Procédures modérées

1 515 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à vingt échographies abdominales sous anesthésie de quinze minutes et dix prélèvements de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés avant la naissance ou sur des souriceaux de deux, cinq et quinze jours, pour déclencher un cancer du foie de l'enfant, d'autres animaux recevant une greffe de fragment tumoral au cours d'une chirurgie abdominale. Le porteur signale que l'usage d'animaux à des âges aussi précoces peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger. Toutes sont tuées à l'issue, pour une maladie qui touche vingt enfants par an en France et dont quatre sur cinq guérissent avec les traitements actuels.

Objectifs

L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.

Procédures

Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).

Devenir

Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.

Remplacement

Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.

Raffinement

Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.

Choix des espèces

La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.

Les femelles de cette lignée transgénique peuvent mourir subitement à quinze mois sans signe annonciateur, seule nuisance du modèle que le porteur reconnaisse. 1 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après une biopsie de la queue au sevrage, elles passent trois tests comportementaux à trois, six, douze et dix-huit mois, dont un test de mémoire en piscine étalé sur cinq jours, et une partie est transportée une à deux heures vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales sous anesthésie. Le porteur détaille la répartition des mises à mort : 456 pour prélever le cerveau et l'intestin, 592 après les imageries, 297 couples reproducteurs ou animaux surnuméraires tués après avoir été inclus dans des études hors champ, le tout pour un futur complément alimentaire à base de polyphénols.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les souris sont identifiées en posant une boucle d'oreille numérotée et les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.

225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux cents d'entre elles reçoivent sous la peau un implant de tissu biologique, opération de dix minutes sous anesthésie, puis subissent une micro-incision de la queue pour un prélèvement de sang au moment où l'implant leur est retiré, avant d'être tuées. Les 25 restantes, écartées parce qu'elles n'ont pas le génotype recherché, sont laissées en vie et réutilisées dans d'autres protocoles en cours. Le projet cherche à savoir si le blocage d'une enzyme freine la calcification des bioprothèses valvulaires, et le porteur affirme devoir le vérifier "in vivo, dans un système biologique entier", après des résultats non publiés obtenus en culture cellulaire.

Objectifs

Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et sa prévalence augmente avec l’âge. Il n’y a aujourd’hui pas de traitements pour traiter le développement du RAC. En plus du remplacement valvulaire aortique (RVA), les recommandations de prise en charge des patients ayant un RAC incluent aussi l’implantation d’une prothèse biologique dans la valve aortique par voie percutanée (TAVI). Concernant ces prothèses, il a été observé des cas de recalcification et peu d’étude existent sur la durabilité des prothèses au-delà de 5 ans. Nous avons précédemment identifié, en travaillant sur des modèles cellulaires, une cible thérapeutique appelée Ezh2 (Enhancer Zeste Homologue 2), qui agit sur les phénomènes inflammatoires et de calcification dans le RAC. Nous souhaitons au travers de cette étude démontrer son rôle dans les processus inflammatoires associés à la dégénérescence de bioprothèse valvulaire aortique.

Bénéfices attendus

Démontrer l'intérêt thérapeutique du ciblage de l'enzyme épigénétique EZH2 (Enhancer zest homolog 2) par une meilleure compréhension de son rôle dans les processus inflammatoire associés à la dégénerescence des bioprothèses valvulaire aortique.

Procédures

1. implantation de tissus biologiques en sous cutanée chez un modèle de souris sous une anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique adaptée suivant le poids de la souris 40 minutes avant opération chirurgicale. Le temps nécessaire à l'implantation des tissus biologique en sous cutanée est de 10 minutes par souris 2. Chaque souris (n=200) subira un prélèvement sanguin par micro-incision de la queue au moment de l'extraction des implants. La couverture analgésique obtenue dure 6 heures et la durée d'injection de l’analgésique est de 2 à 3 secondes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins (classe légère), les administrations d’analgésique (classe légère) et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2 (classe légère), pourront occasionner des effets secondaires. L’implantation de tissus biologiques en sous cutanée est une procédure de classe modérée pouvant occasionner une douleur modérée post-opératoire et une gêne au niveau des zones implantées.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure (n=200) seront mis à mort. Les implants seront prélevés pour les explorations ex vivo. Les 25 animaux n’ayant pas le génotype d’intérêt et n'ayant donc pas été inclus dans la procédure seront laissés en vie et réutilisés pour d’autres protocoles en cours.

Remplacement

Des résultats non publiés de notre laboratoire ont montré que le ciblage, in vitro, de l’enzyme épigénétique Ezh2 dans les cellules inflammatoires permettait une réduction des phénomènes inflammatoires participant au développement des calcifications de la valve aortique. Dans cette étude nous voulons évaluer, in vivo, dans un système biologique entier, l'effet du ciblage spécifique d'Ezh2 sur les processus inflammatoires associés à la dégénérescence de bioprothèse valvulaire aortique.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. A l'aide du logiciel G*power version 3.1.9.7 qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus le nombre d'animaux nécessaire est ajusté. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre et d'utiliser l'intégralité des animaux OGM produits dans notre animalerie. Une stratégie de reproduction adaptée et associée à une analyse du génotype de chaque animal nous permettra de nous limiter à l'unique production d'animaux pour les procédures expérimentales. Afin d'éviter la production d'animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux seront hébergés sur portoirs ventilés et dans des cages en plaques de cellulose vierge et maisons en carton. Nous avons déterminé des points limites adaptés grâce à notre grille de score qui s’appuie sur le comportement de l'animal, son apparence et des signes cliniques spécifiques. De plus, nous adopterons une stratégie de réhydratation par injection en sous-cutanée de sérum physiologique à 37°C, et en cas de besoin, une injection de glucose par voie intrapéritonéale. Un traitement analgésique en pré et postopératoire, sera administré, soit immédiatement après l'implantation ou une fois par jour sur les 48h qui suivent l’implantation. Si un des points limites est atteint ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score entre 10 et 14, la méthode de mise à mort prévue est la dislocation cervicale. Un suivi quotidien du bien-être animal sera mis en place.

Choix des espèces

La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, l’utilisation d’animaux pour lesquels un gène est invalidé de manière spécifique dans différents types cellulaires comme cela est le cas dans cette demande concernant la délétion de Ezh2 dans les cellules myéloïdes, qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat (modèle développé au sein de notre laboratoire). Ces modèles sont particulièrement intéressants pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. La souche de souris (C57Bl/6j) sera utilisée dans cette étude Nous allons inclure des animaux adultes de 12 semaines. La taille des souris à cet âge permet une implantation facilitée des prothèses .

Après un transfert de cellules T qui déclenche chez elles une maladie auto-immune de la peau, 714 souris sont saignées sous anesthésie à J0, J7, J14, J21 puis J28, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La maladie provoque des érosions sur le museau, autour des yeux et des oreilles, sur le dos, la poitrine, l'abdomen, les quatre pattes et la queue, une perte de poils et un allongement des dents. Le porteur écrit que cette inflammation ne peut pas être atténuée, puisque la réduire modifierait le phénotype recherché. Toutes sont tuées à l'issue, pour mesurer dans leurs tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire.

Objectifs

Les maladies bulleuses auto-immunes sont un groupe de maladies inflammatoires chroniques de la peau rares avec des bulles et des érosions de la peau. Parmi ces maladies, le pemphigus vulgaire (PV) est caractérisé par la production d’auto-anticorps (auto-Ac) dirigés contre deux protéines desmosomales. Les traitements des formes modérées à sévères de PV sont efficaces, cependant, il y a environ 40 % de patients en rechute. Par conséquent, il existe un besoin médical non satisfait afin de prédire et de guérir les rechutes de PV. Les réponses Ac sont contrôlées par des globules particuliers appelés lymphocytes T. Nous avons observé chez les patients PV une diminution de ces cellules T après traitement corrélée à une baisse prolongée des auto-Ac.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de tester le rôle causal et mécanistique des lymphocytes T dans la physiopathologie du PV à l’aide de modèles murins pré-cliniques de PV déficients pour la population de lymphocyte T afin de développer de nouvelles thérapies.

Procédures

Prélèvement sanguin à J0, J7, J14, J21 et J28 après transfert des cellules T afin d'évaluer la mise en place de la pathologie autoimmune de PV par mesure de la quantité d'auto-anticorps sérique. Les prélèvements de sang auront lieu sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie = 2 min). Nombre total d'interventions chez les animaux = 5.

Impact sur les animaux

Développement d'une pathologie équivalente au PV : erosion (Museau, Région périorbitaire, Région périoriculaire, Dos, Poitrine, Abdomen, Patte avant droite, Patte avant gauche, Patte arrière droite, Patte arrière gauche, Queue), alopécie (face, dos, cou et abdomen), allongement des dents avants

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que nous prélevions et analysions dans les tissus le niveau d'inflammation et la réponse immunitaire dans le contexte du pemphigus

Remplacement

Les maladies inflammatoires chroniques cutanées sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (p.ex., les structures épithéliales, les organes lymphoïdes secondaires ou encore le système vasculaires etc). Ce projet est multidisciplinaire et vise à mieux comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans le contrôle d'un modèle murin mimant le PV. De ce fait nous devrons travailler avec des animaux vivants afin de pouvoir analyser le rôle des différents organes et différents types cellulaires suspectés d'être impliqués dans le développement de cette pathologie étudiée.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 3 fois. Au total 10 lots experimentaux réalisés, ce qui correspond à 102 groupes experimentaux. Nous essayons d'effectuer le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux pour analyser la nature, le phenotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires

Raffinement

Les animaux seront attentivement observés après induction du PV. Le poids des animaux sera suivi et si les souris devaient perdre 20% de leur poids initial ou si nous observons des signes de douleurs apparentes, l'animal sera mis à mort. Les animaux seront placés dans des cages (5 souris par cage) avec enrichissement : igloo/maison, papier kraft pour nidification. L'objectif de ce projet est de tester de nouvelles approches thérapeutiques, donc l'inflammation induite ne pourra être réduite car elle impacterait le phénotype.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présentent de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Toutes tuées en fin de procédure pour des analyses post-mortem, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis pour certaines des injections deux fois par semaine pendant quatre semaines, toujours sur animal vigile. Un second groupe est irradié trois minutes sous contention avant de recevoir des cellules par voie intraveineuse, puis des cellules tumorales six semaines plus tard et deux prises de sang. Le porteur reconnaît que l'irradiation peut dégrader l'état général des animaux et que des nécroses peuvent apparaître sur les tumeurs, et conclut que le recours aux souris reste "indispensable" malgré les méthodes alternatives auxquelles son laboratoire a eu recours.

Objectifs

Notre système immunitaire est capable de détecter la présence d’un élément étranger dans notre organisme et de déclencher une réponse immunitaire efficace afin d’éliminer ce pathogène. La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. Le contrôle de la réponse immunitaire est un mécanisme très important pour empêcher par exemple une suractivation des lymphocytes pouvant aboutir à la destruction des cellules saines de l’organisme. Pour cela, les lymphocytes sont équipés de récepteurs dits de contrôle (checkpoint). L’engagement de ces récepteurs avec leurs ligands (molécule qui se lie de manière réversible à son récepteur) régule la durée et l’intensité de l’activation lymphocytaire. Mais ce mécanisme peut être détourné par les cellules tumorales qui en exprimant les ligands des récepteurs checkpoint freinent le système immunitaire au lieu de l’activer. Les médicaments anti-checkpoints sont déjà utilisés en clinique contre plusieurs types de cancers. Cependant ces traitements dit « d’immunothérapie » ne sont pas efficaces chez tous les patients et uniquement pour certains cas de cancers. Comprendre la raison d’une telle variation est un défi important pour la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. Parmi celles-ci, les kinases sont une cible particulièrement intéressante. Ce sont des protéines dont le rôle principal est d'ajouter un petit groupe chimique appelé phosphate à d'autres protéines, ce qui peut les activer ou les désactiver. Dans le contexte du cancer, certaines kinases peuvent être hyperactives, contribuant ainsi à la croissance incontrôlée des cellules cancéreuses. En ciblant spécifiquement ces kinases avec des médicaments inhibiteurs, les chercheurs espèrent ralentir ou arrêter la croissance des cellules cancéreuses. Plus de 30 de ces médicaments sont déjà utilisés, et d'autres sont en cours d’essai clinique. Le but de ce projet est d’explorer si notre protéine kinase d’intérêt peut améliorer les mécanismes de défense anti-tumeurs des lymphocytes en combinaison avec des traitements anti-checkpoints.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de définir si notre protéine kinase d’intérêt joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs solides et pourrait améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Si tel était le cas, elle pourrait être considérée comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer.

Procédures

Dans un premier lot de souris, des cellules tumorales seront injectées une fois par expérience aux animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Certains animaux seront ensuite traités deux fois par semaine pendant maximum 4 semaines par injection sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Dans une deuxième expérience, des souris vigiles seront irradiées (3 minutes) puis 4H après, elles seront injectées avec des cellules par voie intraveineuse et sous anesthésie gazeuse rapide (durée de l’anesthésie inf à 5 minutes). Six semaines après cette manipulation les animaux seront injectés une fois par expérience avec des cellules tumorales. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles 7 jours et 14 jours après cette dernière injection (durée du geste inférieur à 20 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques (douleur légère de courte durée liée à la piqûre elle-même). Une légère douleur de très courte durée est attendue lors des prélèvements sanguins ou des injections par voie intraveineuse. La procédure d’irradiation n’est pas douloureuse pour les animaux néanmoins un stress de courte durée, lié à la contention est attendu. Dans de rares cas, l’irradiation peut entrainer une altération de l’état général des animaux (déshydratation, prostation……) dans les jours suivants l’irradiation.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs et nécessite donc le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. En effet, le développement des tumeurs met en jeu de multiples types cellulaires et de nombreux mécanismes qui ne peuvent pas être reproduits dans des modèles in vitro. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation des souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences. Plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) seront réalisées sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris par groupe est de 10 avec 3 manips afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures, une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal en souffrance est mis à mort. Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, et deux fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur ayant été greffée par voie sous-cutanée, afin d’appliquer les points limites de la grille de score. Après l’irradiation, du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent apparaitre.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet.

Produire des sérums contre le virus West Nile, la fièvre catarrhale ovine et la fièvre aphteuse suppose ici d'immuniser 20 lapins, un par antigène, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit trois injections sous-cutanées espacées de trois semaines et subit quatre prises de sang à la veine de l'oreille. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable, alors qu'il décrit une douleur à l'injection et une réaction inflammatoire locale. La procédure se termine par une ponction de 50 mL dans le cœur sous anesthésie, prélèvement dont le volume impose la mise à mort de l'animal avant tout réveil.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire des anticorps dirigés contre des virus d’intérêt en santé publique et/ou vétérinaire tels que les virus West Nile, de la fièvre catarrhale ovine, de la fièvre aphteuse. Ces virus émergents ou à risque d’émergence ont des impacts sanitaires et économiques importants. Dans le but d’assurer et de garantir une surveillance optimale de ces infections virales chez les espèces sensibles, l'amélioration des outils de diagnostic et de recherche est nécessaire. Cette activité nécessite notamment la constitution de banque de réactifs biologiques tels que des sérums issus d’animaux ayant produit des anticorps spécifiques aux virus d’intérêt, bien caractérisés. Pour permettre la production d’anticorps, des antigènes qui sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines virales, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation), seront utilisés. Les antigènes (protéines virales ou virus ne pouvant pas se multiplier) seront donc injectés à des lapins qui produiront des anticorps dirigés contre ces antigènes. Les anticorps produits sont dits « polyclonaux » car ils sont un mélange d’anticorps dirigés contre différentes parties des antigènes. Afin de récupérer ces anticorps précieux, le sérum (phase du sang sans les globules rouges), dans lequel se trouvent les anticorps, sera collecté en fin de procédure. Ainsi, les sérums obtenus après immunisation de lapins avec des protéines (et en présence d’adjuvant) ou de virus non réplicatifs pour cette espèce serviront au développement et à la validation d’outils de diagnostic sérologiques. Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif.

Bénéfices attendus

L’obtention d’anticorps spécifiques nous permettra de développer et de valider des outis sérologiques de diagnostic et de recherche pour les virus d’intérêt en santé publique et vétérinaire.

Procédures

Trois injections par la voie sous-cutanée à 3 semaines d’intervalle seront réalisées. Les prélèvements prévus sont au total 4 prises de sang à la veine de l’oreille (2mL par prélèvement) à 3 semaines d’intervalle. Le temps de prélèvement est de quelques secondes (inférieur à 1 min). En fin de procédure, un prélèvement d’un volume de 50 mL sera réalisé en ponction intra-cardiaque sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lapins peuvent ressentir de la douleur lors des injections de l’antigène par la voie sous-cutanéée. Une légère réaction inflammatoire locale peut être observée sans conséquence pour le bien-être de l’animal. Nous n’attendons pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

En raison du gros volume de sang prélevé en fin de procédure sous anesthésie, les lapins seront mis à mort avant le réveil.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour la production de sérum contenant des anticorps polyclonaux dirigés contre des virus d’intérêt. La production synthétique reste actuellement moins performante. Le but de cette étude est d’avoir un panel d’anticorps dirigés contre des antigènes viraux issus de nouveaux virus émergents et/ou non commercialisés à visée de diagnostic ou de recherche.

Réduction

Dans le but de réduire la nombre d’animaux, nous avons décidé d’utiliser 1 lapin par antigène. Nous avons au total 20 antigènes pour lesquels nous avons besoin de sérum polyclonal. Un lapin permet l’obtention de sérum de bonne qualité et en quantité suffisante. Cette procédure permet de générer du matériel biologique et aucune analyse statistique sera réalisée.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés par paire dans des cages doubles munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). En cas d’agressivité observée, les lapins seront placés en hébergement individuel avec contat visuel et odorant (séparation des cages faites avec des plaques en plexiglas transparentes et ajourées). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les prélèvements terminaux de sang en vue de la récupération des sérums contenant les anticorps polyclonaux seront effectués sous anesthésie, avec une surveillance permanente des animaux, puis mise à mort avant le réveil.

Choix des espèces

Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif. Les animaux utilisés seront des adultes afin d'avoir un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps

Isolées cinq jours en cage individuelle puis privées de nourriture pendant vingt heures, 144 souris sont ensuite placées devant deux aliments au choix pendant vingt-quatre heures. Toutes seront tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de mesurer le rôle d'une hormone du foie, FGF21, dans la préférence alimentaire après un jeûne, chez des souris dont ce gène a été invalidé au niveau hépatique. Le porteur reconnaît que le jeûne peut provoquer une chute du glucose sanguin, une baisse de la température corporelle et une perte de poids importante, et que l'hébergement individuel stresse l'animal, tout en annonçant retirer de l'étude toute souris présentant un signe de souffrance.

Objectifs

Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle du comportement alimentaire. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie, exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et les protéines. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie dans le comportement alimentaire après une période de jeûne. Pour cela, nous utiliserons des souris mâles et femelles dont le gène FGF21 est invalidé au niveau hépatique spécifiquement. Ces souris, en comparaison d’animaux contrôles de type sauvage, seront soumises à un jeûne prolongé (20h) afin d’induire la production de FGF21 puis auront le choix entre 2 aliments différents afin d’évaluer le rôle de FGF21 hépatique dans la préférence alimentaire en réponse au jeûne.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de définir le rôle de FGF21 d’origine hépatique dans la préférence alimentaire après une période de jeûne. En effet, si le rôle de FGF21 dans le comportement alimentaire est bien connu, il n’est pas décrit dans la littérature la préférence alimentaire dépendante de FGF21 hépatique induite par une période de jeûne.

Procédures

Les animaux seront hébergés individuellement pendant 5 jours, dans des cages de permettant la mesure automatique de la prise alimentaire durant 3 jours pour l’habituation et mis à jeun pendant 20h puis seront renourris ad libitum avec 2 régimes au choix pendant 24 heures.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle, ainsi qu’une perte de poids importante. L’hébergement individuel entraîne un stress de l’animal.

Devenir

Il n'y aura pas d'autres projets portant sur l'étude de la protéine d'intérêt, c'est pourquoi, tous les animaux seront mis à mort a la fin de la procédure.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (notamment foie et cerveau). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

LLe nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, une période de deux semaines minimum dans la salle d'hébergement collectif sera laissée aux animaux afin qu’ils s’acclimatent à leur nouvel environnement. Le change est hebdomadaire, et l’état des animaux est contrôlé au quotidien par le personnel dédié aux soins des animaux. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie), calme dans les pièces et le cycle lumineux (12h/12h) sera inversé, ce qui permet de laisser aux animaux leur temps de repos. Des enrichissements du milieu d’hébergement (dômes de nidification et carrés de coton) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Au moment des expérimentations (mise en cage individuelle), une phase d’acclimatation sera appliquée durant trois jours en conditions de régime standard afin de vérifier que les animaux se nourrissent et s’abreuvent correctement. Les mangeoires et les biberons du système de mesure sont similaires aux cages domestiques typiques des laboratoires, ce qui permet une transition moins stressante vers le système, ils sont de plus, disposés à l'extérieur de la cage et facilement accessibles à la fois à l'animal et à l’expérimentateur Nous surveillerons l’apparence physique externe (Echelle d’évaluation des expressions faciales, affichée dans la pièce), le poids (pesée quotidienne) et le comportement des animaux. Des points limites seront mis en place pour l’évaluation de différents paramètres. Si un animal présente un signe de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente) après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée) après examen par le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte. La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans le projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles car le métabolisme énergétique est différent selon le sexe. Il serait incorrect d’extrapoler les données obtenues chez les mâles aux femelles.