Procédures modérées

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, chacune portant sur le dos une capsule où se nourrissent jusqu'à trente tiques. Elles reçoivent neuf gavages, puis trois à quatre prélèvements sanguins dont certains par ponction du sinus de l'œil, et passent cinq jours isolées en cage individuelle pour que leurs congénères ne mangent pas les tiques. Une partie d'entre elles est génétiquement modifiée pour ne pas produire le sucre alpha-Gal, molécule sur laquelle repose la piste vaccinale testée contre la maladie de Lyme. Le porteur explique qu'il faut cinq souris par groupe parce que la plupart des tiques se détachent ou meurent avant d'avoir fini leur repas, cinq à dix seulement arrivant gorgées par animal.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de tester une stratégie visant à protéger contre la maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia, transmise par les tiques. Cette approche consiste à administrer des bactéries non pathogènes (comme E. coli) modifiées pour exprimer une molécule appelée α-gal (un type de sucre). L'objectif est d'induire la production d'anticorps spécifiques contre α-gal, qui pourraient aider à prévenir l'infection par Borrelia. Les étapes spécifiques du projet sont les suivantes : Induction d'anticorps anti-α-gal : En administrant oralement ces bactéries aux animaux, nous espérons stimuler la production d'anticorps spécifiques (IgM et IgG) contre α-gal. Évaluation de la réponse immunitaire et de la protection contre l'infection : Nous mesurerons si la réponse immunitaire induite permet de réduire la charge de Borrelia dans les tiques parasitant les animaux immunisés. Analyse de la charge bactérienne de Borrelia : Après infestation par des tiques infectées, nous analyserons la présence de Borrelia dans les tiques et dans divers tissus des animaux immunisés. Étude de la mortalité et du comportement des tiques : Nous observerons le comportement alimentaire des tiques et leur taux de mortalité afin d'évaluer si l'immunisation a un impact sur leur cycle de vie. Ce projet vise à déterminer si cette méthode peut non seulement protéger contre l'infection, mais également avoir un effet sur les tiques elles-mêmes

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris seront immunisées par voie orale. Elles recevront 9 administrations et subiront un maximum de 3 prélèvements sanguins. Aux jours 0, 14, 30 et 51, des prélèvements sanguins seront effectués par ponction du sinus, en alternant les côtés à chaque fois, sous anesthésie locale et générale. Une ponction dure 8 minutes, anesthésie comprise. L'administration des probiotiques se fera par gavage. Cette méthode sera appliquée pendant 3 jours consécutifs, avec une pause de 5 jours entre chaque session, sur une période de 3 semaines, soit un total de 3 cycles (une fois par semaine). Chaque gavage durera entre 3 et 5 minutes, anesthésie comprise. Les jours 0,14 et 30 après l’administration orale, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; ce prélèvement durera environ 8 minutes, anesthésie comprise. Le prélèvement du jour 14 permettra de suivre la production normale des anticorps induits par l’immunisation. Le jour 51, après la dernière administration orale, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale. Après la fixation des capsules, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée de 5 jours. Elles bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement que dans les cages collectives. Et afin d’atténuer les effets de l’isolement, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés pour favoriser leur bien-être

Impact sur les animaux

Les tiques sont placées sur le dos des souris au sein d'une capsule. Les souris peuvent se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. les rongeurs sont un réservoir naturel de Borrelia spp, ce qui signifie qu'ils peuvent porter l'infection sans montrer de symptômes graves ou évidents, contribuant ainsi à la transmission de la bactérie par les tiques. D'autre part, l'immunisation peut causer une inflammation et une douleur au site d'injection, ou des réactions allergiques. Le prélèvement sanguin peut provoquer du stress lié à la manipulation ou de la douleur. Pour minimiser ces effets, les procédures sont effectuées sous anesthésie et un suivi constant est assuré afin de détecter tout symptôme indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l’effet protecteur des anticorps anti-α-gal contre Borrelia, en nourrissant des tiques sur des souris immunisées oralement avec différentes souches non pathogènes d'E. coli exprimant α-gal sur leur membrane. Les objectifs incluent l’évaluation de la survie des tiques et de la transmission de Borrelia, par ces dernières. Actuellement, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire avec précision la réponse immunitaire induite par voie orale chez les souris en réponse à une infection bactérienne. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle animal est essentiel pour analyser l’effet protecteur des anticorps et la colonisation des tiques par Borrelia.

Réduction

Chaque souris peut nourrir jusqu'à 30 tiques, mais entre 20 et 25 tiques se détachent sans avoir terminé leur repas ou meurent. En moyenne, nous pouvons obtenir 5 à 10 tiques gorgées par souris. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser 5 souris par groupe pour obtenir entre 25 et 50 tiques gorgées, ce qui est le nombre requis pour nos analyses. Le nombre total d'animaux a été calculé afin de minimiser leur utilisation tout en garantissant le nombre de tiques gorgées nécessaire à la réalisation des analyses.

Raffinement

Les souris seront logées par groupes de 5 dans des conditions standards, avec l'enrichissement nécessaire à leur bien-être, notamment des carrés de coton et des maisons en plastique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter d’éventuels signes cliniques. Lorsque les souris porteront des capsules sur le dos pour nourrir les tiques, elles seront placées en cages individuelles, car elles pourraient retirer les capsules des autres souris ou manger les tiques. Malgré leur isolement, elles bénéficieront des mêmes conditions d'hébergement, avec les enrichissements nécessaires pour leur bien-être. Pour les souris hébergées en cages individuelles des mesures seront prises le temps de leur hébergement individuel afin de garder un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter l'apparition d'éventuels signes cliniques. Des points limites ont été défini pour décider de la mise à mort des animaux en cas d'atteinte sévère de leur état de santé. Par ailleurs afin de limiter la douleur et l'anxiété des souris des protocoles d'anesthésie sont prévus pour certains actes pouvant engendrer une anxiété ou une souffrance.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne produisent pas le sucre α-Gal ; elles peuvent toutefois produire des anticorps spécifiques contre celui-ci. Ces lignées sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Nous utiliserons également des souris non modifiées génétiquement. Elles seront utilisées comme groupe contrôle pour comparer les résultats avec ceux des souris génétiquement modifiées et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge. Ce stade de développement (7 à 8 semaines) correspond à une maturité immunologique optimale chez la souris, ce qui est essentiel pour évaluer efficacement la réponse immunitaire induite par l’immunisation avec l’α-Gal. Il s’agit également d’un âge standard dans les modèles d’infection par Borrelia, permettant la comparaison avec des études antérieures et garantissant la reproductibilité des résultats. Par ailleurs les souris âgées de 7 à 8 semaines sont des souris adultes ce qui facilite les actes de prélèvements sanguins car elles sont plus grosses.

Produire des parasites pour un réactif de diagnostic exigé lors des mouvements internationaux de chevaux : 735 rats vont être infectés par Trypanosoma equiperdum, l'agent de la dourine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection les tue en quelques jours. Ce sont d'anciens reproducteurs de plus de 500 grammes, choisis pour la quantité de sang qu'on peut leur prélever, soumis à deux prélèvements quotidiens sous anesthésie gazeuse avant d'être mis à mort. Le porteur indique que la mise à mort intervient quand la parasitémie atteint son maximum et "autant que possible" avant l'apparition de signes cliniques, un rendement élevé par animal réduisant le nombre de protocoles à lancer. La finalité affichée est d'éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait la circulation commerciale des équidés.

Objectifs

Cette demande d’autorisation à expérimenter sur animaux vivants porte sur la production sur rats de parasites Trypanosoma equiperdum, agent infectieux responsable de la dourine. La dourine est une maladie sexuellement transmissible qui affecte les équidés et qui engendre un fort taux de mortalité ; elle est non transmissible à l’homme. Les procédures utilisées sont celles décrites par les instances internationales et ont pour objectif de produire les réactifs nécessaires au diagnostic officiel permettant d’empêcher la propagation de la dourine lors de mouvements internationaux d’équidés. Les parasites produits pourront également être utilisés dans le cadre de projets de recherche ayant pour vocation l’amélioration du diagnostic de la dourine et l’amélioration des connaissances sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Bien qu’un résultat sérologique négatif soit exigé vis-à-vis de la dourine pour permettre les mouvements internationaux d’équidés, seuls quelques laboratoires au monde sont en mesure techniquement de produire les réactifs nécessaires à la réalisation de ce test. Ainsi l’approvisionnement en réactif pour le diagnostic de la dourine est une réelle problématique dans de nombreux pays du monde. Ainsi ce bénéfice apporté par ce projet est de maintenir notre capacité de production d’antigènes afin d’éviter une pénurie mondiale de réactifs qui entraverait le contrôle du statut sanitaire des équidés vis-à-vis de la dourine qui pourrait impacter fortement les mouvements internationaux d’équidés.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection de parasite T. equiperdum sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - deux prélèvements quotidiens d’une goutte de sang sous anesthésie gazeuse (30 secondes) - une mise à mort sous anesthésie gazeuse complétée par d’une anesthésie profonde (2 min).

Impact sur les animaux

Afin de limiter les signes cliniques causés par le parasite (Trypanosoma equiperdum), la mise à mort est programmée avant que les animaux ne présentent des signes d’affaiblissement. Pour cela un suivi au moins deux fois par jour est réalisé. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort et son sang récolté. Une fiche individuelle de suivi est complétée à chaque intervention sur l’animal.

Devenir

L’infection par le parasite Trypanosoma equiperdum est mortelle au bout de quelques jours pour les rats inclus dans le protocole. Ainsi, pour éviter toute souffrance inutile, des animaux sont mis à mort soit quand la quantité de parasites dans le sang atteint le seuil recherché, soit quand des signes de souffrances sont observés chez l’animal.

Remplacement

Afin de garantir le statut sanitaire des équidés lors de leurs déplacements internationaux, des tests de diagnostic de la dourine sont exigés au niveau mondial. À ce jour, seul le test de fixation du complément (TFC) est reconnu par l’Organisation mondiale de la santé animale (OMSA) pour le diagnostic sérologique de cette maladie. Les quantités de réactifs requis pour la mise en œuvre du TFC, combinés au nombre élevé d’équidés circulant à l’échelle mondiale, font que de grandes quantité de parasites doivent être produites pour répondre à la demande. La seule alternative à l’infection de rats pour produire ces parasites est la culture in vitro. Cependant, les caractéristiques biologiques des parasites limitent fortement les rendements obtenus par cette méthode, rendant la production in vitro insuffisante pour répondre à la demande mondiale en antigènes. Dans le but de réduire (voire de suspendre) le recours à la production sur animaux, notre programme de travail inclut le développement d’un test ELISA standardisé pour la dourine, test pour lequel les quantités d’antigènes utilisés sont compatible avec les capacités de production in vitro. Une fois validé, ce test pourra être proposé à l’OMSA en vue de sa reconnaissance comme méthode officielle de diagnostic, au même titre que le TFC dourine. Dans l’attente de cette reconnaissance, la production d’antigènes sur rats reste à ce jour la seule solution permettant d’assurer la continuité des contrôles sanitaires lors des mouvements internationaux d’équidés.

Réduction

Le nombre d’animaux par production de parasites (21 rats) est défini par les protocoles décrit dans les réglementations internationales. De plus nous apportons un soin particulier à ce que la mise à mort des animaux soit réalisée de manière à obtenir le meilleur rendement de production de parasites, pour permettre de réduire au maximum le nombre de protocoles réalisés.

Raffinement

Les rats sont hébergés en zone de confinement A2, dans une pièce dédiée aux rats, en portoir ventilé, dans des cages permettant la position bipède. Chaque cage possède une plateforme, les rats en fonction de leur poids sont réunis par groupe de 2 ou 3. Pour chaque cage, l’enrichissement du milieu est apporté par : un tunnel, des matériaux de nidification, des os à ronger, ainsi que des buchettes bois à ronger. Afin de limiter la souffrance des animaux, tout acte invasif est effectué sur des animaux anesthésiés. La mise à mort des rats a lieu quand le nombre de parasites comptés dans le sang de l’animal a atteint son niveau maximum et autant que possible avant que les animaux ne développent des signes cliniques. En effet, plus le nombre de parasites collectés par animaux est important, moins nous aurons de protocoles de productions à mettre en place. Pour cela nous surveillons les animaux et réalisons des comptages de parasites de manière régulière. Tout animal présentant un comportement anormal ou des signes de souffrance sera mis à mort (point limite) et son sang récolté ; et ce, indépendamment de sa parasitémie.

Choix des espèces

Notre protocole suit les recommandations internationales quant à l’espèce animale sélectionnée (le rat). Cette espèce a été sélectionnée car elle est assez grande pour récolter des quantités importantes de sang (contrairement à la souris) tout en restant un animal dont l’utilisation est assez répandue pour permettre de standardiser la production d’antigènes. Dans ce contexte les animaux utilisés sont des rats adultes de poids supérieur à 500 grammes (anciens reproducteurs) afin de pouvoir prélever la plus grande quantité de sang possible et ainsi récupérer le plus de parasites par animal.

Tuées à l'issue du protocole pour qu'on leur prélève des tissus musculaires, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries dès l'âge de six semaines et jusqu'à trente semaines avec un régime enrichi en graisse et en sucre, puis reçoivent des injections sous-cutanées, jusqu'à trois par semaine pendant six semaines, avec pesées répétées. Le porteur indique que ce régime provoque obésité, diabète et stéatose hépatique, troubles qui peuvent engendrer de la douleur, et cherche à savoir si un antidiabétique fait perdre aux souris de la force et de la masse musculaires. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études et que "seule l'expérimentation animale" permet ce suivi.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérées comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline et au diabète de type 2. L'hypothèse générale est que l'augmentation des niveaux de tissu adipeux entraîne des changements fondamentaux dans la composition et la fonction des fibres musculaires, qui à leur tour conduisent à une altération de la fonction métabolique. L'obésité est un ensemble d'altérations métaboliques associées à la sédentarité et à la redistribution du tissu adipeux qui précèdent le diabète de type 2. La résistance à l'insuline du muscle est une altération métabolique majeure associée à l'obésité et au syndrome métabolique. En effet, le muscle est le principal tissu responsable de l'élimination du glucose stimulée par l'insuline. Les muscles squelettiques jouent ainsi un rôle important dans ce syndrome et sont des régulateurs de la masse corporelle totale et également de la consommation d'énergie des muscles. Pour traiter le diabète et l'obséité, de nouveaux traitements existent en modulant la satiété et la régulation du glucose. Ces molécules peuvent avoir de multiples rôles et ainsi influer sur la masse et la fonction des muscles. L'objectif de cette étude est de déterminer chez la souris obèse l'effet d'un traitement aigu ou chronique aux molécules antidiabétiques ou anorexigènes sur la fonction et la masse musculaire.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est de déterminer si un traitement aigu ou chronique à base de molécules thérapeutiques destinées à traiter le diabète ou à contrôler la prise de poids chez la souris obèse a un effet sur la fonction et la masse musculaire. On peut ainsi s'attendre à ce que ce type de molécule induise une diminution de la force musculaire associée à une perte de masse musculaire. La mise en évidence de ce problème serait primordiale pour le patient obèse traité par cette molécule car il serait alors possible de mettre en place une action préventive telle qu'un programme d'activité physique adapté pour renforcement musculaire.

Procédures

Les animaux sont nourris à partir de l'âge de 6 semaines chez le fournisseur avec un régime riche en graisse et sucre puis tout au long du protocole. Il y a une étude aigue où l'animal reçoit une injection sous-cutanée et sera pesé chaque jour pendant 3 jours. Dans une deuxième étude, l'animal reçoit trois injections sous-cutanées par semaine et sera pesé trois fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 30 semaines d’âge au maximum) avec des régimes enrichis en graisse et en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les pesées peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère au moment de l'injection.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissus musculaires.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse pathophysiologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et musculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé en fonction de la littérature et à l’aide d'un logiciel d'analyse statistique. Il est ainsi nécessaire d’inclure 10 animaux par groupe en tenant compte du risque d'échec à la dissection et aux mesures de contractilité musculaire. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. Nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel et la prise alimentaire seront mesurés afin de s'assurer de leur bien-être 3 fois par semaine pour le protocole long. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge. Des soins tels que l'hydratation et la mise en place de nourriture dans la litière, si nécessaire, seront effectués.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal parfaitement caractérisé et validé pour l'étude du diabète, de l'obésité et de la dysfonction musculaire, par la communauté scientifique en général et par notre laboratoire. Les animaux sont traités avec un régime riche en gras et sucre à partir de 6 semaines d’âge, pendant 16 semaines, chez le fournisseur afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique). Ils arriveront au laboratoire à l'âge de 22 semaines. Les tests démarrent 2 semaines après, soit au stade adulte, pour une durée de 3 jours ou de 6 semaines.

Pour étudier comment le stress rend certaines souris vulnérables à l'anxiété, un lot est immobilisé jusqu'à deux heures par jour pendant six jours, à trente jours de vie puis une seconde fois à l'âge adulte. 1 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses du cerveau. Un second volet porte sur la démence liée à l'âge, avec des injections dans l'abdomen, quotidiennes pendant deux semaines, puis des tests comportementaux que le porteur décrit comme sans douleur ni stress. Les souris dont le score dépasse 6 sur la grille d'évaluation sont sorties du protocole.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement et l’anxiété peuvent modifier le fonctionnement des cellules du cerveau, en particulier les neurones. L’anxiété touche près de 20% de la population française. Comprendre ses mécanismes au niveau cérébral est crucial pour améliorer son diagnostic et son traitement. De récentes études ont montré qu’un stress peut rendre certaines souris plus vulnérables à l’anxiété en modifiant l’activité de circuits cérébraux bien précis. Ce projet vise à comprendre la modification de ces circuits au niveau des cellules, de leur fonction et leur morphologie à l’origine de cette susceptibilité au cours du développement. Le projet s’intéresse aussi à la démence liée à l’âge, une autre maladie qui touche de plus en plus de personnes. Elle se traduit par des pertes de mémoire et des difficultés à penser clairement, causées notamment par la disparition progressive de neurones. Ces dommages sont en partie liés à un déséquilibre dans les mécanismes naturels de protection contre les agressions chimiques dans le cerveau. Une molécule importante pour ces défenses est produite naturellement dans le cerveau. Lorsqu’elle est dégradée, elle forme des petites molécules appelées dipeptides, qui jouent un rôle dans la communication entre les neurones. En cas de démence, ces dipeptides semblent s’accumuler, ce qui pourrait favoriser l’apparition des troubles. En mesurant la quantité de ces dipeptides et leurs effets sur le cerveau, le projet espère identifier des signes précoces de la maladie et mieux comprendre comment ces déséquilibres contribuent aux symptômes.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une étape essentielle dans la compréhension des circuits neuronaux responsables du contrôle de l'anxiété liée au stress et à la démence liée à l'âge, ainsi que des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement de la susceptibilité ou de la résilience face aux troubles psychiatriques. Les découvertes qui en découleront pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches de prédiction et de traitement des maladies psychiatriques, bénéficiant ainsi à la société humaine.

Procédures

Pour la partie du projet liée à l'anxiété, un lot d'animaux va subir un protocole de stress consistant en des stress psychologiques par contention d'une durée maximale de 2h par jour pendant 6 jours et cela deux fois dans leur vie, pendant l'enfance et au stade de jeune adulte. A la fin de chaque période de stress des prélèvements de feces seront réalisés en laissant l'animal produire naturellement ces excrétas qui seront collectés. Un autre lot d'animaux subira les mêmes procédures que citées ci-dessus mais sans stress de contention effectué, ce sera notre lot contrôle. La plupart des animaux auront leur comportement testé à travers divers tests de comportement non invasifs. Ces tests durent chacun une dizaine de minutes et ne dépassent jamais 1 test par jour et 3 tests par semaine. Ils seront espacés de cinquante jours. Pour le projet lié à la démence, les animaux seront soumis à des injections dans l’abdomen de substances testées. Deux types de traitement seront réalisés : un traitement aigu, avec une seule injection (une injection dure au maximum 10 secondes), et un traitement chronique, avec une injection par jour pendant deux semaines. Les souris recevront soit une injection contenant les substances testées, soit une injection témoin. Par la suite, des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin de tester l’effet des substances sur l’apprentissage et la mémoire. Ces tests sont non invasifs et sont basés sur le comportement naturel des animaux à observer ou retrouver un lieu dans un environnement inconnu. Ils seront espacés d’au moins 24 heures pour limiter la fatigue des animaux et les biais expérimentaux. A la fin de l’expérience, des analyses des tissus neuronaux seront réalisées. Elles permettront de mieux comprendre l’effet des substances testées sur le fonctionnement des cellules nerveuses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables seront principalement liés au stress provoqué par des contentions physiques. Ce type de stress de contention n'entraine pas de douleur mais provoque un stress psychologique. Les tests de comportement seront non invasifs et sans douleur, basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone anxiogène sans contrainte. Les fécès seront prélevés. Les nuisances prévues dans le second axe sont limitées à des injections de degré léger (10 secondes), qui ne provoquent qu’une gêne passagère comparable à une piqûre. Les tests comportementaux réalisés sont non invasifs et n’induisent pas de stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre des études moléculaires, d’activité électrique et histologiques post-mortem du cerveau.

Remplacement

Notre projet repose sur différentes approches telles que l’étude du comportement et l’étude du développement et de la plasticité du système nerveux. Nous voulons comprendre le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Actuellement, il n’y a pas de méthode substitutive qui pourrait remplacer le recours à l’animal dans nos travaux.

Réduction

Notre plan expérimental est conçu de telle manière que les premières expériences réalisées permettront d’optimiser les conditions des expériences suivantes et de réduire, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur mise en œuvre. Le nombre d'animaux par groupe a été évalué statistiquement, ce qui permet d'avoir une bonne estimation des effectifs suffisants pour l'obtention de données statistiquement fiables tout en s'assurant d'une utilisation des animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Le contenu de l’expérience intègre les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, inconfort, stress, détresse chez l’animal. Les animaux seront placés en cage de maximum 5 individus avec maisonnette en carton plus du coton afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé à l’expérimentation animale et aux connaissances spécialisées dans les procédures décrites. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés toutes les semaines. Enfin nous utiliserons une grille détaillant l'état des animaux pour s'assurer qu'ils ne souffrent pas afin de leur fournir les meilleurs soins le cas échéant. Les animaux manifestant au moins un des points limites ( critère prédéfini utilisé dans l’expérimentation animale pour interrompre ou modifier une procédure expérimentale afin d’éviter ou de limiter la souffrance, la douleur ou la détresse inutile chez l’animal) identifiés ou un score supérieur à 6 (grille) seront systématiquement sorti du protocole.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car ressemblant à l'homme concernant les mécanismes à l’œuvre dans le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Enfin, il existe des tests du comportement chez la souris permettant d'identifier des symptômes psychiatriques se manifestant de la même manière chez l'homme. Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude du fonctionnement du cerveau surtout concernant les circuits neuronaux qui contrôlent les émotions car ils sont similaires à ceux du cerveau humain, en particulier pour l’anxiété et la démence. Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un excellent modèle pour nos études. Dans le cadre des troubles anxieux, le stress de contention précoce commencera lorsque les animaux auront 30 jours. Les stades d'études moléculaires et histologiques sont justifiés par le fait que nous étudions les effets du stress de contention pendant la période où la aprtie du cerveau responsable du contrôle des émotions continue de maturer. Les paramètres biologiques seront donc étudiés après le premier stress de contention mais aussi après un second stress de contention à l'age adulte qui provoquera l’apparition de symptômes d’anxiété chez les animaux ayant subis les deux stress de contention. Les tests de comportement permettant de contrôler les niveaux d'anxiété seront réalisés sur des animaux adultes. Concernant la démence, les injections de substances se feront sur trois périodes vie : Jeune (1 mois), adulte (6 mois) et âgée (12 mois). Ces périodes sont justifiés par le vieillissement naturel et l’installation progressive de la démence avec l’âge. L’étude sur des souris jeune est essentielle pour identifier à quel stade les substances testées commencent à s’accumuler et comment elles peuvent avoir un impact sur l'apparition des troubles cognitifs

Génétiquement modifiées pour développer une myopie forte ou syndromique, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'implantation chirurgicale d'un casque sur le crâne, une heure d'opération, puis jusqu'à dix anesthésies gazeuses en trois semaines pour le nettoyage des lentilles et des yeux, avec le port prolongé d'un cadre à lunettes. Le porteur signale que l'hébergement individuel peut provoquer apathie et agressivité, et que l'enrichissement sera réduit pendant tout le projet. Toutes sont tuées et leurs yeux prélevés, le porteur indiquant qu'en tant qu'animaux OGM elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à l'accouplement.

Objectifs

La myopie est causée par une croissance anormale de l’œil. Ceci implique des questions optiques, génétiques, mais aussi neuronales. La myopie peut exister seule, ou associée à un syndrome oculaire plus vaste, on parle alors de myopie « syndromique ». Différents mécanismes mènent à l’apparition de la myopie, soulignant la nécessité de personnaliser les traitements en fonction des causes de la myopie. Plusieurs solutions thérapeutiques sont déjà proposées, sous forme de collyre (exemple : l’atropine) ou optiques (exemple : thérapie à lumière rouge ou verres de freination). Ces solutions présentent des effets secondaires conséquents (gêne et assèchement oculaire, photophobie, effet rebond) et une efficacité variable liée à divers facteurs. Notamment, de nombreux patients ne répondent pas ou peu à ces traitements. Il est donc nécessaire de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Au cours de ce projet, nous allons tester différentes voies thérapeutiques : 1) Il existe une molécule, formulable sous forme de collyre qui, d’après nos expériences passées, pourrait être prometteuse. Nous allons donc tester cette hypothèse dans divers modèles animaux de myopie forte et syndromique. 2) Différents verres de lunettes ont un impact sur la croissance de l’œil. Les modes d’action de ces verres sont variables et leur efficacité peuvent varier suivant la génétique et l’âge du patient. Ce projet vise à tester différentes solutions thérapeutiques dans différents modèles animaux de myopie forte et syndromique afin de proposer une preuve de concept et valoriser certaines de ces solutions.

Bénéfices attendus

La myopie présente une prévalence déjà élevée (plus d'un adulte sur 3 actuellement, 1 adulte sur 2 en 2050). La rétinopathie pigmentaire et la cécité nocture congénitale stationnaire sont des maladies génétiques rares (1/ personne sur 3500 et 1 personne sur 400000, respectivement), mais toutes trois peuvent mener à une cécité complète des patients affectés. S’il existe des stratégies de correction de la myopie, peu de réels traitements existent et ceux existant présentent une efficacité limitée et de nombreux effets secondaires. Ce projet permettra de fournir des preuves de concept pour le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de la myopie.

Procédures

Pour induire et étudier la myopie ainsi que son traitement, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne des animaux est nécessaire, 1 fois par animal. La chirurgie dure 1 heure maximum par animal. Pour mesurer le degré de myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux : 3 fois par animal, 5 minutes à chaque fois. - Anesthésies gazeuses répétées : 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux et 1 examen des yeux. Soit 10 anesthésies maximum sur 3 semaines d’une durée de 15 minutes maximum/animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées, entrainant un stress. Les animaux seront soumis à une chirurgie : Les techniques chirurgicales peuvent mener à une perte de sang durant l’opération et à des pertes de poids, infections, douleurs durant la période post-opératoire. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette : le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Les traitements médicamenteux peuvent aussi engendrer une gêne et un assèchement oculaire. Les animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales caractérisées par de l’apathie et de l’agressivité. L’enrichissement sera réduit pendant ce projet, ce qui peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés selon la procédure réglementaire car il s'agit d'animaux OGM ne pouvant être réutilisés pour d'autres projets ou pour l'accouplement. De plus les yeux des animaux seront récupérés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction et l’étude de la myopie nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir un oeil en 3D. L'utilisation de certaines des molécules testées ici est déjà reconnue comme efficace in vitro, dans les modèles animaux et chez les patients, mais n'a jamais été testée sur des modèles animaux avec les modifications génétiques que nous proposons. Afin de valider (ou invalider) l'usage des molécules que nous testons, pour le traitement de la myopie syndromique et non syndromique, la prochaine étape est donc un usage sur modèle in vivo.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. La myopie n’est pas connue pour impacter un sexe plus que l’autre. Nous testerons donc des mâles et femelles sans distinction. Nous avons optimisé le nombre et nature des accouplements d’animaux pour réduire le nombre d’animaux à générer. Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe) et des contraintes techniques (taux de réussite estimé des procédures). Les données issues de conditions contrôles sont réutilisées pour réduire le nombre d’animaux à générer. Nous aurons besoin de générer 480 animaux pour ce projet

Raffinement

Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien-être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin de modèles génétiques particuliers qui n’existent que dans cette espèce. Nos expériences visent à étudier la myopie, qui survient durant la croissance de l’œil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’oeil est trop petit. Nos expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’oeil y est encore en phase de croissance critique.

Sur 3 072 poulets, 300 sont autopsiés à différents âges et 2 772 partent dans le circuit alimentaire humain, ce que le porteur décrit comme une valorisation. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, infectés par des coccidies via l'eau de boisson à quatorze jours, pesés, soumis à des prélèvements de fientes puis à l'examen des lésions de leurs organes. Le porteur annonce comme seuls effets indésirables un retard de croissance et des fientes plus liquides, alors qu'il décrit par ailleurs une parasitose dont les effets peuvent aller jusqu'à la mort. L'essai compare des extraits de plantes à un antibiotique dans la ration, pour une filière qui cherche des alternatives aux médicaments.

Objectifs

Les poulets de chair peuvent être affectés par des parasites appelés « coccidies » ou, plus largement, « Eimeria spps », dont les effets délétères peuvent aller jusqu’à la mort. L’objectif de l’étude est de vérifier l’efficacité d'extraits de plantes (en comparaison à un antibiotique) apportés dans la ration de poulets sur leur bien-être et leurs performances de croissance. Le modèle d’inoculation doit permettre de tester des solutions alternatives à l’utilisation d’antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action des plantes actuellement utilisées pour lutter contre la coccidiose. A court terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles formulations d'aliments sans médicament. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles méthodes d'alimentation et de prévention pour traiter les volailles et améliorer leur bien-être.

Procédures

Durée prévue de l’étude : 30 jours Interventions prévues : - Les animaux seront pesés par groupe dès leur arrivée, puis à 6 jours, 20 jours, et la veille de leur départ. - Ces pesées permettront de calculer, pour chaque groupe, le poids moyen et la croissance quotidienne. - A 14 jours, les animaux seront parasités par les coccidies via l'eau de boisson. - Des échantillons de fientes seront prélevés à 19, 24 et 30 jours. Une boîte sera installée la veille pour faciliter la collecte. Ces échantillons seront ensuite analysés pour estimer la présence de parasites. - Des observations seront faites sur certains organes pour évaluer d’éventuelles lésions liées à l'infection.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront montrer les effets indésirables suivants : un retard de croissance et un aspect des fèces plus liquide.

Devenir

Au cours de chaque procédure, le nombre d'animaux qui seront autopsiés au total : 300 (à différents âges pour des biopsies). Nombre d'animaux gardés en vie (replacés afin d’être valorisés dans le circuit alimentaire humain, étant conforme au paquet hygiène ) : 2772.

Remplacement

Bien que nous menons en parallèle des études in vitro sur des cellules de parasites, la coccidiose est un syndrome global qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes. Avant de tester un additif sur poulet, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poulets nous travaillons avec des analyses en laboratoire permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés sur animaux, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux. Compte tenu de notre expérience d’essai (plus de 20 ans de données dans nos fermes de recherche zootechniques), nous avons accès à une très grande quantité de données. Toutes ces data nous permettent de réaliser des tests statistiques avant chaque essai, pour valider que nous aurons une probabilité importante d’obtenir des résultats significatifs avec le plus faible nombre d’animaux possible.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Dans le cadre de ce protocole, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place afin de limiter le stress, la douleur et l’inconfort des poulets tout au long de l’expérimentation. Les animaux seront hébergés en groupe, dans des enclos équipés d'une litière de copeaux et enrichis à deux périodes avec caisses servant à récolter les fientes et servant de perchoir. Cet enrichissement vise à réduire l’ennui, améliorer le bien-être et permettre aux animaux d’adopter des comportements exploratoires et sociaux. Les manipulations, y compris les prélèvements hebdomadaires, seront réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques douces et des contenants adaptés pour limiter la contention et le stress. Une surveillance quotidienne sera assurée par l’animalier, et des critères de points limites spécifiques au protocole ont été définis pour permettre une détection précoce de toute souffrance, avec des mesures d’intervention rapide prévues en cas de besoin.

Choix des espèces

Les infections à Eimeria spp provoquent spécifiquement chez le poulet (Gallus gallus) des désordres digestifs associés à une altération du bien être animal, et une baisse des performances zootechniques. Les poulets utilisés auront de 1 à 30 jours d’âge, soit la durée classique d’élevage d’un poulet de chair standard.