Procédures modérées

Du chlorure de fer à 20 % appliqué sur l'artère cérébrale moyenne provoque un accident vasculaire cérébral chez 924 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine caudale, passe cinq séances d'IRM sous anesthésie entre le jour de l'occlusion et le quatorzième jour, et termine par une ouverture du thorax et de l'abdomen suivie d'une ponction cardiaque. Les molécules testées viennent de partenaires industriels qui financent le projet et attendent, en cas de résultats favorables, un passage en essais cliniques puis une mise sur le marché. Le porteur annonce une batterie de trois tests comportementaux qu'il qualifie d'indolores, répétés à sept dates, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 924 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer à 20% au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à un par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Pendant l’opération chirurgicale d’AVC ischémique, l’animal sera profondément anesthésié avec de l’isoflurane dans un mélange d’air sous couverture analgésique 15 minutes avant la première incision cutanée. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles, une anesthésie locale sera également appliquée. De plus, chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, l’anesthésie sera coupée, et le débit d’oxygène sera élevé à 1 L/minute pour permettre une meilleure récupération post-opératoire de la souris au sein de sa cage individuelle. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Pour cela, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivant l’opération chirurgicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Toutes tuées en fin de protocole pour prélever leurs tissus, 24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze d'entre elles portent des modifications génétiques qui déclenchent une rétinopathie diabétique évoluant jusqu'à la mort. Chaque animal passe trois heures dans un tube de contention pour un test de tolérance au glucose puis un test à l'insuline, avec cinq gouttes de sang prélevées à la queue à chaque fois, 72 heures seul en cage de calorimétrie, et deux anesthésies gazeuses de trente minutes avec quatre électrodes piquées sous la peau. Le porteur qualifie cet isolement de 72 heures d'"indispensable" et affirme que ces régulations ne sont modélisables que dans un "organisme complet".

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le profil métabolique et cardiologique d’un nouveau modèle de souris atteinte de rétinopathie diabétique. Il s’agit d’une des complications du diabète au niveau des yeux, entrainant une atteinte de la rétine et progressivement une perte de la vue. Nous disposons d’un modèle de souris ou des modifications génétiques ont été introduites et sont capables de modifier la présence de 2 gènes chez l’animal. En modifiant ces gènes dans l’organisme, les souris vont développer une rétinopathie diabétique au cours du temps, conduisant au décès. Nous prévoyons de comparer 12 animaux par groupe : animal sauvage vs animal mutant. Une analyse de la fonction cardiaque sera associée à une analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions conséquences de la rétinopathie diabétique sur ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance de la rétinopathie diabétique et plus précisément dans l'impact physiologique (cardiaque et métabolique) de ces gènes dans cette pathologie. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées au diabète et plus précisément dans la rétinopathie diabétique. À plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicaments chez l'Homme.

Procédures

Ce projet, composé d'une cohorte de 24 animaux, vise à déterminer l'effet d'une mutation génétique induisant une rétinopathie diabétique sur les fonctions métaboliques et cardiaques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent, mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, un prélèvement sanguin sera effectué pour analyser des paramètres biochimiques. Ce prélèvement à lieu à la fin du protocole. Chaque geste sera espacé dans le temps pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. L'analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque sera effectuée deux fois (en début et fin de protocole), et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux recevront une injection d'insuline, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalles réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaître leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pendant 72h. Cet isolement permet de connaître la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. Lorsque nous étudierons la fonction cardiaque, les animaux seront anesthésiés par méthode gazeuse durant une période de 30 minutes environ. Durant les 4 dernières minutes de l'anesthésie, dans le protocole d'électrocardiographie, 4 électrodes seront piquées en surface de la peau pour obtenir les signaux électriques. Cela n'entraîne pas de dommages ensuite ni de saignement. À la fin du protocole, les animaux subiront un prélèvement de sang.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ces mutations sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la rétinopathie diabétique sur les fonctions physiologiques de l'animal. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet, à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations (homéostasie glucidique, lipidique, fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Par ailleurs, seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, glucides, balance énergétique...), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu, en prenant en compte la fragilité de ces animaux, que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre la puissance d'analyse et la réduction du nombre d'animaux utilisés. Durand cette étude nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysés à l'aide l'analyse de variance à deux facteurs (ANalyse Of VAriance, autrement appelé ANOVA). Nous avons aussi conçu notre protocole afin de n'utiliser qu'une seule cohorte d'animaux qui suivra l'ensemble des tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleures conditions d'hébergement possible par la présence d'un enrichissement. Nous ajouterons des croquettes au sol pour permettre aux plus faibles un accès facilité à la nourriture. Si l'hyperglycémie de ces souris se traduit par une augmentation de la quantité d'urine, le fond des cages sera changé plus souvent. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adaptée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptique...).

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques induisant une rétinopathie diabétique. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. À ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

Pour mettre au point un vaccin contre le papillomavirus et les cancers qu'il provoque, 695 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de 20 000 cellules tumorales sous la peau, puis subit des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux ou trois jours et jusqu'à huit prélèvements sanguins submandibulaires sur animal vigile. Le porteur décrit une tumeur qui se développe sous la peau sans toucher les organes internes, tout en prévoyant le cas d'un échappement métastatique provoquant perte d'appétit, amaigrissement, agressivité et isolement. Deux points limites sont annoncés, la nécrose de la tumeur et sa taille quand elle gêne la mobilité de l'animal, avec une surveillance tous les deux ou trois jours à partir du vingtième jour après la greffe.

Objectifs

Cette étude fait partie d’un projet de recherche translationnelle (d’une étude pré-clinique vers une évaluation clinique) pour déterminer le meilleur protocole de vaccination contre le papilloma virus et contre les cancers en dérivant. Pour cela, différents paramètres vont être affinés : les voies d’injection, la nécessité d’utiliser ou non un adjuvant et la fréquence d’administration du vaccin. Enfin dans le cadre de l’effet anti-tumoral, l’efficacité de cette vaccination sera testée en prophylaxie, mais également en thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet est dans la continuité d’études préexistantes utilisant une technologie particulière pour la vaccination. Le vaccin est un anticorps qui cible des cellules importantes dans la mise en place d’une réponse immunitaire vaccinale. Ce type de vaccin a démontré une bonne efficacité pour d’autres pathologies. Pour certains de ces pathogènes, ce vaccin a permis de générer une réponse immunitaire mémoire protectrice. Cette étude nous permettra d’étudier les réponses immunitaires mémoires générées, et en particulier ces cellules avec un plus haut degré de protection. Bien sûr, de manière plus large, ce projet vise à introduire un nouveau type de vaccin contre le Papillomavirus Humain avec des propriétés thérapeutiques anti-tumorales. Ce type de vaccin cible des populations plus vulnérables dans les pays en voie de développement qui ont une faible couverture vaccinale, associée à un système de prévention et de diagnostic non optimal.

Procédures

Dans ces procédures, les vaccins sont injectés à des moments précis selon la procédure impliquée. Ces injections ne durent que quelques secondes, sur des animaux sous anesthésies, et selon un volume en adéquation avec les limites autorisées ne dépassant pas 50µl. Des prélèvements périodiques de sang sont pratiqués sur les souris au cours des procédures. Il s'agit d'un prélèvement submandibulaire à Jour 0, 8, 15, 21, 28 et 35. (Dans le cadre des expérimentations sur 90 jours, deux autres points de prélèvement sont effectués, à jour 60 et 90). Ces prélèvements ne durent que quelques secondes également, et sont pratiqués avec une fine aiguille sur animaux vigiles. Sur les procédures de croissance tumorale, une greffe de cellules tumorales est effectuée. Les cellules tumorales sont injectées par une seringue avec une fine aiguille. La greffe se fait en sous cutanée, le geste durant 10 à 20 secondes sur animaux vigiles. Enfin la mesure des tumeurs se fait de manière périodique (2-3 jours) par l’intermédiaire d’un pied à coulisse. La mesure dure 30 secondes sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris impliquées seulement dans la procédure de vaccination ne subissent pas de nuisances ou d’effets indésirables lourds, outre les injections répétées du vaccin. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. En revanche, les animaux impliqués dans les procédures de croissance tumorale sont greffés avec des cellules tumorales via une injection sous-cutanée. Cette greffe produit des lésions cutanées tumorales, puis le développement d’une tumeur. La croissance tumorale est cependant contrôlée à la fois par la quantité de cellules injectées et par la cinétique expérimentale associée à cette dose. La dose de cellules tumorales injectée est de 20 000 cellules, elle a été définie au sein d’un laboratoire partenaire et a fait l’objet d’une publication. La tumeur se développe sous la peau, les organes internes de l’animal ne sont pas touchés. Le mal-être de l’animal issu d’une défaillance d’organes ne peut donc pas être atteint, excepté en cas d’échappement métastatique. Dans ce cas des métastases se forment dans les organes internes de l’animal provoquant des changements physiologiques comme « perte d’appétit » (sans aucun autre signe clinique) et « amaigrissement », puis des changements comportementaux comme « agressivité » et « isolement ». Des nuisances ou effets indésirables apparaissent en fin de cinétique au niveau de la tumeur avec notamment l’apparition de parties nécrosées au sein de la tumeur et sa taille pouvant gêner la mobilité de l’animal. Ces deux points sont alors des points limites expérimentaux.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.

Remplacement

Sur la question du « Remplacement », les expérimentations in vitro ne rendent pas compte de toute la complexité rencontrée dans la mise en place de la réponse immunitaire (multi-cellulaires et multi-organes), et de la relation entre le système immunitaire et la tumeur, notamment à cause des différents organes et types cellulaires impliqués. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles expérimentaux in vitro ou ex vivo qui permettent de suivre la réponse anti-tumorale. L’expérimentation animale reste dans ce cas la solution de référence pour étudier l’effet du vaccin anti-CD40.E6-E7.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris nécessaires pour que les résultats soient significatifs. Ce nombre, impliquant tous les groupes des trois procédures, est estimé à 695 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique validée et couramment utilisée dans ce cadre.

Raffinement

Pour les stratégies de « Raffinement », nous allons donner tous les produits nécessaires au bien-être animal, réduisant au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Au niveau de l’hébergement au cours de l’expérimentation, des produits d’enrichissement sont utilisés comme différents types de neslets, des tubes de carton et des dômes de carton. Au cas où la souffrance animale apparait après échappement métastatique sans que nous puissions la résoudre, nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques. Cette grille nous permet d’évaluer la souffrance de l’animal, et ainsi de définir des points limites. Si ces points limites sont atteints, nous sacrifions l’animal. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille à partir du vingtième jour après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille ne doivent pas apparaitre sur l’ensemble de la cinétique expérimentale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort.

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’Homme. De plus, les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires importantes qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation et mécanismes impliqués dans les effets observés. Ainsi les souris sélectionnées pour cette étude qui sont immunocompétentes et qui présentent donc une réponse immunitaire complète, pourront être comparées dans leurs réponses immunitaires aux souris ayant des modifications génétiques. Les souris sont âgées de 6-12 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux.

Reçues à l'animalerie à douze mois et gardées jusqu'à vingt-deux, une partie des souris attend dix mois avant d'être infectée, un vieillissement en cage que le porteur associe lui-même à de l'alopécie, à de l'hypothermie et à des blessures de combat. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Chacune reçoit trois administrations sublinguales ou trois inoculations nasales sous anesthésie, des injections sous la peau ou dans le muscle, un prélèvement de sang à l'œil, puis le virus de la grippe, la perte de poids qui suit servant à mesurer l'efficacité vaccinale. Le porteur présente ces souris comme un passage obligé "avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l'humain", nommément le primate non humain.

Objectifs

Actuellement, la vaccination classique dirigée contre la grippe utilise la voie d’injection par aiguille. Cependant, ce mode d’administration ne procure qu’une immunité partielle (production d’anticorps au niveau sanguin) ce qui n’empêche pas l’entrée des pathogènes dans notre corps. La voie muqueuse nez/bouche/gorge est une voie intéressante car ces muqueuses sont la porte d’entrée du virus de la grippe. Il a été décrit dans la littérature scientifique que la vaccination par cette voie peut permettre l’induction d’une double protection immunitaire dans le sang et dans les muqueuses, et ainsi diminuer le risque d’infection et de transmission du virus. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer et de comparer la réponse immunitaire vaccinale dirigée contre le virus de la grippe après un rappel de vaccination par voie sublinguale, sur des animaux jeunes et âgés. En effet, les personnes âgées sont une population particulièrement à risque dans les cas d’infection par le virus de la grippe. Tous les animaux du projet seront infectés par le virus de la grippe afin de comparer l’efficacité de notre candidat sublingual avec un vaccin commercial de référence. Un suivi du poids après l’infection sera effectué afin de mesurer l’efficacité de notre candidat vaccin sublingual. L’objectif au long terme de ce projet est d’élaborer un vaccin capable d’induire une immunité durable dans le sang et les muqueuses à la fois chez les individus jeunes et âgées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques du projet concernent majoritairement l’évaluation de l’efficacité vaccinale d’un candidat administré par voie sublinguale, en fonction de l’âge. Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à administration muqueuse (sublinguale) qui réduira drastiquement l’infection et la transmission des virus respiratoires. En cas de succès, ce projet sera étendu à d’autres virus respiratoires (SARS-Cov-2, Virus Respiratoire Syncytial…).

Procédures

- Administrations par voie sublinguale pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention, nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie gazeuse (3 fois/animal, durée : 15 minutes). Sur 2 lots (20 animaux). - Administrations par voie intranasale (infection virale) sont des actes pouvant générer un stress supplémentaire pour l’animal notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale (3 fois/animal, durée : environ 30 minutes). Sur tous les lots (80 animaux). - Injections par voie sous-cutanée ne nécessitent pas d’anesthésie au préalable (3 fois/animal, durée : 5 minutes). Sur quatres lots (40 animaux). - Injections par voie intramusculaire ne nécessitent pas d’anesthésie au préalable (2 fois/animal, durée : 5 minutes). Sur deux lots (20 animaux). - Prélèvement sanguin à l’œil est un geste qui dure 30 secondes maximum. Ce geste est une technique pouvant induire un stress supplémentaire à l’animal, notamment par la contention. Nous effectuerons donc ce geste sous anesthésie générale additionnée d’une anesthésie locale (1 seule fois/animal, durée : 5 minutes). Sur tous les lots (80 animaux).

Impact sur les animaux

- Administration sublinguale et intranasale : ces gestes seront réalisés sur l’animal anesthésié et peuvent induire un inconfort léger après leur réveil. - Infection par le virus de la grippe : une perte de poids est attendue, correspondant aux symptomes d’une infection par le virus de la grippe chez la souris. - Injection en sous-cutané et dans l’abdomen : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles sous contention et peuvent générer un stress chez l’animal. - Injection par voie intramusculaire : ces gestes seront réalisés sur animaux vigiles sous contention. Une augmentation de la température corporelle est envisageable après les immunisations. - Immunisation : Une petite fièvre passagère est envisageable après les vaccinations. - Prélèvement de sang à l’oeil : Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie et peuvent induire des lésions au niveau de l’œil ainsi un inconfort léger après leur réveil. - Vieillissement des animaux : les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 12 mois et seront hébergées jusqu’à un âge maximal de 22 mois. Cette durée prolongée d’hébergement peut être la source de stress et d’anxiété chez l’animal pouvant entrainer divers symptômes liés au vieillissement (alopécie, hypothermie, blessure liée au combat…).

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Avant l’utilisation des candidats vaccins sur l’animal, des études de toxicité et de réponse inflammatoire ont été menées sur des cultures cellulaires épithéliales et immunitaires. De manière générale, la vaccination repose sur la mise en place d’une réponse immunitaire faisant appel à l’ensemble des organes lymphoïdes, dont les ganglions lymphatiques et la rate, et dans différents organes ciblés. Le recours à l’animal est donc incontournable, nous n’avons donc pas d’autre solutions que d’utiliser l’animal dans son entier pour étudier la réponse immunitaire de nos candidats vaccins.

Réduction

Dans l’ensemble, le nombre d’animaux utilisé a été réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et la significativité statistique des expérimentations. Il a été évalué pour 2 ans à 80 souris. Pour la procédure, des groupes de 10 souris/lot ont été calculés pour répondre à l’objectif. Les analyses se feront avec des statistiques classiquement décrites pour les études vaccinales.

Raffinement

- Les injections et prelèvements seront réalisés sous anesthésie. Après chaque anesthésie, le bon réveil des souris sera vérifié (mouvement de la souris, comportement, prise de boisson ou de nourriture) avant de les renvoyer dans leur pièce d’hébergement. - Le suivi des animaux après chaque étape des procédures comprend : la réalisation d’une pesée de l’animal et l’observation de l’activité/comportement (isolement, dos vouté, etc…), des modifications physiques (inflammation/rougeur au niveau des sites d’administration : gueule/langue, museau ou abdomen). En complément, une prise de la température de l’animal sera effectuée chaque semaine. En cas de variation importante de la température, une nouvelle mesure sera effectuée toutes les 24h et des moyens seront mis en œuvre pour la rétablir (anti-inflammatoire, armoire chauffante). - En cas de perte de poids importante, de la nourriture se mise à disposition au sol dans la cage. - En cas de lésion cutanée, une pommade nettoyante et cicatrisante sera appliquée sur la zone et si besoin un isolement de l’animal sera effectué.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont un modèle très adapté aux études de l’immunité car il existe beaucoup d’outils biologiques d’analyses de la réponse immunitaire chez la souris, qui est bien caractérisée. Les souris seront utilisées à partir de 10 semaines de vie (ce qui correspond à un jeune adulte avec une système immunitaire mature) ou entre à partir de 16 mois (ce qui correspond à une population âgée) afin de comparer l’efficacité du vaccin à deux âges différents. De plus, la lignée choisie présente des caractéristiques immunitaires proches de l’humain. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin. Ces modèles sont essentiels avant de passer à des animaux plus pertinents et proche de l’humain dans un contexte d’infection viral, tel que le primate non humain.

Une injection de cellules tumorales sous anesthésie, puis quatre injections de vaccin, chacune sous anesthésie : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tumeurs. Le porteur décrit une douleur possible au point d'injection, puis des douleurs liées au développement de la tumeur et une dégradation visible de l'état des animaux, absence de toilettage, prostration, lenteur des mouvements. Il attend du vaccin les mêmes effets que chez l'humain, inflammation, fièvre et douleurs musculaires. Il affirme par ailleurs connaître assez bien le modèle pour arrêter chaque expérience "bien avant d'atteindre les points limites", alors que la dégradation qu'il décrit constitue un critère classique de point limite.

Objectifs

Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de certains cancers. Cependant de nombreux patients restent non-répondeurs à ces traitements. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers qui servent de portes d’entrées majeures à des lymphocytes tueurs. Ces lymphocytes sont des cellules du système immunitaire capable de tuer les cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet antitumoral d’un vaccin immunothérapeutique qui permettra d'augmenter les vaisseaux TA-HEV, donc d'augmenter les portes d'entrées au sein de la tumeur pour permettre un meilleur recrutement des lymphocytes tueurs.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mettre en évidence un effet anti-tumoral puissant médié par les lymphocytes T et les TA-HEV. Cela permettra donc à court terme d’établir la preuve de concept de l’effet antitumoral du vaccin. Et à plus long terme de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique permettant de traiter des patients non répondeurs aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles.

Procédures

Les souris subiront une injection de cellules sous anesthésie (2-3 minutes) et subiront 4 injections de vaccins sous anesthésie (10 secondes à 1 minute)

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur légère au site d'injection. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les vaccins peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme : inflammation, fièvre et douleurs musculaires.

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort à l'issue de la procédure pour des prélèvements de tumeurs

Remplacement

La procédure réalisée sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 20 animaux pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives.

Raffinement

La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti-tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille de scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les injections de vaccins seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.

1 345 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, certaines suivies jusqu'à dix-huit mois. Les 1 048 souris incluses dans le protocole passent trois tests de comportement à quatre âges différents, dont un test de mémoire en piscine étalé sur cinq jours, et voient leurs fèces récoltées une fois par mois. 592 d'entre elles sont transportées vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales précédées d'une mise à jeun, tandis que 297 reproducteurs et surnuméraires sont tués après avoir été versés dans des études "hors champ". Le bénéfice espéré tient en une phrase du porteur : la production, à plus long terme, d'un complément alimentaire pour mieux vivre chez les personnes âgées.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur EU1, les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.

Impact sur les animaux

Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.

Réduction

Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.

Choix des espèces

Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.

192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par exsanguination pour le prélèvement de leur cerveau. Ils subissent une chirurgie cérébrale de deux heures avec injection virale, quatre jours d'hébergement individuel, puis, trois semaines plus tard, des séances où on leur applique des stimuli douloureux pour mesurer leur réaction. Le RNT annonce des tests comportementaux et "différents stimuli douloureux" sans jamais préciser lesquels, alors que toute la mesure repose sur eux. Le porteur affirme le recours à l'animal "indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui les conditions étudiées, et présente les résultats obtenus chez le rat comme "très facilement transposables à l'homme".

Objectifs

Notre projet vise à comprendre comment le cerveau traite la douleur. Plus précisément, nous étudions une partie du cerveau appelée thalamus médiodorsal (MD). Nous nous intéressons à la fonction de chaque subdivision du MD dans la transmission et le traitement des différentes composantes de la douleur (sensorielle et émotionnelle), ainsi qu'à la connectivité du MD avec la partie frontale du cerveau et son rôle dans la douleur. Nous voulons comprendre le rôle des connexions du MD avec les autres régions cérébrales impliquées dans la douleur. Pour cela, nous stimulerons ou inactiveros spécifiquement chacune des sous-régions du MD et nous observerons les effets sur le comportement nociceptif de l’animal. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes de traitement de la douleur dans le cerveau, et de développer de nouvelles solutions pour la diminuer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de cette étude visent à améliorer le traitement de la douleur, en particulier de la douleur chronique. En effet, nous espérons améliorer notre compréhension des mécanismes par lesquels les trois subdivisions du thalamus médiodorsal (MD) contribuent à la transmission des composantes sensorielles et émotionnelles de la douleur. Ceci nous permettra de développer des traitements plus efficaces contre des symptômes spécifiques de la douleur chronique. La douleur chronique est bien plus qu'un simple inconfort temporaire, elle peut dégrader la qualité de vie de manière significative et entraîner des coûts économiques importants (arrêts de travail, consultations médicales, etc.). De plus, la sensibilisation à la douleur peut amplifier des symptômes psychiques tels que la dépression et l'anxiété, créant un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Notre projet vise à décrire les mécanismes précis de ces interactions dans les zones du cerveau et les voies nerveuses qui régulent la transmission de la douleur. Ces mécanismes, qui sont partiellement communs aux douleurs et aux troubles psychiatriques associés, seront la cible des traitements que nous espérons développer. En résumé, notre étude vise à améliorer la compréhension et le traitement de la douleur chronique, en s'attaquant aux mécanismes qui la sous-tendent et à ses interactions avec les troubles psychiatriques.

Procédures

La chirurgie et l'injection virale seront effectuées simultanément chez les rats adultes en une seule intervention d'une durée approximative de deux heures. Après l'intervention, les rats seront hébergés individuellement pendant quatre jours pour favoriser leur récupération et limiter les risques de complications. Trois semaines après les chirurgies, les rats subiront des tests comportementaux pour évaluer leur sensibilité à la douleur. Ces tests permettront de déterminer l'effet de l'activation ou de l'inhibition du noyau d'intérêt sur la perception de la douleur. Chaque test comportemental comporte une phase d'habituation de 30 minutes suivie d'une phase de test de 5 minutes. Au cours de la phase d'habituation, les rats seront familiarisés avec l'environnement et la procédure du test. La phase de test permettra de mesurer la réaction des rats à différents stimuli douloureux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental 4/ un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection virale 5/ un risque de légère douleur lors des tests de nociception 6/Hébergement individuel pendant 4 jours pour la récupération post-opératoire

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à l’aide d’une exsanguination afin de récupérer le cerveau pour les analyses hsitologiques.

Remplacement

Le rat est une espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées

Réduction

Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de rats utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 8 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux en utilisant uniquement des rats mâles pour la réalisation de ce projet. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non paramétriques).

Raffinement

Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux seront importés dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central du rat présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat sont largement transférables à l'homme. Les sous-noyaux du MD sont de très petite taille et nécessitent une grande précision pour y accéder. Cela rend les manipulations impossibles chez les espèces plus petites que le rat. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de deux mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

Les souris mâles de ce projet sont génétiquement modifiées pour développer un cancer du testicule dans 75 % des cas. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le seul acte que le porteur décrit est le prélèvement de deux phalanges au maximum à sept jours, pour l'identification et le génotypage, et il annonce comme nuisances la tumeur elle-même, une gêne au déplacement quand elle se développe au niveau du scrotum, une baisse d'activité. Les animaux surnuméraires et ceux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués, les autres le sont en fin de procédure pour le prélèvement d'organes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires et la sensibilité aux traitements par chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le cancer du testicule (CT) est le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme jeune (15-35 ans). Son incidence n'a cessé d'augmenter dans les pays industrialisés depuis plusieurs décennies. L'étiologie des CT est peu connue. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces cancers permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Ceci est d'autant plus important que 10% des malades décèdent des suites de leur cancer. L'étude de la physiologie des cellules germinales est fondamentale, puisqu'elles sont à l'origine de la majorité (95%) des CT. Des études récentes ont démontré les rôles des signalisations des xénobiotiques dans la régulation de la physiologie testiculaire et notamment celle des cellules germinales. L’objectif de ce projet est d’analyser l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des cancers germino-testiculaires.

Procédures

Sur ces animaux, il y aura 1 prélèvement à 7 jours de deux phalanges maximum par souris pour la numérotation et le génotypage.

Impact sur les animaux

Seulement les animaux obtenus des croisements avec la lignée exprimant la recombinase Cre développeront des tumeurs. Les nuissances et effets indésirables attendus seront d'une part développement de la tumeur, ce qui au niveau du scrotum pourrait entrainer une gêne pour le déplacement de la souis, aussi nous abserverons les troubles au niveau de son activité (hypoactivité).

Devenir

Les animaux surnumérères et de génotypes sans intérêt pour le projet seront mis à morts. De même à la fin de la procédure, les animaux d'intérêt seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.

Remplacement

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de l'étiologie la tumorigenèse testiculaire avec une origine potentiellement au cours de la vie empbryonnaire et un développement de la patholgie et période postnatale.

Réduction

Nous réduirons au maximum le nombre de souris utilisées et présentant des attente délétère grâce à l'utilisation du système de ciblage tissulaire de l'altération génétique dans le tissus d'intérêt. Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence l'effet des altérations génétiques dans la survenue des tumeurs germinales du testicule. Avec une incidence attendue selon la litérrature de 75%; nous utiliserons 20 animaux par groupe et par âge afin d’obtenir des résultats valides pour définir les différences entre les différents génotypes.

Raffinement

Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre de souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré à des intervalles qui seront définis avec le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement et qui développent dans 75% des cas un cancer germino- testiculaire. il s'agit d'un des rares modèles permettant de développer ce type de pathologie avec un incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats fiables.