Procédures modérées

Obtenir l'autorisation de mise sur le marché de dispositifs médicaux, prothèses, pansements, ovules ou gels lubrifiants : 434 lapins vont être utilisés dans des tests d'irritation cutanée, oculaire, vaginale, rectale et intradermique, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les réactions attendues vont de l'érythème à l'escarre, avec destruction de l'épiderme et du derme, œdème, et pour l'œil larmoiement, œdème de la cornée et atteinte de l'iris, effets pouvant persister jusqu'à la fin de l'étude, soit vingt et un jours. Les lapins sont hébergés seuls jusqu'à sept semaines et maintenus dix à vingt minutes sur un portoir de contention pour les traitements vaginaux quotidiens. Le porteur précise que les antalgiques ne sont administrés que dans les tests oculaires, "puisque ce sont les exigences de la norme utilisée", et que cette même norme impose l'espèce, 232 lapins peu ou pas irrités étant réutilisés dans un autre test et les autres tués.

Objectifs

Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (prothèses, pansements, ovule, gel lubrifiant...) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa tolérance locale, autrement dit sa capacité à ne pas induire de réactions d’irritation. Afin de répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons sur le modèle du lapin des tests d’irritation cutanée, oculaire, vaginale, rectale, et intradermique. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaire européennes.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, autrement dit sa biocompatibilité. Ce projet fait partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Europpéen et exigée par les organismes notifiés afin d’accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.

Procédures

* Tolérance cutannée : Un traitement local (maximum 24h) sur 3 animaux vigiles. En fonction du projet le traitement peut être répétés, la durée peut varier. Deux pesées. Observations macroscopiques tous les jours jusqu’à la fin de l’étude. Euthanasie (1minute). *Tolérance intradermique : Un traitement (5minutes) sur 3 animaux vigiles. Deux pesées. Observations macroscopiques tous les jours. Euthanasie (1minute). *Tolérance oculaire : Analgésie (30 sec) au début de l'étude et si besoin pendant le déroulé du projet. Un traitement local dans le sac conjonctival sur 3 animaux vigiles (1minute). Deux Pesées. Observations macroscopiques tous les jours, nécessitant un colorant (2minutes). Euthanasie (1minute). * Tolérance sur muqueuse vaginale et anale : Traitements vaginaux quotidien (espacés de 24h) sur 6 (traitement d’un produit pur) ou 12 (traitement par extrait) animaux vigiles. Les animaux restent sur le portoir de contention entre 10 et 20 minutes selon le nombre d’animaux à traiter. Deuxpesées. Observations macroscopiques tous les jours. La durée de l’étude et le nombre de traitement peut varier en fonction du projet. Euthanasie (1minute). Autopsie et prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

*Tolérance cutanée : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir une sécheresse cutanée, une perte de souplesse de la peau, un érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épidermes et du derme, et de l’œdème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 14 jours. *Tolérance oculaire : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir du larmoiment, de l’œdème, des conjonctives, de l’érythème, une atteinte cornéenne (opacitée, néovascularisation, œdème cornéen), une atteinte de l’iris. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 21 jours. * Tolérance intradermique : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte et de l’œdème. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, soit 3 jours. * Tolérance sur muqueuse vaginale et anale : les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Il peut y avoir un érythème, de l’œdème et des écoulements. Les effets observés peuvent restés jusqu’à la fin de l’étude, durée du traitement varie en fonction du projet. L'ensemble des procédures sont classées en modérées. Les animaux étant hébergés individuellement, ils ont un contact limité avec leurs congénères ce qui limite également l’expression de comportements grégaires (durée d'hébergement maximal: 7 semaines).

Devenir

Concernant les tests de tolérance cutannée et oculaire, les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation ou des signes très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima irritante pour la peau. Dans ce cas là les animaux seront euthanasiés. Pour les tests de tolérance intradermiques, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Les tests de tolérance sur muqueuse vaginale ou anale conduisent également à l’euthanasie des animaux puisque des analyses histopathologiques sont nécessaire à la conclusion de l’étude.

Remplacement

Pour l’ensemble des études de tolérance locale, tout matériau connu pour être irritant pour la peau, les yeux ou les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2.0 ou ≥ 11.5 ne doit pas être testé. Dans des cas exceptionnels où une caractérisation/évaluation des risques est nécessaire malgré cela, ces cas doivent être justifiés et documentés. Par ailleurs, les tests d’irritation ne doivent être envisagés que si les données de sécurité ne peuvent pas être obtenues par d’autres moyens. A l’heure actuel un test in vitro est aujourd’hui accepté par les autorités règlementaires et peut être utilisé pour remplacer certains tests in vivo. Ce test est également régi par la norme 10993-23 (+ adaptation de l’OCDE 439). Il permet d’évaluer la tolérance locale pour les extraits des DM en contact avec une peau saine et lésée. Néanmoins lorsque le dispositif est un mélange, un implantable long terme, permet une communication interne externe ou qu’il est en contact avec les muqueuses les tests in vivo seront toujours recommandés. Le test in vitro repose sur la mesure de la viabilité cellulaire à travers l’utilisation d’épiderme reconstruit. Ces épidermes sont constitués de plusieurs couches de cellules épidermiques et d’une couche cornée enfin de créer une véritable barrière cutanée qui pourrait donc s’apparenter à la peau. Pour mesurer cette viabilité nous utilisons un produit chimique qui va pénétrer dans les cellules vivantes et sera réduit par les mitochondries en sel bleu de formazan et donc donnera une couleur violette. La lecture de la viabilité se fait ensuite par mesure de densité optique. Aujourd’hui, aucun test in vitro n’est accepté par les autorités règlementaires pour évaluer l’effet irritant d’un dispositif médical sur les yeux (norme ISO 10993-23). Une veille technologique et scientifique est effectué régulièrement par le groupe afin de rester attentif à des avancés scientifique et parution de nouvelles normes qui permettrait d'utiliser des méthodes in vitro à la place de methode in vivo.

Réduction

Tolérance locale : Les animaux utilisés dans ces études peuvent être issus d’autres études de tolérance locale où ils ont été traités avec une autre voie d’administration. Cela n'est possible que lorsque aucun effet ou des effets très légers ont été observés. Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent à l’exception de l’irritation vaginale qui est réalisée sur des femelles. Pour l’ensemble des projets lapins, nous ne faisons pas de témoins positifs afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les études précédentes présentant des scores nous servent de témoins. Le nombre d'animaux par étude est exigé par la norme ISO et le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vue du nombre de test effectué les années précédentes. Aucun test statistique n'est utilisé dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et un enrichissement par briquettes de bois est mis à leur disposition. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toutes souffrance inutile aux animaux. Concernant le projet d’irritation oculaire, des analgésiques sont utilisés avant, pendant et après le traitement. L'analgésie continuera aussi longtemps que nécessaire. Les antalgiques ne sont possibles que pour les tests oculaires puisque ce sont les exigences de la norme utilisée.

Choix des espèces

L’espèce et le stade de développement des animaux à utilisé est imposé par la normes ISO 10993-23. Le choix d’une autre espèce doit être justifié. Pour la totalité des projets présentés, nous utilisons des lapins jeunes adultes de 9 à 15 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ce premier volet d'un projet en deux parties repose sur des chirurgies d'une à six heures, jusqu'à deux par animal, pour implanter des électrodes cérébrales et une canule nasale, suivies de sessions quotidiennes d'enregistrement de deux heures pendant plusieurs mois. Les retombées annoncées concernent les apnées du sommeil et les troubles respiratoires observés dans la maladie d'Alzheimer, alors que l'objet immédiat reste de décrire comment le rythme respiratoire module l'activité des neurones. Le porteur affirme qu'il faut travailler sur des animaux vigiles, ce qui rend selon lui l'étude impossible in vitro, et que les questions posées ne peuvent pas non plus être traitées in silico.

Objectifs

La respiration est intimement liée à la physiologie du cerveau. D’une part, l’activité respiratoire est modulée par les stimuli sensoriels, par l’attention, l’état émotionnel et elle peut être affectée dans certaines pathologies du cerveau. D’autre part, la respiration impacte le fonctionnement cérébral, influençant la perception, les émotions et la cognition en général. Un grand nombre de neurones sensoriels situés dans la cavité nasale sont des mécanorécepteurs sensibles au flux d’air et transmettent le signal de respiration aux structures en aval, dont le bulbe olfactif et de nombreuses régions cérébrales. Ce signal est supposé jouer un rôle important dans la coordination des réseaux neuronaux et pourrait participer aux processus cognitifs dans les phases d’eveil mais aussi pendant le sommeil au cours duquel, entre autres, nous consolidons nos souvenirs. L’objectif général de ce projet est de comprendre la nature du dialogue entre respiration et activité neuronale et en particulier : 1- De comprendre comment la respiration, de par son activité rythmique, influence l’activité neuronale dans le système olfactif et les régions associées 2- De comprendre comment la respiration – de par son rôle dans l’oxygénation du cerveau - influence l’activité neuronale 3- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est identique dans plusieurs lignées de souris sauvages 4- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est déficient dans un modèle de maladie neurodégénérative 5- D’identifier des mécanismes de contrôle de la respiration par l’activité des neurones. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé humaine étant donné que la prévalence des apnées du sommeil dans la population et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies (y compris la maladie d’Alzheimer).

Bénéfices attendus

Notre activité cérébrale est intimement liée à la façon dont nous respirons. La respiration module le fonctionnement cérébral (émotions, attention etc) et notre état cognitif régit en retour notre comportement respiratoire. Cependant les mécanismes impliqués dans ce dialogue sont peu connus. Cette étude apportera des éléments essentiels à la compréhension de cette question. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé étant donné que de nombreuses personnes souffrent d’apnées du sommeil et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies humaines (dont la maladie d’Alzheimer).

Procédures

Les souris seront étudiées lors de l’expression de comportements naturels et spontanés, lorsqu’elles dorment, mais aussi lors de courtes sessions où leur tête devra rester fixée face à un masque à oxygène. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau et son lieu avec la respiration, les souris seront équipés d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). Les enregistrements seront réalisés au maximum une fois par jour pour une durée de 2 heures environ (1h30 pour les expériences tête fixée). Au cours de certains enregistrements, nous ferons légèrement varier le taux d’oxygène présent dans l’atmosphère de la souris (variations

Impact sur les animaux

Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. La respiration sera enregistrée via une canule placée au niveau de la cavité nasale. Ceci nécessite la réalisation de chirurgies sous anesthésie et analgésie avec un impact très limité sur l’animal. Le port des implants suite à ces chirurgies peut générer une légère gêne pour l’animal. De plus, afin de contrôler le taux d’oxygénation des souris, nous devrons les placer dans une enceinte fermée dans laquelle l’atmosphère peut être contrôlée de manière précise. Dans une autre série d’expérience, il nous faudra maintenir la tête des souris au niveau d’un masque à oxygène, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La restriction des mouvements de l’animal pendant ces deux procédures ainsi que les variations de taux d’oxygénation peuvent être légèrement désagréables pour l’animal, tout du moins avant qu’il n’y soit y habitué. Enfin, nous prévoyons d’utiliser des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui parfois présentent des crises d’épilepsie et une mortalité accrue à partir de 4.5 mois.

Devenir

L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Ceci concerne les souris dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements naturels, interagissent avec leurs congénères, explorent, courent ou dorment : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est 900 souris adultes sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris pendant plusieurs sessions d’enregistrement, ceci donnant accès à un jeu de données riche. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique. Pour les expériences visant à tester l’impact de l’oxygénation sur le cerveau, avec différents taux d’oxygénation, une souris sera son propre contrôle car elle sera testée à différent taux d’oxygénation : ce qui augmentera notre puissance statistique et donc le nombre de souris nécessaires. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment à la fixation de tête). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésiques et analgésiques permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Lors des sessions d’enregistrement, les souris seront étudiées alors qu’elles expriment des comportements spontanés et naturels : elles seront exposées à des stimuli sensoriels différents de leur cage d’hébergement ce qui constituera, en soi, une forme régulière d’enrichissement.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction complexe entre cerveau-et respiration, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’influence de la respiration sur les fonctions cognitives a été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme ce qui appuie la pertinence de ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-12 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. L’utilisation de souris >6mois sera notamment réservée aux souris APP-PS1 qui développent un phénotype pathologique uniquement à partir de 3 mois chez les femelles et 6 mois chez les mâles.

Cinq à dix chocs électriques en une séance de douze minutes servent à installer une peur durable chez des souris dont la tête est ensuite fixée pour observer leur amygdale pendant leur sommeil. Les 240 souris du projet sont d'abord opérées une heure et demie à deux heures pour la pose d'un implant, habituées deux semaines à la contention, puis toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est soumise à un protocole censé produire un phénotype comportemental de stress post-traumatique, que des stimulations optiques doivent ensuite corriger. Le porteur qualifie ces chocs de légers tout en visant une réponse de peur durable, et cite les attentats et la pandémie de COVID-19 parmi les motifs du projet.

Objectifs

Le cerveau relie les informations importantes de notre environnement aux émotions que nous ressentons, ce qui renforce nos souvenirs et facilite leur rappel au bon moment. Ce processus se déroule à la fois lorsque nous sommes éveillés et pendant le sommeil, notamment pendant le sommeil paradoxal (ou sommeil REM). Pendant la journée, nos expériences émotionnelles sont enregistrées, puis consolidées pendant le sommeil. Ce traitement peut réduire l'impact émotionnel de certains souvenirs, d'où l'expression "la nuit porte conseil". Améliorer la qualité du sommeil réduit l'anxiété, le stress et la dépression, tout en augmentant la satisfaction de vie. Les troubles du sommeil paradoxal sont souvent liés à des problèmes émotionnels comme le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Ce projet vise à comprendre comment le sommeil stabilise les souvenirs émotionnels et à explorer de nouvelles pistes pour traiter les souvenirs traumatisants. Nous étudierons le cerveau de souris en utilisant des techniques d'imagerie avancées et en observant leur sommeil pendant des tâches émotionnelles, en nous concentrant sur l'amygdale, une région clé pour les émotions souvent impliquée dans des troubles comme le TSPT.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, la France a traversé des périodes difficiles qui ont entraîné une augmentation des troubles psychologiques, notamment le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Les attentats terroristes ont laissé des séquelles profondes, non seulement chez les personnes directement touchées, mais aussi dans l'ensemble de la population. Environ 20 % des médecins ayant soigné des victimes d'attentats montrent des symptômes de TSPT. Plus récemment, la pandémie de COVID-19 et le confinement ont aussi augmenté les troubles psychologiques, y compris le TSPT. Le sommeil est crucial pour la santé et la qualité de vie. En France, environ quatre millions de personnes souffrent d'insomnie sévère. Le sommeil aide à apprendre et à consolider les souvenirs. Manquer de sommeil affecte notre capacité à nous concentrer et à retenir des informations. Ce projet vise à comprendre comment le cerveau retient les souvenirs pendant le sommeil et pourquoi certaines personnes, comme celles atteintes de TSPT, ont des difficultés avec leurs souvenirs émotionnels. Nous nous concentrerons sur l'amygdale, une partie du cerveau importante pour les émotions, souvent liée à des problèmes de sommeil.

Procédures

Tous les animaux (240 souris) subiront une intervention chirurgicale (1.5-2 heures) pour l'implantation permettant l'imagerie ou le contrôle optique des populations neuronales dans l'amygdale (neurones excitateurs ou inhibiteurs). Ils suivront ensuite un protocole d'habituation à la fixation de la tête pour l'imagerie à deux photons pendant le sommeil naturel ou aux câbles implantés de manière chronique (2 semaines). Ensuite, un groupe d'animaux (40 souris) subira un processus d'imagerie des populations neuronales de l'amygdale pendant le sommeil immédiatement après un protocole de conditionnement de la peur (durée totale de la procédure: 25 jours). Un deuxième groupe (80 souris) suivra un protocole de contrôle optique d'une sous-population neuronale dans l'amygdale suite à une tâche de conditionnement de la peur (durée totale de la procédure: : 25 jours). Enfin, un troisième groupe subira un protocole de génération de phénotypes comportementaux de TSPT et l'activité de l'amygdale de ces souris sera soit imagée (40 souris) soit contrôlée optiquement pendant le sommeil pour restaurer les performances comportementales normales des animaux (durée totale de la procédure: : 25 jours).

Impact sur les animaux

Les désagréments possibles sont les suivants : 1. Stress lié au génotypage : Lorsqu'on prélève un petit morceau de la queue pour analyser l'ADN, il peut y avoir un léger saignement. Pour y remédier, nous utilisons du tissu hémostatique et désinfectons la zone. 2. Stress dû à l'isolement : Les souris peuvent ressentir du stress et développer des comportements répétitifs lorsqu'elles sont isolées. Pour y remédier, nous enrichissons leur environnement. 3. Stress léger lié aux manipulations : Lorsque les souris sont manipulées par les chercheurs, elles ressentent un stress léger. Cependant, elles s'habituent rapidement à ces manipulations. 4. Complications chirurgicales : Lors des chirurgies, des gonflements, inflammations ou saignements peuvent survenir. Nous utilisons des médicaments spécifiques pour prévenir ces problèmes et appliquons du tissu hémostatique pour contrôler les saignements. 5. Inconfort au réveil après anesthésie : Après les chirurgies, les souris peuvent ressentir un inconfort. Toutefois, grâce à un protocole efficace de médicaments antidouleur et anti-inflammatoires, elles récupèrent rapidement. 6. Gêne liée à l'implant : Les premiers jours après l'installation d'un implant, les souris peuvent ressentir une gêne. Cependant, elles s'y habituent en quelques jours, et au bout de 5 jours, la plupart des souris retrouvent un comportement normal. 7. Perturbations dues à la fixation de la tête : Lors de la fixation de la tête, nous suivons un protocole pour minimiser le stress. En général, les souris retrouvent un cycle de sommeil normal après 5 à 6 jours. 8. Perturbation du sommeil par la lumière : Pendant les expériences d'optogénétique, la lumière utilisée peut perturber le sommeil des souris. Pour réduire cela, nous recouvrons la zone avec un vernis noir pour minimiser les réveils. 9. Perturbations dues au conditionnement à la peur : Lors du conditionnement à la peur, une seule séance de courte durée (12 minutes maximum) est réalisée, avec 5 à 10 chocs électriques légers pour induire une réponse de peur durable.

Devenir

Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie à la fin du deuxième jour de l'expérience.

Remplacement

Bien que des animaux plus simples comme la drosophile, le poisson rouge ou le ver C. elegans soient parfois utilisés pour étudier l'activité du sommeil, ils n'ont pas de sommeil paradoxal, une phase spécifique que l'on trouve chez les mammifères et les oiseaux (et peut-être chez les reptiles). Leur système nerveux est beaucoup moins complexe que celui des mammifères, et donc pas comparable pour comprendre des processus neurologiques complexes. De nouvelles méthodes, comme la modélisation informatique, l'intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puce ou les organoïdes cérébraux, sont prometteuses mais ne remplacent pas encore la souris pour analyser et comprendre les dysfonctionnements du cerveau ou reproduire des observations cliniques liées à des pathologies neurologiques. Notre recherche vise à comprendre comment le sommeil est régulé et ses fonctions sur la physiologie et la cognition. Pour cela, nous avons besoin d'utiliser des animaux vivants et en bonne santé. Les techniques utilisées pour étudier les réseaux neuronaux et les mécanismes complexes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme, car elles nécessitent des interventions invasives et des modifications génétiques ciblées, possibles uniquement chez la souris. Dans ce contexte, l'utilisation de la souris reste essentielle pour mener des études physiologiques et comportementales sur le long terme.

Réduction

Les expériences ont été conçues pour utiliser le moins d'animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Pour chaque type d'expérience, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaires, en prévoyant une petite marge pour les pertes éventuelles. Par exemple, pour les expériences d'imagerie à 2 photons, nous prévoyons un groupe de 10 animaux, en incluant une marge pour une perte possible de 20 %. Ces calculs sont basés sur des méthodes statistiques reconnues, qui nous aident à déterminer la taille minimale des groupes tout en maintenant la fiabilité des résultats. Une fois les données collectées, elles seront analysées à l'aide de tests statistiques, pour vérifier que les résultats sont significatifs et fiables.

Raffinement

Le projet a été conçu pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Hébergement et soins : Les souris seront logées à quatre par cage pour favoriser leurs interactions sociales et réduire le stress. Elles auront un environnement enrichi pour leur bien-être. Après la chirurgie, elles seront placées par deux dans des cages doubles avec un séparateur pour qu'elles puissent interagir sans se nuire. Elles seront surveillées quotidiennement pour s'assurer de leur bonne récupération, avec des ajustements comme des analgésiques si nécessaire. Lorsque l'isolement est nécessaire, nous leur fournirons des matériaux pour construire un nid et ajouterons de nouveaux objets régulièrement pour stimuler leur environnement. Le stress affecte le sommeil, donc nous surveillerons leur comportement et leur sommeil avec des enregistrements polysomnographiques, qui permettent de suivre les cycles de sommeil et les signes de stress. Chirurgie : Toutes les procédures chirurgicales, y compris l'anesthésie et l'analgésie, sont réalisées selon les meilleures pratiques pour minimiser la douleur. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement. Une grille de notation (0 : meilleur état à 2 : état dégradé) évaluera leur état général en se basant sur plusieurs critères tels que le poids, la mobilité, la préparation du nid et l’état du pelage. Si le score atteint ou dépasse 4 pendant 3 jours consécutifs, ou si l’état des animaux se détériore malgré les soins après 7 jours, les animaux seront retirés de l’étude.

Choix des espèces

L’étude des mécanismes neurobiologiques des comportements complexes, comme le sommeil, nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Le sommeil paradoxal est commun aux mammifères tels que la souris, le rat et l'homme, avec une organisation cérébrale similaire. Les modèles animaux alternatifs (drosophile, poisson zèbre, Caenorhabditis elegans), bien que populaires, n’ont pas de sommeil paradoxal et ne sont pas pertinents pour nos travaux. Depuis plus de 20 ans, les modèles de souris génétiquement modifiées ont fourni des résultats importants. L'utilisation de ces modèles pour étudier les circuits veille-sommeil est justifiée par la conservation de ces circuits chez les mammifères. Les résultats obtenus sont donc transposables au cerveau humain. En raison des ajustements souvent nécessaires dans les modèles transgéniques, nous utilisons une technique appelée transfection neuronale. Cette méthode consiste à introduire des gènes spécifiques dans les neurones (les cellules nerveuses du cerveau) en utilisant des virus modifiés, afin de mieux comprendre et modifier leur fonctionnement. Cette approche est reconnue comme très efficace pour étudier les fonctions cérébrales. Nous utiliserons des souris de souche standard et des souris transgéniques spécifiques (comme celles portant des gènes pour activer ou inhiber certains neurones) âgées de 10 à 12 semaines au début des procédures. À cet âge, les souris ont atteint leur maturité cérébrale, avec un système locomoteur et un cycle veille-sommeil stabilisés. De plus, l’efficacité de la transfection neuronale est maximale chez les souris jeunes adultes et diminue avec l’âge.

156 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune passant soixante-douze heures puis quatre-vingt-seize heures seule en cage à métabolisme, sur un sol grillagé que le porteur décrit lui-même comme peu confortable. Sept fois, elles sont enfermées deux minutes dans un tube étroit pour une mesure de composition corporelle, la vessie vidée au préalable par massage abdominal. Un régime carencé en potassium leur est imposé et deux prélèvements sanguins sont pratiqués sous anesthésie, avant une chirurgie de quinze minutes sans réveil pour prélever les reins. Le porteur annonce comme bénéfice humain une prise en charge peut-être différente des hypokaliémies féminines, et comme bénéfice pour les animaux non-humains le fait de pouvoir désormais associer les femelles de ses élevages aux expériences.

Objectifs

Au-cours de l’évolution, nous avons considérablement changé nos habitudes alimentaires passant d’un régime riche en potassium et pauvre en sel à un régime (dit régime occidental) diamétralement opposé. Nous sommes actuellement très loin des recommandations de l’organisme mondial de la santé concernant les apports nutritionnels en sodium et potassium. Heureusement nos reins sont là pour nous aider à faire face à ces changements. Cependant, à long terme cette alimentation peut contribuer au développement de maladie comme l’hypertension et être corrélée à un risque accru de mortalité. Il est bien connu que le manque de potassium dans l’alimentation va induire une adaptation :1) le muscle peut relarguer du potassium contribuant rapidement à la modulation du potassium plasmatique et 2) le rein va diminuer sa sécrétion de potassium dans les urines et augmenter sa réabsorption vers le sang. Deux protéines essentielles à l’adaptation à un régime dépourvu de potassium ont été mise ne évidence : un transporteur rénal spécifique et un facteur de croissance,. L’ensemble de ces études ont été réalisé chez le mâle. Cependant une étude récente montre une différence d’adaptation à un régime carencé en potassium entre des souris mâles et femelles. Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium, et en comprendre les différences. L’ensemble des études seront réalisées chez des souris mâles et femelles sauvages ou n’exprimant pas le transporteur rénal spécifique ou le facteur de croissance .

Bénéfices attendus

La prévalence de l'hypertension artérielles est très élevées dans nos populations avec une différence notoire entre les hommes et les femmes (36 pourcents contre 25.2 pourcents - Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire, 2018). Notre étude est un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiologie et physiopathologie rénale. Du point de vue des animaux, les résultats permettront de mettre en œuvre un des aspects des 3R, à savoir la réduction puisque nous pourrons associer les femelles de nos élevages à nos expériences. Du point de vue bénéfice humain, les résultats nous permettront de peut-être envisager une prise en charge différente des hypokaliémies féminines. Nos recherches désigneront des protéines importantes, potentielles cibles thérapeutiques, qui pourraient être différentes chez les hommes et les femmes.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons 5 prélèvements urinaires en cages à métabolisme sur animal vigile au cours de 2 sessions en cage spécifique. La première session en cage métabolique implique un hébergement individuel de 72h à raison de 48h d’habituation et 24h pour le recueil. La seconde session dure 96h correspondants à 4 fois 24h pour 4 recueils. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation en continue dans ces cages. Nous effectuerons 7 mesures de la composition corporelle en fluides (masse grasse, masse maigre et eau libre) en utilisant un appareil de résonance magnétique nucléaire dédié à ces mesures . Cette technique est non invasive et n’induit aucune douleur chez l’animal. L’animal est placé délicatement dans un petit tube qui restreint ces mouvements, le tube est placé dans l’équipement de mesures durant 2 minutes, puis l’animal est sorti du tube et replacé dans sa cage. Nous réaliserons également 2 prélèvements sanguins de faible volume réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés : les 2 prélèvements seront espacés d’environ 11 jours, le geste dure 1min/animal. Enfin, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et analgésie au cours d’une chirurgie sans réveil (15 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l’animal. Le régime carencé en potassium est normalement bien toléré. La mise en cage à métabolisme peut entrainer un stress chez l’animal, par le fait qu’elle restreint légèrement la liberté de mouvement des souris et qu’elle impose un hébergement individuel des animaux . Leur structure rend l’ hébergement peu confortable sur une grille. La mesure de Kalièmie nécessite un prélèvement sanguin qui sera fait sous anesthésie et qui peut entrainer une hémorragie. Les risques liés à l’anesthésie sont à prendre en compte, comme par exemple, la survenue d’une l’hypothermie. Certaines souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle par mesure de résonance nucléaire magnétique. Cette procédure peut entraîner un léger stress au moment de la manipulation des souris pour vider leur vessie par massage abdominale et le temps de la mesure (2 minutes ).

Devenir

A la fin de chaque procédure , tous les animaux de la procédure seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie. L'euthanasie des animaux est requise en raison des prélèvements d'organes nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium. Cette adaptation met en jeu différents organes qui vont interagir les uns avec les autres via différents stimuli (messages hormonaux, humoraux…). L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes vivants entiers (ici des souris).

Réduction

Pour les procédures mise en œuvre, le nombre de souris par groupe sera de 12 animaux pour une procédure et 14 animaux pour l'autre. Il y aura 6 groupes par procédure soit un total de 156 animaux. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ce chiffre correspond au nombre de souris nécessaires afin de mettre en œuvre les analyses statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans la mesure du possible, un même animal sera utilisé pour la mesure de plusieurs paramètres comme décrit dans les différentes procédures.

Raffinement

Les procédures de raffinement mises en place sont les suivantes : 1) 5 souris maximum par cages en portoir ventilé, dans des conditions d’hébergement conforme à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée 2) Libre accès à l’eau et la nourriture sous forme de croquettes (en hébergement individuel, la nourriture sera en poudre et déposée dans la mangeoire adéquate), 3) Enrichissement par nids végétaux et/ou tunnels en carton ou plastique dans les cages et/ou buchettes en peuplier de taille moyenne, sans traitement chimique et autoclavable (les animaux peuvent les ronger, les déplacer…). Lors du passage en hébergement individuel, étape indispensable pour avoir accès aux métabolites urinaires et à la fonction rénale, les cages sont placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact visuel, auditif et olfactif. Nous placerons une petite coupelle en verre de 6 cm de diamètre et de 1cm de hauteur de bord dans la cage qui servira de nid à la souris. Nous avons, au préalable, vérifier que la majorité des souris s’installent dans cette coupelle pour dormir et que cela ne change pas les recueils d’urine ou de fèces. Pour la mesure dans l’appareil à résonnance magnétique nucléaire, les animaux seront habitués à être manipulés et à être placés dans le tube de mesure. Les mesures de kaliémie seront réalisées sous anesthésie totale . L’expérimentateur qui fera ces prélèvements a plus de 10 ans d’expérience. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil, avec analgésie. L’ensemble des expériences sera mené par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie.

Choix des espèces

L’intérêt d’utiliser des souris est que nous possédons des résultats préliminaires chez cette espèce. De plus les modèles transgéniques que nous voulons étudier existent chez la souris et nous les élevons à l’animalerie. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles « normales » (dites sauvages) et transgéniques âgées de 8 à 16 semaines. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse (développement du rein) soit totalement terminée.

Réutilisés d'un projet à l'autre tant que le vétérinaire juge leur état général suffisant, 225 porcs et 135 chiens vont être utilisés pour évaluer la tolérance de candidats médicaments, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à quarante administrations en dix semaines, subir dix prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, être mis à jeun vingt-quatre heures, passer deux fois par semaine en cage à métabolisme et subir une biopsie d'organe sous deux heures d'anesthésie générale. Le porteur indique que les effets indésirables des produits testés ne sont pas prévisibles au début du projet. Sur les 135 chiens, 100 sont annoncés comme réutilisés et 20 comme adoptables, les autres étant tués pour des prélèvements terminaux, tout comme 25 des 225 porcs.

Objectifs

L’étude de la sécurité de nouveaux médicaments est une étape importante lors de leur développement. Ces études permettent d’identifier, d’atténuer les risques associés à l’activité du médicament. Lors d’une modification de la formulation, de la voie d’administration ou d’un ajustement de la dose thérapeutique, il peut être nécessaire d’étudier les effets des candidats médicaments. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité locale et/ou systémique de futurs candidats médicaments après leur administration chez le porc et le chien. Pour ce faire, les animaux seront régulièrement observés après l’administration du composé suivant une grille de surveillance définie et des prélèvements de sang et/ ou de tissus pourront être effectués au cours et/ou à la fin des études.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments ou des nouvelles formulations de médicaments déjà mis sur le marché, présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, les composés testés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire.

Procédures

Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (environ 3min/administration avec un maximum de 40 administrations sur 10 semaines). Pour l'administration intraveineuse, une sédation ou anesthésie sera réalisée pour la pose de l'accès veineux (durée de 30min à 1h). Après administration, des observations des animaux seront réalisées suivant des grilles prédéfinies. Des prélèvements de sang (durée 2min, maximum 10 prélèvements sur 24h) et d'urine (maximum 24h en cage à métabolisme, 2 fois par semaine) pourront également être réalisés. Enfin, une biopsie d'organes pourra être faite soit sous anesthésie générale (environ 2h avec maximum 1 prélèvement sur 24h) soit sous anesthésie locale dans le cas d'une biopsie de peau (environ 15 min avec un maximum de 5 prélèvements sur 24h). Les animaux pourront être mis à jeun au maximum 24h préalablement à l'anesthésie ou administration du candidat médicament.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet pourront subir un stress de courte durée équivalente à la piqure d'une aguille lors des administrations, prélèvements de sang et induction de l'anesthésie. Ils pourront également subir un stress lié à la mise à jeun avant administration ou anesthésie et à l'hébergement individuel en cage à métabolisme pour le recueil d'urine. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet et feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Les animaux seront généralement réutilisés pour d'autres projets si l'état général des animaux (attesté par le vétérinaire) le permet. Si leur état de santé le permet, les chiens ne pouvant plus être réutilisés pourront être mis à l'adoption. Enfin certains animaux seront euthanasiés en fin de projet pour réalisation de prélèvements terminaux.

Remplacement

Avant toute administration chez l’homme d’un nouveau candidat médicament, l’animal constitue un passage obligatoire qui permet d’évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique de ce nouveau médicament. Il n’existe pour l’instant pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pouvant se substituer en totalité à l’administration chez l’animal. Dans ce projet, les chiens et les porcs sont parmi les espèces non rongeur les plus adaptées à l’évaluation de la tolérabilité d’un composé.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe (3 à 6 par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, sera envisagée et permettra également de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Le recours aux procédures d’anesthésie/analgésie adaptées dès que nécessaire • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages , • La sortie régulière des animaux mis en cage à diurèse.

Choix des espèces

Les espèces (chien et porc) qui seront utilisés dans ce projet, sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’études de tolérabilité et de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir (absorption, distribution, métabolisation, élimination), d’un produit testé, dans le sang et/ou les urines (lorsque ces espèces sont utilisées au cours du développement préclinique de ce produit). Ces espèces présentent des similarités physiologiques et cliniques avec l'homme et peuvent développer des pathologies analogues aux pathologies humaines. Animaux sevrés en croissance et animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Opérées une ou deux fois sous anesthésie, pendant une à six heures, pour l'implantation d'électrodes cérébrales et d'une canule dans la cavité nasale, 900 souris sont ensuite enregistrées jusqu'à deux heures par jour, la tête fixée face à un masque à oxygène pendant une heure trente. Le taux d'oxygène de l'air qu'elles respirent est abaissé par séquences de moins d'une minute toutes les quatre minutes, et des stimulations optogénétiques leur sont appliquées jusqu'à une fois par minute, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les enregistrements se poursuivent quatre mois, jusqu'à dégradation du signal, sur des souris parfois hébergées seules pour protéger leurs implants et, pour une partie du dispositif, sur des souris modèles de la maladie d'Alzheimer qui présentent des crises d'épilepsie et une mortalité accrue à partir de quatre mois et demi. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau, y compris celles dont la canule nasale s'est bouchée.

Objectifs

La respiration est intimement liée à la physiologie du cerveau. D’une part, l’activité respiratoire est modulée par les stimuli sensoriels, par l’attention, l’état émotionnel et elle peut être affectée dans certaines pathologies du cerveau. D’autre part, la respiration impacte le fonctionnement cérébral, influençant la perception, les émotions et la cognition en général. Un grand nombre de neurones sensoriels situés dans la cavité nasale sont des mécanorécepteurs sensibles au flux d’air et transmettent le signal de respiration aux structures en aval, dont le bulbe olfactif et de nombreuses régions cérébrales. Ce signal est supposé jouer un rôle important dans la coordination des réseaux neuronaux et pourrait participer aux processus cognitifs dans les phases d’eveil mais aussi pendant le sommeil au cours duquel, entre autres, nous consolidons nos souvenirs. L’objectif général de ce projet est de comprendre la nature du dialogue entre respiration et activité neuronale et en particulier : 1- De comprendre comment la respiration, de par son activité rythmique, influence l’activité neuronale dans le système olfactif et les régions associées 2- De comprendre comment la respiration – de par son rôle dans l’oxygénation du cerveau - influence l’activité neuronale 3- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est identique dans plusieurs lignées de souris sauvages 4- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est déficient dans un modèle de maladie neurodégénérative 5- D’identifier des mécanismes de contrôle de la respiration par l’activité des neurones. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé humaine étant donné que la prévalence des apnées du sommeil dans la population et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies (y compris la maladie d’Alzheimer).

Bénéfices attendus

Notre activité cérébrale est intimement liée à la façon dont nous respirons. La respiration module le fonctionnement cérébral (émotions, attention etc) et notre état cognitif régit en retour notre comportement respiratoire. Cependant les mécanismes impliqués dans ce dialogue sont peu connus. Cette étude apportera des éléments essentiels à la compréhension de cette question. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé étant donné que de nombreuses personnes souffrent d’apnées du sommeil et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies humaines (dont la maladie d’Alzheimer).

Procédures

Les souris seront étudiées lors de l’expression de comportements naturels et spontanés, lorsqu’elles dorment, mais aussi lors de courtes sessions où leur tête devra rester fixée face à un masque à oxygène. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau et son lieu avec la respiration, les souris seront équipés d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). Les enregistrements seront réalisés au maximum une fois par jour pour une durée de 2 heures environ (1h30 pour les expériences tête fixée). Au cours de certains enregistrements, nous ferons légèrement varier le taux d’oxygène présent dans l’atmosphère de la souris (variations

Impact sur les animaux

Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. La respiration sera enregistrée via une canule placée au niveau de la cavité nasale. Ceci nécessite la réalisation de chirurgies sous anesthésie et analgésie avec un impact très limité sur l’animal. Le port des implants suite à ces chirurgies peut générer une légère gêne pour l’animal. De plus, afin de contrôler le taux d’oxygénation des souris, nous devrons les placer dans une enceinte fermée dans laquelle l’atmosphère peut être contrôlée de manière précise. Dans une autre série d’expérience, il nous faudra maintenir la tête des souris au niveau d’un masque à oxygène, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La restriction des mouvements de l’animal pendant ces deux procédures ainsi que les variations de taux d’oxygénation peuvent être légèrement désagréables pour l’animal, tout du moins avant qu’il n’y soit y habitué. Enfin, nous prévoyons d’utiliser des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui parfois présentent des crises d’épilepsie et une mortalité accrue à partir de 4.5 mois.

Devenir

L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Ceci concerne les souris dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements naturels, interagissent avec leurs congénères, explorent, courent ou dorment : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est 900 souris adultes sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris pendant plusieurs sessions d’enregistrement, ceci donnant accès à un jeu de données riche. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique. Pour les expériences visant à tester l’impact de l’oxygénation sur le cerveau, avec différents taux d’oxygénation, une souris sera son propre contrôle car elle sera testée à différent taux d’oxygénation : ce qui augmentera notre puissance statistique et donc le nombre de souris nécessaires. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment à la fixation de tête). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésiques et analgésiques permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Lors des sessions d’enregistrement, les souris seront étudiées alors qu’elles expriment des comportements spontanés et naturels : elles seront exposées à des stimuli sensoriels différents de leur cage d’hébergement ce qui constituera, en soi, une forme régulière d’enrichissement.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction complexe entre cerveau-et respiration, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’influence de la respiration sur les fonctions cognitives a été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme ce qui appuie la pertinence de ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-12 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. L’utilisation de souris >6mois sera notamment réservée aux souris APP-PS1 qui développent un phénotype pathologique uniquement à partir de 3 mois chez les femelles et 6 mois chez les mâles.