Procédures modérées

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles des procédures expérimentales tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage maintenues en vie pour la reproduction. Sur chaque animal s'enchaînent la pose chirurgicale d'un implant d'œstrogène, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant trente semaines, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et une ligature vasculaire, avec des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Le porteur indique que les tumeurs peuvent devenir douloureuses au-delà d'un certain volume et gêner l'alimentation, et que le gavage risque de perforer l'œsophage ou d'envoyer la solution dans les poumons, tandis que l'identification de nouveaux traitements des syndromes d'hypercroissance reste annoncée comme une possibilité. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'environnement complexe de ces cellules et que la souris est le seul mammifère chez lequel la protéine visée a été mutée.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Quinze anesthésies et dix-huit injections d'analgésiques par animal sur six mois, plus sept électrorétinogrammes et sept séries de tests visuels : 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyser leur œil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dans un œil, sous anesthésie, une greffe de tissu rétinien fabriqué à partir de cellules souches humaines, l'autre œil servant de témoin, avec un risque de décollement de la rétine et de petites hémorragies oculaires, pour vérifier si cette greffe rétablit une part de vision dans la rétinite pigmentaire. Ces rats portent deux mutations, l'une qui les rend aveugles dès trois semaines, l'autre qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui les expose aux infections opportunistes et leur fait perdre leurs poils, lesquels s'accumulent sous leurs paupières. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que sa taille rend le geste chirurgical moins difficile, donc l'échec moins probable.

Objectifs

Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Ce projet a pour objectif de vérifier que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire. Ce morceau de rétine est fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations sont réalisées dans un modèle de rats porteur d’une mutation génétique entrainant la perte de la vue et également d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Le potentiel thérapeutique des greffons est évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière). Par ailleurs, lors de la greffe, nous évaluerons également si des vésicules extracellulaires (petites subtances produites par des cellules) peuvent facilité la prise des greffes dans la rétine.

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette procédure chirurgicale consiste en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes. Cette opération n’est réalisée qu’une seule fois. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Les rats ont un phénotype dommageable : ils sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 7 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 7 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Anesthésies (injections intrapéritonéales d’une durée de quelques secondes): 15 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 6 mois. Analgésies + antidote anesthésie (injections sous cutanées d’une durée de quelques secondes): 18 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 6 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). Un stress peut aussi être engendré lors des contentions réalisées pour les injections intraperitoneales et sous cutannées. Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d'évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n'est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d'un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptés aux petits effectifs. Au final, 220 animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l'accès à l'eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d'analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’oeil entraînera l’euthanasie.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront injectés à 3 semaines avec des vésicules extracellulaires (produites par des cellules) pour tester leur potentiel fonctionnel à moduler l'environnement dégénératif. Pour greffer un morceau de rétine issu de cellules souches, les rats seront greffés à un stade ou la vue est complétement perdue (vers 2/3mois après la naissance). Les différentes analyses seront réalisées dès 30 jours après l’opération. L'ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation et jusqu’à 6 mois post-greffe, le stade le plus tardif prévu par l’étude.

Les tumeurs mammaires greffées peuvent atteindre 2 000 mm3, chez des souris qui pèsent une vingtaine de grammes. 120 souris vont être utilisées sur ce second site du même projet, toutes tuées à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injectées vigiles de cellules cancéreuses, puis d'immunoliposomes à trois reprises et d'un anticorps d'immunothérapie, elles font le trajet entre deux bâtiments pour les séances d'imagerie, avec un risque de métastases pulmonaires et de gêne respiratoire. Le nombre de 120 n'est rattaché à aucun calcul, et l'explication censée exposer la réduction des effectifs reprend mot pour mot la description des tumeurs.

Objectifs

Le cancer du sein est un cancer de la glande mammaire. Autrement dit, c'est un cancer qui naît dans les unités cellulaires dont la fonction est de sécréter le lait, les unités ducto-lobulaires du sein, essentiellement chez la femme. Huit cancers du sein sur dix se déclarent après 50 ans. Premier cancer dans le monde, il touche, en 2016, 1,8 million de femmes par an dans le monde, dont 50 000 femmes en France. On s'attend à ce qu'une femme sur huit reçoive un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie. Le traitement s'est considérablement amélioré au fil des ans, et a conduit à davantage de cas de rémission. Le cancer du poumon est la cause de 1,3 million de décès par an dans le monde. Les symptômes les plus fréquents sont le souffle court, la toux (éventuellement les crachements de sang), et l'amaigrissement. Les principaux types de cancers du poumon sont le carcinome à petites cellules et les cancers non à petites cellules. Malgré les améliorations des traitements actuels, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes) que nous avons validés dans un modèle de lymphome murin. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo, sur d’autres modèles de cancers (sein et poumon). Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins, en greffant, en orthotopique, des lignées cellulaires cancéreuses murines déjà établies dans des souris C57BL/6 et BALB/c. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale. Nous étudierons également l’effet d’une combinaison de ces immunoliposomes avec une immunothérapie anti-PD1, connue pour être efficace et utilisée dans les traitements cliniques des cancers humains. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) situés dans deux bâtiments voisins.

Bénéfices attendus

Nous avons identifié de nouveaux candidats immunoliposomes qui, une fois injecté par i.v. bloquent les populations immunosuppressives du cancer. Ces immunoliposomes se sont montrés efficaces pour ralentir fortement la prolifération des cellules cancéreuses sur un modèle murin de lymphome. Nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur d’autres modèles murins d’étude du cancer. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des cancers du sein et du poumon.

Procédures

L’injection des cellules cancéreuses se fera une seule fois sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 minutes. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera une seule fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 minutes. La majorité des expérimentations seront faites dans l’établissement utilisateur EU1. Seules les expérimentations qui concernent la prise d’images de bioluminescence sur appareil IVIS seront faites dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les nuisances indésirables légère attendues sont au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, ainsi que l’injection intraveineuse, dans la veine caudale dilatée, des cellules cancéreuses du poumon qui se fait dans un tube de contention, qui ne durera pas plus que deux minutes. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection du sein des animaux, jusqu’à 2000 mm3 pour le modèle du cancer du sein, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement (nuisance modérée). Il y a aussi un risque de formation de métastases pulmonaires avec ce modèle. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastases (foci). Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration (nuisance modérée).

Devenir

Tous les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûrs que les composés qui vont être étudiés in vivo ciblent bien les cellules du système immunitaire et qu’il y aura donc une efficacité thérapeutique. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leur efficacité in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.

Réduction

Les nuisances indésirables légère attendues sont au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, ainsi que l’injection intraveineuse, dans la veine caudale dilatée, des cellules cancéreuses du poumon qui se fait dans un tube de contention, qui ne durera pas plus que deux minutes. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection du sein des animaux, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement (nuisance modérée). Il y a aussi un risque de formation de métastases pulmonaires avec ce modèle. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastases (foci). Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration (nuisance modérée).

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles. Nous avons aussi planifié et établi les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Pour le transport entre les deux établissements utilisateurs, les animaux seront placés dans une cage munie d’un couvercle à filtre. Le transport durera moins de 30 minutes car les établissements sont situés à quelques minutes à pied l’un de l’autre, et les cages seront remplacées à l’arrivée dans le second établissement utilisateur.

Choix des espèces

Nous disposons de modèles de cellules cancéreuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées qui seront injectées à des souris dont le système immunitaire est fonctionnel. Après l’injection, les cellules murines forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection dans la glande mammaire. Ces études ne peuvent se réaliser que sur le modèle murin femelle. L’injection des cellules cancéreuses murines du poumon dans la littérature se fait sur modèle murin, par injection dans le sang, les cellules vont alors se nicher dans les poumons et conduire au développement du cancer. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est préférentiellement choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur le cancer du sein et du poumon. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.

Pour savoir si un trouble de la coagulation aggrave une hémorragie cérébrale, 450 souris vont subir une chirurgie de trente minutes qui provoque un saignement dans leur cerveau. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une hémophilie ou une maladie de von Willebrand par modification génétique, et chaque animal passe deux IRM sous anesthésie, à quatre heures et à sept jours de l'induction. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut entraîner une perte d'appétit, une perte de motivation et une anxiété accrue à plus ou moins long terme, et prévoit, selon les points limites atteints, d'isoler l'animal, de le soigner ou de le mettre à mort.

Objectifs

Notre projet repose sur l'utilisation d'un modèle pré-clinique d'hémorragie intracérébrale (HIC) chez le rongeur, caractérisée par un saignement occasionné par la rupture de vaisseaux cérébraux. Cet accident vasculaire cérébral est l’un des plus dévastateurs, avec en 2018 un taux de mortalité de 50% la première année. Environ 30% des survivants deviennent dépendants 4 ans plus tard. Il n'y a actuellement pas de traitement. Des recherches précliniques et cliniques sont en cours. Mais dans les essais cliniques, les personnes atteintes d'anomalies de l'hémostase (hémophilie, maladie de Von Willebrand...) sont exclues d'emblée, du fait de risque accru de saignement. Ce modèle a été validé chez le rat (projet APAFIS numéro #14066-2018031312529642v3) mais nécessite d'être validé chez la souris pour pouvoir bénéficier de modèles hémophiles dans cette espèce. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelle mesure les troubles hémostatiques influencent la taille et les mécanismes inhérents à la survenue d'une HIC. de microhémorragies cérébrales (MHC) disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se rapprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives. Ce modèle repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, ouvrent les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), en « érodant » les membranes cellulaires endothéliales jusqu'à obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris (APAFIS n°19866-2019030701722644). Les MHC sont des constructions radiologiques qui se présentent sous la forme de foyers hypointense visibles et qui sont prédicteurs d'une future hémorragie intracérébrale (HIC), le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur sans traitement validé à ce jour. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelles mesures les troubles hémostatiques influencent l'incidence des MHC et leur transformation en HIC. L'existence d'un trouble hémostatique favorise-t-il la transformation en macro-saignement? Par quels mécanismes? Les anomalies hémostatiques congénitales telles que l'hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des situations uniques, dans lesquelles l'HIC est fréquente et dévastatrice. Grâce à l'utilsation de lignées murines d'hémophilie et de maladie de Von Villebrand, nous explorerons la transformation potentielle des MHC en HIC et étudierons le rôle de ces défauts hémostatiques sur la réponse inflammatoire autour du saignement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'influence de troubles de l'hémostase (défaut de coagulation ou de l'hémostase primaire) sur la taille des HIC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur évolution, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. sur la fréquence et la taille des MHC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur transformation en HIC, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. L'identification des facteurs prédictifs d'une future hémorragie cérébrale est de la plus haute importance chez les personnes atteintes de graves déficiences hémostatiques et peut conduire à une modification du régime de traitement préventif des patients, et peut aussi, en cas d'HIC, leur permettre de bénéficier de traitements innovants pour lesquels ils sont actuellement exclus par principe de précaution. A partir d'un scénario plutôt caricatural d'une maladie génétique rare, ces nouvelles connaissances peuvent également profiter à tous les patients présentant d'autres anomalies hémostatiques (par exemple les personnes traitées par anticoagulants oraux).

Procédures

Tous les animaux subiront la chirurgie permettant d'induire les HIC (environ 30 min par intervention), ainsi qu'une IRM à 4h et à 7j de l'injection (chaque IRM dure 30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des HIC MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqés dans la survenue de MHC dans un contexte de troubles hémostatiques Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 450 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure BEA (Bien-Etre Animal) ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.

Choix des espèces

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des souris C57bl6 homozygotes stables. Le choix de cette espèce de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois, âge nécessaire pour permettre la mise en place des troubles hémostatiques.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sur animal vigile, dans la glande mammaire pour les femelles du modèle mammaire, dans la veine de la queue pour le modèle pulmonaire, l'animal maintenu dans un tube de contention pendant deux minutes. Les tumeurs qui poussent peuvent gêner leurs déplacements, les métastases pulmonaires provoquer une gêne respiratoire, et les souris font le trajet entre deux bâtiments pour les séances d'imagerie de bioluminescence. Le porteur affirme que les immunoliposomes testés ont déjà fait la preuve de leur ciblage in vitro, et que le remplacement "n'est plus possible à ce stade", l'efficacité devant être jugée sur un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer du sein est un cancer de la glande mammaire. Autrement dit, c'est un cancer qui naît dans les unités cellulaires dont la fonction est de sécréter le lait, les unités ducto-lobulaires du sein, essentiellement chez la femme. Huit cancers du sein sur dix se déclarent après 50 ans. Premier cancer dans le monde, il touche, en 2016, 1,8 million de femmes par an dans le monde, dont 50 000 femmes en France. On s'attend à ce qu'une femme sur huit reçoive un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie. Le traitement s'est considérablement amélioré au fil des ans, et a conduit à davantage de cas de rémission. Le cancer du poumon est la cause de 1,3 million de décès par an dans le monde. Les symptômes les plus fréquents sont le souffle court, la toux (éventuellement les crachements de sang), et l'amaigrissement. Les principaux types de cancers du poumon sont le carcinome à petites cellules et les cancers non à petites cellules. Malgré les améliorations des traitements actuels, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes) que nous avons validés dans un modèle de lymphome murin. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo, sur d’autres modèles de cancers (sein et poumon). Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins, en greffant, en orthotopique, des lignées cellulaires cancéreuses murines déjà établies dans des souris C57BL/6 et BALB/c. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale. Nous étudierons également l’effet d’une combinaison de ces immunoliposomes avec une immunothérapie anti-PD1, connue pour être efficace et utilisée dans les traitements cliniques des cancers humains. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) situés dans deux bâtiments voisins.

Bénéfices attendus

Nous avons identifié de nouveaux candidats immunoliposomes qui, une fois injectés dans le sang bloquent les populations immunosuppressives du cancer. Ces immunoliposomes se sont montré efficace pour ralentir fortement la prolifération des cellules cancéreuses sur un modèle murin du lymphome. Nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur d’autres modèles murins d’étude du cancer. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des cancers du sein et du poumon.

Procédures

L’injection des cellules cancéreuses se fera une seule fois sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 minutes. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera une seule fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 minutes. La majorité des expérimentations seront faites dans l’établissement utilisateur EU1. Seules les expérimentations qui concernent la prise d’images de bioluminescence sur appareil IVIS seront faites dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les nuisances indésirables légère attendues sont au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, ainsi que l’injection intraveineuse, dans la veine caudale dilatée, des cellules cancéreuses du poumon qui se fait dans un tube de contention, qui ne durera pas plus que deux minutes. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection du sein des animaux, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement (nuisance modérée). Il y a aussi un risque de formation de métastases pulmonaires avec ce modèle. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastases (foci). Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration (nuisance modérée).

Devenir

Tous les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnels. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leurs efficacités in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour chaque modèle de cancers (sein et poumon), nous testerons lors d’une première expérimentation, la capacité des immunoliposomes à diminuer le nombre de cellules immunitaires favorisant le développement des tumeurs. Si nous obtenons une bonne efficacité, l’effet des immunoliposomes sur le ralentissement de la croissance tumorale sera alors réalisé, dans une seconde expérimentation.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles. Nous avons aussi planifié et établi les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Pour le transport entre les deux établissements utilisateurs, les animaux seront placés dans une cage munie d’un couvercle à filtre. Le transport durera moins de 30 minutes car les établissements sont situés à quelques minutes à pied l’un de l’autre, et les cages seront remplacées à l’arrivée dans le second établissement utilisateur.

Choix des espèces

Nous disposons de modèles de cellules cancéreuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées qui seront injectées à des souris dont le système immunitaire est fonctionnel. Après l’injection, les cellules murines forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection dans la glande mammaire. Ces études ne peuvent se réaliser que sur le modèle murin femelle. L’injection des cellules cancéreuses murines du poumon dans la littérature se fait sur modèle murin, par injection dans le sang, les cellules vont alors se nicher dans les poumons et conduire au développement du cancer. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est préférentiellement choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur le cancer du sein et du poumon. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.

Rendues obèses par une suralimentation organisée dès après leur naissance, les souris de ce projet doivent développer un trouble du rythme cardiaque. 324 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie un capteur d'électrocardiogramme implanté par trois incisions, quatre injections intraveineuses de microvésicules, et passe deux séjours en cage individuelle que le porteur reconnaît stressants. Vient ensuite une exploration électrophysiologique par l'œsophage, dont il indique que l'animal n'est pas réveillé, et il affirme que ces altérations ne s'observent que dans un "organisme entier", aucun modèle cellulaire ou in silico ne pouvant répondre à la question posée.

Objectifs

La fibrillation atriale est une trouble du rythme cardiaque, qui fait battre le coeur de manière irrégulière, c’est-à-dire de façon arythmique. Son apparition est favorisée par l’obésité et l’altération des vaisseaux sanguins. Dans ce projet, notre hypothèse est qu’une protéine sécrétée par ces vaisseaux, nommée brain-derived neurotrophic factor, généralement appelée BDNF est impliquée dans cette dysfonction du coeur. A partir de souris en surpoids à cause d’une suralimentation postnatale, invalidées ou non pour le gène du BDNF, nous allons vérifier en mesurant leur électrocardiogramme si cette protéine est vraiment impliquée dans ce trouble électrique du coeur.

Bénéfices attendus

L'un des principaux résultats du projet sera d'aborder le rôle du BDNF dans la FA métabolique d'un point de vue translationnel, ce qui ouvre la voie à la découverte de nouveaux mécanismes, cibles et médicaments grâce à la genèse d'un large éventail de données innovantes. Par exemple, certains résultats obtenus sur nos modèles expérimentaux pourraient être pris en compte dans des études cliniques à grande échelle afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques pour traiter ou prévenir la FA. Ces résultats serviront à guider le volet clinique de ce projet. Ainsi, notre projet a des impacts scientifiques, socio-économiques et cliniques élevés. Les données obtenues dans ce projet seront régulièrement présentées à la communauté scientifique lors de conférences nationales et internationales. Les résultats seront publiés dans des revues d’audience internationale à comité de lecture.

Procédures

Les animaux des groupes ‘SAPN’ auront une prise de poids supérieure aux animaux non SAPN, conduisant ce groupe à un surpoids. Les animaux seront soumis sous anesthésie gazeuse et locale à une implantation chirurgicale d'un capteur permettant de mesurer l'électrocardiograme (durée 25 min). Les animaux seront soumis à une exploration électrophysiologique transoesophagienne sous anesthésie gazeuse (20 à 35 min). Les animaux auront 4 injections intraveineuses de microvésicules pour rétablir leur niveau circulant de BDNF sous anesthésie gazeuse. L’ensemble des animaux auront deux périodes d’hébergement individuel pouvant conduire à un stress.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur une suralimentation conduisant à un surpoids des animaux. La caractérisation fonctionnelle repose d'une part sur l'enregistrement de l'électrocardiogramme par un système implanté qui envoie des données à distance par télémétrie. L'implantation du dispositif ECG est bien maitrisée et aucune nuisance supérieure à une sévérité légère n'est attendue par l'acte chirurgical en lui-même (implantation sous cutanée nécessitant 3 petites incisions de la peau). Ces animaux implantés devront être hébergés individuellement en cage unique à 2 reprises pour des raisons de suivi et techniques (post-implantation du capteur de télémétrie d’une durée supérieure à 24h et enregistrement de l’électrocardiogramme, durée égale à 24h). Cet hébergement individuel pouvant conduire à un stress sera pris en compte pour le suivi journalier de l'animal. L'exploration électrophysiologique transoesophagienne a été choisie car elle est réalisée sous anesthésie générale de l'animal et est non-invasive. L'animal n’est pas réveillé à la fin de la procédure. Pour l’ensemble des actes des procédures, cette DAP est classée comme sévérité modérée.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

La fibrillation atriale est l'arythmie cardiaque la plus fréquente et dont la prévalence chez l’humain augmente dans le monde. Cette arythmie est associée à des complications délétères majeures telles que les accidents vasculaires cérébraux, l'insuffisance cardiaque et la mortalité. L’ensemble de ces altérations sont observables chez l’animal uniquement dans un organisme entier et impliquent des interactions inter organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas se substituer à un modèle animal impliquant des relations entre les organes et ne peuvent donc pas être utilisés dans ce projet. De même, auccun modèle in silico ne pourrait répondre à notre questionnement.

Réduction

Ne sera utilisé que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes afin d'en tirer des conclusions non biaisées. L'utilisation de plusieurs techniques sur le même animal permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement de leur milieu de vie (nid en cellulose et carré de cellulose, morceau de bois), dans une pièce calme et tempérée, avec régulation des cycles lumineux. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins per-opératoires et post-opératoires comprenant anesthésie générale et analgésie seront apportés tout au long de l’étude. Une grille d'évaluation clinique permettant l’établissement d’un score selon une échelle de douleur permettra leur suivi et le respect des points limites. Selon cette échelle, une décision sera prise dont, notamment, la mise à mort de l’animal si un point limite est atteint afin de prévenir ou arrêter les souffrances.

Choix des espèces

La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. De surcroît, les mécanismes physiologiques du controle du rythme cardiaque et physiopathologiques conduisant à la genèse de la FA chez les souris sont semblables à ceux de l'Homme, ce qui nous permet de réaliser des études translationnelles. Les animaux seront âgés de 4, 6 et 12 mois afin de suivre l’évolution dans le temps des paramètres cardiaques des animaux en fonction du temps d'installation progressive des troubles métaboliques. Ces différents âges correspondent à la période jeune adulte à adulte vieillissant chez l’Homme.

Pour récupérer des spermatozoïdes épididymaires destinés à une étude sur la congélation du sperme, trois ânes mâles sont castrés sous anesthésie générale, dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré. Réformés en raison de leur âge après avoir été utilisés comme reproducteurs dans l'élevage, ils reçoivent un cathéter jugulaire, puis des antibiotiques pendant trois jours, des anti-inflammatoires trois à cinq jours, des diurétiques en cas d'œdème et des morphiniques si des signes de douleur apparaissent. Le porteur retient l'infection du site opératoire et l'hémorragie comme complications classiques, et surveille la sudation, l'écartement des membres postérieurs et la contraction des muscles de la face. Ces trois ânes doivent être castrés parce que l'acheteur l'exige, l'étude scientifique se greffant sur une opération décidée pour permettre leur vente à des particuliers.

Objectifs

Notre unité expérimentale doit castrer ces 3 mâles pour permettre leur replacement ultérieur. Le scientifique responsable d'un projet relatif à la préservation de l'espèce asine s'est déclaré intéressé par la récupération des spermatozoïdes épididymaires.

Bénéfices attendus

Cette castration permettra au scientifique de compléter son étude de l'impact du plasma séminal sur la congélation.

Procédures

Une mise à jeun de moins de 16H, pose d'un cathéter jugulaire (2 minutes), anesthésie (15 minutes pour attendre d'estimer les effets de chaque produit injecté et éviter les surdosages), castration sous anesthésie générale (10 à 20 minutes selon la localisation du testicule, plus ou moins engagé dans le canal inguinal). Injections intramusculaires d'antibiotiques une fois par jour pendant 3 jours (

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être stressés par la mise à jeun et par les manipulations préalables à l'anesthésie. La pose du cathéter à la veine jugulaire est légèrement douloureuse (piqure d'aiguille). Il peut être ressenti une douleur post-opératoire malgré les injections préventives (variabilité individuelle). Les complications classiques d'une castration sont l'infection du site opératoire ou l'hémorragie.

Devenir

Dès récupération post-opératoire, ces trois ânes seront vendus à des particuliers compétents pour assurer des bons soins.

Remplacement

Ces trois animaux doivent être castrés pour faciliter leur replacement (vente à des particuliers). L'unité a donc contacté le scientifique responsable d'un projet intéressé pour récupérer les testicules et épididymes.

Réduction

Ces trois mâles doivent être replacés et être cédés à des particuliers. Ils doivent donc être castrés tous les trois. Aucune étude statistique n'est envisagée.

Raffinement

Les animaux seront contrôlés lors d'un examen clinique préalable à l'intervention, ils seront manipulés dans le calme. Un cathéter jugulaire permettra d'optimiser les injections intraveineuses. Un congénère sera à proximité de l'animal hospitalisé lors des phases de mise à jeun et de réveil post-opératoire. L'analgésie sera assurée dès la prémédication et sera relayée en post-opératoire immédiat puis les 4 jours suivants l'intervention. Un anesthésique local sera injecté au niveau du site opératoire (il n'est pas possible de l'injecter dans les testicules car ceux-ci sont ensuite l'objet d'études histologiques). Le box de réveil sera paillé abondamment. Les animaux seront surveillés 3 fois par jour minimum les 3 jours suivant l'intervention. Du foin de qualité leur sera administré dès le réveil effectif. Ils retourneront dans leur aire d'élevage habituel dès que leur état clinique le permettra. La plaie sera surveillée pour détecter un éventuel oedème (traité par injection de diurétique), une hémorragie (hématome sous-cutané : en ce cas le traitement antibiotique sera prolongé) ou une infection (suture suintante, inflammée ; en ce cas, les antibiotiques seront prolongés). Les signes de douleur potentielle seront surveillés : sudation, posture (membres postérieurs écartés, éloignés de la ligne médiane), contraction des muscles de la face. En ce cas, l'injection d'analgésiques sera renforcée.

Choix des espèces

Ces trois ânes faisaient partie du troupeau des reproducteurs étudiés dans l'élevage (spermogramme, insémination artificielle). Ils doivent être réformés en raison de leur âge et nous souhaitons leur éviter l'euthanasie. Pour les replacer (ventes à des particuliers), il est demandé par l'acheteur de les castrer.