Procédures modérées

450 souris et 50 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent dans le péritoine une préparation issue de prélèvements humains ou animaux, sang, biopsies, liquide céphalo-rachidien, insectes, pour que les micro-organismes qu'elle contient s'y multiplient, avant une anesthésie terminale et le prélèvement du sang et des organes. Le laboratoire indique n'utiliser que deux animaux par échantillon, le second au cas où le premier ne répondrait pas à l'inoculation. Leur corps tient lieu de milieu de culture, et le porteur affirme que produire ces germes hors d'un organisme vivant reste hors d'atteinte, les organoïdes n'étant "pas encore au point".

Objectifs

Le but de ce travail est double : isoler des micro-organismes dont la culture est fastidieuse, voire impossible et les produire en grande quantité ce qui permettrait d’une part la confirmation de diagnostic, et d’autre part la mise au point d’un milieu de culture axénique (stérile et exempt d’autres microorganismes).

Bénéfices attendus

Le laboratoire reçoit plusieurs milliers de prélèvements (sang, biopsies, LCR- Liquide Céphalo-Rachidien, arthropodes, insectes…) effectués par des vétérinaires ou des médecins dans le cadre de consultations ou de projets de recherches. Certains de ces prélèvements contiennent des micro-organismes en petite quantité qui n’ont jamais été décrits ou dont la culture n’a jamais été mise au point, d’où l’intérêt d’amplifier les pathogènes en les inoculant à un animal de laboratoire sensible. A partir des prélèvements de l’animal infecté il sera possible d’ensemencer une gamme variée de milieu afin d’identifier et de mettre au point une culture axénique. Des souris ou des cobayes seront utilisés en fonction de la nature du germe à isoler.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront les injections en intrapéritonéal (IP) de la préparation issue du prélèvement et in fine, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements post-mortem.

Impact sur les animaux

La première nuisance sera celle de l'injection en intrapéritonéal (IP) de la préparation issue du prélèvement. Au niveau local, une rougeur et/ou gonflement peuvent apparaitre suite à l’injection. Si ces signes diminuent ou disparaissent dans les 48heures post-inoculation, la procédure sera poursuivie jusqu’à la fin du protocole. En revanche, si des complications et des signes extérieurs d’inconforts décrits dans la grille de scores des points limites sont observés, les mesures décrites dans la grille seront appliquées. Une deuxième nuisance peut être liée à l’injection en IP des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. L’anesthésie ayant un effet rapide, aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux: Les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour permettre le prélèvement sanguin et/ ou d’organes avant l’euthanasie finale.

Remplacement

Il n’existe pas toujours de milieu de culture pour certains micro-organismes et un animal sensible à l’infection est utilisé d’une part pour l’isolement et d’autre part pour maintenir un stock de ces pathogènes afin de les étudier ultérieurement. En outre, la mise au point d’un milieu de culture axénique (stérile et exempt d’autres microorganismes) nécessite la disponibilité d’un nombre important du pathogène à étudier pour tester ses conditions de culture (test de composés de culture différents) d’où la nécessité d’utiliser un animal pour produire les pathogènes à tester. La mise au point d'organoïdes par exemple n'est pas encore au point afin d'amplifier des microorganismes ex-vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux est de 2 maximum par prélèvement potentiel. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet reste faible. Lorsque nous recevons un échantillon « précieux », il est en général en faible quantité et la concentration en microorganisme est assez faible aussi. Nous utilisons 2 animaux par échantillons au cas ou une injection ou un animal ne répondrait pas favorablement à l’inoculation.

Raffinement

Les deux individus de la même espèce sont hébergés ensemble dans la même cage avec une surface suffisante ainsi que des éléments de raffinement appropriés (igloo, carrée de nidification, bois à ronger). Pour limiter toute souffrance et/ou angoisse des animaux, nous mettons en oeuvre des mesures d’acclimatation en zone d’hébergement d’une semaine avant de commencer les manipulations. Les animaux seront observés par un personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) quotidiennement et pesées (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. La température corporelle sera prise si des signes extérieurs correspondant à la grille de score sont observés. De la nourriture et de l'eau sont disponibles ad libitum. Un analgésique sera administré en cas de signes avérés de souffrance suivant la grille de score couplée à ce projet. L’analgésique que nous utiliserons sera de la buprénorphine en SC (sous-cutané) toutes les 12 heures pour la souris et toutes les 6 heures pour le cobaye. Un anesthésique sera administré avant l'euthanasie finale en injection IP pour les 2 espèces.

Choix des espèces

Certains pathogènes ne peuvent être produit qu'en utilisant un modèle animal. Selon le pathogène suspecté soit la souris soit le cobaye sera l'hôte approprié/ sensible pour sa multiplication. Par exemple: Le cobaye Dunkin Hartley pour cultiver Borrelia hispanica Les souris BALB/c: autres Borrelia, Coxiella, Bartonella et Rickettsia Le stade choisi sera le stade adulte : souris 6 à 8 semaines et cobaye 4 à 5 semaines. La volémie chez l’adulte est plus importante (un volume de sang plus important pourra être collecté).

206 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de l'extrémité de la queue vers six à huit jours de vie pour le génotypage, puis un tatouage à l'encre. Le porteur crée deux lignées portant des mutations de facteurs de réparation de l'ADN, prévoit une létalité embryonnaire, et annonce des résultats susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques pour les patients dont le génome est instable. Si un phénotype dommageable apparaît avant le sevrage, les souris sont tuées immédiatement pour que leur système hématopoïétique soit analysé.

Objectifs

Des mutations dans des génes impliqués dans la stabilité du génome peuvent causer des défauts hématopoïétiques. Afin de déterminer quelles sont les conséquences de ces mutations in vivo, 2 modèles de souris portant ces mutations seront produits. Ces modèles permettront de déterminer les conséquences fonctionnelles de ces mutations en se focalisant sur le système hématopoïétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients présentant une instabilité du génome.

Procédures

Biopsie de la queue réalisée vers 6-8 jours de vie en vue du génotypage (une biopsie par animal). Une biopsie correspond à un prélèvement de l'extrémité de la queue par animal qui dure quelques secondes. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation.

Impact sur les animaux

Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défauthématopoïétique. Stress associé à la biopsie nécessaire pour le génotypage ainsi que le tatouage (marquage à l'encre). De plus, une létalité embryonnaire pourrait être observée.

Devenir

A la fin de chaque procédure les souris seront mis à mort selon la méthode règlementaire utilisée en fonction de l’âge des souris

Remplacement

Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement des cellules du sang qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. En effet, le développement des cellules sanguines des mammifères et leurs rôles sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN sera en grande partie réalisée dans des lignées cellulaires des différentes lignées de souris ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.

Réduction

En se basant sur des tests statistiques, nous réduiront au maximum le nombre de souris utilisées pour obtenir les résultats escomptés. Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des lignées cellulaires obtenues de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront observées de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des souris dans une zone sans pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes et ainsi éviter un caractère dommageable. La mise à mort de la souris sera réalisée selon la méthode réglementaire en fonction de l'âge en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites observés lors du scoring hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement des cellules sanguines, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les souris et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (au stade embryonnaire (E13) ainsi qu'après la naissance) sera déterminé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système hématopïétique sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel). Si un phénotype dommageable est observé avant cette période, les souris seront immédiatement mise à mort et leur système hémaopoïétique sera analysé.

63 souris seront immobilisées trois heures par jour pendant vingt et un jours, et 192 rats subiront huit prélèvements de sang en six heures : 322 souris et 192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent aussi des gavages pendant deux à trois semaines et des injections dans l'abdomen sur deux à huit semaines, dont des injections de LPS qui provoquent fièvre, fatigue, repli sur soi et perte de poids. Le porteur décrit ces réactions comme "temporaires, adaptatives et contrôlées", et qualifie le stress de contention de psychologique. Le projet mesure ce que des phytonutriments du régime méditerranéen apportent au "bien vieillir", avec des retombées annoncées sous forme de recommandations nutritionnelles et de produits naturels.

Objectifs

Avec l'allongement de l'espérance de vie, le vieillissement démographique représente un défi majeur pour la société, étant associé à une augmentation des maladies chroniques et des coûts de santé. Pour faire face à ces enjeux, il est impératif d'identifier des moyens de prévention pour favoriser le "bien vieillir" et réduire l'incidence des maladies liées à l'âge telles que les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires. Parmi les facteurs de risque, une alimentation inadéquate a été identifiée comme contribuant à ces maladies. L'alimentation étant un comportement modifiable, elle offre une voie prometteuse pour mettre en place des stratégies préventives basées sur la nutrition. Dans ce contexte, le régime méditerranéen (Medi) se distingue comme l'un des régimes les plus sains, grâce à ses bénéfices sur la santé et la longévité. Ce projet vise donc à explorer le rôle protecteur des phytonutriments du Medi dans la prévention du vieillissement et des maladies chroniques associées. Notre objectif principal est de comprendre les mécanismes d'action des phytonutriments du Medi et d'évaluer leur efficacité potentielle dans la promotion du "bien vieillir", en utilisant des modèles animaux pertinents pour simuler les processus inflammatoires, les effets du vieillissement accéléré, et le stress chronique. Nous cherchons également à développer des méthodes d'analyse fiables permettant de mesurer les phytonutriments et leurs métabolites dans les tissus biologiques des animaux, afin d'évaluer leur biodisponibilité et dans le but d’établir des corrélations entre les niveaux de métabolites des phytonutriments et les effets biologiques associés au vieillissement, tels que l'inflammation, le stress oxydant, et les altérations épigénétiques. Cette étape cruciale nous permettra d'évaluer comment ces composés sont absorbés et métabolisés dans l'organisme, ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhension de leur efficacité potentielle. En utilisant des modèles animaux pertinents, nous évaluerons ensuite les effets protecteurs des supplémentations en phytonutriments du Medi contre l'inflammation, les altérations cognitives liées au vieillissement accéléré, et les effets délétères du stress chronique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à approfondir la connaissance scientifique en nutrition et vieillissement, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour améliorer la santé humaine. En caractérisant les effets des phytonutriments du régime Medi sur le vieillissement et les maladies chroniques à l'aide de modèles animaux spécifiques, cette recherche contribuera à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux bénéfices de ces composés sur la santé. Les résultats permettront d'identifier les phytonutriments clés et leurs combinaisons ayant un potentiel effet protecteur contre le vieillissement et les maladies associées, notamment en modulant l'inflammation, le stress oxydatif et d'autres processus biologiques liés au déclin cognitif et aux pathologies liées à l'âge. Cette caractérisation approfondie des mécanismes d'action des phytonutriments éclairera sur les stratégies nutritionnelles pour favoriser un vieillissement en bonne santé, ouvrant des perspectives pour le développement de produits naturels visant à promouvoir le "bien vieillir" et à réduire l'incidence des maladies chroniques liées à l’âge. En approfondissant notre compréhension des interactions entre les phytonutriments et processus biologiques, cette recherche pourrait conduire à des interventions précoces ou à des recommandations nutritionnelles personnalisées pour améliorer la santé des individus vieillissants. Les bénéfices dépassent la recherche fondamentale, avec des implications potentielles dans la santé publique. Les connaissances générées pourraient conduire à des recommandations nutritionnelles spécifiques pour promouvoir le "bien vieillir", contribuant ainsi à réduire l'incidence des maladies chroniques associées à l'âge et à améliorer la qualité de vie des individus vieillissants. Avec l'allongement de l'espérance de vie, les systèmes de santé et les économies nationales sont confrontés à des défis importants, notamment des problèmes de santé chroniques entraînant des surcoûts en matière de soins, incapacité et dépendance. En identifiant les phytonutriments favorisant un vieillissement en bonne santé, cette recherche pourrait atténuer les impacts économiques du vieillissement de la population. Ce projet revêt ainsi une importance économique dans le contexte du vieillissement démographique. Ce projet vise donc à combler les lacunes actuelles dans notre compréhension des liens entre nutrition, vieillissement et santé, avec des implications potentielles significatives pour la santé publique.

Procédures

Les 322 souris seront soumises à deux prélèvements sanguins à la veine sous maxillaire (maximum 200µL et minimum deux semaines d'intervalle entre les prélèvements). Elles seront également sourmises à une administration orale par gavage pendant 2 à 3 semaines (232 souris), et à des injections intrapéritonéales allant de 2 à 8 semaines (250 souris). 63 souris seront également soumises à un stress de contention quotidien de 3h/jour pendant 21 jours. Les 192 rats quant à eux seront soumis à une cinétique de prélèvements sanguins effectués à la veine caudale ou saphène, et consistant en un prélèvement de 200µL maximum espacés de 30mn minimum ; 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, et 360mn.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les interventions prévues peuvent entraîner diverses réponses physiologiques et comportementales chez les animaux utilisés. Par exemple, l'administration de substances, bien que rapides et non douloureuses lorsqu’effectuées par une personne expérimentée, peut induire un stress temporaire lié à la manipulation directe des animaux. Pour atténuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à ces procédures. Les injections intrapéritonéales de LPS induiront des réactions physiologiques telles qu'une réaction inflammatoire, de la fièvre, de la fatigue et des comportements anormaux tels que le repli sur soi, l'hypophagie et la perte de poids chez les souris. Ces réactions, appelées comportement de maladie, sont temporaires, adaptatives et contrôlées, favorisant la récupération en mobilisant les ressources de l'organisme pour combattre l'agent pathogène. Les prélèvements sanguins répétés chez les rats peuvent causer une légère gêne et une perte de volume sanguin, tandis que les injections répétées chez les souris peuvent entraîner une réaction locale temporaire. Pour minimiser ces effets, nous alternerons le côté d'injection et limiterons le volume prélevé selon les recommandations spécifiques à chaque espèce. Les interventions expérimentales peuvent induire un stress léger entraînant une restriction alimentaire et une légère perte de poids chez les animaux. Tout changement de poids sera surveillé de près et un animal présentant une perte de poids significative sera retiré des expériences pour assurer son bien-être. Concernant le stress de contention chronique, bien que non invasif sur le plan physique, ce modèle entraine un stress psychologique et un inconfort dû à la restriction de mouvement, sans toutefois altérer la mobilité une fois le stress terminé. Ces interventions respecteront les lignes directrices éthiques et les expérimentateurs s'engageront à minimiser les perturbations et les impacts négatifs sur le bien-être des animaux en utilisant des techniques adaptées et en surveillant étroitement leur santé et leur comportement tout au long de l'étude et en prenant en charge la douleur si nécessaire. Des mesures telles que l'enrichissement de leur environnement seront mises en place pour garantir leur bien-être et leur confort. En cas de symptômes persistants ou sévères, les animaux seront euthanasiés selon des critères éthiques stricts pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le but de mener des investifations aux niveaux biologiques et neurobiologiques.

Remplacement

Il existe actuellement peu d'alternatives non animales capables de reproduire adéquatement les interactions complexes entre nutriments et processus biologiques observés chez les animaux vivants. Les modèles animaux restent essentiels pour étudier les effets physiologiques et comportementaux des nutriments dans un contexte biologique pertinent, comme dans notre projet visant à caractériser les effets des phytonutriments sur le vieillissement et les maladies chroniques. L'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre les réponses systémiques et les impacts à long terme sur la santé. Les modèles animaux permettent d'observer les effets intégrés des composés nutritifs sur différents organes et systèmes biologiques, ce qui est essentiel pour une compréhension holistique des mécanismes sous-jacents. Cependant, lorsque l’objectif le permettra, des études seront faites en culture cellulaire afin d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires, ces modèles in vitro offrant des informations utiles sur les réponses cellulaires aux composés nutritifs, mais ne pouvant pas reproduire les interactions complexes et intégrées observées dans un organisme vivant. Par exemple, les cultures de cellules Caco-2 peuvent être utilisées pour étudier l'absorption intestinale des phytonutriments in vitro, évaluant ainsi leur biodisponibilité et leur potentiel effet systémique. Ainsi, ce type d’étude in vitro peut être utilisé pour mener un screening initial des phytonutriments d’intérêts pour notre projet. De même, des cultures cellulaires spécifiques pourront être employées pour évaluer les effets des composés sur divers aspects de la santé cellulaire, comme la modulation de l'inflammation ou du stress oxydatif. Ces études peuvent fournir des informations précieuses sur les mécanismes d'action potentiels des phytonutriments sans nécessiter l'utilisation d'animaux. Cependant, malgré ces avantages, les modèles cellulaires présentent certaines limites. Ils ne peuvent pas reproduire de manière exhaustive les interactions complexes entre différents organes et systèmes biologiques observées dans un organisme vivant entier. Par conséquent, les études sur les modèles animaux restent nécessaires et justifiées pour atteindre nos objectifs scientifiques en l'absence d'alternatives satisfaisantes. Nous nous engageons cependant à minimiser le nombre d'animaux utilisés, à réduire au maximum leur souffrance et à suivre des protocoles rigoureux conformément aux normes éthiques en vigueur.

Réduction

Plusieurs mesures ont été mises en œuvre dans ce projet afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés tout en atteignant nos objectifs scientifiques. Tout d'abord, le nombre d'animaux prévus pour ce projet a été déterminé en tenant compte des besoins expérimentaux et des objectifs de recherche afin de garantir la robustesse de nos résultats, tout en minimisant autant que possible la taille de nos effectifs. En effet, il existe une grande variabilité interindividuelle et nos précédentes études ont montré que la métabolisation des nutriments chez les animaux est sensible à cette variabilité, ce qui nous impose d’avoir un nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à notre problématique, tout en nous restreignant à des effectifs les plus faibles possibles. Le calcul du nombre d’animaux a donc été fait sur la base de 8 à 10 animaux par groupe en fonction du modèle, nombre minimal requis afin d’atteindre une puissance statistique suffisante. De plus, nous adoptons une approche de partage et de réutilisation des tissus animaux pour maximiser leur utilisation. Les foies des rats seront utilisés pour établir des microsomes afin de développer des modèles cellulaires, notamment dans le cadre du protocole INFOGEST. Les tissus non utilisés des souris seront également employés pour le développement de méthodes analytiques sur tissus, minimisant ainsi le besoin de nouveaux prélèvements. Pour optimiser l'utilisation des animaux, nous avons choisi d'utiliser le rat dans la phase d'études de biodisponibilité. Cette décision est motivée par la plus grande taille des rats, qui offre une plus grande disponibilité d'échantillons et permet de nous restreindre à des effectifs les plus faibles possibles comparés à ceux qui auraient été nécessaires avec de plus petits animaux comme la souris. En outre, nous avons adopté une approche expérimentale ciblée pour étudier l'effet des phytonutriments. Dans le modèle de stress inflammatoire induit par le LPS, nous évaluerons l'effet des phytonutriments dans des conditions basales et stimulées. En revanche, dans d'autres modèles, nous nous concentrerons uniquement sur l'effet des phytonutriments en conditions stimulées, ce qui permet de minimiser le nombre de groupes expérimentaux tout en respectant nos objectifs scientifiques. Ces différentes pratiques nous permettent donc de maximiser l'utilisation des ressources disponibles tout en respectant les normes éthiques et les objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, nous mettrons en œuvre des mesures rigoureuses afin à minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux pendant les procédures expérimentales. Tout d'abord, une surveillance quotidienne des animaux sera assurée tout au long de l'étude pour évaluer leur santé et leur comportement, avec un renforcement accru en cas de symptômes de détresse ou de douleur, et des mesures immédiates seront prises pour administrer un traitement de confort afin de soulager la souffrance des animaux le cas échéant. Nous avons défini avec attention des points limites pour chaque procédure expérimentale, permettant d'identifier rapidement les signes de détresse et de prendre des mesures appropriées, y compris l'euthanasie si nécessaire pour éviter toute souffrance inutile. Nous prendrons aussi en compte le bien-être des animaux via l'enrichissement environnemental dans les cages avec l'ajout de carrés de coton, d'igloos en carton et de bâtons de bois. Ces enrichissements offrent aux animaux des possibilités d'exploration et de comportement naturel, réduisant ainsi le stress lié à la captivité. De plus, nous favorisons la stabulation en cages collectives ce qui permet aux animaux de bénéficier de contacts sociaux et de réduire l'isolement. Cette approche contribuera à maintenir le bien-être psychologique des animaux tout au long de l'étude. Nous avons intégré dans nos protocoles des procédures d'entraînement et d'habituation préalable pour familiariser les animaux aux manipulations expérimentales, réduisant ainsi le stress associé aux procédures telles que l'administration orale ou les prélèvements sanguins. Enfin, nous resterons attentifs aux avancées scientifiques et aux nouvelles techniques de raffinement pendant la durée de vie du projet, ce qui nous permettra d’intégrer ces avancées dès qu'elles sont disponibles pour améliorer le bien-être des animaux et optimiser nos pratiques expérimentales.

Choix des espèces

Le rat sera utilisé pour les études de biodisponibilité et le développement des méthodes d’analyses en raison de sa taille anatomique, facilitant les prélèvements sanguins et d'organes en quantité suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilisés et en conservant une facilité d’hébergement et de manipulation. Le rat est également préféré à la souris pour la réalisation de cinétiques de prélèvements en raison de son plus gros volume sanguin. La souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement optimal conforme aux règles éthiques, sera choisie pour l’étude des phytonutriments sur le vieillissement. En effet, les souris sont adaptées aux manipulations nutritionnelles et aux expériences comportementales et les modèles sélectionnés sont largement validés et utilisés dans la communauté scientifique sur cette espèce. Enfin, l’utilisation de souris représente un avantage économique, coutant moins cher que les autres rongeurs en terme d’hebergement et de régimes alimentaires. S’agissant d’étude sur le vieillissement, les animaux seront utilisés à l’âge adulte.

Une pompe osmotique est implantée sous la peau ou dans une veine, en dix à vingt minutes d'opération : 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infusion continue se poursuit ensuite sur animal éveillé, avec des prélèvements de sang répétés, puis une injection létale permet de prélever organes et tissus. Le projet est mené par une société privée qui teste ses propres vecteurs d'acheminement de médicaments vers le cerveau, à raison de six études par an et de groupes de quatre animaux. Le porteur retient la souris parce que sa physiologie est bien connue, et parce qu'à 27 ou 30 grammes elle est "particulièrement économique" en termes de posologies.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations, Il s’agira de contourner les problématiques de la pharmacologie (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de notre système de pompe autonome (délivrances prolongées et maîtrisées). Nous pourrons ainsi proposer de meilleures pharmacologies et optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher leurs meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces.

Procédures

Une première partie de mise en place de l’étude sur animaux éveillés, une seconde sous anesthésie et anti-douleurs (chirurgie) et enfin le suivi et manipulation jusqu’à la mise à mort de l’animal en fin de cinétique. -Constitution des groupes d'animaux (éveillés). -Analgésie (éveillé) : Administration simple et unique (5 secondes) sous la peau au niveau de la nuque. - Procédure chirurgicale et implantation des pompes osmotiques : implantation en sous-cutanée (10 min) ou intraveineux (20 min). -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animal éveillé en cours de cinétique. -Mise à mort finale pour prélèvements de tissus et organes.

Impact sur les animaux

Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées : - Du stress et des douleurs légères de courte durée causées par les injections et les prélèvements sur animaux vigiles. - Du stress et de l’inconfort lors des anesthésies et de possible douleurs suites aux interventions chirurgicales Le composé injecté ne devrait pas avoir d'effets indésirables sur les animaux

Devenir

Afin de réaliser l'étude de l'efficacité pharmacologique, les organes et tissus d'intérêts doivent être prélevés. Pour cela, les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement étudiés in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des suivis pharmacologiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de contrôler le maintien de leurs efficacités directement sur leurs cibles (Récepteurs cellulaires), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pharmacologique pour l’infusion médicamenteuse, nous devrons réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de petits groupes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti de manière équivalente pour les deux procédures d’implantations, en sous-cutanée puis en intra-veineux. Les animaux seront répartis en petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 4 groupes tests par étude et 6 études par an, ce qui représente 96 individus/an et par procédure. C’est-à-dire pour les deux procédures, 192 animaux par an (mixité des groupes 96 mâles + 96 femelles). Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles. En expérimentation animale nous travaillons avec des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles que nous prendrons en considération lors des tests statistiques. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données précieuses sur le sang.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. Les opérations chirurgicales et implantations se feront sur animaux anesthésiés + anti-douleur, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se fera sur animal éveillé. Le contrôle des pesées et les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. .

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille (d'animaux) de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, et qui s’avère particulièrement économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risques immunogènes).

Tester des extraits de plantes en complément d'immunothérapies anticancéreuses, dans un contexte où "les industriels cherchent sans cesse à approfondir leur expertise sur les propriétés des végétaux" : 3 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou directement dans le rein par chirurgie, des injections d'immunothérapie tous les trois jours pendant deux semaines, et des gavages d'extraits de plantes trois fois par semaine pendant trois à quatre semaines. Le porteur qualifie la croissance de la tumeur rénale de "bien tolérée" et le gavage de "contrainte légère". Les extraits testés se trouvent déjà en pharmacie de proximité, et le projet vise à documenter ce qu'ils ajoutent à des immunothérapies existantes.

Objectifs

Les végétaux offrent une action globale au sein de l’organisme en agissant à plusieurs niveaux et en régulant différentes fonctions. Ces dernières années, les progrès en chimie ont permis l’extraction et la mise en évidence de principes actifs de certaines plantes, permettant d’accompagner la santé des individus (sommeil, digestion, stress, etc…). L’impact du régime alimentaire sur la modulation de notre microbiome intestinal a déjà été établit chez la souris comme chez l’Homme. Au sein de notre laboratoire, nous avons démontré l'association entre le microbiote intestinal et l'efficacité des traitements immunothérapeutiques dans le traitement du mélanome, du fibrosarcome et du carcinome rénal à cellules claires. Cet environnement intestinal est un haut lieu d’échange où communiquent les cellules épithéliales et le système immunitaire de l’individu avec un milliard de micro-organismes. De nos jours, les individus souhaitent de plus en plus se tourner vers l’emploi de produits dits naturels afin de renforcer leur microbiote intestinal et leur système immunitaire tandis que les industriels cherchent sans cesse à approfondir leur expertise sur les propriétés des végétaux. C’est dans cette optique que nous nous intéresserons à l’impact de la prise d’extraits de plantes sur la réponse immunitaire dans un contexte oncologique, en association avec des traitements immunothérapeutiques. Le but de ce projet est d’étudier le potentiel thérapeutique des extraits de plante afin d’améliorer le parcours thérapeutique des patients avec ceux-ci tout en approfondissant nos connaissances sur les propriétés de certains végétaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’effet de la bioactivité de certains extraits de plantes et/ou composés actifs sur la croissance tumorale, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale des traitements immunothérapeutiques. Ainsi, nous pourrions approfondir nos connaissances concernant certains végétaux et ainsi, utiliser leurs propriétés afin de répondre aux besoins médicaux des patients. Cela se traduirait par l’accompagnement de la prise de traitements immunothérapeutiques par des extraits de plantes ou composés actifs, que l’on retrouve déjà dans nos pharmacies de proximité, permettant l’amélioration de la réponse anti-tumorale dans des cancers reconnus comme agressifs (rein et mélanome). Aussi, nous pourrions moduler positivement la balance « bonnes » bactéries/ « mauvaises » bactéries au sein du microbiote intestinal, au bénéfice des patients atteints de ces cancers.

Procédures

Les animaux auront des injections de tumeurs, réalisés sous anesthésie (durée 2 minutes, une par souris), ou des injections orthotopiques (injection chirurgicale dans l'organe) sous anesthésie générale (durée 10 minutes, une par souris). Les injections des traitements immunothérapeutiques se feront tous les 3 jours pendant 2 semaines, durée 2 minutes. Nous réaliserons également des gavages d’extraits de plantes ou de composés actifs issus de ces plantes, 3 fois par semaine pendant 3 à 4 semaines, durée 2 minutes. Des prélèvements sanguins seront également effectués sur les animaux, sous anesthésie générale (n=5, durée 5 minutes au maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger lié aux manipulations (préhension). Ils auront des injections en sous-cutanées ou par voie chirurgicale au niveau rénal, et des gavages d’extraits de plantes ou de composés actifs issus de ces plantes. Les injections sous-cutanées et intrapéritonéales provoquent une douleur transitoire légère et seront donc faites sous anesthésie. Les gavages provoquent une contrainte légère. La croissance des tumeurs dans le rein est bien tolérée et provoque des conséquences au maximum modérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des analyses sur divers organes et tissus.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le microbiote, l’immunité anti-tumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse anti-tumorale dans un contexte tumoral, avec toutes les intéractions nécessaires. Il est actuellement impossible de reproduire toutes ces interactions in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Nous mènerons cette étude de façon séquetielle pour que chaque procédure fasse suite à la validation de l’hypothèse précédente. Chaque expérimentation concluante sera répétée une seconde fois, afin d’éliminer le biais d’expérimentation et de s’assurer de la validité de nos observations. Dans le cas où la procédure s’avère non concluante, l’expérimentation ne sera pas répétée et le protocole sera arrêté, ce qui diminuera le nombre de souris. Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été réalisé grâce à un test statistique, ce qui nous a permis d'établir un nombre de 8 souris par groupe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : régime alimentaire adapté et une eau stérile correspondant à leurs besoins, ainsi qu’un enrichissement adapté à l'espèce utilisé. Les animaux seront mis en quarantaine pendant une semaine avant le début de l’expérimentation, afin de leur permettre de s'acclimater à leur nouvel environnement. Dès le début des procédures, les souris auront un examen clinique quotidien afin de s’assurer de leur bien-être tout au long des procédures, suivant des critères pré-définis (poids, aspect du pelage et de la dentition, comportement social, taille et aspect de la tumeur). Des points limites ont ainsi été définis et seront strictement appliqués. Les injections et prélèvements sanguins se feront sous anesthésie. Les souris faisant partie des groupes nécessitant une chirurgie bénéficieront d'un suivi post-opératoire spécifique durant lequel nous leur administrerons des analgésiques.

Choix des espèces

La génétique de la souris est proche de celle de l’Homme et bien décrite au niveau de la littérature scientifique, ce qui rend comparable les voies de signalisation immunologiques des tumeures entre l'Homme et la souris.Les modèles de tumeur que nous utiliseront sont issus de lignées cellulaires murines. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 8 semaines, ce qui nous permettra d'étudier le système immunitaire à un stade de développement optimal et fonctionnel.

Injections dans l'abdomen tous les deux jours de un à quatre mois, test de force trois fois par jour chaque mois, vingt-quatre heures d'enregistrement de l'activité locomotrice répétées jusqu'à quatre fois, prélèvement de sang mensuel : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent l'une des deux mutations les plus fréquentes chez les patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires, et présentent une faiblesse musculaire dès l'âge de deux mois. Le porteur signale aussi une douleur et un stress liés au poinçonnage de l'oreille et au tatouage de la queue. La mesure finale de la force musculaire dure jusqu'à trente minutes sous anesthésie, sans réveil, et les souris sont tuées pour que leurs muscles soient prélevés.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes et des myalgies. La majorité des patients présentent également des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multisystémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Nous avons précedemment généré et caractérisé deux modèles murins portant les deux mutations TAM/STRMK les plus communes chez les patients, localisées sur des gènes différents. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes cliniques. A partir d'une librairie de médicaments approuvées pour le traitement médical chez l'homme, nous avons identifier deux médicaments capables d'inverser les défauts associés à la maladie in vitro. Une autre molécule est actuellement entrée en Phase II en essais cliniques pour la pancréatite aïgues mais cible la même voie dérégulée chez nos patients. Nous avons l'intention de traiter nos modèles souris TAM/STRMK avec les deux médicaments et la molécule en Phase II afin de tester la prévention mais également la réversion des symptômes observés chez les souris. Nous espérons ici trouver une nouvelle indication thérapeutique à des médicaments utilisés pour le traitement d'autres maladies. Cette méthode permet d'offrir une solution thérapeutique plus rapide aux patients et également peu toxique. Cette méthode est particulièrement intéressante pour les maladies rares comme TAM/STRMK où le nombre de patients diagnostiqués n'est pas suffisant pour réaliser des essais cliniques sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Il est attendu que cette étude apportera une preuve de concept pharmacologique pour un traitement efficace de TAM/STRMK.

Procédures

Les animaux seront injectés par injection intrapéritonéale tous les deux jours entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention, et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. L'injection est réalisée en moins de 30 secondes. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour toutes les mois entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. Chaque test dure 60 secondes avec repos minimal de 5 minutes entre chaque test. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 2 fois pour la stratégie de réversion (1 fois par mois). Le prélèvement du sang sera répété 1 fois par mois, soit 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 3 fois pour la stratégie de réversion, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections péritonéales seront réalisées pour administrer le traitement. La procédure prendra environ 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les souris malades manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, et les plaquettes, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal. Une douleur et un stress physique sont attendus suite au poiçonnage de l'oreille et au tatouage consécutif de la queue lors de l'identification de l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à morts à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage. La couleur de leur peau et la présence d'une poche de lait seront évaluées tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l'air sera assurée par une ventilation et un cycle de lumière de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à volonté à de l'eau et de la nourriture. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire pour maintenir les animaux propres et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids et un tube. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une phase de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pendant toute la procédure afin de maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. Des points limites pour nos souris incluent des signes de difficultés motrices majeurs tels que la perte de poids et une immobilité prononcée des membres postérieurs avec l’apparition d’une cyphose (dos arrondi). Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées. Les sites d'injections seront surveillés quotidiennement pour prévenir une infection.

Choix des espèces

Le modèle souris nous permet d’étudier la possible amélioration du phénotype musculaire et notamment du phénotype observé sur d’autres organes dans ce modèle murin d’une maladie multisystémique. Nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est plus différente. C'est pourquoi nous proposons de réaliser ces techniques sur des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires. Les tissus de la souris peuvent alors être utilisés pour effectuer d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et minimisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement.

Pour tester des inhibiteurs de canaux calciques contre la leucémie aiguë lymphoblastique et le neuroblastome, 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules cancéreuses en boîte de contention, puis des molécules dans l'abdomen une fois par jour pendant cinq jours, et passent deux séances d'imagerie par semaine pendant quinze jours. Le porteur indique que les souris témoins surtout, mais aussi les souris traitées, vont développer le cancer, avec une restriction des mouvements des pattes arrière et une perte d'appétit pour la leucémie, une tumeur sous-cutanée qui progresse pour le neuroblastome. Une échelle de gravité fixe le seuil à partir duquel la souffrance doit être arrêtée, et la mise à mort intervient quand ce seuil est atteint ou quand les prélèvements l'exigent.

Objectifs

Bien que la prise en charge des patients atteints de cancer soit considérablement améliorée au cours des dernières décennies, les patients qui rechutent deviennent résistants à un certain nombre des traitements par chimiothérapies. Ces derniers reposent sur un ou une combinaison de plusieurs traitements (chirurgie, chimiothérapie, immunothérapie ou traitement ciblé). L'enjeu d'identifier l'origine et les mécanismes de cette résistance pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques reste aujourd'hui un objectif stratégique. Le cancer se caractérise par une survie accrue des cellules cancéreuses et une résistance à leur mort. Ces deux mécanismes sont associés à des défauts de régulation de la signalisation du calcium. Dans des études récentes, il a été mis en évidence des perturbations de la signalisation calcique dans deux types de cancer : le neuroblastome et la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL). Par exemple dans la LAL, il a été observé une augmentation du niveau de base du calcium dans les cellules résistantes en comparaison aux cellules sensibles aux traitements. Ces études in vitro ont permis d'identifier des molécules qui sont responsables de cette dérégulation calcique pour ce type de cancer et que leur inhibition étaient efficaces pour rétablir l'équilibre calcique. Ce projet a pour objectif principal de proposer une alternative thérapeutique en utilisant des inhibiteurs ou anticorps spécifiques qui ciblent ces molécules responsables de cette dérégulation calcique dans ces cancers. Et l’objectif secondaire est de déterminer l'efficacité thérapeutique de ces anticorps ou inhibiteurs spécifiques en combinaison avec les agents pharmacologiques conventionnels utilisés en première ligne de traitement.

Bénéfices attendus

Il est attendu une efficacité des différents inhibiteurs ou modulateurs avec un effet bénéfique sur le ralentissement de la progression tumorale et, le pouvoir de ces inhibiteurs à ameliorer la sensibilité des drogues. Le but est de permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuse.

Procédures

Prélèvement sanguin sur animaux anesthésiés (anesthésie générale gazeuse) : 1 prélèvement, moins de 10 secondes. Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention : 1 injection de cellules, moins de 10 secondes par injection. Injection de molécules thérapeutiques en intra-péritonéal sur souris anesthésiée : 1 fois par jour sur 5 jours, moins de 10 secondes par injection. Suivi du développement des tumeurs sur souris anesthésiée par utilisation d'un bioimageur, acquistion du signal durant 2 minutes, 2 fois par semaine sur 15 jours.

Impact sur les animaux

Les souris contrôles surtout mais également celles traitées vont développer un cancer, leucémie ou neuroblastome. L'avancée de la maladie va conduire dans le cas de la leucémie à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrière, une perte d'appétit et de poids et pour le neuroblastome une tumeur qui va progesser en sous-cutané. Une échelle de gravité des symptômes observés permet d’établir un point limite dans l’ensemble des expériences. Ces points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Lors des 2 procédures les animaux recevront des injections et seront soumis à des prélèvements de sang, source de légère douleur liée à la piqure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort , car point limites atteints et/ou nécessité de prélevements (sang, organes)

Remplacement

Au préalable, plusieurs screening et évaluations (efficacité, cytotoxicité, etc.) in vitro des différents traitements ont été effectués sur des lignées cellulaires. Cependant, pour se rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité dans un modèle in vivo reste indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique. Le choix de la souris repose sur la connaissance du système immunitaire de cette espèce, sur l’abondance des outils d’analyse des réponses immunitaires à disposition et par sa proximité phylogénétique avec l'homme qui permet d’envisager la transposition en clinique des stratégies évaluées.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux en expérimentation, ne seront utilisés que les inhibiteurs ou modulateurs des canaux calciques ayant démontré une efficacité dans une étude de non-toxicité cellulaire in vitro (dans un modèle cellulaire préalablement validé). Le nombre d’animaux nécessaire est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité des mesures entre les souris du même groupe permettant une analyse statistique significative. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement. La croissance tumorale sera suivi en ayant recourt à de l'imagerie non invasive rendu possible grâce à l'utilisation de cellules tumorales bioluminescentes. Un tel suivi longitudinal sur l'animal permet une réduction du nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF (Specific Pathogen Free) : ce statut SPF considère les principaux pathogènes chez les rongeurs et permet donc d’établir un état sanitaire pour des animaux « en bonne santé » et indemnes des principaux pathogènes. Les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse en respiration spontanée. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront réduit au strict minimum. Nous avons optimisé notre procédure en définissant des points limites permettant d’identifier le moment à partir duquel la souffrance et /ou la détresse de l’animal doit être arrêtée. Le suivi de la croissance tumorale se fera par un système d'imageur par bioluminescence, suivi longitudinal non invasif pour l'animal.

Choix des espèces

Le modèle animal le plus couramment utilisé dans le développement et dans l’évaluation thérapeutique en oncologie est la souris, en effet elle constitue un modèle préclinique implantable ou de greffe, dans lesquels la culture de cellules humaines sont greffés sur des animaux immunodéficients ou immunocompétents. Ce modèle constitue donc un outil pour des études physiopathologiques et le développement thérapeutique expérimental susceptibles d’améliorer le diagnostic, les connaissances physiopathologiques et nosologiques. Les souris utilisées seront agées au minimum de 6 semaines au début du protocole. Les tests débutent classiquement à 8 semaines de vie.

Un mois de doxycycline dans l'eau de boisson, pour éteindre un gène dans les fibres musculaires : 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend de cette délétion un déclin progressif de la fonction musculaire, sans mort prématurée ni dystrophie, et prévoit une échelle de douleur de 0 à 3 pouvant conduire à une mise à mort anticipée. La question posée relève de la biologie fondamentale, savoir si les cellules musculaires éliminent leurs noyaux par autophagie, les retombées sur les maladies musculaires et le vieillissement étant annoncées comme un impact futur. Il compte 42 souris privées du gène et 42 témoins, soit 84 animaux, quand l'effectif déclaré est de 42.

Objectifs

Dans nos cellules, les organites ne sont pas permanents et subissent des dommages constants. Ces dommages déclenchent un mécanisme de nettoyage appelé autophagie, qui permet à la cellule d'éliminer les éléments endommagés. Contrairement aux autres organites, la plupart des cellules n'ont qu'un seul noyau, qui n'est donc pas considéré comme jetable. Cependant, les cellules musculaires squelettiques ont la particularité d'avoir des centaines de noyaux, ce qui pourrait faire du noyau un organite jetable. Nos recherches antérieures ont en effet montré que les cellules musculaires éliminent constamment les noyaux préexistants. Cependant, le mécanisme à l'origine de ce processus reste inconnu. Dans ce projet, nous explorons la possibilité que l'autophagie soit impliquée en suivant les noyaux marqués dans les fibres musculaires grâce à des outils génétiques développé chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront un éclairage totalement nouveau sur la façon dont nous concevons l'homéostasie du tissu musculaire. Elles auront à leur tour un impact important sur la compréhension des maladies musculaires et du vieillissement, où de nombreux noyaux musculaires aberrants s'accumulent.

Procédures

Administration de doxycycline par voie orale dans l’eau de boisson pendant 1 mois pour induire la délétion de notre gène d’intérêt dans les myofibres.

Impact sur les animaux

La doxycycline est un antibiotique largement utilisé et son administration n'entraîne aucune gêne. La conséquence de son administration est le marquage des noyaux musculaires qui n'induit pas, non plus, de gêne. La perte de notre gène d'intérêt dans les myofibres a été signalée, dans une autre étude, comme provoquant une gêne modérée : les souris ne meurent pas prématurément et ne développent pas de dystrophie, mais elles présentent un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps. Cette gêne modérée ne sera présente que chez les animaux délété du gène d'intérêt dans les myofibres après induction par la doxycycline soit 42 animaux. Les 42 animaux contrôles ne sont pas impactés, ils ne subiront aucune gêne.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons, post mortem, tous les tissus musculaires pertinents de tous les animaux à la fin de la procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Notre projet porte sur la dynamique cellulaire et nécessite donc la présence de plusieurs structures cellulaires complexes. Il est important de noter qu'il n'existe actuellement aucun modèle de culture cellulaire permettant d'éliminer les noyaux musculaires préexistants (nous n'avons obtenu que récemment des données montrant que cela peut se produire chez les animaux dans notre propre équipe). Nous ne connaissons aucune méthode pour induire l'élimination des noyaux des cellules musculaires cultivées, ce que nous devrons comprendre en utilisant des modèles de souris. Enfin, nous souhaitons souligner les limites des cellules musculaires différenciées in vitro. Ces cellules sont extrêmement immatures et incomplètes car elles manquent de nombreuses caractéristiques des cellules musculaires matures : par exemple, absence de jonction muscle-neurone, absence de jonction muscle-tendon, absence de sarcomères matures, noyaux ne se déplaçant pas vers la périphérie de la cellule et se regroupant plutôt au centre de la cellule, etc. Si un chercheur étudie des mécanismes impliquant des événements de différenciation très précoces (par exemple, la sortie du cycle cellulaire, l'expression de gènes de différenciation précoce, la fusion musculaire, etc. ), les modèles in vitro existants peuvent s'avérer utiles. Cependant, pour toute question scientifique concernant des cellules musculaires entièrement matures et leurs structures (comme les nôtres), ces modèles de culture ne peuvent malheureusement pas remplacer les modèles animaux. Les modifications génétiques que nous utilisons ne sont possibles que chez la souris. Elles nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées.

Réduction

Notre étude du renouvellement des noyaux musculaires dans le temps reprend des points temporaux déjà établis dans des études précédentes. De plus nous collecterons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 groupes. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe pour ce projet est de 7 femelles et 7 males afin d'obtenir une différence statistiquement significative.

Raffinement

Au cours de notre projet nous attendons un déclin progressif de la fonction musculaire au fil du temps chez les animaux délété pour notre gène d’intérêt dans les myofibres. Ce déclin sera très modéré néanmoins tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère (exemple : inconfort léger au niveau d’un membre type légère boiterie), dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente (exemple : douleur manifeste d’un membre entrainant un problème de déplacement), dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense (exemple : paralysie des membres), dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Les souris seront surveillées régulièrement. Le suivi de nos souris comprend une observation visuelle du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés). Si des souris devaient présenter des difficultés à se déplacer et donc des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage.

Choix des espèces

Nous utilisons des outils génétiques pour le suivi des noyaux musculaires, qui sont établis dans des modèles de souris. La lignée de souris permettant la délétion de notre gène d’intérêt, et donc de la protéine, après croisement avec une lignée exprimant la protéine Cre recombinase est également établie. La souris est donc le meilleur choix pour mener cette étude. Comme notre projet se concentre sur la régulation de la dynamique cellulaire dans les muscles matures, nous devons utiliser des souris dont le développement est terminé. Nous utiliserons donc des animaux adultes, mâles et femelles, âgés d’au moins 10 semaines.