Procédures modérées

Jusqu'à cinq chocs électriques par séance, une séance de trente minutes par jour pendant neuf jours: 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi cinq injections dans l'abdomen, un gavage cinq jours sur sept pendant dix semaines, et passent des séries de quatre tests cognitifs, certaines étant isolées en cage pour la mesure de leur rythme circadien. Le porteur qualifie ces chocs de désagréables mais non douloureux, et écrit par ailleurs que l'usage d'analgésiques centraux est à proscrire pour des raisons scientifiques. Toutes sont tuées et leurs cerveaux prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et moléculaires.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cinq gènes d’intérêts dans le fonctionnement normal et pathologique des cellules immunitaires du cerveau. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière et jouent des rôles critiques à la fois dans son fonctionnement en conditions physiologiques et pathologiques. Les études récentes ont permis d’établir que la population de cellules immunitaires du cerveau est hétérogène et existe sous une grande diversité d’états microgliaux. Comment ces différents états sont contrôlés et quels sont leurs rôles dans le fonctionnement physiologique et pathologique du cerveau reste encore à déterminer. Notre équipe s’intéresse à plusieurs gènes qui de par leur localisation et/ou leur fonction dans d’autres cellules immunitaires sont susceptibles de jouer un rôle clé dans le contrôle de ces différents états microgliaux. L’objectif final du projet est donc de comprendre, dans différents contextes physiologiques et pathologiques (en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer), le rôle de ces cibles dans le fonctionnement des cellules microgliales. Pour ce faire, nous utiliserons une combinaison de lignées murines permettant de modifier l’expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules immunitaires du cerveau. In fine, ce projet permettra de valider l’intérêt thérapeutique des gènes cibles dans les différents contextes envisagés. L'ajout d'une intervention (gavage) nécessite une deuxième modification du projet initiale sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

MODIFICATION: 1. Déchiffrer le rôle de gènes d’intérêt exprimés dans des cellules immunitaires dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique des cellules immunitaires du cerveau (en particulier dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer) 2. Valider l’intérêt thérapeutique de ces cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques, notamment dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer 3. Valider l'efficacité d'un traitement pharmaceutique, une molécule ciblant les cellules immunitaires, contre le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

MODIFICATION: Les interventions prévues dans le cadre de ce projet sont : des injections dans l’abdomen (5 injections, à raison d’une injection par jour, sur 5 jours, durée d’une injection environ 10 sec) ; administration d'une substrance pharmacologique par gavage 5j/7 pendant 10 semaines, durée de la manipulation environ 30sec; l’enchainement de tests pour évaluer le comportement cognitif des animaux (au maximum 1 série de 4 tests de 3 min (soit 12 min/animal/jour) chacun par jour, 5j par semaine sur 2 semaines ; chacun des tests étant non-invasif et reposant sur la propension des rongeurs à explorer leur environnement) ; un test basé sur l’évitement d’un choc électrique désagréable mais non douloureux (au maximum les animaux peuvent recevoir 5 petits chocs électriques par session, 1 session de 30 min par jour sur 9 jours). L’étude de l’effet de l’impact de la pathologie et/ou des gènes d’intérêt sur l’activité circadienne requiert l’emploi de tests impliquant des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement isolé temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude.

Impact sur les animaux

MODIFICATION: Les effets indésirables découlant des interventions sont les suivants : Douleurs et stress léger de piqure d’aiguille dans le péritoine ; Stress et inconfort de l'introduction de la sonde de gavage; Stress léger et inconfort de certains tests de comportement. Isolement temporaire pour l’évaluation de l’activité circadienne.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à ce projet sera mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et/ou moléculaires.

Remplacement

Les cellules immunitaires du cerveau sont, par nature, des cellules ultra-sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans le fonctionnement physiologique ou physiopathologique du système nerveux central, il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Dans ce contexte, les données récentes de la littérature indiquent que les morphologies, les fonctions ou encore le répertoire de gènes exprimés par les lignées cellulaires microgliales ou même les cultures primaires de microglies diffèrent substantiellement de ceux exprimés par les microglies fraichement isolées à partir de cerveaux adultes. L’utilisation d’animaux vivants est donc requise. Par ailleurs, certains des rôles des cibles que nous cherchons à évaluer (i.e. effets sur comportement cognitif, en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer) ne peuvent être réalisées que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 2250) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans la biologie des cellules immunitaires du cerveau, les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Par ailleurs, la maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative. Nos données antérieures et celles de la littérature indiquent que les cellules immunitaires du cerveau pourraient jouer des rôles fonctionnels différents en début et en fin de pathologie, les effets des cibles d’intérêts seront donc évalués à deux stades différents, au stade précoce et à un stade plus tardif. Dans la mesure du possible, nous réaliserons l'expérimentation comportementale, et les analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux statistiquement requis en fonction des effets escomptés.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive (évaluée de manière visuelle); prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l’euthanasie de l’animal. En cas de blessures (notamment à la suite de bagarres entre animaux), des analgésiques d’application locale pourront être utilisés. Cependant, notre projet se référant à l’étude de processus neuroinflammatoires, l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques centraux (hors procédure d’euthanasie) est à proscrire pour des raisons scientifiques. La présence d'une roue d'activité pour mesurer la rythmicité circadienne constitue un enrichissement très apprécié des souris. Ce test nécessite de travailler avec un seul animal par cage, mais les contacts visuels et olfactifs sont maintenus entre animaux de cages voisines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour étudier les effets des modifications génétiques sur le comportement, les tissus, les cellules et les molécules des cellules immuitaires du cerveau. L'utilisation de la recombinase Cre pour contrôler ces modifications génétiques est particulièrement intéressante. C'est pourquoi les modèles murins, en particulier dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, sont privilégiés. Ces avancées permettent de respecter au mieux les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Refinement). Nous utiliserons des animaux adultes à différents âges en fonction des sous-objectifs du projet : 2-3 mois pour les études en conditions physiologiques ; 4 et 8 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début précoce; 9 et 12 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début tardif.

Nourries pendant seize à vingt-quatre semaines avec un régime destiné à leur provoquer obésité, foie gras et inflammation hépatique, une partie des souris reçoit en plus deux injections par semaine pendant douze semaines pour induire une fibrose du foie. 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, du foie, du tissu adipeux et du nerf sciatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage quotidien pendant douze à vingt-quatre semaines, des jeûnes de six heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures, et le porteur décrit une neuropathie allant jusqu'à la perte de la sensibilité. L'objectif est de tester un médicament déjà développé pour limiter l'accumulation d'un lipide, sans que les trois analyses neurologiques annoncées soient nommées.

Objectifs

La neuropathie diabétique est une complication fréquente du diabète qui touche environ 40 pourcents des patients. Elle provoque une perte de sensation, en particulier dans les pieds, ce qui peut entraîner des blessures et, dans les cas graves, des amputations. Actuellement, il n'existe pas de traitement permettant de restaurer la sensibilité perdue. En plus du diabète, d'autres facteurs comme l'obésité et le syndrome métabolique peuvent aussi causer des atteintes nerveuses similaires. Des recherches ont montré qu'un certain type de graisse pourrait jouer un rôle important dans ces dommages nerveux. Un médicament a été développé pour limiter l'accumulation de ces lipides. Ce projet de recherche veut tester si le traitement employé pour limiter cette graisse particulière pourrait aussi être utile contre la neuropathie diabétique en réduisant la synthèse de ces dérivés lipidiques et en protégeant les nerfs. Si cela fonctionne, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste de traitement pour améliorer la qualité de vie des patients diabétiques.

Bénéfices attendus

La neuropathie liée au diabète peut entraîner de graves complications, comme des plaies aux pieds pouvant aller jusqu’à l’amputation. En France, environ 8 000 amputations par an sont dues à cette maladie. Ce projet de recherche s’intéresse à certains lipides et à leur rôle potentiel dans ces atteintes nerveuses. Un médicament agit justement sur la synthèse de ces mdérivés lipidiques. L’idée serait d’explorer s’il pourrait aussi aider les patients diabétiques en réduisant le risque de complications graves, comme les amputations.

Procédures

Les animaux seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, un gavage par jour sera réalisé pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h, après une mise à jeun de 6h) ainsi que des analyses neurologiques (2 tests sur animal vigil (2 et 10 min respectivement et 1 test sous anesthésie, 30min; chaque test étant espacé de 2 jours, 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) risque de réduction de la prise alimentaire lié à la néophobie des souris au changement de régime, 2) la maladie hépatique induite par régimes spéciaux ou par injection bihebdomaire intrapéritoneale d'un traitement (douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille) et ses conséquences métaboliques avec insulinorésistance provoquant un diabète (polyurie-polydipsie) et une obésité et les conséquences sur le nerf (neuropathie périphérique avec troubles de la sensibilité ou perte de la sensibilité) 3) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie 4) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose) 5) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques et durant les tests de sensibilité et de conduction nerveuse. 6) risque de perte de poids, d’hémorragie lié au prélèvement et risque d’hypoglycémie ainsi que la mise à jeun de 6h avec sensation de faim pour les tests métaboliques. 7) irritation oesophagienne liée au gavage quotidien du médicament testé

Devenir

A la fin de la période de maintien des animaux, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt (sang, tissus adipeux, foie et nerf sciatique) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme lipidique en cas de MASLD (maladie métabolique du foie) sur la neuropathie périphérique. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 960 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. En cas d'obésité avec difficulté à se mouvoir, la nourriture sera déposée en fond de cage. Le change de la cage augmenté si necessaire pour s'adapter à la diurèse induite par le diabète et permettre aux souris de rester au sec. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les points limites sont évalués par un personnel compétent.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. De plus sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et/ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Dans les protocoles, les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l'âge de 6-8 semaines afin que le métabolisme des animaux soit stabilisé.

5 450 nouveau-nés, 3 250 ratons et 2 200 souriceaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun passant ses quatorze premiers jours de vie enfermé dans une enceinte en hyperoxie pour lui provoquer une hypertension pulmonaire. Leurs mères sont échangées toutes les vingt-quatre heures pour leur éviter l'effet toxique de l'oxygène. Suivent des échographies cardiaques, des mesures de pression cardiaque et une pléthysmographie invasive, sur des animaux gardés jusqu'à un an afin de suivre les séquelles à l'âge adulte. Tous sont tués pour l'extraction du bloc cœur-poumon, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" de comprendre les mécanismes de cette maladie et que "seul l'animal entier" permet les interactions entre organes.

Objectifs

La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.

Impact sur les animaux

L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.

Raffinement

Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).

Jusqu'à six chirurgies d'implants de huit heures chacune et jusqu'à neuf ouvertures de volets osseux dans le crâne: 8 macaques, quatre à longue queue et quatre rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils travaillent en chaise de contention cinq à sept fois par semaine, lors de séances allant jusqu'à cinq heures, un contrôle de l'eau servant de levier de motivation puisque la récompense hydrique constitue une partie de leur apport journalier. Le porteur veut comprendre comment le cerveau des macaques perçoit les visages, le statut de dominance et les liens sociaux entre congénères. Sept des huit macaques resteront en utilisation continue, un sera tué pour l'étude post-mortem de son cerveau.

Objectifs

Le cerveau des primates, des humains comme des singes, leur permet de vivre en société, ce qui participe à la survie de leur espèce. Notre cerveau de primate est notamment adapté pour la perception des individus et pour l’analyse de leurs comportements. Or la cognition sociale est la première à être touchée dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et nous ne connaissons pas exactement l’origine de ces problèmes, notamment du fait de notre connaissance insuffisante des mécanismes cérébraux qui nous permettent de percevoir et de comprendre les autres. L’objectif de ce projet est de comprendre par quels mécanismes le cerveau des primates non-humains leur permet de percevoir et comprendre leur groupe social. Nous savons par exemple, que les singes, tout comme les humains, possèdent dans leur cerveau des régions spécialisées pour la perception des visages par rapport à d’autres objets visuels. Cependant nous ne savons pas 1/ par quels mécanismes biologiques, les neurones –c’est-à-dire les cellules de ces régions cérébrales– codent les caractéristiques sociales des individus (comme leur genre, leur statut de dominance, leurs liens d’amitié) 2/ comment les neurones associent une même caractéristique sociale perçue par différentes modalités sensorielles 3/ s’il existe des régions cérébrales spécifiques aux odeurs sociales et au toucher social, deux modalités très importantes depuis le plus jeune âge pour percevoir les autres. Par ailleurs, les primates sont des spécialistes pour l’analyse des comportements de leurs congénères et possèdent des régions cérébrales spécifiques pour l’analyse des interactions sociales. Cependant, nous ne savons pas par quels mécanismes les neurones extraient des informations sur les individus à partir d’observation d’actions. Dans ce projet, nous proposons de répondre à ces questions majeures pour les neurosciences, la psychologie sociale ou encore la biologie évolutive en utilisant des techniques d’étude du cerveau à plusieurs niveaux combinant des méthodes exploratoires d’imagerie du cerveau afin d’identifier les régions cérébrales responsables de ces processus sociaux, à des méthodes fines d’enregistrement de l’activité des neurones et de manipulations moléculaires, avec l'objectif à long terme de fournir aux neurosciences cliniques de nouvelles hypothèses pour comprendre comment ces mécanismes peuvent être perturbés dans les maladies psychiatriques ou neurologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront d’abord de mieux comprendre la représentation du réseau social, des interactions sociales et des individus dans le cerveau avec une précision et une compréhension au niveau des mécanismes neuronaux jamais atteintes jusque-là. Les perturbations temporaires des régions du cerveau identifiées par imagerie par résonance magnétique (IRM) pourraient permettre de s’approcher au plus près des tableaux cliniques humains et donc fournir aux neurosciences cliniques de nouvelles hypothèses pour comprendre comment les mécanismes sociaux sont perturbés dans les maladies psychiatriques et neurologiques. Ainsi ce projet pourrait permettre d’établir un modèle animal pour la compréhension des troubles sociaux qui impactent les patients présentant des troubles neurologiques ou psychiatriques. Il s’agira également potentiellement de découvrir de nouvelles régions cérébrales sur la perception des odeurs et du toucher social, et d’obtenir une comparaison du cerveau social des singes et du cerveau social humain et donc de comprendre les mécanismes conservés au cours de l’évolution et ceux qui sont spécifiques à notre espèce et à l’espèce des macaques rhésus.

Procédures

Tous les animaux sont habitués aux différents dispositifs et au personnel pour limiter tout stress. Ils seront entrainés à la réalisation de tâches comportementales (5-7 fois/semaine, 20min-4h/session). Le bon positionnement dans la chaise pourra s’accompagner d’un faible sédatif (sur environ 10séances si nécessaire). Les animaux réaliseront des IRM sous anesthésie (4h, 1-2sessions/mois avant 4ans puis 6fois/an). Ils auront 3 chirurgies d’implants minimum (mise en place d’un implant de maintien de la tête, de chambres d’enregistrement, d’électrodes d’enregistrement) et 6 maximum s’il est nécessaire de réparer, retirer ou remettre un implant (durée: 8h maximum/chirurgie sous anesthésie générale). Ils auront 2 interventions d’ouvertures de volets osseux ciblés minimum et 9 maximum s’il est nécessaire d’ajouter ou d’agrandir les volets existants (durée: 5h maximum/intervention sous anesthésie générale). Les chambres d’enregistrement sont entretenues 2 fois/semaine minimum (durée 60min). Les animaux vigiles participeront à des enregistrements de l’activité cérébrale par IRM et par électrophysiologie pendant qu’ils réaliseront des tâches comportementales (durée 5h maximum, 5-7 fois/semaine). Pour favoriser la motivation des animaux pendant les tâches comportementales, ils seront récompensés à l’aide d’une récompense hydrique qui constituera une partie de leur apport journalier en liquide. Un retour progressif à un apport à volonté est effectué au moins 2 fois une semaine chaque année. Une surveillance quotidienne est réalisée afin de garantir un bon état d’hydratation et une bonne santé, vérifiée par des analyses sanguines 2 fois/an (prise de sang de 4min). Chaque IRM s’accompagnera d’une injection intraveineuse d'un agent de contraste (durée 2min). Cet agent sera ensuite éliminé par deux composés (1 administration intramusculaire/jour de 30s, et 2 administrations orales/jour de 3min). Des analyses sanguines seront réalisées pour suivre le retour aux valeurs de référence (environ 4 prises de sang à la fin des séquences de plusieurs IRM, durée 4min). Des molécules seront administrées pour moduler l’activité cérébrale par inhalation (60 administrations maximum par animal de 20min), ou par la nourriture (60 administrations maximum/animal), ou par injection intraveineuse (60 administrations maximum/animal de 4min), ou dans le cerveau (60 administrations maximum/animal de 50min). Un des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

L’animal pourrait ressentir une gêne ou des douleurs après les différentes chirurgies (pose de l’implant de tête, des chambres d’enregistrements ou des électrodes à demeure). Il y a également la gêne liée à la présence de ce matériel à demeure. Les risques liés à l’anesthésie (notamment hypothermie, sécheresse oculaire, dépression cardio-respiratoire) peuvent survenir. Il existe des risques d'infection sur les implants de tête, sur les électrodes implantées et lors de l'introduction des électrodes amovibles pour les enregistrements. Les risques de perte d’implant peuvent survenir suite à un rejet du matériel biocompatible provoquant chez certains animaux une réponse inflammatoire chronique et un rejet du matériel chirurgical. L’animal pourrait ressentir un stress/contrainte lors des séances d'électrophysiologie, d’imagerie, de tests ou d’entrainement pendant lesquelles il est positionné en chaise de contention ou maintenu par l’implant de tête. Le stress de l’hébergement en captivité peut être présent. Le contrôle hydrique peut induire un stress pour l’animal, une sensation de soif, de la déshydratation ou une perte de poids. Les risques liés aux agents pharmacologiques existent, lies à la tolérance/réaction individuelle aux molécules utilisées ainsi qu’à la capacité de la récupération propre à chaque animal, pouvant induire par exemple une réaction allergique, une accumulation dans les tissus, un mauvais fonctionnement du foie ou des reins. L’animal pourrait ressentir une gêne ou une douleur de courte durée au point d’injection lors des injections et prélèvements en intraveineuses, ou en intramusculaire.

Devenir

7 des 8 animaux seront en utilisation continue pour poursuivre l’acquisition de données sur ce sujet de recherche afin de privilégier l’utilisation d’un animal déjà entrainé par rapport à un animal naïf (réduction du nombre d’animaux). Cette utilisation continue se fera en accord avec l’équipe vétérinaire et dépendra de l’état de bien-être des animaux. 1 animal sera euthanasié pour l’étude post-mortem de son cerveau.

Remplacement

Avec les technologies actuelles, le présent projet ne peut être abordée qu'avec l’utilisation d’animaux. Nous ne pouvons pas utiliser de lignées cellulaires ou tissus, car ils ne présentent pas de processus perceptifs ou cognitifs. Les modèles informatiques du cerveau, ne permettent pas de comprendre, sans données empiriques préalables, quels algorithmes sont effectivement utilisés dans le cerveau réel en action. D’autre part, les études non invasives chez des sujets humains en bonne santé ne permettent pas d’enregistrer des signaux avec une résolution temporelle et spatiale suffisante pour étudier les mécanismes neuronaux. Le travail chez les patients humains est également limité, car pour des raisons éthiques, les enregistrements électrophysiologiques quand ils ont lieux ne peuvent pas cibler des régions d’intérêt scientifique mais uniquement des régions d’intérêt clinique. Il est donc impossible d’acquérir une compréhension mécanistique de la cognition sociale chez l’humain, les cultures cellulaires ou les cultures de tissus. Contrairement à d’autres animaux (ex. rongeurs/oiseaux), les fonctions cérébrales et l’anatomie des systèmes sensoriels des primates non humains (PNH) sont organisées autour de la modalité visuelle et sont ainsi homologues à l’Homme. Ces homologies concernent les systèmes neuraux et les stratégies cognitives et sociaux-cognitives des PNH, y compris certaines interactions sociales dont seuls les primates sont capables, ce qui n’est pas retrouvé dans d’autres modèles (ex. oiseaux/rongeurs). Comme nous comparerons nos résultats avec ceux observés chez l’humain, ce modèle est déterminant et le plus pertinent pour mener ce projet grâce à cette proximité.

Réduction

Les normes de publication, notre expérience, et les analyses statistiques indiquent que les données doivent être obtenues chez 6-8 animaux pour les expériences comportementales, 4-6 animaux pour l'imagerie, 2-3 animaux pour l’électrophysiologie, les neuromodulations, afin d'obtenir des données robustes et interprétables. L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) est sans doute la technique la plus efficace pour réduire le nombre d'animaux en fournissant des connaissances sur les régions cérébrales pertinentes à étudier ensuite par électrophysiologie. Sans cette connaissance, les enregistrements devraient être effectués dans tout le cerveau et pourraient nécessiter jusqu'à 10 fois plus d’animaux pour enregistrer dans toutes les régions possibles. De plus, l’utilisation d’agent de contraste lors des IRM fonctionnelles permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’acquisitions. Ainsi nous utiliserons 8 macaques dans notre projet, ces 8 animaux participeront aux tâches comportementales, puis seront répartis par groupe de 4 à l’IRMf et par groupe de 2 à l’électrophysiologie avec/sans perturbations de l'activité cérébrale. Ce point répond également à la nécessité d'obtenir plus d'informations à partir du même nombre d'animaux et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. Nous privilégierons de répéter nos enregistrements sur un même animal afin d’utiliser le plus faible nombre d’animaux possible. Nous utiliserons les tests statistiques adaptés pour analyser les données récoltées.

Raffinement

L’état de bien-être de l’animal est primordial et s’il y a une anomalie des mesures seront prises pour aider à le restaurer. Les animaux sont observés quotidiennement tout au long du projet et des points limites ont été établis pour assurer une prise de décision rapide et efficace pour s’assurer que le bien-être de l’animal est préservé. L’hébergement en groupe social, dans une animalerie aux paramètres surveillés quotidiennement (lumière, température, hygrométrie), ainsi que l’enrichissement et une alimentation adaptée sont mis en place pour stimuler les animaux et leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels. L’entraînement régulier par renforcement positif permettra d’instaurer une routine limitant les contentions et le stress lors des manipulations et des tâches demandées. Le contrôle hydrique sera adapté à la demande de chaque animal en ayant intégré les particularités individuelles. Les chirurgies et IRM anesthésiées sont réalisées sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après ; une réévaluation avec le vétérinaire est disponible si besoin). Lors des anesthésies, une surveillance des constances physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire, température…) est toujours mise en place et la température est maintenue. Le dispositif implanté sera le plus adapté possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie. Le post-opératoire sera surveillé avec une aide à l’alimentation pour faciliter la récupération, des enrichissements et une taille de la cage adaptée pour stimuler l’animal et faciliter les déplacements. La récupération complète est vérifiée avant la poursuite du projet.

Choix des espèces

Les singes Macaca mulatta, Macaca fascicularis (PNH) présentent des similitudes cognitives aux humains. Particulièrement, dans le domaine social : les macaques observent longuement leurs congénères ; sont socialement polyvalents ; leur environnement social, comme les sociétés humaines, comprend de nombreux paramètres qui nécessitent une extraction calculée des informations. Nous étudierons leurs connaissances des comportements sociaux complexes de leurs congénères, y compris d'un éventail d'interactions sociales dont seuls les primates sont capables. Leurs fonctions cérébrales et l’anatomie de leurs systèmes sensoriels sont organisées autour de la modalité visuelle et sont ainsi homologues à l’Homme. Comme nous comparerons nos résultats avec ceux observés chez l’humain, le modèle PNH est déterminant et le plus pertinent pour mener ce projet. Nous utiliserons des animaux adultes ou jeunes adultes (plus de 2ans), déjà sevré, car leur cerveau est à un stade mature nécessaire à nos recherches.

9 000 rongeurs, soit 7 200 rats et 1 800 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets indésirables de molécules sur la respiration, le système nerveux et le cœur. Outre les administrations de la molécule et les prises de sang, ils sont isolés jusqu'à 12 heures dans un pléthysmographe, contenus éveillés pour des tests neurologiques non détaillés, et une partie des rats reçoit par chirurgie un émetteur de télémétrie. L'établissement, spécialisé dans les études réglementaires, produit pour chaque composé un rapport d'effets adverses, étape d'un dossier qui débouchera "potentiellement sur la commercialisation d'un nouveau médicament". Les rongeurs sont tués en fin de procédure, et une partie, en général des rats porteurs d'un émetteur, peut être réutilisée dans des procédures sans réveil, comme un prélèvement d'organes, 3 000 étant déclarés réutilisés. Le porteur affirme que "Seule l'expérimentation animale permet de définir leur innocuité".

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’un futur médicament. Préalablement aux études cliniques, les effets d’une molécule sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques d’une molécule. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur les systèmes respiratoire, nerveux central et cardiovasculaire chez le rongeur. L’évaluation de la fonction respiratoire (rat/souris) se fera par pléthysmographie corporelle. Cette méthode permettra de déterminer les fréquences et volumes respiratoires.L'évaluation de la fonction neurologique (rat/souris) se fera par évaluation neurocomportementale. L'évaluation cardiologique (rat uniquement) se fera par électrocardiographie implantée ou externe (non invasive). La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé testé.

Bénéfices attendus

Actuellement dans le monde, les maladies cardiovasculaires font 17,9 millions (M) de morts par an, les cancers 10 M/an, les maladies neurologiques 9 M/an, les maladies infectieuses 7,7 M/an, les maladies respiratoires chroniques 3,9 M/an, le diabète 1,5 M/an. Pour un grand nombre de ces pathologies, il n’existe aucune solution thérapeutique satisfaisante. Cette demande d’autorisation de projet permettra de couvrir une étape importante, et indispensable sur le plan réglementaire, du développement de composés innovants. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’une molécule. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. La conduite d’études de pharmacologie de sécurité permettra : 1. d’améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. d’améliorer la sécurité des patients, en identifiant et caractérisant les effets indésirables d’une molécule 3. d’optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. de contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. de réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité et l'efficacité des traitements 6. de répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique d’une molécule. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers règlementaires qui permettront de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera potentiellement sur la commercialisation d’un nouveau médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration d'un composé thérapeutique par différentes voies selon les caractéristiques du composé testé ainsi que des prélèvements saugins. Les volumes et fréquences d'administration et de prélèvements sont établies en fonction des caractéristiques de chaque composé testé, dans le respect des recommandations des instances pharmacologiques et médicales internationales. Les animaux sont généralement anesthésiés pour ces prélèvements, mais peuvent être vigiable pour les administrations. Chaque geste dure généralement quelques minutes. Pour évaluer la fonction respiratoire, les animaux sont isolés dans un plesthymographe après une période d'habituation, au moins 30 minutes, et jusqu'à 12h maximum. Pour évaluer la fonction neurologique, des contentions et tests neurologiques sont effectués vigiles, pendant 10 environ. Pour évaluer la fonction cardiovasculaire, les animaux utilisés auront un émétteur télémétrique implanté par chirurgie avec la procédure décrite dans cette autorisation, ou bien auront un gilet (système non invasif) pouvant être porté en continue pusieurs jours d'affilée.

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. 1) Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress modéré. 2) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration de la molécule testée peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. . 3) Liées à une toxicité de la molécule testée : ce projet vise à évaluer les effets pharmacologiques, y compris délétères, d’une molécule. Cependant, les recommandations internationnales des agences de santé qui sont appliqué par l'établissement sont de choisir une dose ne produisant que des effets indésirables au maximum modérés, il n’est donc pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie.

Devenir

Afin d'éviter tout risque pour l'animal ou la santé publique, les animaux sont en 1er intention euthanasiés en fin de procédure. Une partie des animaux, généralement les rats disposant d'un émétteur télémétrique, peuvent être réutilisé dans des procédures sans réveil (ex : prélèvement d'organes). Dans certains cas, les animaux des groupes témoins peuvent être adopté, après avis vétérinaire et validation de la SBEA. La décision est prise au cas par cas, en fonction du protocole expérimentale de l'étude et du composé utilisé dans le groupe témoin.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule extérieur au corps et une ou plusieurs cibles en lien avec les systèmes respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires. Ces interactions recouvrent les effets potentiels de la molécules, ou de ses produits de dégradation sur les fonctions étudiées. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique avant tout essais chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • si nécessaire, des études pilotes seront réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux Concernant les études de pharmacologie de sécurité : le nombre d’animaux est fixé au minimum permettant de détecter statistiquement des effets adverses.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 5 à 15 jours selon le protocole, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à 3 par cage au minimum, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement . En parallèle, une échelle de douleur sera employée et un analgésique sera mis en place si nécessaire, après validation par un vétérinaire. • des soins vétérinaires adaptés seront mis en place si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, exception faite des animaux implantés avec un boitier de télémétrie. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface placé dans un gilet est en cours d'évaluation.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont régies par la ligne directrice ICH S7A. Ces études peuvent être réalisées sur des espèces rongeur et non rongeur. Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité et font l’objet de cette DAP. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines. Les données récuillies sur les études de la fonction neurologique et la fonction respiratoire sont plus robuste sur des animaux de 6-8 semaines et 8-12 semaines respectivement.

Pour mettre au point une technique de synchronisation des chaleurs à partir de progestérone extraite de plantes, 52 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une ovariectomie sous anesthésie générale, opération d'une trentaine de minutes, suivie de 12 prélèvements sanguins à la jugulaire, les brebis entières en subissant 31. La finalité reste zootechnique, remplacer les hormones de synthèse par des molécules végétales dans la maîtrise de la reproduction des troupeaux. Les brebis ne sont pas tuées à l'issue, elles retournent à l'unité expérimentale où le porteur les décrit comme "potentiellement réutilisables".

Objectifs

Mise au point, pour l'élevage caprin et ovin, d'une technique de synchronisation des oestrus et des ovulations à partir de progestérone et molécules associées, issues de plantes, en remplacement des techniques actuelles qui utilisent des substances de synthèse issues de l'industrie du médicament. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

1. Mise au point d'une technique durable de synchronisation des oestrus et des ovulations chez la chèvre et la brebis. 2. Fin de l'utilisation de substances chimiques de synthèse, remplacées par des molécules naturelles issues de plantes 3. Meilleure connaissance des contenus de certaines plantes en progestérone et molécules associées et du déterminisme génétique de ces contenus

Procédures

1. Ovariectomies réalisées en une seule fois sous 1 anesthésie générale dans l'EU1. L'opération dure une trentaine de minutes. Elle est réalisée par un chirurgien expérimenté. 2. Prélèvements sanguins à la veine jugulaire réalisés par des techniciens expérimentés. Chacun de ces animaux fera l'objet de 12 (ovx) ou 31 (entières) prélèvements ponctuels. Chaque prélèvement dure quelques secondes et sera réalisé dans l'EU2. 3. Pose d'une éponge intra vaginale contenant du FGA sur 15 chèvres de la partie 2 (chèvres entières) réalisée dans l'EU 02.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pre opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthsie, une irritation de l'appareil respiratoire supérieur (lié à lintubation) peut apparaître, mais c'est rare. Un hématome peut apparaître suite aux prises de sang à la veine jugulaire, ainsi qu'aux injections intramusculaires, mais c'est rare. Du fait que la progestérone, au contraire d'autres stéroïdes comme l'oestradiol, est plutôt connue par ses effets protecteurs que néfastes sur le fonctionnement cellulaire et sur le système nerveux central, nous n'attendons pas de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux liés à l'administration de progestérone. Toutefois, compte-tenu du fait qu'il y a des molécules associées à la progestérone et d'autres composés encore inconnus dans la plante étudiée, nous mettrons en place au cours de l'expérimentation, des observations précises (troubles comportementaux, digestifs ou autres manifestations visibles) sur les animaux recevant les préparations testées.

Devenir

Les expérimentations prévues n'occasionneront aucun désordre de long terme ni aucune invalidité permanente. Les animaux retourneront donc dans l'unité expérimentale où ils seront potentiellement réutilisables.

Remplacement

Nous nous intéressons à une réponse physiologique complexe. Des méthodes de remplacement, telles que des cultures de cellules ou une modélisation mathématique, ne peuvent, du fait de cette complexité extrême, être utilisées.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire, tout en conservant une bonne mise en évidence statistique. Sur la base d’un test-t et avec les concentrations de P4 attendues et des effectifs de 20(contrôle) et 20 (P4), on obtient une puissance de test de 100% .

Raffinement

Les animaux ovariectomisés recevront un traitement anti-douleur ; tous les animaux seront hébergés en groupe social sur paille et avec enrichissement (caisse en bois pour grimper). Le nombre de prises de sang a été réduit au minimum (ovx: 4 pour le premier jour et 2 par jour ensuite pendant 5 jours; entières : 1 par semaine pendant 3 semaines, puis 1 par jour pendant 4 semaines). Le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, distants de 300 mètres, sera réalisé dans une bétaillère agréée, conduite par un chauffeur et un animalier diplômés et expérimentés. La vitesse sur le centre est limitée à 30 kms/heure et, de ce fait, n'occasionnera pas de trouble supplémenaire aux animaux. De la paille fraîche sera répandue sur le sol du véhicule prélablement nettoyé, ocassionnant ainsi un confort certain aux animaux transportés.

Choix des espèces

Les ovins sont une des espèces qui utilisent ces traitements en ferme sur le terrain. Aucun traitement de synchronisation analogue n’existe sur des espèces modèles de type souris, rat, poisson-zèbre ou C. elegans et l’effet mâle n’existe pas dans ces dernières espèces, ce qui justifie l’utilisation de l’espèce caprine choisie qui est, en même temps, l’espèce modèle et celle à qui s’adressera la technique si celle-ci débouche sur le terrain. Animaux adultes femelles et mâles (pour l'induction des ovulations), donc âgés de deux ans ou plus et qui sont choisis pour être dans la moyenne des âges des brebis et béliers en production susceptibles, dans les élevages cibles, de recevoir le traitement utilisant la la plante de nos campagnes contenant de la progestérone naturelle.

Huit prises de sang et douze ponctions de liquide cérébrospinal par un port d'accès implanté sous la peau des lombes, posé au cours d'une chirurgie de moins de deux heures : cinq macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués quatre jours après l'injection du produit testé pour prélever leurs organes. Les actes se font sur animal vigile, avec des contentions de trois à quinze minutes, et le porteur mentionne un risque rare de lésion de la moelle épinière pouvant causer une paralysie des membres postérieurs. L'objet est de vérifier si un anticorps dirigé contre les plaques amyloïdes, couplé à une molécule de transport, franchit la barrière hémato-encéphalique, en vue d'une mise sur le marché. Le porteur retient le primate pour son néocortex élargi et sa proximité génétique avec l'être humain, et des animaux jeunes parce que les macaques de plus de quatre ans altéreraient la qualité des échantillons prélevés après leur mort.

Objectifs

L’anticorps testé dans le cadre de ce projet a été développé pour cibler et éliminer les plaques β-amyloïdes impliquées dans progression de la maladie d’Alzheimer chez l’Homme. Lorsqu’il est injecté seul dans un organisme, cet anticorps n’a pas la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et ne peut donc pas atteindre sa cible située dans le cerveau. Cependant, s’il est lié à une petite molécule spécifique (non thérapeutique), il peut être pris en charge par un récepteur se trouvant à la surface des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins et traverser la BHE. Le but final de ce projet est donc de déterminer si cet anticorps conjugué est capable de traverser la BHE chez le primate en étudiant son profil pharmacocinétique dans le sang, dans le liquide cérébro-spinal et sa biodistribution (notamment dans les tissus du système nerveux central). Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de ce candidat médicament. L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, le dosage utilisé dans ce projet est efficace pharmacologiquement mais non toxique (d’après une étude préliminaire toxicologique réalisée chez le primate).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation et la mise sur le marché d’un anticorps conçu pour cibler et éliminer les plaques β-amyloïdes impliquées dans progression de la maladie d’Alzheimer chez l’Homme.

Procédures

Après deux semaines d’habituation, une chirurgie peu invasive (de moins de 2h) sera réalisée sous anesthésie et analgésie sur l’ensemble des animaux (après une mise à jeun inférieure à 16h ) afin d’implanter un port d’accès sous-cutané en région lombaire dans le but de réaliser des prélèvements de liquide cérébro-spinal (LCS) répétés au cours du projet. Des prélèvements de sang et de LCS seront réalisés avant et après administration de l’anticorps afin d'étudier son profil pharmacocinétique (au maximum : 8 prélèvements sanguins et 12 prélèvements de LCS au total). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 15 minutes. Les animaux recevront la molécule test par une injection unique de moins d’une minute (temps de contention d’environ 10 min) entre 7 et 14 jours après la chirurgie (selon la récupération des animaux). L’ensemble des actes techniques réalisés au cours de ce projet (prélèvements et injections) seront effectués sur animal vigile (hormis la chirurgie). Le suivi des paramètres physiologiques (poids suivi 1x/semaine et température corporelle suivie 4 fois avant administration et 4 fois après administration) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Le projet prendra fin 4 jours après administration de l’anticorps.

Impact sur les animaux

Les administrations peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection, des ecchymoses ou des hématomes. Les prélèvements de sang et de LCS (par ponction d’un port d’accès en sous-cutanée) pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux. La chirurgie d’implantation pourra provoquer des douleurs légères ainsi que des réactions locales au niveau du site d’incision ou une infection post-opératoire. L'insertion d’une aiguille spinale dans l’espace vertébral peut provoquer des lésions de la moelle épinière pouvant causer une paralysie des membres postérieurs dans de très rares cas. L'anesthésie des animaux dans le cadre de ces interventions pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

À l’issue du projet, tous les animaux seront mis à mort afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution du produit.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer la demi-vie de l’anticorps, l’évolution de sa concentration dans le sang et dans le LCS au cours du temps et sa la localisation dans les tissus après administration (afin de déterminer où sera distribué l’anticorps thérapeutique). Ceci ne pourrait être obtenu in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, la biodistribution et la pharmacocinétique dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins (qui métabolisent et éliminent l’anticorps), ainsi que les barrières biologiques comme celle du cerveau. Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de suivre le trajet réel d’un anticorps et de comprendre s’il atteint efficacement sa cible.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 2 groupes ont été constitués pour un total de 5 animaux. Le premier groupe comprendra 2 animaux qui recevront l’anticorps seul (non couplé à la molécule permettant hypothétiquement le passage de la BHE). Ce groupe contrôle permettra de confirmer, ou non, que l’anticorps seul ne peut pas traverser la BHE. Deux animaux seront utilisés afin de pouvoir détecter une tendance dans le groupe. Le second groupe est constitué de 3 animaux qui recevront l’anticorps couplé à une petite molécule permettant le passage de la BHE. Ce groupe test permettra de déterminer si l’anticorps conjugué (candidat-médicament sous sa forme complète) est capable de traverser la BHE. 3 animaux seront utilisés car, en plus de pouvoir détecter une tendance dans le groupe, ce nombre permet de déceler toute valeur extrême, ce qui est un paramètre critique pour l’interprétation des résultats scientifiques du projet. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux sont acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de deux semaines avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Un traitement antibiotique et analgésique post-opératoire sera également mis en place. L’administration de l’anticorps et les prélèvements de sang et de LCS seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Cependant, une sédation pourra être envisagée en cas de besoin. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’anticorps étudié dans ce projet ayant pour objectif d’atteindre le système nerveux central (SNC) chez l’Homme, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité avec l'Homme en termes de patrimoine génétique et d’organisation fonctionnelle de son SNC (notamment concernant la barrière hématoencéphalique), le primate non humain (PNH) a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, il est admis que les PNH présentent de nombreuses similitudes que l'on ne retrouve pas chez d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie de séquence d'ADN, des schémas d'expression génique similaires entre les cerveaux de macaques et les cerveaux humains (contrairement aux cerveaux de souris). Aussi les primates et les humains ont en commun un néocortex considérablement élargi et une spécialisation des zones corticales par rapport aux souris. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de cet anticorps. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système nerveux central et la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses post mortem. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.