Procédures modérées

Au-delà d'un score de douleur de 3 sur 5, le traitement antalgique est réintroduit : c'est le seuil retenu pour 35 mini-porcs adultes soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une injection d'iodoacétate monosodique dans l'articulation de la mâchoire provoque une arthrose, avec douleur persistante à la mastication, limitation de l'ouverture buccale et perte de poids attendues. Chaque animal passe trois à quatre scanners de deux heures sous anesthésie générale, reçoit un hydrogel en injection percutanée, puis une prothèse articulaire posée par chirurgie ouverte. Les mêmes 35 porcs sont utilisés successivement pour créer le modèle, tester l'hydrogel et essayer la prothèse, ce que le porteur compte comme une réduction. Il décrit ces études comme "indispensables" au dossier de mise sur le marché du dispositif et impossibles à remplacer "légalement, techniquement ou éthiquement".

Objectifs

Les dysfonctions temporomandibulaires (DTM) touchent 5 à 12 % de la population, provoquant douleurs chroniques et limitation de l’ouverture buccale. Les traitements incluent des méthodes non-invasives (limitées aux formes mineures), des interventions mini-invasives (arthroscopie avec injection intra-articulaire d’anti-inflammatoires, de corticostéroïdes ou d’acide hyaluronique), et la chirurgie ouverte (pose de prothèse). Cependant, les traitements mini-invasifs sont souvent limités ou entraînent des effets indésirables. Actuellement, aucune substance injectable ne combine les avantages d’un visco-supplément et d’une action pharmacologique durable. Nous développons un hydrogel à base de chitosan et de naproxène, aux propriétés visco-élastiques et anti-inflammatoires. Des études sur le modèle de rat montrent une réduction des douleurs et des lésions d'ostéoarthrite après injection de cet hydrogel, mais une validation sur un modèle plus adapté est nécessaire avant une application clinique. La chirurgie par prothèse de l’articulation temporomandibulaire (ATM), réservée aux cas graves de destruction articulaire, est associée à une morbidité importante et des résultats fonctionnels limités. Elle implique l’amputation des trois parties de l'articulation, remplacées par une prothèse bi-compartimentale, entraînant une perte des mouvements latéraux. Nous cherchons à développer une prothèse mini-invasive "sur mesure", qui préserve les tissus osseux et le muscle ptérygoïdien latéral, améliorant ainsi les résultats fonctionnels et réduisant la morbidité. Ce projet vise à créer un modèle d’ostéoarthrite (OA) chez le mini-porc (souche « Goëttingen ») pour tester l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux pour les DTM. L'induction d'une OA de l'ATM par injection d'iodoacétate monosodique (MIA) a été validée chez le rat, mais ce modèle présente des limites empêchant son extrapolation à l’homme. En revanche, le modèle porcin est plus pertinent en raison de la similarité anatomique et fonctionnelle de l’ATM avec celle des humains. Après avoir validé l’induction d'une OA de l'ATM chez le mini-porc via injection de MIA, nous testerons la sécurité et l'efficacité de l'hydrogel à base de chitosan/naproxène, ainsi que la biocompatibilité d’une prothèse mini-invasive "sur mesure". Le projet sera realisé dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Bénéfices scientifiques : • Création et validation d’un modèle d’ostéoarthrite (OA) chez le porc : Ce modèle d’OA de l’articulation temporomandibulaire (ATM) chez un grand mammifère est essentiel pour le développement de nouveaux dispositifs médicaux avant leur application clinique. La validation de ce modèle va au-delà de l'évaluation de l'hydrogel ou de la prothèse dans ce projet. Elle propose un modèle simple et reproductible d’OA de l’ATM, utilisable pour toute recherche ultérieure, notamment pour tester d'autres dispositifs médicaux dans la prise en charge des dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). • Acquisition de connaissances scientifiques sur l’hydrogel et la prothèse : Cette étude permettra de mieux comprendre l’efficacité de l’hydrogel chitosan/naproxène ainsi que celle de la prothèse "mini-invasive" et "sur mesure" pour l’ATM, développée dans le cadre de ce projet. En fonction des résultats obtenus in vivo, la conception de la prothèse et la formulation de l’hydrogel pourront être ajustées et optimisées. 2. Bénéfices cliniques : • Validation de l’hydrogel et de la prothèse : En validant l’efficacité de l’hydrogel chitosan/naproxène et la biocompatibilité de la prothèse "mini-invasive" et "sur mesure" pour l’ATM, ces dispositifs médicaux ont des implications cliniques potentielles importantes. Ils pourraient représenter des avancées significatives dans la prise en charge des DTM, en réduisant la douleur et en restaurant la fonction de l’appareil manducateur. • Perspectives de recherche clinique : Des résultats concluants obtenus sur grand mammifère concernant l'hydrogel pourraient ouvrir la voie à des essais cliniques à moyen terme, permettant ainsi de tester ces avancées directement sur l'homme.

Procédures

Pour la réalisation du projet, les animaux subiront quatre types d'interventions distinctes : Les Scanners sont réalisés dans l'EU 2/2 , toutes les autres interventions sont réalisés dans l'EU 1/2 .1. Scanners (3 scanners par animal sur 6 mois) : o Cette intervention est peu invasive et consiste en la réalisation de quatre scanners au total. o Le premier scanner sert de référence et sera utilisé comme comparateur (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe induction du modèle). o Le deuxième scanner a pour but de confirmer la bonne induction de l'ostéoarthrite et sert de comparateur pour l’évaluation de l’hydrogel. o Le troisième scanner sera utilisé pour évaluer l’efficacité de l’hydrogel dans la deuxième procédure (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe évaluation hydrogel). o Le quatrième scanner est réalisé pour vérifier la bonne ostéointégration de la prothèse. o Chaque scanner nécessite le transport de l’animal sous anesthésie générale jusqu’à l’appareil, suivi de l'acquisition des images. La durée totale de l’intervention est d’environ 2 heures. 2. Injection de MIA : o Cette intervention vise à induire le modèle d’ostéoarthrite (OA) par une injection de iodoacétate monosodique (MIA) sous anesthésie générale. o Il s'agit d'une intervention peu invasive, réalisée par voie percutanée à J0. o La durée totale de l’intervention est d'environ 30 minutes. 3. Injection de l'hydrogel (uniquement pour les animaux faisant parti du groupe évaluation hydrogel) : o Sous anesthésie générale, cette intervention permet d'évaluer la performance de l'hydrogel médical par une injection percutanée à J60. o Cette intervention, également peu invasive, est réalisée en une seule fois. o L’ensemble de l’intervention dure environ 30 minutes. 4. Pose de la prothèse : o Cette intervention, réalisée sous anesthésie générale, est plus invasive. Elle consiste en la pose d’une prothèse articulaire. o En raison de son caractère invasif, les animaux bénéficieront d’un traitement analgésique ainsi que d'une antibiothérapie. o Cette intervention est réalisée à J120 et dure environ 2 heures.

Impact sur les animaux

Le projet présente plusieurs nuisances et effets indésirables potentiels, principalement liés à l’induction du modèle d’ostéoarthrite et à la chirurgie prothétique. Les principaux effets indésirables sont les suivants : • Douleur persistante au niveau de l'articulation temporomandibulaire (ATM) : La douleur, généralement légère, est due à l'inflammation initiale provoquée par l'injection intra-articulaire de MIA, suivie du développement de l'arthrose débutante. Cette douleur pourrait persister au fil du temps, en lien avec la progression du modèle d’ostéoarthrite. • Limitation des amplitudes mandibulaires : Une diminution de l'amplitude de l'ouverture buccale est attendue, en raison de l’inflammation et de la progression de l’ostéoarthrite, ce qui affecte la mobilité mandibulaire des animaux. • Perte de poids : Plusieurs facteurs peuvent contribuer à une perte de poids, notamment le stress expérimental, la limitation des amplitudes mandibulaires et la douleur à la mastication, qui pourrait affecter l'alimentation des animaux. • Complications per-opératoires lors de la pose de la prothèse (ces complications ne sont pas attendues mais possible) : o Perte sanguine : Les saignements per-opératoires sont possibles durant la chirurgie, en raison de la nature invasive de l’intervention. o Complications anesthésiques : Des complications respiratoires ou vasculaires liées à l’anesthésie générale pourraient survenir pendant la pose de la prothèse. • Complications post-opératoires suite à la pose de la prothèse (ces complications ne sont pas attendues mais possible) : o Infection et hyperthermie : Une infection au niveau de la zone opérée pourrait entraîner de la fièvre (hyperthermie) chez les animaux. o Désunion de la cicatrice pré-tragienne : Une mauvaise cicatrisation ou une désunion de la cicatrice au niveau de la zone pré-tragienne peut également constituer une complication post-opératoire.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Cette étude porte sur le développement préclinique de dispositifs médicaux destinés à l'articulation temporomandibulaire (ATM) dans la prise en charge des dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). Ces études animales sont indispensables pour constituer le dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM) du futur dispositif médical et ne peuvent être remplacées légalement, techniquement ou éthiquement par d'autres méthodes (tests in vitro, essais cliniques, etc.). Le modèle porcin est le plus approprié et couramment utilisé dans le cadre de l'ostéoarthrite en raison de la similitude anatomique avec l'homme, permettant ainsi une transposition fiable des résultats. De plus, les caractéristiques fonctionnelles et mécaniques de l'ATM du porc sont proches de celles de l'humain. Les tests préliminaires effectués sur des petits animaux pour l'hydrogel ont montré qu'ils ne peuvent se substituer aux études sur les grands mammifères, et la pose de prothèse ne peut techniquement pas être réalisée sur de petits animaux à cause de leur taille.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été optimisé. Ainsi, les 35 animaux utilisés pour la création du modèle ou pour tester l’hydrogel seront également réutilisés lors de la pose de la prothèse. Cependant, il est prévu d’interrompre la dernière étape (étape 3) dès que la validation de la prothèse est obtenue chez 6 animaux consécutifs. La validation de la prothèse est considérée acquise lorsqu'elle respecte les réglementations européennes en matière de mise sur le marché des dispositifs médicaux (Règlement (UE) 2017/745 relatif aux dispositifs médicaux). De plus, avant les expérimentations sur les porcs, les hydrogels ont été testés chez des rats, permettant ainsi de sélectionner les meilleurs hydrogel-candidats. Cette approche préliminaire a permis de ne retenir que les formulations les plus prometteuses, réduisant ainsi le nombre de porcs nécessaires aux tests, car seules les versions les plus performantes seront évaluées. Des moyens d’évaluation peu invasifs de l’OA, tels que le scanner ou l’examen clinique, seront utilisés afin de limiter le nombre d’animaux sacrifiés pour les analyses histologiques intermédiaires. Le nombre d’animaux du groupe témoin négatif a également été réduit, car la littérature a validé l’utilisation de sérum physiologique comme contrôle. Pour limiter le nombre d'essais par animal, la prothèse a été créée par Conception Assistée par Ordinateur (CAO), suivie d’un prototypage et réalisation d'essais mécaniques expérimentaux, permettant d'obtenir rapidement un modèle performant et adapté limitant une expérimentation animale « empirique ». Cette simulation numérique, associée à l’expertise d’une équipe chirurgicale expérimentée dans le domaine, nous permet d’optimiser les résultats attendus et de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, en limitant les risques d’échec lors des premières expérimentations. Le nombre d'animaux dans le groupe contrôle a été réduit, car la littérature valide l'utilisation de sérum physiologique comme contrôle. De plus, les études sur petits animaux (rats) menées sous le protocole Apafis 25897 ont permis de sélectionner les matériaux optimaux, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour les études chez le porc. Après euthanasie, des tissus pourront être prélevés par des utilisateurs du site pour leurs travaux nécessitant du matériel biologique porcin.

Raffinement

Les porcs sont hébergés par groupes de deux, avec un accès libre à l’eau. Leur alimentation est adaptée à leurs besoins physiologiques sous forme de bouillie (farine + eau), distribuée en mangeoire, sans modification alimentaire lors de l’induction du modèle. La capacité d’alimentation est soigneusement surveillée, et la quantité de nourriture non consommée est mesurée. En cas de forte chaleur, des glaçons enrichis sont proposés. Une période d’adaptation de 10 jours permet aux porcs de s’habituer aux manipulations et à la présence du personnel. En cas de problèmes de bien-être (diminution de l’appétit, évolution défavorable d’une plaie, agressivité), les porcs peuvent être hébergés individuellement. Toutes les interventions se font sous anesthésie générale après prémédication, avec des mesures strictes d’asepsie pour prévenir les infections postopératoires. La douleur est évaluée systématiquement et contrôlée par une anesthésie locale (chlorhydrate de ropivacaïne) au site opératoire, associée à la buprénorphine pendant l’intervention et un patch transdermique de fentanyl pour une analgésie continue sur trois jours, renouvelable si nécessaire. Si la douleur dépasse un seuil de 3/5 sur l’échelle PGS, le traitement antalgique est réintroduit. Plusieurs paramètres sont suivis pour garantir le bien-être des animaux : poids quotidien pendant une semaine après l’opération puis hebdomadaire, température, évaluation quotidienne de la plaie pendant une semaine et analyse comportementale (posture, sociabilité, mobilité). Pour limiter le stress et les souffrances liées au transport, des mesures de raffinement strictes sont appliquées : transport individuel dans des véhicules adaptés et sécurisés, prémédication systématique pour réduire le stress, manipulation par un personnel formé pour assurer une contention douce, transport court (11 km, environ 15 minutes), conditions environnementales optimisées dans les véhicules (ventilation, température, faible bruit) et suivi immédiat de l’état de santé des animaux à l’arrivée. Ces mesures visent à assurer un transport sécurisé et respectueux du bien-être animal, conformément aux recommandations de la directive européenne 2010/63/UE, et à limiter au maximum le stress, la douleur et les risques d’infection tout au long du protocole expérimental.

Choix des espèces

Le porc a été choisi comme modèle animal de référence pour cette étude. Parmi les grands mammifères, il est le plus couramment étudié dans le cadre de l’ostéoarthrite temporomandibulaire, en raison de sa proximité anatomique et histologique avec l'homme, permettant ainsi une transposition fiable des résultats vers l'application clinique chez l'humain. De plus, l'articulation temporomandibulaire (ATM) du porc présente des similarités fonctionnelles et mécaniques importantes avec celle de l'être humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour les études sur les dispositifs médicaux liés aux dysfonctionnements temporomandibulaires (DTM). Les modèles murins, bien qu’utiles dans d’autres types d’études, sont jugés trop petits pour la pose d'une prothèse de l’ATM. En conséquence, ils ne sont pas adaptés pour obtenir des données transférables à l’homme dans ce contexte. L'utilisation de brebis a été envisagée, mais ce modèle présente plusieurs inconvénients, notamment un manque de données préexistantes et une fragilité apparente lors des expérimentations périmandibulaires, difficultés partagées par l'équipe de la plateforme d'expérimentation animale. Les porcs seront utilisés à l’âge adulte, avec un poids situé entre 40 et 80 kg. Cela garantit que l’articulation est pleinement mature et que la croissance est terminée, évitant ainsi des biais dans les résultats liés à des modifications anatomiques dues à la croissance. Les porcs seront testés à l’âge adulte de leur développement avec un poids situé entre 40 et 80 kg afin d’avoir une articulation mature et une absence de croissance pouvant biaiser les résultats.

Génétiquement modifiées pour développer un diabète de type 2, les souris de ce projet grossissent jusqu'à une obésité que le texte qualifie lui-même de sévère et de "source de souffrance et d'inconfort". 1 080 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant dix semaines, subissent des ponctions dans une veine de la mâchoire en état vigile, une incision à la pointe de la queue, quatre séances d'imagerie cardiaque sous anesthésie, et passent jusqu'à vingt heures seules sur une grille, sans nourriture ni litière, pour le recueil d'urine. Les mâles restent isolés pendant tout le protocole. La mise à mort intervient après ouverture du thorax et mesure de la pression directement dans le cœur, et l'effectif prévoit 20 % d'animaux supplémentaires pour compenser la mortalité attendue en cours de route.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie progressive qui se caractérise par une incapacité du cœur à assurer un débit de sang suffisant pour couvrir les besoins du corps en oxygène, d’abord en cas d’effort puis même au repos. L'insuffisance cardiaque peut se caractériser par une diminution de la capacité du coeur à se remplir de sang, et ses causes sont multiples : âge, hypertension, obésité, diabète… Malgré les nombreuses recherches et études cliniques menées ainsi que l’arsenal thérapeutique déployé et testé, aucune thérapie semble être efficace en termes d’allongement de la durée de vie des patients atteint de cette maladie. Afin de pouvoir tester de nouveaux composés médicaments, le développement et l’utilisation de modèles animaux aux plus proches des atteintes cardiovasculaires de l'insuffisance cardiaque est nécessaire. Le modèle de souris génétiquement modifié pour exprimer des troubles du mébolisme et de la fonction rénale permet d'entrainer une insuffisance cardiaque similaire à ce que l'on retrouve chez l'Homme. Ainsi, l’objectif du projet est d’utiliser ce modèle d'insuffisance cardiaque pour évaluer l’efficacité de nouveaux composés à visée thérapeutique sur la progression de l’insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur un modèle de souris génétiquement modifiée d’insuffisance cardiaque . Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant de cette maladie.

Procédures

Au cours du protocole, plusieurs prélèvement de sang seront réalisés sur animaux vigiles au niveau de l'une des veines de la machoire et au niveau de la queue après une légère incision (1min par prélèvement). Les animaux seront soumis à plusieurs analyses d'imagerie cardiaque (4 fois maximum, 30min par analyse) réalisées sous anesthésie générale. Durant plusieurs heures (

Impact sur les animaux

Ce modèle de souris génétiquement modifié présente un phénotype dommageable et se traduit par le développement naturel de troubles métaboliques (exemple: augmentation du glucose dans le sang) et aboutit à un diabète de type 2. Ces effets entrainent une suralimentation et provoque une obésité sévère, source de souffrance et d’inconfort. Les souris mâles seront hébergées individuellement dans des cages et génére du stress. Le prélèvement de sang sur animal vigile nécessite une contention de l’animal pouvant être source de stress, ainsi qu’une ponction avec une aiguille dans l'une des veines de la mâchoire pouvant générer une douleur. L’étude du glucose sanguin nécessite une légère incision à la pointe de la queue entrainant un court saignement pouvant générer une douleur et du stress, et peut nécessiter une privation de nourriture lorsqu'elle est faite à jeun. L’utilisation des cages permettant de récolter l'urine requière l’hébergement individuel des souris sans alimentation et dans laquelle les souris sont uniquement placées sur une grille sans sciure et enrichissement et ce, sur plusieurs heures (20h au maximum). Des anesthésies gazeuses, provoquant une légère irritation des voies respiratoires, pourront être réalisées au cours du protocole afin de réaliser des examens du coeur sur plusieurs semaines. De même, en fin de protocole, des mesures de la pression sanguine seront effectuées dans la carotide et le coeur sur animal anesthésié à la suite de l’intubation des animaux et après l'ouverture du thorax pouvant être suivi par un prélèvement de sang dans le coeur. Un des effets indésirables potentiels est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. Le traitement par injection intra-péritonéale peut entrainer une inflammation de l'abdomen et le traitement par voie orale peut entrainer des fausses routes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car les mesures effectuées en fin de procédure sont des mesures terminales nécessitant l’ouverture de la cage thoracique pour les mesures de pression.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composés in vivo. Afin d’évaluer l’effet du composé sur l’insuffisance cardiaque, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’étudier les répercussions de la pathologie dans un système complexe entier ni d’évaluer l’efficacité d’un composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (n=18) pour ce projet est basé sur des données obtenues dans la littérature (n=12) qui prennent en compte que des critères d’inclusion stricts peuvent être appliqués (+ 20%) et que du fait des différentes procédures prévues il peut y avoir une mortalité des animaux (+ 20%). Les animaux sont répartis de manière homogène à la suite des pesées et mesures de glucose sanguin à jeun initiales. L’examen cardiaque par imagerie permet de faire un suivi tout au long du protocole sur le même animal limitant ainsi le nombre d’animaux. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus des animaux contrôles sont conservés en interne pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). Cela permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Avec le recul de plusieurs études, le nombre d’animaux par groupe pourra être revu à la baisse.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 7 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux sous anesthésie lors de l’imagerie cardiaque seront placés sur un tapis chauffant et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux. Après chaque prélèvement, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte de vu volume sanguin. Les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques, analgésiques et de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses, volume). Les mesures de pression sanguine réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'un analgésique.

Choix des espèces

La souris, classiquement utilisée en laboratoire, présente des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie vasculaire et cardiaque. La réponse pathophysiologique de la souris dans l'insuffisance cardiaque est comparable à celle des humains notamment en termes de modification du tissu cardiaque et de modification des pressions sanguines. De plus, ce modèle génétiquement modifié de souris développe des facteurs de comorbidités tels qu'un diabète de type 2 pouvant être à l’origine de l’insuffisance cardiaque chez l’Homme. Les souris utilisées auront au minimum 8 semaines. En effet, ce modèle est sensible à l’âge et la survenue de la pathologie apparait progressivement au cours du développement de l’animal. Un âge de 8 semaines correspond à l’âge minimum pour lequel les premiers symptômes apparaissent chez ces souris.

Des fragments de tumeurs prélevées sur des patients sont greffés sous la peau de 4 964 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal ne subit l'opération qu'une fois, sous anesthésie gazeuse, et la tumeur est ensuite suivie à l'œil et par palpation jusqu'à la mise à mort, qui permet d'analyser les organes et de mesurer la dissémination des cellules tumorales. Le texte annonce des conséquences systémiques "très limitées" et une simple gêne mécanique, sans indiquer jusqu'où les tumeurs sont laissées croître. Le même document annonce le développement de tumeurs cultivées en trois dimensions pour, à terme, remplacer progressivement les souris, tout en programmant près de cinq mille greffes.

Objectifs

La résistance aux traitements contre le cancer est un des plus grands défis auxquels nous faisons face. Certaines études estiment qu’elle est responsable de près de 90% des décès liés au cancer. Cette résistance peut se développer de deux façons : soit à cause de mutations génétiques qui permettent aux cellules cancéreuses de survivre au traitement, soit à cause de changements dans le comportement des cellules (appelés mécanismes épigénétiques), qui ne modifient pas leur ADN, mais influencent la manière dont elles réagissent au traitement. Le projet cherche à mieux comprendre comment ces mécanismes épigénétiques peuvent influencer la progression du cancer, la réponse du système immunitaire et la résistance aux traitements. Pour cela, des échantillons de tumeurs de patients atteints de différents types de cancer (comme les cancers digestifs, du poumon, des ovaires ou les sarcomes) seront prélevés avant puis après que la résistance au traitement soit établie. Ces échantillons seront ensuite étudiés chez la souris pour mieux comprendre les mécanismes de résistance. Au cours du projet, des modèles en 3D de tumeurs (appelés organoïdes) seront également créés, afin de pouvoir, à terme, continuer d’étudier les tumeurs sans avoir à utiliser autant de souris. L'ensemble de ce travail est essentiel pour aider les chercheurs et les médecins à mieux comprendre pourquoi certains traitements ne fonctionnent pas et à trouver de nouvelles stratégies pour vaincre le cancer.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements contre le cancer, notamment à travers l’étude des modifications non génétiques qui influencent la progression tumorale et la réponse aux thérapies. En analysant des échantillons de tumeurs de patients avant et après la résistance au traitement, ce projet offre de nouvelles perspectives pour des traitements plus efficaces et personnalisés. Il permettra de comprendre comment agissent de nouveaux médicaments prometteurs, de mieux comprendre l’interaction entre cancer et système immunitaire, et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces avancées pourraient améliorer la prise en charge des patients, prolonger l’efficacité des traitements et, à terme, offrir des solutions plus ciblées et moins agressives pour lutter contre le cancer.

Procédures

Des fragments tumoraux issus de patients seront greffés sur les animaux, après une anesthésie générale gazeuse ainsi que l’administration d’analgésiants sur les zones incisées. Chaque animal ne subira cette procédure qu’une seule fois, pour une durée comprise entre 3 minutes et 10 minutes, et les interventions seront faites en condition stériles et optimisées pour limiter la douleur animale, sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées sur les animaux seront principalement liées à la greffe des biopsies de tumeurs de patients. Possibilité de gêne mécanique modérée selon la taille de la tumeur et selon la localisation. Conséquences systémiques attendues très limitées, perte de poids modérée possible pour certaines greffes.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour analyses sur les tissus et les organes afin d'étudier les tumeurs et d’évaluer la dissémination éventuelle de cellules tumorales au niveau des organes adjacents.

Remplacement

Les modèles alternatifs, qui n’impliquent pas l’utilisation de modèles animaux, appelés in-vivo, ne permettent pas de représenter toute la complexité de l’environnement d’une tumeur. En effet, les tumeurs ne sont pas uniquement composées de cellules malignes présentant une prolifération aberrante, elles comprennent aussi un ensemble de cellules immunitaires qui régissent la biologie de la tumeur, et lui donnent des propriétés invasives ou métastatiques. Dans le cadre des cultures cellulaires dites classiques (c’est-à-dire en 2 dimensions), il n’est pas possible de mimer toutes ces diverses populations, et d’étudier les interactions entre les cellules du même système tumoral. Plus généralement, environ 95% des gènes codant pour les protéines sont identiques entre les souris et les humains, ce qui en fait un excellent modèle d’étude, plus fiable et robuste pour assurer un passage en clinique par la suite. En dépit des limites actuelles des modèles de tumeurs, nous nous efforcerons tout de même de développer des modèles de tumoroïdes, c’est-à-dire des modèles de tumeurs cultivés in-vitro mais qui sont assemblés sous forme d’une structure 3D. Bien qu’ils ne reflètent pas toute la complexité de l’environnement tumoral, ils sont aujourd’hui vastement utilisés pour des tests pharmacologiques précliniques, afin d’étudier la réponse des tumeurs à différents traitements. L’établissement de ces modèles nous permettra, à terme, de remplacer progressivement l’utilisation de modèles murins.

Réduction

Le nombre de souris anticipé sur la durée du projet a été déterminé en fonction de notre expérience concernant le taux de prise des modèles de tumeurs habituellement greffées. Les méthodes de greffes utilisées ont été pensées consciencieusement, de sorte à minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en maximisant le taux de prise afin d’assurer le succès de l’établissement du modèle. Le nombre d’animaux a été pensée en fonction du taux de succès des greffes, et l’estimation du nombre total reste une estimation maximale. Le projet prévoit de stabiliser les modèles par passages et de vérifier leur robustesse et la possibilité de la conserver par congélation pour des recherches futures.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et, dès l’apparition d’un signe de douleur, les animaux recevront un traitement. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et locale, et en présence d’analgésie, afin de limiter la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront attentivement surveillés après la chirurgie, afin de s’assurer du réveil correct de l’animal dans sa cage : il sera vérifié que la souris est vigile, réactive, mobile et se réalimente. Les animaux seront hébergés en groupe à tout moment, c’est-à-dire dès leur arrivée, après la chirurgie et sur toute la durée de leur vie. Les groupes recevront nourriture et boissons à volonté. Des points limites adaptés et des critères d’arrêt précoces de souffrance ont été définis, en vertu de la charte d’engagement en faveur du bien-être animal. Si les animaux sont amenés à présenter une faiblesse, des compléments alimentaires adaptés leurs seront proposés avec facilité d’accès.

Choix des espèces

L’intérêt d’utiliser des espèces murines pour la greffe de tumeurs humaines est que les souris présentent une similarité génétique et biologique avec l’espèce humaine, ce qui permet d’évaluer, de manière plus représentative, les processus tumoraux. Environ 95% des gènes codant pour les protéines sont identiques entre les souris et les humains. Ainsi, une fois les tumeurs greffées dans la souris, elles conservent leurs propriétés de colonisation et d’interaction avec leur microenvironnement. De plus, il est plus simple de suivre l’évolution tumorale en évitant tout acte invasif sur ces modèles, c'est à dire qu'il est aisé de suivre l'évolution de la tumeur de manière visuelle ainsi que par palpation, sans avoir à passer par une procédure dérangeante pour l'animal. Ce sont donc des souris âgées de 6 à 9 semaines, qui seront utilisées pour ces procédures. Ce stade de développement est celui généralement utilisé dans le cadre de greffes tumorales, car le taux de prise y est meilleur. Finalement, le sexe des souris pour les greffes est déterminé comme suit : pour les tumeurs ovariennes, des souris femelles seront préférées. Pour les autres modèles tumoraux (sarcomes, cholangiocarcinomes, tumeurs du poumon), des souris femelles ou mâles pourront être greffés de la même manière.

Réutilisés d'une étude à la suivante pendant quatre à cinq ans, 370 des 495 animaux impliqués repartent vers d'autres procédures, 30 chiens sont proposés à l'adoption et 95 animaux sont tués pour prélèvements terminaux. 225 cochons, 135 chiens et 135 macaques à longue queue vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à 40 administrations en dix semaines par minipompe, subir dix prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, des biopsies de peau ou d'organes sous anesthésie de deux heures, et passer jusqu'à quarante-huit heures seul en cage à métabolisme. Les effets des produits testés sont déclarés non prévisibles au lancement du projet. Le porteur écrit qu'avant toute administration à l'homme l'animal constitue un "passage obligatoire", et présente ces données comme une "étape indispensable" à la mise sur le marché de nouvelles molécules.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la tolérance locale et/ou systémique de futurs candidats médicaments après leur administration chez les non-rongeur. Dans le cadre de développement de nouveaux candidats médicaments, une modification de la formulation, de la voie d'administration ou un ajustement de la dose thérapeutique peut amener à étudier, dans ces nouvelles conditions, les effets sur l'état général de l'animal et/ou les effets en local, par exemple les effets sur la peau et l’étude de résidus du composé. Après administration du composé, une observation régulière des animaux sera réalisée grâce à une grille de surveillance adaptée à chaque étude et à chaque modèle animal. Également, une évaluation du comportement général pourra être effectuée. Des prélèvements répétés de sang ou des biopsies pourront être effectués au cours et/ou à la fin des études.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments ou des nouvelles formulations de médicaments déjà mis sur le marché, présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, les composés testés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire.

Procédures

Afin d'administrer les candidats médicaments aux animaux, différentes voies d'administration pourront être utilisées (2 minutes ou moins, sauf pour les administrations par minipompe qui peuvent se faire sur plusieurs jours et avec un maximum de 40 administrations sur 10 semaines). Des prélèvements sanguins (durée 2min, maximum 10 prélèvements sur 24h) pourront être réalisés. Également, des biopsies de peau (2 minutes ou moins) ou d'organes (2h sous anesthésie) pourront être réalisés. Pour les recueils urinaires, les animaux seront placés en cage à métabolisme sur une durée de 24h en général qui peut être augmenté jusqu’au 48h au maximum. Les animaux pourront éventuellement être mis à jeun la veille de l’administration pour une durée qui est fonction du produit testé (24h maximum).

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques (diarrhée, vomissement). Les animaux de ce projet pourront subir une contrainte lié à la privation de nourriture avant administration du produit ou une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration et de l'anesthésie, une contrainte lié à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour la collecte d’urine, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, une contrainte lié à l'anesthésie/sédation lors des poses d’intraflons, de cathéter veineux ou de minipompe.

Devenir

Lorsque les chiens ne peuvent pas être reutilisés (4 à 5 ans après leur arrivée), ils pourront être mis à l'adoption si leur état de santé le permet. Certains animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez les non-rongeur, car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer la tolérabilité ainsi que la pharmacocinétique d’une nouvelle molécule. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le chien, porc et le primate non humain sont des espèces non rongeur adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 3 à 6 animaux par groupe. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Le recours aux procédures d’anesthésie/analgésie adaptées dès que nécessaire • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages de prélèvements (Chien, PNH), • Des séances d'exercice et de jeu pour les animaux.

Choix des espèces

Les espèces (chien, porc, primate non humain) qui seront utilisés dans ce projet, sontles espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de tolérabilité et de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque ces espèces sont utilisées au cours du développement préclinique de ce produit). Ces espèces présentent des similarités physiologiques et cliniques avec l'homme et peuvent développer des pathologies analogues aux pathologies humaines. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse modifiée, laissées plusieurs mois, avant huit à vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses, en cholestérol et en sucre destiné à provoquer obésité, résistance à l'insuline, maladie du foie et athérosclérose. Suivent des mises à jeun, cinq microprélèvements de sang à la queue par test, des tests de tolérance au glucose et aux lipides sur animal vigile, et pour une partie une échographie cardiaque sous anesthésie. Les retombées annoncées se limitent à envisager un lipide comme marqueur de risque et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, quand l'obésité provoquée, elle, est immédiate. Le porteur affirme que le dialogue entre organes ne peut pas s'étudier en culture cellulaire et que le projet ne s'envisage qu'à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies métaboliques telles que l’obésité sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète, le cholestérol ou la maladie du foie gras. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les mécanismes suggérés dans la littérature scientifique, une modification de certaines cellules immunitaires pourrait avoir un rôle important. Parmi ces éléments, un lipide essentiel pourrait être crucial. Cependant, le mécanisme d’action n’est pas compris pour le moment. Nous souhaitons donc dans ce projet bloquer la production de ce lipide essentiel uniquement dans les cellules immunitaires identifiées comme importantes afin d’identifier les mécanismes que ce lipide contrôle, notamment dans la progression des troubles qui sont associés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés à l’émergence des maladies liées à l’obésité et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’athérosclérose ou l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des macrophages dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des macrophages dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager ce lipide comme un marqueur pertinent, et ainsi d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et finalement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une greffe de moelle osseuse qui implique une irradiation préalable (moins de 15 min) et une injection de cellules de moelle modifiées, sous anesthésie (5 min). Après plusieurs mois de repos pour que la greffe ait bien prise, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie. A la suite du régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h). Les réponses des souris à une ingestion de sucre ou de graisse seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements de sang à la queue (5) sur de courtes périodes (moins de 2h). De même, la réponse des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront distribuées équitablement afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur plusieurs jours grâce à des cages munies de divers capteurs. Enfin, une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie et un électrocardiogramme. Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les souris seront exposées à des régimes riches en graisses, en cholestérol, et en sucre pendant plusieurs semaines (8 à 24) afin d’induire une obésité et de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, maladies du foie non alcoolique, troubles du rythme, athérosclérose, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à l’obésité développée. L’injection de progéniteurs de moelle-osseuse aux souris pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération de la fonction des cellules immunitaires dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués

Réduction

Le projet impliquera 560 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en graisse utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 10 à 12 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour supporter la transplantation, seront utilisées. Les régimes obésogènes seront mis en place à l'âge de 12 à 16 semaines, afin de laisser le temps aux souris de récupérer de leur transplantation.

Sept jours enfermées seules dans une cage calorimétrique, sans congénères et sans enrichissement : 2 160 souris vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant hormonal sous la peau lors d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, puis des injections deux fois par semaine, une partie recevant en plus un régime gras pendant près de trois mois. Le déséquilibre hormonal ainsi provoqué doit reproduire un syndrome ovarien chronique et entraîne, selon le texte, prise de poids, résistance à l'insuline, anxiété accrue et agressivité perturbant la cohabitation. Les femelles utilisées ont 5 à 7 semaines, un stade prépubère retenu pour observer l'effet d'une perturbation hormonale prolongée sur le développement ovarien.

Objectifs

Certaines maladies chroniques touchant les ovaires peuvent entraîner des troubles hormonaux importants chez les femmes. Ces affections apparaissent souvent dès l’adolescence et peuvent évoluer au cours de la vie. Elles se manifestent notamment par des irrégularités menstruelles, une production excessive d’hormones masculines, une difficulté à ovuler ou à concevoir un enfant, ainsi que par la formation de petits kystes dans les ovaires. Ces troubles sont parfois associés à une prise de poids, à des problèmes de peau (acné), à une pilosité excessive ou à une chute de cheveux. Ils peuvent également augmenter le risque de développer d'autres maladies comme le diabète, l’hypertension ou certains troubles cardiovasculaires. L’origine de ces pathologies reste encore mal comprise, bien que des facteurs génétiques et liés au mode de vie soient probablement impliqués. Ces maladies peuvent aussi avoir un impact psychologique important, notamment en raison de l’infertilité ou de la modification de l’apparence physique. Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contribuent à l’apparition et au maintien de ces troubles, afin d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, qui présente des caractéristiques proches de celles observées dans ces maladies. Nous testerons si l’activation ou la régulation de certains processus biologiques naturels permet de limiter les manifestations les plus marquantes de la maladie. L’objectif est d’identifier de nouvelles stratégies pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes concernées, en agissant à la source des déséquilibres hormonaux et métaboliques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider, au sein de plusieurs modèles expérimentaux, une nouvelle approche thérapeutique ciblant les déséquilibres biologiques impliqués dans une maladie hormonale chronique des ovaires. Cette affection fréquente chez les femmes en âge de procréer est souvent sous-diagnostiquée. Elle constitue l’une des principales causes de troubles de la fertilité, et elle s’accompagne fréquemment de complications métaboliques, cardiovasculaires et psychologiques, ayant un impact significatif sur la santé globale et la qualité de vie des personnes concernées. Le développement d’un traitement capable de corriger les dérèglements hormonaux et métaboliques associés à cette pathologie pourrait contribuer à améliorer la fonction reproductive, à prévenir les complications à long terme, et à limiter l’apparition de maladies associées. En améliorant la prise en charge globale, cette approche permettrait aussi de réduire les coûts médicaux et sociaux liés à ces troubles. À terme, cette stratégie pourrait déboucher sur des solutions thérapeutiques innovantes et mieux tolérées, destinées à améliorer durablement la santé des patientes.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (environ 30 minutes), précédée et suivie d’une analgésie. Certaines souris recevront un régime alimentaire riche en graisses jusqu’à la fin de la procédure (durée du régime : 80 et 87 jours). Elles recevront des injections sur animaux vigiles, deux fois par semaine (quelques secondes). Certaines souris recevront également 4 à 5 injections d’une molécule supplémentaire (quelques secondes) sur animaux vigiles en 1 semaines ou en 4 semaines. La composition corporelle sera mesurée deux fois par une méthode non invasive, sans anesthésie (durée inférieure à 2 minutes). Elles seront également hébergées individuellement en cage (durée 7 jours) pour permettre de mesurer en continu des paramètres physiologiques tels que la consommation d’oxygène, la production de dioxyde de carbone, l’activité locomotrice.

Impact sur les animaux

Les souris recevront un implant hormonal sous-cutané destiné à reproduire les déséquilibres endocriniens caractéristiques de certaines maladies chroniques des ovaires. Cette intervention chirurgicale peut entraîner une réaction inflammatoire locale et un inconfort transitoire au site d’implantation. L’anesthésie générale utilisée peut provoquer une hypothermie, une dépression respiratoire, voire des troubles du réveil. Une mauvaise cicatrisation de la plaie, une dessiccation des tissus ou une gêne post-opératoire peuvent également survenir. Le déséquilibre hormonal induit peut entraîner une prise de poids, une résistance à l’insuline, des troubles glycémiques, une baisse de l’activité physique, une sécheresse cutanée, une modification du pelage, une anxiété accrue, ainsi qu’une augmentation de l’agressivité pouvant perturber la cohabitation des animaux. Une altération du comportement exploratoire est également observée dans certains cas. Certaines souris recevront des injections intrapéritonéales répétées, ce qui peut générer un stress lié à la contention, une douleur transitoire au point d’injection, ainsi qu’un risque d’irritation locale ou d’adhérences. Des infections, bien que rares, peuvent survenir aux sites d’injection ou de prélèvement. Les animaux seront également placés, pendant une semaine, en hébergement individuel dans des cages calorimétriques. Ce dispositif, indispensable à la mesure de paramètres métaboliques individuels, impose l’absence temporaire de cohabitation et d’enrichissement, ce qui peut induire un stress social et sensoriel. Le passage en cage calorimétrique ainsi que la manipulation répétée des animaux au cours du protocole peuvent également constituer des facteurs de stress supplémentaires.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Le laboratoire réalise un grand nombre d’expérimentations pour lesquelles les animaux ont été remplacés par des méthodes alternatives. Ces approches incluent notamment l’utilisation de modèles in vitro et d’outils in silico, utilisés dans les phases exploratoires pour limiter le recours aux animaux. Cependant, l’avancée du projet nécessite la mise en place d’expériences, justifiées, qui impliquent de l’expérimentation animale. L’étude des déséquilibres hormonaux et métaboliques liés aux maladies chroniques des ovaires implique des interactions complexes entre systèmes endocrinien, ovarien, nerveux et immunitaire, qui ne peuvent être fidèlement reproduites dans des systèmes alternatifs. Aucun modèle in vitro ou in silico ne permet actuellement d’évaluer l’impact d’une modulation hormonale prolongée sur l’ensemble des fonctions métaboliques, comportementales et reproductives. Le modèle animal reste donc indispensable pour valider les effets des interventions thérapeutiques dans un organisme entier, dans des conditions mimant au plus près la physiopathologie humaine.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2160 souris. Afin de limiter le nombre d’animaux témoins, les expérimentations seront regroupées autant que possible. Plusieurs tissus seront prélevés et analysés par différentes approches biologiques afin d’exploiter pleinement les données obtenues. Ces échantillons seront également partagés avec des collaborateurs, ce qui contribuera à réduire le nombre total d’animaux nécessaires. La taille des effectifs a été déterminée à l’aide d’un calcul de puissance, permettant d’utiliser le nombre minimal d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Des analyses statistiques seront effectuées pour interpréter correctement les effets observés et garantir la robustesse des conclusions.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront la réglementation en vigueur et seront optimisées en collaboration avec le personnel de l’animalerie afin d’assurer le bien-être des animaux. Les souris auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum, et leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification pour favoriser leur confort et leur comportement naturel. Une surveillance rigoureuse et régulière sera mise en place pour identifier rapidement tout signe de mal-être, tel que des yeux mi-clos, une réduction de l’activité ou des comportements anormaux, permettant ainsi une intervention précoce si nécessaire. Des points limites spécifiques à chaque type d’expérience seront définis afin de minimiser toute douleur ou souffrance. Une perte de poids significative, une altération marquée de l’état général ou l’apparition de signes cliniques sévères (difficultés respiratoires, prostration) entraîneront une évaluation immédiate et, si nécessaire, l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. Les réactions au site d’implantation et aux injections seront surveillées régulièrement afin de détecter précocement toute inflammation, infection ou complication locale. Des interventions seront prévues en cas de nécessité, incluant l’application d’antiseptiques ou l’administration d’analgésiques adaptés aux animaux présentant des signes de douleur. En cas de difficulté d’alimentation, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage pour garantir un apport nutritionnel suffisant. L’ensemble du personnel impliqué dans ce projet est spécifiquement formé aux bonnes pratiques d’expérimentation animale et suit une formation continue afin d’assurer des manipulations sécurisées et respectueuses du bien-être animal. Toutes les interventions seront réalisées dans le strict souci de réduire l’inconfort des animaux, notamment grâce à l’utilisation d’anesthésie et d’analgésie adaptées ainsi que de lampes chauffantes pour limiter l’hypothermie post-anesthésique. Les femelles présentant des signes d’agressivité liés à l’hyperandrogénie seront placées en hébergement individuel pour éviter les blessures et le stress liés aux interactions sociales conflictuelles. Si nécessaire, des ajustements en temps réel seront apportés aux conditions d’hébergement et aux protocoles expérimentaux afin d’améliorer le bien-être des animaux tout en garantissant la rigueur scientifique du projet.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur des considérations scientifiques et méthodologiques. La souris est un modèle bien établi, bénéficiant d’une expertise approfondie en élevage, en techniques expérimentales et en suivi vétérinaire. Le choix de la souris repose sur des critères scientifiques et pratiques. Il s’agit d’un modèle largement utilisé, pour lequel les connaissances en matière de manipulation, d’élevage et de suivi vétérinaire sont bien établies. Ce modèle permet de reproduire de manière fiable les manifestations cliniques observées dans certaines pathologies humaines, notamment en ce qui concerne les déséquilibres hormonaux, les troubles métaboliques et comportementaux. Les animaux utilisés dans ce projet présentent des caractéristiques compatibles avec l’étude des effets d’un déséquilibre hormonal prolongé. Ils sont viables, fertiles et ne présentent pas d’anomalies phénotypiques connues. Les expérimentations seront réalisées chez des femelles âgées de 5 à 7 semaines, correspondant à une période prépubère. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour étudier l’impact des perturbations hormonales sur le développement ovarien et les fonctions métaboliques à long terme.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant deux fois seize heures en cage métabolique individuelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit cinq injections quotidiennes de diurétique en état vigile, d'autres subissent une chirurgie sous anesthésie pour la pose d'une minipompe délivrant une molécule en continu, les souris témoins étant elles aussi ouvertes puis suturées pour rester comparables. Le protocole associe un régime pauvre en sel et une eau enrichie en oxalate afin de provoquer une atteinte rénale par cristaux, l'objectif déclaré étant de comprendre une néphropathie mal connue chez les patients déshydratés. Les critères d'arrêt sont la prostration ou la perte de 10 % du poids initial. Sur les atteintes, le porteur affirme que les souris ne seront pas impactées par la déshydratation grâce à la brièveté du protocole, tout en indiquant que l'ajout d'une autre molécule pourrait induire une insuffisance rénale modérée.

Objectifs

Notre projet porte sur l’étude de l’absorption digestive de l’oxalate dans le côlon en situation de déshydratation. L’oxalate est une petite molécule éliminée dans l’urine, qui précipite avec le calcium urinaire, formant des cristaux d’oxalate de calcium dans les reins et pouvant entrainer une insuffisance rénale aigue liée à une néphropathie oxalique dite « cristalline ». L’hyperoxalurie peut être génétique (production accrue d’oxalate par le foie) ou dgestive (absorption accrue de l’oxalate dans le côlon. Cependant, certains patients développent des insuffisances rénales aigües avec précipitation d’oxalate de calcium dans des circonstances de déshydratation extracellulaire (dû à des vomissements et/ou diarrhées, diurétiques...) sans que l’on identifie de cause classique d’hyperoxalurie. Le transporteur « DRA » au niveau colique permet le transport du chlore et de l'oxalate. Notre but est de montrer, lors d'un état de déshydratation, une augmentation de stimulation de ce transporteur, induisant ainsi une augmentation de l’absorption digestive de l’oxalate et par conséquent une augmentation de l’oxalate urinaire. L’objectif est de comprendre la physiopathologie d’une néphropathie cristalline encore mal connue, probablement plus fréquente que supposé, et de mieux comprendre la physiopathologie de l’hyperoxalurie suite à une déplétion sodée importante. Cette étude permettra également de déterminer la mise en place des mesures préventives spécifiques lors des épisodes de déshydratation extracellulaire chez les patients atteints de syndrome de grêles court ou autres conditions à risque de néphropathie oxalique.

Bénéfices attendus

Ce projet aura un impact clinique important si nos hypothèses se confirment. La néphropathie oxalique est caractérisée par la précipitation de cristaux d’oxalate et de calcium dans les tubules rénaux. Cette néphropathie peut entraîner une insuffisance rénale terminale dans 50 pourcents des cas. Sa fréquence est non négligeable. Cette prévalence augmente drastiquement dans les groupes de patients à risque, notamment les situations de malabsorption, qui concernent jusqu'à 50 pourcents des diagnostics de néphropathie oxalique. Ce projet permettrait de confirmer la voie innovante d'un potentiel effet propre de la déplétion sodée sur l'augmentation de l'activité de transport digestif de l'oxalate, menant ainsi à une hyperoxalurie digestive, tout en se passant de la voie physiopathologique classique malabsorptive (sus-mentionnée). En effet, les patients atteints de diarrhée chronique avec malabsorption (comme dans les situations de syndrome de grêle court, de maladie de Crohn...) sont affectés par une hyperoxalurie massive qui conduit au développement d'une insuffisance rénale. Si cette oxalurie est liée en partie à l'effet de l'angiotensine 2, cela permettra de prendre en compte la part liée à la déshydratation dans l’apparition de cette néphropathie, et de prévenir davantage le déclin de la fonction rénale en adaptant les apports hydro-sodés chez ces patients.

Procédures

Une partie des souris seront sous régime alimentaire pauvre en sel ou enrichie en oxalate (eau de boisson) pendant 5 jours ou 14 jours. Toutes les souris seront exposées à 2 reprises à un recueil urinaire en cages métaboliques en état vigiles au cours de chacune des procédures (15 jours avant le traitement et jour 5 ou jour 14 après le premier traitement) sur une durée de 16h impliquant un hébergement individuel. Certaines souris auront également des injections quotidiennes d'un diurétique pendant toute la procédure (5j), soit 5 injections au total sur souris vigile (durée de l’acte moins de 5 secondes). D'autres souris seront également soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant la mise en place d'une pompe osmotique délivrant en continu une molécule (la mise en place de la pompe dure environ 5 minutes). Enfin, à l’issue de la période de maintien, tous les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin (durée de cet acte 1 minutes) sous anesthésie et analgésie qui sera suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées en diurétique ou en diluant seul administré quotidiennement. L’exposition à une alimentation pauvre en sel ne devrait pas avoir d'impact majeur sur les animaux qui seront en déshydratation extracellulaire modérée. Les souris ne seront pas impactées par cette déshydratation modérée grâce à la durée courte du protocole. En revanche, l'ajout de petites doses d’une autre molécule associé à ce régime pourrait induire une insuffisance rénale modérée, qui ne devrait pas avoir de retentissement pour les animaux grâce à une surveillance adaptée (mesure du poids). Les changements de régimes pourraient induire un léger stress chez les souris qui sont néophobes (peur de la nouveauté). Les injections sont nécessaires pour la mise en place du modèle pourraient induire un stress lors de la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille). Dans l’un des modèles, des mini pompes seront installées sous anesthésie générale/analgésie pour délivrer des molécules en continu ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Comme pour toute chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie (rare), elle peut induite des douleurs/irritations notamment au niveau de la suture, ou encore des complications liées à l'anesthésie (stress thermique, détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire). De même, les souris contrôles devront également être anesthésiées, ouvertes et suturées et recevront 2 injections d’une analgésie pour garantir le même traitement des souris et éviter un bais suite à la chirurgie et de l’injection. Le recueil d'urine en cage métabolique peut induire un stress social pour les animaux. Enfin, un prélèvement sanguin unique et terminal sera effectué en fin de période, sous anesthésie et analgésie sans autre contrainte que la piqure permettant l’anesthésie correspondant à un stress lié à la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le mécanisme du système rénine angiotensine suite à une déplétion sodée avec ou sans apport d'oxalate sur les transporteurs rénaux et du tube digestif. Pour cela, nous souhaitons mettre en évidence la physiopathologie de plusieurs organes (reins, colon, foie) lors d'une déplétion sodée et l'expression des transporteurs d'oxalate ainsi que la réponse du système rénine angiotensine suite à ce stimulus. L'implication de plusieurs organes avec une supplémentation en oxalate (alimentation) et d'un traitement ne nous permet pas de réaliser ces procédures sur des cellules ou des organoïdes. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable. Les essais thérapeutiques sur le modèle d'insuffisance rénale ne peuvent être réalisés que sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. La taille des effectifs a été établis grâce à un calcul de puissance pour prendre en compte les risques afin de réduire au maximum d’animaux utilisés. Le nombre de 10 animaux par groupe est issu notamment de l’expérience dans le modèle connu de l’équipe. Un calcul de puissance nous a permis de déterminer un nombre minimal de 8 souris par groupe, auquel nous préférons ajouter un pourcentage de sureté expérimentale et pour pallier aux potentiels variabilités interindividuelles, soit 10 souris par groupe. Pour des raisons de reproductibilité, nous réaliserons une deuxième série, soit 20 souris par groupe. De plus, nous utiliserons des tests afin de prendre en compte l’effectif des souris par groupe et pourvoir obtenir des résultats fiables et les interpréter. Nous utiliserons également d’autres tests pour la comparaison de plusieurs groupes. Le nombre d'animaux prévu est de 240 souris à ratio égale de mâles et femelles de 3 mois.

Raffinement

La prise hydrique est contrôlée lors du change de biberons et si nous observons un groupe plus ou moins déshydraté, le personnel pourra ajouter de la nourriture hydratée directement dans la cage. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Si une agressivité est observée, les souris seront placées en hébergement individuel pour une durée de 5 heures. Lors du regroupement au décours des 5 heures, les cages seront enrichies avec des cocoons et de la sizale en plus. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de 10 pour cent du poids initial (les animaux seront pesés tous les jours). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure par du personnel qualifié (écarts de poids, apparence physique externe, changement de comportement, évolution des signe cliniques, degré d’activité). Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et repérer tout saignement et/ou risque d'infections. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. Des mini-pompes osmotiques seront installées, sous anesthésie générale, sous la peau des souris ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Un analgésique sera donné aux souris 30 min avant le début de la chirurgie puis 5-6h après. Si des signes de douleurs persistent et sont détectés 20 heures après la chirurgie, l’analgésie pourra être injectée une troisième fois. Concernant la chirurgie, si au-delà de 48 heures post chirurgie, les souris présentent toujours des signes de douleur ou agitation, nous considèrerons que ce point limite nuit au bien-être animal et la souris sera euthanasié.

Choix des espèces

Le protocole ne peut pas être réalisé sur des cellules ou organoïdes, mais afin de pouvoir étudier la physiologie de plusieurs organes dans son ensemble, cela doit être réalisé sur un organisme entier. Le modèle murin permet d’avoir des résultats fiables en limitant au minimum le nombre d’animaux nécessaires ainsi que l’impact du protocole sur le bien-être des animaux. Pour les procédures, nous utiliserons des souris de 3 mois, âge à partir duquel les souris seront assez robustes pour supporter 16 heures dans une cage métabolique (cage individuelle avec grille avec un accès illimité à la boisson) et obtenir une quantité suffisante d'urine. Nous achèterons des souris qui auront 11 semaines et auront 1 semaine d’acclimatation avant les protocoles. Les souris auront donc 12 semaines au moment du protocole.

Jusqu'à huit heures d'IRM fonctionnelle par séance, deux séances par mois, et une chirurgie cérébrale pouvant durer six heures pour implanter des dispositifs d'enregistrement. 18 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certains maintenus éveillés et immobilisés dans une chaise de contention, récompensés à l'eau, au jus ou aux fruits. Le projet vise à augmenter la résolution de l'IRM fonctionnelle, puis à étudier la conscience et l'effet de l'ocytocine sur le comportement social, l'hormone étant délivrée dans le cerveau par ultrasons focalisés une fois toutes les deux semaines. Le porteur affirme que les macaques sont les seuls animaux non-humains capables d'apprendre ces tâches dans un délai raisonnable, et prévoit qu'ils soient gardés en vie et réutilisés dans d'autres projets après avis du vétérinaire.

Objectifs

Comprendre Comment Notre Cerveau Traite les Informations Visuelles Les zones visuelles du cerveau sont organisées en petits compartiments qui traitent différents signaux visuels, tels que la couleur et le mouvement. Pour comprendre comment ces compartiments fonctionnent ensemble, les chercheurs utilisent généralement des techniques invasives ou étudient le cerveau après qu'il a été retiré du corps. Cependant, une technique non invasive peut être utilisée pour étudier l'ensemble du cerveau sans l'endommager. Améliorer la Technologie de Scanner Cérébral Les technologies actuelles d’imageries ne sont pas assez précises pour étudier les petits compartiments dans le cerveau. Notre objectif est de développer une technique plus avancée qui peut détecter ces petites zones en utilisant des scanners IRM puissants et un équipement spécialement conçu. Nous testerons cette nouvelle technique en comparant ses résultats avec ceux d'autres méthodes. Mieux comprendre la Conscience et le Comportement Social Avec notre technologie améliorée, nous visons à répondre à deux grandes questions : 1. Comment différentes parties du cerveau travaillent-elles ensemble pour créer des expériences conscientes ? Nous étudierons certaines zones du cerveau pour comprendre comment il traite l'information à très fins niveaux. 2. Comment une hormone impliquée dans le comportement social affecte-t-elle le cerveau ? Nous utiliserons notre nouvelle technique d’imagerie et une méthode non invasive pour administrer cette hormone à des zones spécifiques du cerveau, ce qui pourrait nous aider à développer de meilleurs traitements pour les troubles du comportement social comme l'autisme. En repoussant les limites de la technologie IRMf, nous espérons obtenir une compréhension plus approfondie de la manière dont nos cerveaux fonctionnent et développer de nouvelles façons de traiter les troubles neurologiques.

Bénéfices attendus

Comprendre la Conscience: Notre projet vise à améliorer notre compréhension de la manière dont nos cerveaux créent des expériences conscientes. En utilisant une technologie avancée pour étudier le cerveau, nous pouvons cartographier les schémas d'activité cérébraux avec plus de détails, ce qui nous aidera à comprendre comment différentes régions du cerveau travaillent ensemble pour nous rendre conscients du monde qui nous entoure. Cette connaissance peut également être utilisée pour développer de nouveaux traitements contre certains troubles affectant la conscience, tels que le coma ou les états végétatifs. Comprendre le Comportement Social: Nous développons une méthode non invasive pour administrer une substance naturellement présente impliquée dans le comportement social directement à des parties spécifiques du cerveau. En combinant cette approche avec une technologie avancée pour étudier le cerveau, nous pouvons examiner comment cette substance affecte les interactions sociales, y compris notre capacité à lire les expressions faciales. Les résultats de cette recherche pourraient avoir des implications importantes pour le traitement des conditions liées au comportement social, comme l'autisme et les troubles d'anxiété sociale. Avancées dans la Recherche sur le Cerveau: Notre projet a le potentiel de fortement impacter la recherche sur le cerveau et le traitement. En développant une méthode pour administrer des médicaments directement à des parties spécifiques du cerveau, les chercheurs peuvent améliorer les traitements pour diverses pathologies. De plus, la technologie utilisée dans cette étude permettra d’étudier le cerveau dans un niveau de détails jamais ateint auparavant, ce qui mènera à de nouvelles découvertes sur le fonctionnement du cerveau humain.

Procédures

Les animaux impliqués dans cette étude subiront diverses procédures, notamment des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM),. Les scans fonctionnels (IRMf) durent au maximum 8 heures, au nombres de 2 par mois maximum par animal. Certains animaux auront également de petits dispositifs implantés dans leur cerveau pour enregistrer l'activité cérébrale, ce qui nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie durant au maximum 6 heures. De plus, chaque animal recevra au maximum 1 injection toutes les deux semaines par un processus utilisant de l'énergie ultrasonore focalisée Certains animaux seront éveillés pendant les procédures et pourraient ressentir une certaine détresse ou anxiété en raison de l'environnement inhabituel et de la manipulation par les chercheurs. D'autres seront anesthésiés au maximum deux fois par mois, pour certaines procédures, comme la chirurgie (moins de 2h) ou les scanners IRM (6h au maximum), afin de minimiser leur stress et leur inconfort. Les chercheurs surveilleront de près le comportement et les réponses physiologiques des animaux pour s'assurer qu'ils ne subissent pas un état de stress trop important.

Impact sur les animaux

Les animaux impliqués dans cette étude seront pris en charge dans un environnement contrôlé, ce qui pourrait leur causer un certain inconfort ou stress en raison des restrictions de mouvement ou des changements dans leur routine quotidienne. Certaines procédures impliquées dans l'étude nécessitent une chirurgie, qui comporte certains risques (en fonction de l’opération : Infections, hematomes, hémoragies, douleurs post opératoire…), comme toute intervention chirurgicale. Pendant un court moment après la chirurgie, les animaux pourraient ressentir de la douleur ou de l'inconfort et devront peut-être s'adapter à des changements temporaires dans leurs habitudes alimentaires ou d'activité. De plus, l'utilisation de la technologie IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) peut causer un certain inconfort en raison des bruits forts et de l'espace confiné. Dans le cadre de l'étude, une procédure utilisant des ultrasons sera utilisée pour administrer une hormone impliquée dans le comportement social. Cette procédure est généralement sûre, mais il existe un faible risque de changements temporaires de la pression artérielle ou d'un léger inconfort au site d'application. L'hormone elle-même peut avoir certains effets temporaires sur le comportement ou la physiologie, tels que des changements dans les interactions sociales ou la fréquence cardiaque, mais ces effets sont généralement légers et de courte durée.

Devenir

Animaux gardé en vie et reutilisés dans d’autres projet après avis du veterinaire.

Remplacement

Dans cette étude, il n'est pas possible d'utiliser des humains comme substituts aux animaux car certaines des procédures que nous devons effectuer ne peuvent être réalisées en toute sécurité ou efficacement sur les humains. Certaines techniques qui nous permettent d'étudier l'activité cérébrale en détail sont trop invasives pour les sujets humains, sauf dans de rares cas où des patients atteints de troubles neurologiques subissent des procédures médicales temporaires. De plus, certains des équipements que nous utilisons ne sont pas encore adaptés à l'usage humain, ce qui rend les modèles animaux essentiels pour notre étude. Nous ne pouvons pas non plus compter sur des simulations informatiques pour étudier des mécanismes cérébraux complexes car ils ne sont pas suffisamment bien compris. Quant à l'utilisation d'animaux autres que les primates, ce n'est pas possible car nous avons besoin d'un animal capable de réaliser des tâches complexes, concentrer son attention et comprendre les interactions sociales. Les macaques sont les seuls animaux non humains qui peuvent apprendre à faire ces tâches dans un délai raisonnable. De plus, leur structure cérébrale est plus similaire à celle des humains que celle d'autres animaux, ce qui en fait de meilleurs modèles pour notre étude. Enfin, bien que certains petits animaux aient des comportements sociaux similaires, ils ne sont pas des substituts appropriés car leurs cerveaux intégrent les informations différemment et manquent de régions spécialisées présentes dans les cerveaux humains qui permettent certaines fonctions complexes étudiées dans cette étude.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux nécessaires à cette recherche, nous n'utiliserons que quelques individus par condition expérimentale - généralement 2-3. C'est le nombre minimum qui nous permet d'obtenir des résultats fiables et de confirmer nos découvertes sur plusieurs animaux. À mesure que nous collectons des données, nous les analyserons soigneusement en cours de route. Cela nous aidera à identifier quand nous aurons recueilli suffisamment d'informations, afin que nous puissions arrêter de collecter des données et éviter des procédures inutiles. Les procédures succéssives comportent peu d’effets indésirables sur les animaux, c’est pourquoi nous incluons les mêmes animaux dans plusieurs expériences, et pouvons réduire le nombre total d'animaux nécessaires à notre étude. Par exemple, certains groupes d'animaux participeront à deux sous-projets distincts, ce qui nous aide à atteindre notre objectif de minimiser l'utilisation des animaux tout en continuant à progresser dans la compréhension de questions scientifiques importantes.

Raffinement

Nous voulons nous assurer que les animaux ne sont pas stressé pendant les sessions d'entraînement. Pour y parvenir, nous leur fournissons des chaises spécialement conçues qui répondent à leurs besoins individuels. Ils participent à des tâches cognitives et reçoivent des récompenses telles que de l'eau, du jus, des fruits ou d'autres aliments. Nous limitons les sessions à une durée de 1 et 4 heures, et nous arrêtons lorsque l'animal semble prêt à faire une pause. Pour minimiser l'inconfort et la douleur, nous utilisons des médicaments (anesthésie/analgésie) chaque fois que nécessaire pendant les procédures. Un protocole d’anesthésie sera mis en place pour toute intervention le nécessitant. Nous utiliserons les anesthésiants limitant au maximum l’inconfort. Des points limites précoces et spécifiques sont établis pour réduire au maximum la souffrance et le stress des animaux. Les animaux seront écartés du projet si leur bien-être ou leur santé sont impactés. Nous nous efforçons d’offrir aux animaux un environnement stimulant qui favorise leur bien-être. Pour y parvenir, nous avons mis en place des programmes d'enrichissement conçus pour les maintenir actifs. De plus, nous nous efforçons de veiller au bien être animal. Nous les logeons en groupes sociaux, et utilisons des techniques non invasives chaque fois que possible. Par exemple, nous administrons des médicaments directement dans le cerveau en utilisant une technique spécialisée non invasive, et nous utilisons des systèmes de navigation avancés pour éviter de les sédater pendant les procédures. Après toute intervention chirurgicale, nous veillons à ce qu'ils reçoivent des soins appropriés avec des antibiotiques et des médicaments antidouleur.

Choix des espèces

Pour étudier certains aspects du comportement humain et du fonctionnement cérébral, les chercheurs doivent utiliser des animaux étroitement apparentés aux humains. Dans ce cas, les primates non humains sont le meilleur choix car ils partagent de nombreuses similarités avec nous, ce qui en fait un modèle idéal pour s'assurer que les résultats de l'étude sont pertinents pour les humains. La manière dont différentes parties du cerveau sont organisées chez les primates non humains est plus similaire à celle des humains. Pour étudier des fonctions et comportements complexes, le stade de développement adulte des primates non humains est nécéssaire. Primates adultes, car le développement cérébral doit être terminé. L'une des raisons pour lesquelles d'autres animaux ne conviennent pas à ce type de recherche est que leur cerveau fonctionne différemment du nôtre. Par exemple, certaines tâches réalisables facilement par les humains et les primates non humains peuvent être difficiles ou impossibles pour d'autres animaux. D'autres animaux comme les souris ou les rats ne peuvent pas être utilisés comme substituts aux primates non humains dans cette étude. Cela est dû au fait que ces petits animaux présentent des différences clés dans leur cerveau et leur comportement qui les rendent moins appropriés à l'étude de certains aspects de la biologie humaine. Plus précisément, ils manquent de régions cérébrales spécialisées présentes chez les humains et nos proches parents, qui permettent les fonctions complexes sur lesquelles se concentre cette étude.

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer 48 heures seule en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent quinze jours d'un médicament qui reproduit les symptômes du syndrome de Gitelman, jusqu'à quinze jours de gavages deux fois par jour avec un risque de fausse route, deux prélèvements sanguins sous anesthésie, ou une chirurgie sans réveil pour prélever leurs reins. Le porteur écrit qu'aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure, et qu'une souris dont l'état se dégrade en cage à métabolisme est ramenée en hébergement classique avant le franchissement des points limites, sa mise à mort pouvant ensuite être envisagée.

Objectifs

Le syndrome de Gitelman est une maladie génétique rare conduisant à une perte rénale de sel qui s’accompagne d’une déshydratation modérée, d’une perte rénale de potassium et de magnésium ce qui provoque une baisse de leur concentration plasmatique (hypokaliémie et hypomagnésémie). La prévalence de cette maladie est de 1 sur 40000. Ce syndrome est dû à des mutations inactivatrices d’un gène codant pour un co-transporteur sodium et chlorure. A noter, qu’il existe un inhibiteur pharmacologique (la famille des thiazides) utilisé dans le traitement de l’hypertension qui reproduit les effets de ces mutations. L’hypokaliémie chronique entraine souvent de la fatigue et des troubles du rythme cardiaque. Des protéines participent à la conservation du potassium et ce projet vise à étudier si deux d’entre elles pourraient être mises en jeu dans le syndrome de Gitelman pour limiter la perte de potassium et l’hypokaliémie.

Bénéfices attendus

La découverte récente d’un lien entre un facteur de croissance, un transporteur rénal de potassium et la capacité du rein à retenir le potassium, nous a amené à envisager que cette voie pourrait être mis en œuvre dans le contexte du syndrome de Gitelman. Notre projet, qui utilisera 624 souris mâles et femelle invalidées ou non pour les gènes codant soit pour facteur de croissance soit pour transporteur de potassium permettra d’évaluer le rôlr de cette voie dans ce contexte pathologique ce qui pourrait permettre d’envisager d’agir dessus pharmacologiquement au bénéfice des malades. Par ailleurs, la mesure de du facteur de croissance dans le plasma ou l’urine des patients, pourrait devenir un outil diagnostique pour évaluer l’état de déplétion potassique de la personne considérée.

Procédures

Certains animaux seront traités avec un agent pharmacologique pendant 15 jour afin de mimer les symptômes du syndrome de Gitelman selon différentes méthodes : par injection 1 fois par jour sur animal vigile (quelques secondes par animal), ou via l’alimentation ou l’eau de boisson en prise spontanée.. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie, à des fins de recueils de tissus/organes. Pour une autre partie des animaux et afin de mesurer l’effet du traitement pharmacologique, deux recueils urinaires sur animal vigile seront réalisés ce qui nécessitera de les placer 48 heures en cage à métabolisme (24h d’habituation et 24h pour le recueil). Toujours pour évaluer l’effet du traitement, nous effectuerons, également, 2 prélèvements sanguins à 9 jours d’intervalle sur animal anesthésié (1 minute par animal). Afin de documenter la voie de signalisation impliquée dans les effets du traitement pharmacologique, une partie des animaux sera soumise à 6 ou 15 jours de gavages deux fois par jour (30 secondes par animal) avec l’inhibiteur d’une protéine et subira un prélèvement sanguin unique sous anesthésie (1 minute par animal) pour analyser si l’inhibition de cette protéine affecte l’effet du traitement. Toutes les souris sont euthanasiées en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions prévues chez la souris sont connus car celles-ci ont été et sont utilisées en routine dans d’autres projets. Une partie des animaux subira un prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (risque d’arrêt cardio-respiratoire) pouvant entrainer une hémorragie (stress hémodynamique). Pour le prélèvement de leurs reins, certains animaux seront également sujet à une chirurgie sans réveil sous anesthésie et antalgie susceptible d’entrainer une insuffisance respiratoire (risque d’arrêt cardio-respiratoire). En fonction des groupes expérimentaux, certains animaux seront hébergés individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur fèces. Ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement (stress social) et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite (inconfort). Des animaux subiront également un gavage qui pourrait conduire à une fausse route (étouffement).

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie en fin de procédure. A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir utiliser leurs organes à des fins d’études post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront d’étudier les conséquences physiopathologiques sur l’équilibre de la balance potassique induit par un syndrome de Gitelman. En effet ces processus font intervenir des systèmes complexes qui travaillent de concert et qui agissent également les uns sur les autres. L’identification de l’implication possible de ces différents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilités pour développer des stratégies thérapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera l’utilisation de 624 souris. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous l’avons calculé au plus faible à l’aide de tests statistiques et sur la base de notre expérience. Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant des expériences sur les mêmes animaux en limitant toutefois les expériences qui aboutiraient à des souffrances trop importantes et qui pourraient impacter négativement certains résultats. Par ailleurs, le nombre d’animaux utilisé est susceptible d’évoluer à la baisse si nous constatons qu’il n’existe pas de dimorphisme sexuel, ce qui permettra de mélanger les résultats des souris mâles et femelles ou si nous constatons que certaines de nos hypothèses concernant l’implication de nos protéines d’intérêt ne sont pas validées.

Raffinement

Durant leur hébergement en stabulation, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et des maisons en plastique. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur. Afin de limiter les désagréments liés à la grille, nous plaçons une coupelle en verre de 6 cm de diamètre sur cette grille ce qui permet à la souris de dormir ou de se réfugier en n’étant plus en contact permanent avec la grille, ce dispositif n’altérant pas le recueil d’urine. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites et de replacer l’animal en stabulation classique avant que son état ne se détériore si ces points devaient être franchis. Le suivi de ces points limite continuera afin de vérifier s’ils reviennent à la normal. Le cas échéant, l’euthanasie de l’animal pourra être envisagé. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil. L’ensemble des expériences sera mené dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur, par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'étude des fonctions rénales qui ont des effets systémiques. Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car les modèles d’invalidation des gènes susceptibles de nous intéresser ont été générés chez la souris. De plus, ces expériences ont pour objectif d'être associés à des expériences déjà réalisées dans le laboratoire sur ces mêmes lignées de souris. Nous utilisons des souris mâles et femelles, jeunes adultes matures sexuellement (âgées de 8 à 15 semaines), afin d’étudier le syndrome de Gitelman car c’est souvent dans cette période de la vie que les symptômes de cette maladie se manifestent chez l’Homme.

Les souris de ce projet portent la mutation d'une maladie osseuse pédiatrique rare qui remplace l'os des mâchoires par un tissu fibreux, et leur phénotype osseux s'installe entre six et dix semaines de vie. 72 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six injections intrapéritonéales sous anesthésie, quatre examens d'imagerie à quinze jours d'intervalle et deux heures seules en cage métabolique pour le recueil d'urine. Toutes sont tuées par ponction cardiaque afin de prélever les tissus et de comparer l'évolution de l'os à celle des flores buccale et intestinale, une piste que le porteur présente comme suggérée par la littérature sans y avoir été confirmée.

Objectifs

Nous nous intéressons à une maladie osseuse pédiatrique rare caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions spécifiques de cette maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Le principal traitement proposé aux patients pour le moment consiste principalement en chirurgies itératives et quelques rares molécules pour les formes très sévères. Ce qui définit la localisation anatomique et la période d’apparition de cette pathologie ne sont pas connues. Avoir accès et comprendre l’apparition du granulome permettrait de proposer des traitements plus précoces et efficaces aux patients. L’objectif de ce projet est donc de définir le rôle du microbiote oral et microbiote intestinal dans le développement du phénotype osseux. Nos travaux précédents ont confirmé la progressivité du phénotype osseux entre 6 et 10 semaines. Nous souhaitons désormais étudier la qualité et le potentiel changement dans la composition de la flore buccale et intestinale. L’implication de cette flore orale dans le développement de la perte ossuese liée au chérubisme a été suggérée sans confirmation par la littérature. Nous allons donc suivre en parallèle le phénotype osseux et deles microbiotes oral et intestinal dans un modèle murin de la maladie pour mettre en évidence une éventuelle dysbiose susceptible de participer au développement de la perte osseuse. La cinétique d’évolution des 2 types de flores en parallèle du phénotype osseux n’a jamais été réalisée et pourrait démontrer l’importance de la flore buccale et intestinale dans le phénotype osseux et offrir de nouvelles possibilités de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L’origine et la localisation très particulière du chérubisme ne sont pas clairement expliquées. L’implication du microbiote oral dans le développement des granulomes pathognomoniques du chérubisme a été suggérée. Nous souhaitons vérifier cette hypothèse. Cette implication pourra permettre de proposer de nouvelles stratégies de traitement (une fois des cibles thérapeutiques identifiées) pour le chérubisme dont les patients atteints manquent cruellement.

Procédures

examen d’imagerie non invasif sur animal anesthésié (5 min), tous les 15 jours au maximum 4 fois, recueil passif d’urine en cage métabolique, 1 fois, maximum 2h, injections en intrapéritonéal de fluorochrome, 2 fois, durée max d’une min.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis au maximum 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes), 2h de cage métabolique et une ponction cardiaque terminale. La répétition des manipulations entraine une sévérité modérée. Aucun autre dommage que d’être manipulé pour pratiquer les injections, lesquelles peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère qui ne nécessite pas de médication particulière. L’isolement en cage métabolique peut également engendrer un stress.

Devenir

L'étude nécessite la mise à mort de tous les animaux pour les prélèvements nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Les mutations du gène identifé comme responsable de la maladie n'expliquent pas toutes les caractéristiques de la maladie. L’implication du microbiote oral a été proposée. Nous voulons aussi évaluer l’impact du microbiote intestinal dans le développement de la maladie. L’effet d’une perturbation de la flore intestinale ou orale sur le squelette ne peut pas être modélisée in vitro et nécessite un organisme entier avec son microbiote oral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (72) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’analyse de l'impact des flores orale et intestinale sur le développement du phénotype osseux.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie ). Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites mentionnés plus loin, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée et appétente seront mis en place.

Choix des espèces

Les mutations du gène identifé comme responsable de la maladie n'expliquent pas toutes les caractéristiques de la maladie. L’implication du microbiote oral a été proposée. Nous voulons aussi évaluer l’impact du microbiote intestinal dans le développement de la maladie. L’effet d’une perturbation de la flore intestinale ou orale sur le squelette ne peut pas être modélisée in vitro et nécessite un organisme entier avec son microbiote oral. A 10 semaines le granulome est mis en place (comme décrit précédemment). Nous voulons analyser le phénotype osseux en parallèle de l’évolution du microbiote oral et du microbiote intestinal entre 6 et 10 semaines, les âges où le phénotype osseux est le plus prononcé.