impliquées dans la méiose, la mitose et l'embryogenèse. Les travaux de recherche se concentrent sur l'interaction entre ces réseaux de signalisation et les ajout de sucres ou de fixation de sucres sur des molécules clefs. En utilisant Xenopus laevis comme modèle principal, le projet vise à identifier les principales cibles moléculaires et à déchiffrer les mécanismes d'action associés aux dérégulations conduisant à l'infertilité et à des pathologies telles que les parasitoses ou les cancers.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la compréhension fondamentale des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement et la reproduction, avec des retombées potentielles pour la recherche médicale et la santé humaine. Les résultats pourraient ainsi contribuer à la lutte contre l’infertilité, les maladies parasitaires et certains cancers.

Procédures

Nos procédures impliquent : - le prélèvement des ovaires ; - l'induction de l'ovulation par injection d'hormone chorionique gonadotrope, - la manipulation d'embryons obtenus par fécondation externe : les ovocytes sont obtenus par ponte (stimulation par injection d’hormone chorionique gonadotrope) et les spermatozoïdes sont obtenus après prélèvement des testicules. Les animaux ayant été injecté pour stimulation de la ponte ovarienne et les anmiaux subissant l'ovariectomie ne sont pas les mêmes.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées entraînent des douleurs légères de courte durée et ne provoquent pas d’effets indésirables notables à long terme. Les risques associés aux procédures chirurgicales seront évalués quotidiennement : torpeur, perte rapide de poids, tension de l’abdomen et gonflement, hémorragies cutanées. 

Devenir

La réalisation de l'induction par injection d'hormone chorionique gonadotrope peut être répétée, pour stimuler chez un même individu (6 mois d'intervalle, au minimum, et ce afin de permettre la régénération des ovaires). 3 stimulations sont considérés, au maximum, et dans l'optique de réduire le nombre des animaux utilisés. Les femelles ayant subi 3 prélèvements et 3 injections sont considérés peuvent être de nouveau considérées pour une procédure d'ovariectomie ou d'injection hormonale, en fonction de leur état et dans une perspective de réduction du nombre d'animaux utilisés. La décision est prise par le responsable du projet, en concertation avec les membres du SBEA.

Remplacement

Les cellules d’un organisme en développement partagent de nombreux points communs. Tandis que les cellules normales sont sédentaires, différenciées et se divisent peu, les cellules d’un organisme en développement prolifèrent rapidement (prolifération), se déplacent (migration) et possèdent la capacité à se différencier dans de nombreux types cellulaires (différenciation). Les limites inhérentes aux systèmes in vitro ne leur permet pas de récapituler de manière adéquate les événements moléculaires complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire d’un animal vivant : prolifération, différenciation et migration cellulaires.

Réduction

3 groupes sont prévus : - 1 groupe pour les ovariectomies, composé de 140 femelles. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'ovariectomie peut être répétée sur un même individu, après une intervalle d'au minimum six mois. - 1 groupe pour les inductions d'ovulation, composé de 60 femelles. Chaque femelle peut être stimulée 3 fois, à des intervalles de 6 mois, et ce afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. - 1 groupe pour le prélèvements des testicules, où 60 mâles sont nécessaires si l'on considère que chaque prélèvement sert à la réalisation de 4 fécondations in vitro. En conclusion, par année seront réalisées (1) au minimum 30 ovariectomies (60 maximum pour les années 2 à 5, en considérant le prélèvement chez des animaux déjà opérés une fois ; le total du nombre d'ovariectomie se portera donc à 30 pour la première année et 60 maximum chaque année suivante année 1), et (2) au maximum 48 fécondations in vitro (le prélèvement des testicules chez les mâles constituera le facteur limitant du nombre possible de fécondation). Les nombres d'animaux enrôlés dans les deux premiers groupes tiennent compte d'un pourcentage d'animaux qui ne donneront pas de pontes correctes. Ce modèle "alternatif " aux mammifères permet de raffiner les expérimentations qui pourront être faites sur des modèles de vertébrés inférieurs, et réduire ainsi le nombre de vertébrés supérieurs utilisés à des fins d’expérimentation animale. Les résultats obtenus dans ces modèles sont transposables chez les mammifères, dans la mesure où les mécanismes étudiés sont hautement conservés au cours de l'évolution. L'utilisation des amphibiens s'inscrit dans une démarche visant à diminuer le nombre de mammifères impliqués en expérimentation animale, et à diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les points limites sont définis chez les amphibiens, comme indiqués ci-dessous: - Postures d’effondrement, reconnaissables à l’exposition vers l’extérieur de la partie interne de la palmure des pattes postérieures - Perte rapide de poids, visible grâce à la formation de groupes d’animaux de tailles comparables voire identiques du cloaque ou rostre. - Torpeur et absence de réaction lorsque les animaux sont légèrement pincés - Abdomen tendu et gonflement - Hémorragies cutanées - Érosion des doigts avec les os effleurant la peau - Usure des mâchoires - Perforations de la peau sur la partie dorsale. - Saignements au niveau des yeux et des membranes. En présence d’un de ces points limites, l’euthanasie est considérée .

Choix des espèces

Les cellules d’un organisme en développement partagent de nombreux points communs. Tandis que les cellules normales sont sédentaires, différenciées et se divisent peu, les cellules d’un organisme en développement prolifèrent rapidement (prolifération), se déplacent (migration) et possèdent la capacité à se différencier dans de nombreux types cellulaires (différenciation). Les limites inhérentes aux systèmes in vitro ne leur permet pas de récapituler de manière adéquate les événements moléculaires complexes qui se produisent durant le développement embryonnaire d’un animal vivant : prolifération, différenciation et migration cellulaires. L’espèce Xenopus constitue un modèle largement caractérisé et établi pour l’étude des événements du développement embryonnaire depuis près d’un siècle. Les ovocytes, des œufs et les embryons de ces espèces offrent de nombreux avantages : développement externe, fortes concentrations de protéines, synchronisation physiologique, fortes capacités de synthèse protéique et forte conservation des mécanismes moléculaires de contrôle du cycle cellulaire. Ce modèle animal s’impose également comme un modèle de choix dans les approches de criblage pharmacologique ou toxicologiques. Ce modèle alternatif permet de raffiner les expérimentations qui pourront être faites sur des modèles de vertébrés inférieurs, et réduire ainsi le nombre de vertébrés supérieurs utilisés à des fins d’expérimentation animale. La régénération des ovaires chez cette espèce permet de réduire le nombre d'animaux femelles utilisés dans le protocole. Des individus des deux sexes sont nécessaires pour obtenir des oeufs fécondés et des embryons précoces.