Procédures modérées

Aucun analgésique ne sera administré, le porteur estimant qu'ils interféreraient tous avec le modèle, et les souris qui atteignent les points limites sont tuées par surdosage d'anesthésiques. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs intestins. Elles reçoivent pendant sept jours du dextran sulfate de sodium dans leur eau de boisson, ce qui déclenche une inflammation intestinale, une douleur viscérale et une perte de poids, puis passent une minute trente dans un tube de mesure de composition corporelle la veille de leur mise à mort. L'enjeu déclaré est de vérifier si des antagonistes du récepteur minéralocorticoïde, déjà commercialisés pour d'autres indications, pourraient être repositionnés contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Objectifs

5.5.1 décrire les objectifs du projet (repris automatiquement du champs 3.3.2.1) Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin affectent près de 300 000 personnes en France. Il existe des thérapies, mais de nombreux patients ne répondent pas à ces thérapies ou y deviennent résistants. Le projet a pour objectif d’évaluer l’inhibition du récepteur minéralocorticoïde sur la réponse inflammatoire dans un modèle de colite aiguë induite par un agent chimique. L’inhibition du récepteur minéralocorticoïde exerce des effets anti-inflammatoires dans des contextes extra-intestinaux. Ces effets anti-inflammatoires sont médiés par une de ces cibles : la neutrophil gelatinase-associated lipocalin, et impliquent les cellules myéloïdes.

Bénéfices attendus

Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, de nombreux patients ne répondent pas ou plus aux traitements proposés. De plus, les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde ne sont pas contre-indiqués chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. En cas de validation de notre hypothèse de travail, nous pourrions repositionner les antagonistes du récepteur minéralocorticoïde déjà disponibles sur le marché dans un nouveau champ thérapeutique. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication du récepteur minéralocorticoïde dans le développement de l’inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront soumis à du dextran sulfate sodium (1%) dans leur eau de boisson durant 7 jours afin d'induire une inflammation intestinale relative aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. La composition corporelle des animaux sera mesurée le jour précédant la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans un tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur, la souris reste 1min30 dans l'appareil.

Impact sur les animaux

Le modèle de colite aiguë induite par le dextran sulfate sodium peut entrainer une douleur viscérale chez la Souris, ainsi qu’une perte de poids. La composition corporelle des animaux sera mesurée, le jour précédent la mise à mort des animaux. Cette mesure peut occasionner un inconfort chez les animaux lors de l’introduction de la souris vigile dans le tube de mesure, mais n’entraine pas de douleur.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs intestins pour analyser différents paramètres et marqueurs biologiques.

Remplacement

Avant d’être testés in vivo, nous utilisons des modèles in vitro d’inflammation intestinale comme des lignées de cellules épithéliales intestinales ou de macrophages en réponse à des molécules pro-inflammatoires. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales.

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience (données nutritionnelles, composition corporelle, poids des animaux, inflammation et fonction de barrière intestinale). Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : la dose de Dextran Sodium Sulfate utilisée est évaluée à chaque lot de dextran sulfate sodium comme recommandé dans le protocole initial et nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible de dextran sulfate sodium (1%) pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux. L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifiques, caractérisés par une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. Nous avons fait le choix de tester l’inhibition génétique du récepteur minéralocorticoïde uniquement sur les animaux colitiques et par conséquent de limiter les groupes contrôles au strict minimum. Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de côlon seront préservés dans le laboratoire et indiqués dans une base de données communes à notre Unité et pourront ainsi être réutilisées au cours d’un autre protocole.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages standards (4 souris/cage), avec enrichissement. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des points limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite par le dextran sulfate sodium, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison en de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe un panel d’analgésiques utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures. En cas d'atteinte des points limites, les souris seront mises à mort par surdosage d'anesthésiants .

Choix des espèces

La Souris est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme. La Souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale et les modèles génétiques d’invalidation du récepteur minéralocorticoïde ne sont disponibles que chez la Souris. Cette souche n’est pas résistante à l’induction par le dextran sulfate sodium et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.

Provoquer des vomissements chez des chiens pour vérifier qu'un médicament les arrête : 28 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun tué à l'issue, tous rendus disponibles pour une autre expérience après une période de repos. Chaque animal peut recevoir de l'apomorphine une fois par semaine sur cinq séances consécutives, avec des nausées et des vomissements durant en moyenne trente minutes et jusqu'à deux heures et demie. Le porteur y ajoute une somnolence, une perte d'appétit, une salivation accrue, une déshydratation et des troubles transitoires du rythme cardiaque, et prévoit une mise à jeun de quatre heures avant chaque induction pour limiter le volume vomi. Le produit testé appartient à un donneur d'ordre qui en a déjà mené les essais de toxicité, ce qui situe le projet dans le développement commercial d'un médicament vétérinaire.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : de développer et valider un modèle de nausées/vomissements induit par l’apomorphine chez le chien provoquant des signes cliniques mesurables, répétables, homogènes entre les animaux et pouvant être inhibés par l’utilisation d’antiémétiques; et d’évaluer l’efficacité d’un antiémétique vétérinaire en cours de développement sur ce modèle induit.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle de nausées/vomissements chez le chien contribuera au développement de nouveaux médicaments vétérinaires antiémétiques. Ce modèle pourra également être utilisé pour le développement de médicaments à visée humaine car le chien a une sensibilité aux vomissements proche de celle de l’homme. Le développement de ces nouveaux médicaments permettra de prévenir les nausées et vomissements et de pallier aux effets secondaires de certains médicaments. Le vomissement est en effet l’effet secondaire le plus fréquent des différents médicaments en pratique vétérinaire ou en chimiothérapie. Ce signe clinique peut limiter l’efficacité des doses administrées et cause une gêne considérable qui diminue le confort et la qualité de vie des patients. De plus, une première étude pilote sur un nouveau médicament avec un faible nombre de chiens permettra de valider la poursuite de son développement ou non avant de passer aux études réglementaires de sa mise sur le marché. Le développement de nouveaux produits permettra également la mise sur le marché de médicaments pouvant être moins douloureux à l’administration ou encore permettant de palier à de potentielles ruptures de stock de médicaments déjà sur le marché.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : 1) Administration d’apomorphine en sous-cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur un maximum de 5 séances consécutives, puis un repos de minimum 4 semaines sera appliqué avant de nouvelles administrations si besoin. 2) Administration de maropitant en sous-cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur 2 séances. 3) Administration d’un anti-émétique en cours de développement en sous cutanée sur animaux vigiles (quelques secondes) : au maximum une fois par semaine sur 2 séances

Impact sur les animaux

L‘objectif de ce projet est d’induire des nausées/vomissements chez le chien. De nombreuses publications sur ce sujet montrent que la durée moyenne de ces symptômes est d’environ 30 minutes après l’administration d’Apomorphine avec une durée maximum de 2,5h. L’apomorphine est un émétique commercialisé (EMEDOG) dont les effets secondaires fréquents sont une somnolence, diminution ou perte de l’appétit, augmentation de la salivation, déshydratation légère, troubles du rythme cardiaque transitoire et une douleur légère à modérée au point d’injection. . Le Maropitant est également une substance active présente dans un produit vétérinaire commercialisé (ex. CERENIA). L’effet indésirable fréquent est une douleur au point d’injection. Il n’est pas attendu d’effets majeurs indésirables avec le nouveau produit en développement car les premiers tests de toxicité auront déjà été réalisés par le donneur d’ordre. En revanche, quelques effets secondaires liés à ce produit peuvent éventuellement ne pas avoir encore pu être anticipés.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens pour mettre en place ce modèle de vomissement est justifié car il n’existe pas de méthode alternative pour vérifier l’efficacité d’un traitement antiémétique. L’utilisation d’un modèle in vivo permettra d’utiliser un nombre restreint d’animaux tout en testant des candidats médicaments dans un environnement contrôlé et standardisé.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour cette étude. Des recherches bibliographiques ont permis d’établir le protocole pour mettre en place un modèle de vomissement avec un nombre restreint d’animaux et de périodes dans chaque phase du projet. La molécule choisie (Apomorphine), la dose à administrer, la voie d’administration, les effets attendus seront ainsi déjà estimés. Le nombre d’animaux utilisés correspondra au minimum pour obtenir des résultats interprétables. Le nombre d’animaux sera réduit avec leur réutilisation sur plusieurs phases si possible et une dernière phase en cross-over. L’étude pilote de preuve de concept sur le médicament en développement permettra de valider la poursuite de son développement avec un nombre restreint d’animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, tunnel/plateforme). Avant l’inclusion dans une nouvelle phase, l’état de bonne santé des chiens sera confirmé par un examen clinique et un bilan hémato-biochimique. Pour limiter les quantités de vomissement en volume, les animaux auront été mis à jeun environ 4 heures avant l’administration d’apomorphine. Le bénéfice de cette période de mise à jeun sera évaluée grâce aux observations cliniques lors de la phase 1 et 2. S’il est relevé que la mise à jeun a un impact négatif sur la réponse à l’apomorphine, la période de mise à jeun sera diminuée, ou bien les animaux seront induits en condition nourris. Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués maximum quatre heures après l’administration du traitement pour le suivi des observations. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Les animaux seront observés pendant deux heures après l’induction du vomissement afin de caractériser les signes apparus. Puis toutes les 30 minutes jusqu’à au moins 4 heures post-traitement et jusqu’à disparition des signes (durée maximale des signes est de 2.5h selon le résumé des caractéristiques du produit). Lors de la phase 3 et 4, l’administration du Maropitant (Cerenia) sera faite à température réfrigérée pour diminuer la douleur au site d’injection comme indiqué dans la notice du produit. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal les points limites suivants ont été définis : vomissements très intenses à répétition (plus de 10 en 30 minutes ou qui durent plus de trois heures), prostration de l’animal, difficultés respiratoires. Dès l'apparition de ces symptômes, l'animal sera pris en charge par le vétérinaire désigné et un traitement adapté sera prescrit pour le soulager.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible pour la mise en place du modèle de nausées/vomissements qui sera utilisé pour le développement d’un traitement antiémétique. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Ce modèle pourra également être utilisé pour le développement de médicaments à visée humaine car le chien a une sensibilité aux vomissements proche de celle de l’homme Chiens adultes correspondant à l’âge cible des traitements administrés.

Toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus, 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 240 d'entre elles reçoivent de trois jours à quatre semaines un régime enrichi en graisses destiné à les faire grossir, 160 subissent deux prélèvements sanguins à la mâchoire, d'autres passent vingt-quatre heures à jeun avant un test de réalimentation. La mesure des paramètres métaboliques impose d'isoler des souris pendant quatre semaines, un enfermement que le porteur range parmi les sources d'inconfort. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà obtenu la preuve de concept in vitro et écrit avoir "maintenant besoin de la souris", la régulation de l'énergie mobilisant selon lui plusieurs organes à la fois.

Objectifs

L'homéostasie énergétique se définit comme l'équilibre entre les entrées et les dépenses énergétiques. Les dépenses résultent principalement du métabolisme basal et de l’activité physique, tandis que les apports trouvent leur origine dans l’alimentation. Quand cet équilibre est rompu, le terrain est favorable à l’installation de maladies métaboliques telles que l’anorexie ou l’obésité. Récemment, nous avons mis en évidence le rôle neuronal d'une protéine dans la régulation de la balance énergétique. Nous avons récemment observé, chez la souris, qu'en invalidant cette protéine dans les cellules microgliales (cellules immunitaires du cerveau impliquées dans la neuroinflammation) les animaux soumis à un régime riche en graisse présentent une prise alimentaire et une prise de poids réduites. Or, ce régime alimentaire est bien connu pour induire une inflammation de bas grade qui contribue à l'obésité, établissant ainsi un lien entre notre protéine d'intérêt dans les cellules microgliales et l'obésité induite par un régime gras. Cependant ces observations ont été réalisées aprés plusieurs semaines de régime gras. Dans ce projet, nous voulons déterminer les mécanismes moléculaires précoces de la neuroinflammation induite par un régime gras conduisant à l'obésité.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les mécanismes responsables de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Cette étude servira à identifier les mécanismes moléculaires qui font le lien entre la suralimentation et la mise en place de l'obésité et, par conséquent, le développement du DT2. L'identification de ces mécanismes permettra de savoir si notre protéine d'intérêt constitue une cible thérapeutique pour prévenir le développement de l'obésité. En effet, les médicaments réduisant l'obésité sont particulièrement intéressants pour l'industrie pharmaceutique, notamment en combinaison avec des médicaments qui agissent pour restaurer la fonction des cellules sécretrices d'insuline. Ainsi, notre approche jettera les bases de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients atteints de DT2.

Procédures

Des prélèvement sanguins seront réalisés sur 160 animaux vigiles. Ces animaux subiront un prélèvement temporo-mandibulaire (1min) à l'age de 9 semaines et un autre à l'âge de 15 semaines avant euthanasie. Au cours du test de tolérance au glucose, des gouttes de sang seront prélevées (6x10 secondes). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras pendant 3 jours, 1 semaine ou 4 semaines, qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène sera mise en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages. La tolérance au glucose nécessite l'injection d'un bolus de glucose qui peut entrainer un inconfort chez la souris. La détermination des paramètres métaboliques par calorimétrie indirecte nécessitent d'isoler les souris pendant 4 semaines.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour des études histologiques ou moléculaires

Remplacement

Toutes nos données in vitro convergent vers une fonction de notre gène d'intétêt dans la neuroinflammation induite par l'obésité. Nous avons apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 768 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. L'invalidation du gène n'est pas fiable à 100%, pour cette raison, le nombre d'animaux a été déterminé en prennant en compte cette difficulté. Afin d’analyser les paramètres évalués (poids des souris, nourriture consommée) nous déterminerons les tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant L'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Un tube sera disposé dans la cage pour déplacer les animaux en limitant le stress dû à la préhension. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelles le gène pour notre protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront injectés avec du tamoxifène à l'age de 5 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 9 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

Pour tester une molécule pro-coagulante destinée à limiter les hémorragies cérébrales humaines, 36 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une chirurgie d'une heure sous anesthésie générale leur provoque une hémorragie dans le cerveau, suivie d'IRM et de scanners à quatre, six et vingt-quatre heures, chaque examen exigeant une nouvelle anesthésie. Le porteur indique que les animaux se retrouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs. Il envisage de ne pas les réveiller après l'examen de six heures et conclut que, dans ce cas, "il n'y aurait pas de nuisance associée au réveil".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une atteinte neurologique soudaine, secondaire à une lésion vasculaire. On peut distinguer 2 types d’AVC : l’AVC ischémique ou infarctus cérébral (85% des cas), et l’AVC hémorragique (15% des cas). Les hémorragies cérébrales (HC) représentent 10 à 30 % des AVC, soit environ 25 000 nouveaux cas par an. Les HC sont à l’origine d’une très lourde morbi-mortalité, avec une mortalité précoce de plus de 40% à 30 jours dont la moitié des décès surviennent dans les 48 premières heures. Seuls 20% des patients seront autonomes à 6 mois. Le mauvais pronostic des hémorragies cérébrales est directement lié à la croissance de l’hématome ainsi qu’aux complications survenant à la phase aiguë (hypertension intracrânienne, hydrocéphalie aiguë et crises convulsives). L’objectif thérapeutique principal est de contrôler la croissance de l’hématome et ses complications neurologiques. Une grande proportion de patients atteint d’HC sont bien souvent sous traitement anticoagulant ce qui à pour conséquence d’augmenter considérablement la probabilité et la gravité de l'HC. L'une des principales raisons de ces mauvais résultats est que les patients sont tout simplement traités trop tard avec des agents d'inversion. Les thérapies actuelles nécessitent une prise d’information multifactorielle (identification de l'anticoagulant, calcul de la dose, poids du patient…), processus chronophage qui réduit les chances du patient. Ainsi, le projet propose d’évaluer une nouvelle molécule de première ligne ayant un mode d’action universel ne nécessitant pas d’identifier l’anticoagulant et dont la mise en œuvre est simple et rapide ce qui permettrait une prise en charge plus rapide du patient. Il est donc prévu d’utiliser cette molécule dans un modèle d’AVC hémorragique chez le porc en vue de passer ce nouveau traitement au plus vite en phase clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but de participer au développent d’une nouvelle molécule à visée clinique dans la prise en charge de l’hémorragie intracérébrale. Les travaux réalisés devraient permettre à l’industriel de valider le composé dans un modèle animal dont l'anatomie cérébro-vasculaire est proche de l’homme et ainsi augmenter le taux de succès des futures études cliniques.

Procédures

Les animaux auront une intervention chirurgicale induisant une hémorragie cérérale sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure . Puis l'évolution de cette hémorragie sera suivi à l'aide d'outils d'imagerie médicale IRM (durée de 30 minurtes) et scanner (durée 15 minutes) à différents temps (+4h, +6h et +24h). Pour chaque examen d'imagerie l'animal est maintenu sous anesthésie générale . Ainsi il est prévu de réapliser les imagerie à +4h et +6h dans la continuité de la chirurige. L'animal ne sera donc pas révillé avant la fin des examens à +6h. Une seconde anesthésie sera alors nécessaire à +24h pour effectuer les examens d'imagerie sur une durée de 1 heure.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’induction de l’hémorragie intracérébrale ainsi que le suivi en imagerie post-AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques moteurs et cognitifs vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur les 24h post AVC. Il est également probable que le choix du temps d’évaluation soit inférieur à 24h, soit à +6h post AVC. Dans ces conditions, les animaux ne seraient pas réveillés de l’anesthésie générale et seraient mis à mort suite à l’examen d’imagerie médicale. Ainsi, il n’y aurait pas de nuisance associée au réveil.

Devenir

L'induction d'une hélorragie cérébrale provoquant des troubles neurologiques, il n'est pas prévu de maintenir en vie des animaux dont la qualité de vie soit trop impactée. Ainsi, il est prévu une mise à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les études de développement de stratégies thérapeutiques nécessitent leur validation sur un modèle animal proche de l’homme avant un potentiel essai clinique. Cette étude se positionne dans la validation in vivo d’un nouveau traitement thérapeutique faisant suite à de nombreuses études in vitro. Il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce contexte

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin de pouvoir conclure à un effet de la molécule testée et ce à l'aide d'une analyse de puissance statistique. Il est prévu d’utiliser des approches d’imagerie non invasives afin de faire un suivi de l’évolution de la pathologie à différentes phases post-opératoires et ainsi cibler la meilleure approche stratégique. Le nombre d’animaux nécessaire est néanmoins réduit et l’étude prévoit maximum 36 animaux, 6 pour la phase pilote et 30 pour l’étude principale. En fonction des résultats de la phase pilote, il sera également possible d’inclure les 6 animaux dans l’étude principale permettant de réduire d’autant les animaux de l’étude principale.

Raffinement

Au cours de cette étude, toutes les dispositions seront prises afin de réduire au maximum la souffrance et le stress et l’angoisse des animaux en accord avec les points limites identifiés pour ce projet. L’étude est menée par du personnel formé et expérimenté, sensible au bien-être et soins spécifiques des animaux. Une acclimatation à l’arrivée après transport du fournisseur est prévue (minimum 7 jours). Les animaux seront hébergés 2 par 2 pour favoriser les interactions sociales dans des boxes contrôlés en hygrométrie et température. Enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…) avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique. Les paramètres physiologiques (température, hydratation) seront contrôlés.

Choix des espèces

Les modèles d’hémorragies cérébrales ont été développés chez les rongeurs mais l’anatomie et la physiologie vasculaire du porc est plus proche de celle de l’Homme. En effet, les résultats d’une étude chez le porc apportent des informations plus probantes pour une utilisation ultérieure en clinique chez l’Homme, notamment pour les pathologies cérébrovasculaires. Pour ces raisons, nous avons choisi le porc comme modèle d’étude. De plus, le laboratoire a de l’expérience dans les manipulations chez le porc, les séquences d’imagerie sont connues et les installations sont ad hoc pour le bon déroulé des expériences. Les animaux seront utilisés à un stade jeune (autour de 4 mois, 35 à 40 kg). A ce stade, le cerveau a terminé son développement. Ce poids permet de concilier ses animaux à la manipulation et aux études d’imagerie.

Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".

Objectifs

Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.

Bénéfices attendus

De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.

Procédures

- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes

Impact sur les animaux

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.

Réduction

Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.

Raffinement

Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.

Fournir à un établissement privé des brebis dont les ovaires ont été retirés, pour tester un dispositif intravaginal libérant un progestatif : 30 brebis sont ovariectomisées sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit ensuite cinq prises de sang, cinq collectes d'excréments et dix à douze trajets routiers de deux heures répartis sur deux ans, le porteur prévoyant de les réutiliser d'une étude à l'autre pour réduire l'effectif. Il écrit que les 30 brebis seront gardées en vie et que 10 seront replacées, quand le champ structuré du résumé ne déclare que ces 10 retours. Une brebis qui ne se nourrit plus pendant quatre jours ou qui perd du poids malgré le traitement est mise à mort, et le porteur note qu'une infection postopératoire peut entraîner abattement, fièvre et anorexie.

Objectifs

Le projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, s’inscrit dans le plan de développement préclinique d’un produit pharmaceutique/zootechnique dans la sphère de la reproduction ovine. Ce produit est un dispositif intravaginal à libération longue d’un progestatif. L’objectif est de mettre à disposition des brebis ovariectomisées, pour des études de pharmacocinétiques visant à : 1) caractériser et sélectionner le meilleur prototype de dispositif intravaginal (le produit) en comparaison à un produit de référence (environ 3 à 4 études in-vivo préliminaires), 2) confirmer le profil et les propriétés pharmacocinétiques du dispositif sélectionné et/ou démontrer la bioéquivalence en comparaison avec un produit de référence (1 étude). La phase expérimentale de ces différentes études pharmacocinétiques (4 à 5 études sur 2 ans minimum) sera conduite dans un établissement tiers, situé à moins de 2 h du lieu d’hébergement des brebis. L’établissement dispose d’un comité d’éthique interne qui évaluera chaque étude utilisant les brebis ovariectomisées.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer un produit contenant un progestatif visant à synchroniser l’œstrus des brebis en saison sexuelle ou en contre saison. Actuellement il n’existe pas d’alternative dans la filière ovine à ce type de produit. L’utilisation de brebis ovariectomisées dans le cadre du développement préclinique d’un produit pharmaceutique/zootechnique dans la sphère de la reproduction ovine permet : - de s’affranchir des taux d’hormones endogènes liées au cycle de reproduction qui est saisonné. En effet pour suivre le profil pharmacocinétique des progestatifs utilisés dans les prototypes, il faut pouvoir les doser et donc ne pas être biaisé par les taux endogènes. – de pouvoir réutiliser les mêmes brebis sur l’ensemble des études pharmacocinétiques prévues car les études pourront être réalisées à n’importe quel moment de l’année, indépendamment de la saisonnalité des cycles de reproduction. - d’utiliser des designs d’étude en cross-over, en augmentant ainsi la puissance statistique et permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux à inclure par étude. – de pouvoir comparer les différentes études entre elles car les animaux seront réutilisés pour chacune d’elles (environs 4 à 5 études de pharmacocinétique en prévision).

Procédures

Toutes les brebis subiront dans l'E2 : une ovariectomie sous anesthésie générale (20 minutes); dans l'E1 : 5 prises de sang et 5 collectes de fécès (1 minute pour 1 prise de sang + 1 collecte de fécès), réparties sur 2 ans; et entre 10 et 12 trajets d’environ 2 heures à chaque fois, répartis sur 2 ans.

Impact sur les animaux

Au sein de l’E1, les nuisances attendues relèvent de pratiques d’élevage. Pour gérer de manière optimum le parasitisme, des coprologies de contrôles seront réalisées sur les animaux, pouvant occasionner une gêne transitoire lors du prélèvement de féces. Par ailleurs, dans le cadre des contrôles sanitaires pour les mouvements d’animaux entre l'E1 et l'établissement tiers, nous prévoyons des prises de sang, une après chaque test pharmacocinétique afin de garantir le statut sanitaire du cheptel en retour sur le site d’élevage. Les brebis peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang. Une nuisance éventuelle serait l'apparition d'hématome suite aux prises de sang effectuées. Au sein de l’établissement E2, les nuisances attendues sont liées à la chirurgie ovariectomie. Le statut ovariectomisé n'entraine pas d'effet indésirable au cours de la vie de l'animal. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais c'est rare. Les animaux peuvent subir du stress lors des phases de transport entre les différents établissements.

Devenir

Les 30 animaux seront gardés en vie et retourneront dans l'E1 à l'issue du projet. 10 animaux seront replacés.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour déterminer les profils pharmacocinétiques in-vivo de différents actifs et/ou dispositifs sur l’espèce cible. L’utilisation de brebis ovariectomisées permet de s’affranchir des taux hormonaux endogènes et d’éviter les interférences avec le progestatif du dispositif. Le design en cross-over est accessible et permet de réduire le nombre d’animaux par étude car les animaux sont leur propre témoin et la puissance statistique est plus importante, permettant une meilleure comparabilité des différents prototypes, et des études entre elles. De plus, les brebis ovariectomisées vont être réutilisées à chaque étape du développement préclinique sur une période d’environs 2 ans minimum.

Réduction

Il a été évalué que 30 brebis ovariectomisées seraient nécessaires pour le développement de ce projet. En effet, dans chacune des premières études pilotes, qui vont permettre de choisir un prototype parmi 2 testés, 2 groupes de 12 brebis seront nécessaires (chaque groupe permet de comparer un prototype au produit de référence), soit un total de 24 brebis. Le développement de ce produit est basé sur le principe de bioéquivalence. Selon les bonnes pratiques il faut au moins 12 animaux évaluables par traitement pour que l’étude soit acceptable. Pour une étude pilote, ce nombre d’animaux pourrait être réduit à 10. Cependant, lorsque le risque de perte de sujets existe, on peut inclure des animaux supplémentaires pour maintenir une puissance statistique correcte. Ici, on ne peut négliger ce risque de perte d’animaux évaluables par traitement (perte du dispositif avant la fin de la période de pose). Une marge de 20% d’animaux supplémentaires est communément admise (10+2 soit 12 par groupe). Enfin, à cause de la forte variabilité interindividuelle des profils pharmacocinétiques de progestatifs, 12 animaux par groupe permettraient d’assurer une puissance statistique suffisante pour conclure dans les études pilotes. 3 animaux additionnels sont également prévus dans une étude PK pour couvrir toute problématique (échec d’administration, maladie…). Enfin, les brebis ovariectomisées seront réutilisées pour l’ensemble des études, donc en anticipant la perte possible d’animaux sur les 2 ans de développement, un nombre de 30 brebis ovariectomisées est nécessaire.

Raffinement

Au sein de l’E1, afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité, soit sur aire paillée avec enrichissement soit au pâturage. Les animaux seront supervisés par du personnel formé et habilité. Lors des déplacements entre les établissements, les animaux seront transportés selon les normes de bien-être en vigueur (densité, paillage…) dans un véhicule agrée conduit par du personnel habilité titulaire d’un captav. La durée de transport entre les sites est de 2 heures. Lors de leur arrivée dans l’E2, afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. La douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3-4 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivie du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours ou avec perte de poids par rapport au poids initial malgré le traitement sera mis à mort. Les animaux seront surveillés quodtidiennement sur les 6 paramètres suivants : 1/ s’alimente : oui-non 2/ Boit : oui-non 3/ se lève : oui-non 4/ reste figé : oui-non 5/ température en degré 6/ estimation de la douleur de 0 à 3 (0 aucune douleur et 3 douleur intense).

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse hormonale des ruminants sont particulières à ces espèces. Le projet porte sur un dispositif de contrôle de la reproduction des femelles. Les animaux utilisés sont donc des brebis multipares (ayant mis bas au minimum une fois) et ayant terminé leur croissance et leur développement.

Injectées de cellules leucémiques puis maintenues en boîte de contention pour recevoir jusqu'à trois injections de lymphocytes modifiés, 120 souris immunodéficientes subissent aussi trois prises de sang dans la joue et une ponction de moelle osseuse dans le fémur. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Les souris témoins, laissées sans traitement, développent la leucémie jusqu'à la restriction des mouvements des pattes arrière, la perte d'appétit et la perte de poids. Le porteur écrit avoir déjà démontré en culture que ces cellules tuent les cellules tumorales, et juge pourtant l'étape chez la souris "indispensable et incontournable" avant tout usage clinique.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’étudier différents modes d’administration de cellules qui ont été génétiquement modifiée dans le but de reconnaître puis d'éliminer des cellules cancéreuses (lymphocyte T modifié, CAR-T) afin d’étudier la réponse immunitaire dirigée contre la leucémie dans un modèle murin. La thérapie par cellules CAR-T consiste en la greffe autologue de lymphocytes T préalablement modifiés par thérapie génique pour leur faire exprimer un récepteur dirigé contre une protéine tumorale et permettre son élimination. Cependant, la réponse dirigée contre la tumeur provoque le relarguage massif de certaines molécules pouvant donner lieu à des complications plus grave jusqu’à la mort du patient. De plus, suite à leur activation, les cellules administrées meurent, ce qui nous emmene à une autre problématique : la persistance de ces cellules CAR-T in vivo. Enfin à cause de la pression thérapeutique, les cellules tumorales peuvent perdre l'expression de la cible du CAR-T conduisant aux rechutes des patients traités. Ainsi, le développement de nouveaux modèles d’administration est donc un enjeu majeur pour inhiber ces réponses et permettre le succès thérapeutique sur le long terme. Dans ce projet, nous allons utiliser de 2 types de cellules CAR-T en comparant la méthode d’administration standard telle qu'elle est utilisée à ce jour en clinique à une injection de manière séquentielle (fractionnée). Ainsi, la même dose sera administrée soit en une seule injection soit en deux injections. L’objectif principal sera d’évaluer la tolérance de la dose fractionnée ainsi que l'effet antileucémique comparativement à la dose unique. Secondairement, nous évaluerons la persistance des cellules CAR-T in vivo.

Bénéfices attendus

Cette approche devrait nous permettre d’évaluer dans un modèle murin l’intérêt d’une telle stratégie d’injection chez l’homme afin d’améliorer la sécurité du traitement et d’optimiser l’injection des cellules CAR-T afin d’en améliorer l’efficacité thérapeutique.

Procédures

Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention, 1 injection de cellules à J0 puis 1 ou 2 autres (J10 et J17 selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Des prélevements sanguins seront réalisés en submandibulaire sur souris anesthésiée avec un volume n’excédant pas 75 µl tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, moins de 10 secondes par prélèvement. Suivi par utilistion d'un bioimageur du développement des tumeurs sur souris anesthésiée. Prélèvements de sang et de moelle sur souris après le mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hote plusieurs semaines après l'injection des CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nous avons déjà étudier le phénotype et la fonctionnalité des CAR-T cells in vitro en démontrant leur capacité à tuer les cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de démontrer la qualité et l'efficacité des cellules CAR-T à court terme. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité des CAR-T à long terme dans un modèle in vivo reste cependant indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose et des fibres de coton. Des points limites ont été mis en place et dans l'éventualité où un ou plusieurs animaux atteindraient le point limite, ils seront mis à mort. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront limités à 2 gouttes. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) d'un analgésique sera mis en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un anti douleur adapté sera injecté en sous-cutané, toutes les 6 à 12 heures durant 24 à 48 heures.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observé dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.

1 200 truites, chabots et ombres communs capturés en rivière vont être marqués dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis remis à l'eau vivants. Chaque poisson est anesthésié, mesuré, pesé, puis ouvert par une incision ventrale pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, l'ensemble se déroulant hors de l'eau pendant trente secondes à une minute. Le porteur annonce moins de 1 % de mortalité après l'opération, mais table aussi sur une perte du marqueur chez 5 à 10 % des salmonidés et jusqu'à 20 % des femelles au moment de la fraie, ce qui gonfle l'effectif capturé. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour évaluer si les poissons franchissent une passe aménagée, et la version modifiée du projet porte l'effectif à 1 500 individus.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer, grâce à la technologie RFID (Radio Frequency Identification) la franchissabilité des ouvrages et des aménagements réalisés pour rétablir la continuité écologique dans un cours d'eau salmonicole. Dans cette rivière, de nombreuses actions de restauration de la continuité écologique ont été réalisées sur un secteur long de 6.7 km, sur lequel 8 seuils ont être arrasés ou modifiés pour faciliter la mobilité piscicole mais aussi sédimentaire. En 2022, le dernier des seuils de ce secteur a été aménagé pour permettre aux poissons de franchir un obstacle considéré jusqu’ici comme infranchissable (création d’une rivière de contournement). Dans la suite des efforts réalisés par le syndicat gestionnaire pour améliorer la continuité écologique sur ce secteur dit « renaturé », une étude écologique pluriannuelle, par la technologie RIFD devra confirmer que la mobilité piscicole et sédimentaire y est à nouveau assurée. Cette étude devrait aussi permettre d’identifier les zones de déplacements des poissons en tenant compte des contraintes physiques et morphologiques du milieu (thermie, disponibilité en habitat).

Bénéfices attendus

Les projets permettront de mettre en lumière la « transparence » des ouvrages à la migration des espèces cibles, c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer la continuité écologique et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1'200 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau. MODIFICATION du 30/04/2024 : 1'500 poissons.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval des ouvrages étudiés. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes et mobiles.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l'ouvrage. Ils ont été adaptés au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 80mm ; 23 mm au-dessus. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision (pommade recommandée et fournie par E. Meunier, vétérinaire référent).

Choix des espèces

L’espèce cible principale est la truite commune (Salmo trutta). Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. En complément, une petite espèce d’accompagnement de la truite, le chabot (Cottus gobio), sera également intégrée dans le suivi en raison de son abondance sur certains secteurs et de sa faible capacité de nage. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués à l’aide de PIT tags 23 mm. Pour les chabots, les stades sub-adultes et adultes seront visés, avec une longueur minimale de 80 mm. Ces individus seront marqués par PIT tag de 13 mm. Ces tailles minimales assurent un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. MODIFICATION du 30/04/2024 : l’ombre commun a été ajouté en tant qu’espèce protégée présente sur le secteur d'étude et fortement impactée par la fragmentation des cours d’eau. Les ombres de plus de 180 mm seront marqués.