Procédures modérées

Tuées une heure, trois heures ou vingt-quatre heures après l'injection pour que leurs organes soient prélevés, 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une injection intraveineuse unique de nanoparticules censées acheminer un médicament directement vers un caillot cérébral, puis sont mises à mort selon le délai assigné à leur groupe. Le porteur indique que l'injection peut être douloureuse et que les nanoparticules peuvent provoquer une inflammation du rein, de la rate, du foie ou du poumon. Des tests sur cellules et globules rouges humains n'ont révélé aucune toxicité, ce qui n'empêche pas le porteur de conclure qu'un "organisme vivant complexe" reste "nécessaire" pour observer la distribution du produit.

Objectifs

Cette étude est un projet fondamental dans le domaine de la santé publique. L’accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause mondiale de mortalité. En particulier, 80% des cas d’AVC sont caractérisés par la formation d’un caillot (thrombose) dans une artère cérébrale provoquant une diminution voire une suppression du flux sanguin dans une région du cerveau. L’hétérogénéité des causes de ces thromboses, la complexité et la sensibilité du cerveau font encore de l’AVC une pathologie complexe à traiter et des règles standards de traitements sont difficiles à établir. La première action thérapeutique consiste à rétablir le flux sanguin le plus rapidement possible afin d’éviter des séquelles irréversibles. Le traitement de référence reste le même depuis les années 1980 ; l’injection d'un médicament qui entraine la destruction du caillot. Toutefois, les critères d’inclusion des patients restent très limités, notamment à cause des effets secondaires: saignements, toxicité cérébrale. Le but de ce projet est d'étudier des nanoparticules (particules de taille nanométrique) pour apporter des médicaments directement au caillot, et ainsi éviter ces effets secondaires et diminuer les doses employées. Ce projet expérimental regarde spécifiquement l'innocuité du traitement proposé avec les nanoparticules et leur devenir dans le corps après injection.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, l'absence de toxicité d'un nouveau traitement pour les AVC dus à des caillots sanguins pourra être évaluée, avec en particulier: la mise à disposition des médecins d'un traitement plus complet pour résorber les caillots à l'origine de l'accident, avec une minimisation des effets secondaires (saignement, toxicité cérébrale), une diminution des doses employées et donc une utilisation potentielle pour plus de patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique par voie intraveineuse de nanoparticules sous anesthésie de l'animal (durée inférieure à 10 min), puis après un temps fixé (1 h, 3 h ou 24 h), les animaux seront euthanasiés pour observer la biodistribution des nanoparticules (c'est-à-dire leur distribution dans leurs organes).

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles sont une douleur liée à l'injection, une toxicité éventuelle des nanoparticules, ou une éventuelle inflammation dans les organes responsables de l'élimination des nanoparticules: rein, rate, foie, poumon.

Devenir

Afin de pouvoir observer la distribution des nanoparticules dans les différents organes des animaux, ceux-ci doivent être euthanasiés pour récupérer leurs organes et réaliser l'analyse des tissus biologiques.

Remplacement

Des expériences préliminaires visant à déterminer l'innocuité de ces nanoparticules ont été réalisées, incluant des tests sur cellules humaines ainsi que des sur des globules rouges humains, et ne permettant pas de déceler de toxicité. Ces expériences apportent donc une première réponse au regard de la toxicité sans utiliser d'expérimentation animale. Il n'existe cependant pas de moyen permettant de déterminer une toxicité dans un organisme vivant complexe ainsi que la distribution des nanoparticules dans les organes avec ces premières expériences. Ce projet nécessite donc l'utilisation de modèles animaux pour les étudier.

Réduction

Des études préliminaires ont permis de déterminer les doses de nanoparticules à injecter pour garantir un effet thérapeutique, et permettent donc de ne sélectionner que deux doses à tester dans ce projet, réduisant donc le nombre d'animaux à utiliser. Pour anticiper une éventuelle mortalité du traitement, un nombre maximum de 8 animaux par groupe est prévu comme le minimum nécessaire pour garantir au moins 5 animaux utilisables par groupe et donc garantir la représentation de la variabilité inter-individus.

Raffinement

Avant la procédure: le temps d'acclimatation des animaux sera d'une semaine. Les animaux bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de bien-être et l'absence de signes de stress ou de détresse. Durant la procédure, les animaux seront placés sous anesthésie pour l'injection de nanoparticules. Après réveil, les animaux seront remis dans leur cage, et une vérification visuelle une heure après procédure du site d'injection sera effectuée (absence de lésion) et de l'état général de l'animal sera faite en accord avec une grille de score des points limites (critères objectifs pour déterminer le niveau de bien-être ou mal-être des animaux). Les animaux seront finalement sacrifiés sous anesthésie et le prélèvement sanguin réalisé post mortem pour minimiser les gestes sur l'animal vigile.

Choix des espèces

Les expériences de biodistribution chez la souris sont abondamment décrites dans la littérature scientifique pour des injections intraveineuses de nanoparticules, en particulier pour l'utilisation de nanoparticules à but thrombolytique (c'est-à-dire visant à détruire un caillot sanguin) dans le cadre de maladies cardiovasculaires. les animaux utilisés seront adultes (5-8 semaines), pour obtenir des résultats sur des animaux matures au regard de l'immunité et de la formation des organes, et pertinents vis-à-vis d'une pathologie qui affecte majoritairement des individus adultes.

Confrontées chaque jour pendant dix jours à un mâle sélectionné pour son agressivité, des souris développent l'évitement social, l'anxiété, la perte de motivation et les troubles du sommeil recherchés par le protocole. 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Huit tests comportementaux, cinq semaines d'antidépresseur par voie orale et des séances d'imagerie TEP de soixante minutes sous anesthésie servent à caractériser les altérations du système dopaminergique dans ce modèle de dépression. Le porteur présente la TEP comme une méthode idéale, qui ne nécessite pas la mise à mort et permet la réutilisation des animaux, alors que le cerveau de toutes les souris est prélevé à l'issue.

Objectifs

Les troubles liés au stress tels que le trouble de stress post-traumatique et la dépression sont des maladies souvent chroniques et associées à de fortes incapacités et souffrances qui peuvent avoir un impact dramatique sur la santé, les relations sociales, les performances professionnelles et la vie quotidienne. Malgré ces résultats, les mécanismes cognitifs et biologiques qui sous-tendent leurs causes et leur physiopathologie restent mal compris. De plus, alors que les traitements actuels peuvent généralement être bénéfiques, une part importante des patients est résistante aux traitements actuels. Une explication peut venir du fait que ces troubles comprennent une multitude de profils potentiels et rassemblent donc des patients avec le même diagnostic mais avec une forte hétérogénéité de causes, de processus physiopathologiques et des manifestations cliniques. C’est dans ce cadre que ce projet a été développé et cherche a exploré l’implication de réseaux cérébraux qui ont par le passé été moins étudiés dans ces troubles mais qui pourraient être impliqués à différents niveaux : de la vulnérabilité au stress, à la sévérité des troubles et à la réponse au traitement. L’objectif sera ici de caractériser les altérations du système dopaminergique dans un protocole de stress social chez la souris capable de modéliser la vulnérabilité et la résilience au trouble dépressif et à sa réponse au traitement. En effet le système à la dopamine pourrait être impliqué dans la manifestation de profils cognitif et motivationnels qui sont engagé dans l’adaptation au stress, et des dysfonctions de ce système lors de conditions de stress pourrait potentiellement être à l’origine d’altérations cognitives favorisant ces troubles et la résistance aux traitements. Toutefois, très peu d’articles se sont concentrés sur des marqueurs du système dopaminergique dans ces modèles. A ces fins, nous emploierons une méthode de neuroimagerie non-invasive : la tomographie par émission de positons (TEP) avec des traceurs ciblant 2 composants différents du système dopaminergique : le [18F]LBT-999 et le [18F]-Fallypride. Ces études seront réalisées chez des souris témoins non stressés, et des souris stressées résilientes au stress, susceptibles au stress (= dépressives), la moitié de chaque groupe étant traitée avec un antidépresseur pendant 4 semaines à la suite du modèle de stress social et avant les tests et la séance d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet vont nous apporter des éléments précieux pour compléter et vérifier les hypothèses de l’implication du système dopaminergique et ses altérations dans la dépression, un aspect décisif dans la compréhension de ces troubles et dans l’émergence de nouvelles stratégies préventive, diagnostique ou thérapeutiques. Les résultats obtenus pour cette étude, vont également nous permettre de prendre des décisions sur les stratégies à suivre dans nos futurs projets de recherche. Par exemple, l’utilisation de nouvelles technologies d’imagerie calcique miniaturisée nous permettant d’enregistrer l’activité calcique mais également en parallèle l’activité de la dopamine. Le but sera de déterminer au niveau neuronal la précision de l’activation du signal dopaminergique dans l’adaptation comportementale et cognitive dans des tâches de mémoire et de stress. La finalité étant de comprendre comment le système dopaminergique et sa précision d’activité est altérée dans la dépression. Et enfin, cela nous permettra de voir si l’on est capable de rétablir un fonctionnement normal de ces processus dopaminergiques par différents traitements.

Procédures

Mise en contact de mâles et femelles pour la sélection de mâles agressifs pendant 5 à 10 minutes par jour pendant 10 jours ; 8 tests comportementaux seront réalisés 2 seule fois par animal et durent entre 5 ou 30 minutes suivant le test ; un traitement antidépresseur sera administré par voie orale 1 fois par jour pendant 5 semaines ; Les souris seront anesthésiées par voie respiratoire pour les imageries TEP qui durent environ 60 minutes ; Certaines souris seront ensuite perfusées sous anesthésie générale ce qui entrainera leur mort.

Impact sur les animaux

Modèle de stress sociale : Le risque principal de ce modèle est un stress et dominance physique sur la souris lors de l’interaction avec une souris dominante (En cas de blessure, la souris est prise en charge par les expérimentateurs) Nous attendons également des répercussions psychiques et observables sur le comportement de la souris et permettant de modéliser la dépression : Augmentation des comportements de type évitement social et anxiété, persistance tout au long du protocole et quelques semaines après la fin. Perte de motivation ou plaisir, altération du poids et troubles du sommeil.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle. Si les résultats de l’imagerie TEP ne montrent pas d’effet du modèle alors la deuxième partie du projet utilisant un antidépresseur ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire (injection de sérum physiologique pour l’hydratation, nourriture appétente). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. La neuroimagerie TEP est une méthode de nécessitant pas de mise à mort des animaux, c’est une méthode idéale permettant un suivi longitudinal et une réutilisation des animaux dans une autre expérience. Cette procédure est intégralement réalisée sous anesthésie afin de diminuer le stress que pourrait engendrer le dispositif. De plus, cette procédure est réalisée en collaboration un personnel hautement spécialisé dans l’imagerie TEP sur petit animal.

Choix des espèces

Le choix de la souris est un modèle pertinent pour notre problématique. L’étude du cerveau de la souris s’avère être un modèle très puissant pour l’étude des fonctions cognitives, troubles mentaux du cerveau humain. En effet, il y a une grande homologie génétique dans le développement du cerveau, se traduisant également par une analogie des aires cérébrales et des mécanismes neurobiologiques. Dans cette étude nous utiliserons de souris adultes.

Des dispositifs médicaux injectables, solutions aqueuses plus ou moins visqueuses, sont implantés sous la peau ou dans le derme de rats, de lapins et de porcs pour en évaluer la tolérance locale et la résorption, en vue de leur marquage CE. 300 animaux non-humains, 200 rats, 50 lapins et 50 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des injections sous anesthésie générale, des prises de sang possibles jusqu'à une par semaine pendant un mois puis plus espacées, et jusqu'à 20 biopsies de peau sous anesthésie générale chez les porcs. La plupart sont tués pour prélever les sites d'injection, une partie des porcs biopsiés peut être gardée en vue d'une réutilisation, et 10 des 300 animaux non-humains sont déclarés réutilisés. Le porteur écrit que l'emploi de ces espèces est "rendu obligatoire par le règlement Européen", et prévoit aussi des "études non réglementaires".

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables, ainsi qu'au comportement de ces derniers au sein des tissus, notamment en ce qui concerne leur résorption et leur intégration.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits.ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatiblesen solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme 10993-6. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

23 295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par Mycobacterium tuberculosis par voie intranasale, elles reçoivent ensuite des composés par gavage, jusqu'à quatre fois par jour, cinq à sept jours par semaine, pendant seize semaines au maximum, et jusqu'à sept prélèvements sanguins caudaux dans une même journée. Le porteur annonce des signes cliniques légers à modérés, perte de poids, prostration, poils hérissés, alopécie, et la mise à mort des souris qui perdent 20 % de leur poids ou présentent au moins trois de ces signes. Ce chiffre de 23 295 animaux couvre, écrit-il, "environ 125 études" de criblage de composés antituberculeux menées pour un consortium.

Objectifs

L'objectif global des institutions de santé et de recherche représentant les forces de lutte contre la tuberculose, est d’identifier de nouveaux traitements innovants et de trouver des solutions de santé plus adaptées pour contrer la menace croissante de la tuberculose. Par conséquence, il existe une demande croissante pour le développement et le criblage des bibliothèques de nouveaux composés antituberculeux, en amenant jusqu’au phases cliniques les combinaisons les plus intéressantes. Les études d'infection bactérienne chez l'animal sont documentées dans la littérature et sont essentielles pour démontrer l'efficacité des composés antibactériens résultants des criblages In Vitro de ces composés. Notre objectif est de sélectionner les nouveaux composés qui présentent une meilleure activité in vitro contre la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et de les faire évoluer dans la « pipeline » de développement d’antibiotiques dans le cadre des tests précliniques. Le but global est, donc, d’identifier les composés les plus efficaces par une validation préclinique en modèle animal d‘infection par Mtb. La recherche préclinique permet également d'évaluer la pharmacocinétique et la toxicité des nouvelles drogues dans des conditions d'infection bactérienne. Ces modèles permettent aussi de déterminer les combinaisons de composés et de leurs doses optimales, des schémas de traitement et voies d’administration plus adaptées pour la transposition ultérieure sur les essais cliniques chez l’homme. Dans ce projet nous utiliserons la souris infectée par Mtb comme modèles pré-clinique de tuberculose dans le but d’évaluer l’efficacité des combinaisons de nouveaux composés anti-Mtb potentiellement plus efficaces que les combinaisons d’antibiotiques existants. L'évolution de l'infection par Mtb chez la souris peut être aiguë ou phase chronique, chacune ayant un profil pathologique et histologique distincts. La souris est l‘espèce, "gold standard" utilisée pour tester la chimiothérapie contre la tuberculose. De plus, la caractérisation de certaines cibles cellulaires impliquées dans le mécanisme d’action, l’efficacité thérapeutique et prophylactique des nouveaux traitements et des candidats vaccins peut nécessiter l'utilisation de souris transgéniques.

Bénéfices attendus

Ce projet a commencé en juillet 2019, ayant des procédures d'expérimentation animale approuvés par les instances éthiques concernés, et a déjà permis de grandes avancées pour les traitements anti-tuberculose. Le consortium a été créé dans le but d'introduire dans les essais cliniques de nouvelles combinaisons de médicaments antituberculeux afin de réduire de manière significative la durée du traitement de la tuberculose sensible aux médicaments. L'un des axes de travail prioritaires est l'évaluation de l'efficacité de nouvelles combinaisons de médicaments antituberculeux dans des modèles précliniques de tuberculose. De plus, ce projet soutient la recherche de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement de la tuberculose. Ces modèles comprennent des modèles de souris immunocompétentes infectées à la tuberculose. L'analyse des données historiques de ces modèles, ainsi que des données cliniques disponibles, indique l'utilité de ces données précliniques pour prédire le temps relatif de guérison clinique des combinaisons de médicaments antituberculeux. La justification du renouvellement de ce projet s’insère dans l’objectif global, qui vise à choisir les meilleurs composés ayant démontrés une activité anti-tuberculose important in vitro et la continuité de les évaluer en phase préclinique. Il permet également d'évaluer la pharmacocinétique, et la sécurité des nouvelles drogues dans des conditions d'infection bactérienne. Ces modèles permettent aussi de déterminer les combinaisons de composés et de leurs doses optimales, des schémas de traitement et voie d’administration plus adaptées pour la transposition ultérieure sur les essais cliniques chez l’homme. Cette justification a été approuvée par les instances dirigeantes de notre établissement ainsi que par celles de nos partenaires, et repose également sur des données solides issues de la littérature scientifique ainsi que les données collectées par le groupe dans les études précédentes. Ainsi nous contribuerons à fournir des traitements innovants et à trouver des solutions de santé adaptées pour contrer la menace croissante de la tuberculose.

Procédures

Au cours des études de manière générale les gestes techniques suivants sont réalisés au cours des procédures : • Infection (1 fois, 1min) intra-nasale sous anesthesie flash • traitement : Injection de composés : - Si voie orale : gavage de 1 à 4 fois par jour (30s par administration) 5 à 7 jours par semaine pendant 1 à 16 semaines maximum sur animal vigil - Si voie intra-veineuse : de 1 à 2 fois par semaine (vigile ou sous anesthésie, 3min) pendant 8 semaines maximum - Si voie intraperitonéale ou sous cutanée sur animaux vigile : quotidienne (30s), de 1 à 3 fois par semaine pendant 8 semaines maximum - Si voie intra-nasale ou intra trachéale 1à 4 fois par semaine (3min par administration) ou 1 fois tous les 3 ou 4 jours pendant 2 semaines - Intramusculaire 1 fois (2min) sur animaux anesthésié • l’efficacité des traitements est evaluée en mesurant la charge bactérienne dans le poumon ou autre tissu : Mise à mort : anesthésie de l’animal (5 minutes) puis mise à mort (qq secondes) • Prélèvements sanguins : Des prélèvements sanguins pourront être réalisés dans certaines études à la veine caudale (20µl) : 3 à 7 prélèvements maximum par jour sur une journée ; Des prélèvements de sang terminaux peuvent être réalisés par voix intracardiaque transcutanée sous anesthésie (1 fois, 1min).

Impact sur les animaux

Le design d’étude implique les nuisances suivantes pour les animaux : - L’infection qui se fait principalement par administration intranasale sous anesthésie (léger) - Les traitements : qui sont principalement par gavage de 1 à 4 fois par jour sont effectués par des personnes parfaitement formées afin de réaliser un geste précis et rapide afin de limiter la géne. (Acte léger, mais modéré par le cumul) - Manipulation pour pesée 1 à 3 fois par semaine, qui peut entrainer un stress pour les animaux (léger) Manipulation pour Microsampling peut entrainer une gêne et un stress (léger à modéré selon le nombre de prélèvements). Le geste est réalisé le plus rapidement possible afin de limiter les nuissance et en respectant les volumes et fréquences recommandées par le comité éthique. L'infection par la tuberculose chez la souris est rapportée comme indolore. Le développement de la pathologie chez la souris n’engendre pas normalement de signes cliniques. Cependant la réaction inflammatoire et la charge bactérienne au niveau pulmonaire dans la forme aigüe peuvent entrainer une perte de poids, une baisse de l’état générale, une hypoactivité, voire de la prostration, de l’alopécie, poils hérissés, à un certain stade d’avancement de la maladie. Dans nos études, ces signes restent légers à modéré par l’application de Points-limite anticipés adaptés. Si l’infection est contenue, la souris développe une forme chronique, et ne présente aucun symptôme. Dans ce projet, par les connaisances des différents modèles et l’évolution de la maladie (charge bactérienne), les designs sont adaptés afin de limiter les situations où les animaux développent des signes cliniques. De plus, dans les cas rares de modèle ou il y a développement aigue de la maladie, une surveillance renforcée est mise en place dans des potentielles périodes critiques afin de limiter la soufrance des animaux. De plus, comme les traitements peuvent diminuer le développement de la maladie et donc limiter l’apparition de potentielles nuisances chez l’animal, dans certain modèle (aigue) quand le design le permet le groupe non traité ou véhicule n’est pas inclus avec l’objectif de raffinement et reduction).

Devenir

L’évaluation de l’efficacité des composés se fait par l’analyse de la charge bactérienne dans les tissus. La nécessité de prélèvements d’organes en fin d’étude dans le design d’étude ne permet pas de garder les animaux. À la fin de chaque étude, les animaux utilisés seront euthanasiés.

Remplacement

Mise en œuvre des 3R : Les expériences sont conçues dans le respect des règles des 3R, avec les stratégies suivantes de Remplacement : a) Suppression des tests obsolètes ou redondants, comme la détermination de la dose maximale tolérée de produits administrés, puisque la dose choisie pour chacun de ces composés est determiné au préalable dans des modèle in vitro et différents modèles animaux, including PK, y compris la souche de souris, sans observation de signes de toxicité. b) Jusqu'à présent, aucune méthode respectant pleinement les exigences réglementaires des pays destinataires des produits n'a été mise au point pour remplacer complètement l'utilisation d'animaux dans les procédures expérimentales décrites. En effet, les nouveaux médicaments développés peuvent cibler directement le micro-organisme en le tuant en inhibant des cibles essentielles à sa survie ou en diminuant sa virulence ou cibler l’hote afin de favoriser l’élimination du pathogène par le système immunitaire. A ce jour, aucune methode in vitro de remplacement n’a été mise au point afin de mesurer la virulence et l’impact de la réponse immunitaire.

Réduction

Les expériences sont conçues dans le respect des règles des 3R, dont la Réduction. Bien que ces modèles soient largement publiés avec principalement de 4-8 animaux par timepoints en fonction du design et de l’espèce animale. Le schéma expérimental des tests de ce projet a fait l’objet d’une revue par des biostatisticiens afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux à utiliser tout en permettant un support au dossier réglementaire CTD (Common Technical Document). Ce qui a confirmé le nombre d’animaux utilisés. De plus, à chaque nouvelle étude, le nombre de timepoints, le nombre de groupe et le nombre d’animaux est adapté en fonction des connaissances sur les modèles et composés testés. Pour les nouveaux produits avec potentiel efficacité anti-Mtb, le développement et la validation d'essais in vitro permet d’identifier les composés le plus actifs et de réduire la quantité de composés à être testés in vivo. Certains designs d’étude permettent d’éviter l’utilisation de groupe témoin non traité et «groupe véhicule» ; ce qui permet encore de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’efficacité des composés n’est comparée qu’au groupe contrôle positif. En fonction du design, avec ce nombre d’animaux, nous pourrions faire environ 125 études toutes procédures confondues.

Raffinement

Enfin, la strátégie 3R utilisé pour le Raffinement pour les expériences : a) Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages, au maximum 6 animaux par cage, contenant des dispositifs d’enrichissement, dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé et compétent. b) Raffinement des manipulations pour limiter le stress des animaux : Les experimentateurs sont formés afin d’appliquer les méthodes dans les conditions les moins contraignantes pour les animaux (préhension (soft handling), gavage rapide par personnes expérimentées). Toute manipulation considérée comme invasive et/ou stressant pour l’animale sera faite sous anesthésie. c) Les signes cliniques seront observés quotidiennement : perte de poids, érection des poils et altération de la posture, isolement, vocalisation lors de la manipulation, positionnement des vibrisses. Si les animaux présentent une perte de poids de jusqu'à 10%’ par rapport à son poids initial, une observation renforcée sera faite et l’apport hydrique en gel ou de nourriture sera ajouté au fond de la cage afin de faciliter l'accès des animaux à l'eau et la nourriture. Si les animaux présentent au moins trois de ces signes, ou une perte de poids jusqu’à 20% l’animal sera sacrifié.

Choix des espèces

L’animal de laboratoire permet de mimer au mieux les caractéristiques de la pathologie chez l’homme. Bien qu'il n'existe pas de véritable réservoir animal pour Mycobacterium tuberculosis, de nombreuses espèces animales sont susceptibles d'être infectées, dont la souris, le lapin et le cochon d'Inde. La souris Mus musculus présente plusieurs avantages comme modèle d’infection par Mtb. Sa facilité de conservation, d'élevage et de reproduction, la vaste collection de souches consanguines représentant une population de clones génétiques, et les outils scientifiques et de santé plus disponibles, adaptés, et transposables à l’homme permettent une analyse solide des données expérimentales. Les souris sont âgées de 4-6 semaines à la livraison, et au moins 6 semaines à l’infection afin d’avoir un système immunitaire mature avec un poids autour de 20 grammes afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Il s’agit de rongeurs matures et adultes.

L'évaluation porte sur deux molécules fournies par l'industrie, l'une déjà autorisée hors de France et l'autre en essais cliniques, avec l'objectif annoncé d'un passage rapide en clinique. 250 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans la veine de la queue des cellules leucémiques prélevées sur des patients, puis jusqu'à neuf prises de sang hebdomadaires et quatre semaines de traitement incorporé aux croquettes, avant qu'une centaine d'entre elles ne serve de receveuse pour une deuxième greffe. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'évaluer l'effet des molécules sur les cellules souches leucémiques, ce qui impose selon lui cette greffe secondaire.

Objectifs

Ce projet vise à l’évaluation préclinique d’un nouveau médicament pour le traitement des leucémies aiguës myéloïdes. Les leucémies aigües myéloïdes touchent environ 3 500 personnes chaque année – dont une centaine d’enfants – et constituent un défi majeur pour les médecins. Les taux de survie n’ont que modérément évolué ces vingt dernières années. La prise en charge des patients repose actuellement sur la chimiothérapie, en association avec la greffe de moelle osseuse mais le pronostic global reste mauvais en raison de la fréquence élevée des rechutes. Ces rechutes sont causées par la persistance des cellules souches leucémiques insensibles aux thérapeutiques actuelles. Le développement de nouvelles thérapies permettant de cibler ces cellules est donc un enjeu majeur pour la prise en charge de cette maladie . Ce projet scientifique consiste à évaluer l’efficacité in vivo (sur un modèle murin de la maladie) d’une thérapie ciblant spécifiquement ces cellules. Cette thérapie, basée sur l’administration de deux molécules, a été testée au préalable sur des modèles d’étude in vitro et a montré une très bonne efficacité. Le premier objectif de ce projet est de mettre en place le modèle de leucémie aiguë myéloïde, pour cela des cellules issues de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde seront injectées à des souris (modèle murin de leucémie aiguë myéloïde). A l’issue de cette expérience, deux modèles seront sélectionnés. Le deuxième objectif est d’évaluer l’efficacité anti-leucémique, pour cela les deux molécules seront administrées aux deux modèles murins de leucémie aiguë myéloïde. Les deux molécules seront administrées seules ou en association pendant un maximum de 4 semaines contre placebo. Le troisième et dernier objectif est de tester l’efficacité des traitements sur le contingent de cellules souches leucémiques. Pour cela les cellules médullaires issues de souris greffées avec des cellules leucémiques de patients et traitées avec les nouvelles thérapies le traitement de référence de cette maladie ou le placebo (5 bras de traitement) seront réinjectées à de nouvelles souris. Celles-ci ne seront pas traitées et la survenue ou non d’une rechute de la maladie sera monitorée.

Bénéfices attendus

La leucémie aiguë myéloïde est une maladie qui peut survenir à tout âge, mais seulement 25 % des cas sont diagnostiqués avant 25 ans. C'est surtout après 40 ans que la fréquence de la maladie augmente, l'âge moyen au moment du diagnostic étant de 65 ans. Le pronostic est particulièrement défavorable pour les personnes diagnostiquées plus tardivement. Plus âgées et pouvant présenter certains problèmes de santé, elles ne peuvent pas bénéficier d’un traitement intensif (chimiothérapie et greffe de moelle osseuse) qui leur serait défavorable car trop toxique. Le mauvais pronostic de la pathologie est également dû à la fréquence élevée des rechutes, ceci dans tous les groupes d’âge. Ces rechutes sont dues aux cellules souches leucémiques, un sous type de cellules cancéreuses qui est peu sensible à la chimiothérapie conventionnelle et peut donc persister dans l’organisme après traitement, permettant à la maladie de se développer à nouveau après une période de rémission. Le développement de thérapeutiques alternatives moins toxiques et ciblant plus efficacement les cellules souches leucémiques est donc nécessaire. Les deux molécules candidates pour ce projet sont des composés qui, pour le premier a déjà obtenu une autorisation de mise sur le marché dans le monde (hors France) et pour le second, est testé actuellement dans des essais cliniques (sur l’humain) dans différents cancers dont des cancers du sang. Si l’association montre son efficacité dans le modèle murin de leucémie aiguë myéloïde utilisé pour cette étude, ce projet pourra donc rapidement donner lieu à des essais cliniques chez l’humain. Nos expériences pourraient donc participer au développement de nouveaux médicaments pour traiter la leucémie aiguë myéloïde.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection pour chaque animal (animal vigile, contention simple) de cellules leucémiques humaines dans la veine de la queue. Cette intervention ne dure que quelques minutes au maximum en tenant compte du temps de dilatation des veines par la chaleur. - des prélèvements de sang : la prise de greffe sera évaluée sur des prélèvements de sang hebdomadaires qui seront effectués à partir de la huitième semaine post-greffe et ce au maximum jusqu’à 16 semaines, soit 9 prélèvements maximum. Cette intervention dure moins d’une minute. - un traitement par voie orale d’une durée maximale de 4 semaines, les molécules étant incorporées dans les croquettes

Impact sur les animaux

L’injection dans la veine de la queue de la souris et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale engendrent du stress et de la douleur chez la souris. Le développement de la leucémie chez l’animal peut entraîner l’apparition d’un affaiblissement et/ou une perte de poids chez l’animal. Certains des médicaments utilisés (traitement standard de la leucémie aiguë) peuvent diminuer le nombre de globules blancs, le nombre de globules rouges et de plaquettes chez la souris.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, le développement de la leucémie ne permettant pas de les garder en vie. Ce développement n’est pas réversible et entrainerait la mort des animaux.

Remplacement

Le projet scientifique porte sur l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie ciblée (association de deux molécules candidates) sur un modèle de souris mimant le développement de la leucémie aigüe myéloïde. Il s’agit du modèle in vivo classiquement utilisé pour les leucémies aiguës myéloïdes et plus largement pour les cancers de la moelle osseuse et du sang afin de valider l’étape préclinique. Un modèle in vitro ne peut pas remplacer le modèles in vivo car il ne reproduit pas la caractéristique systémique de cette maladie humaine (qui se traduit par une atteinte de tous les organes qui fabriquent les cellules sanguines). De plus, le maintien d’un modèle in vitro basé sur l’utilisation des cellules de patients se révèle impossible sur la durée, la survie de ces cellules étant limitée dans le temps car n’ayant pas le microenvironnement nécessaire pour leur maintien. Par ailleurs, l’effet de l’environnement des cellules souches leucémiques s’avère fondamental dans le développement des leucémies aiguës myéloïdes, dans l’apparition d’éventuelles résistances et dans l’effet de la leucémie aiguë myéloïde sur l’hématopoïèse normale (processus à l’origine de la production des cellules sanguines). Les effets de cet environnement ne peuvent être pris en compte dans leur globalité que dans un modèle in vivo. Les cellules souches leucémiques représentent une petite fraction des cellules leucémiques, elles sont définies par leur capacité à redonner naissance à la leucémie quand elles sont injectées à des souris, capacité que ne possède pas la majorité des cellules leucémiques. Les cellules souches leucémiques sont à l’origine des rechutes de la maladie observées chez les patients. L’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments sur les cellules souches leucémiques n’est donc possible que dans un contexte de greffe secondaire après l’étape de traitement qui a lieu lors de la greffe primaire. Il n’est donc pas possible de mettre en place des méthodes de substitution qui évitent l’emploi de modèles animaux pour ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé à chaque étape (10 souris/condition) est nécessaire étant donné la variabilité de la prise de greffe d'une souris à l'autre, il est suffisant pour exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats de l’expérience et permet d’obtenir un nombre suffisant pour réaliser une analyse statistique fiable. Si la prise de greffe était plus homogène qu’attendu dans la première étape du projet, le nombre d’animaux nécessaire à la seconde étape serait réduit. Lors de la première étape 5 échantillons de cellules leucémiques, issus de 5 patients différents, seront testés soit un total de 50 souris, car toutes les cellules issues de patients ne se greffent pas dans les souris. Lors de la deuxième étape, l’efficacité des molécules candidates sera testée dans 2 des modèles établis à l’étape précédente, sur la base de groupes de 10 souris, cette étape nécessite 100 souris. A l’issue de cette étape, afin d’évaluer l’efficacité des molécules sur les cellules souches leucémiques, une greffe secondaire sera pratiquée, les cellules d’une souris traitée (molécule(s) ou placebo) devant être réinjectées à une autre souris, cette étape nécessite également 100 souris, soit un total de 250 souris pour le projet. Il est indispensable d’évaluer l’efficacité des molécules sur ces cellules souches leucémiques, car elles sont à l’origine des rechutes de la maladie après une période de rémission. Ces cellules souches leucémiques étant définies comme des cellules étant capables de redonner naissance à la maladie après greffe dans des souris, il est nécessaire pour évaluer l’efficacité sur ces cellules souches leucémiques de réaliser une deuxième greffe.

Raffinement

Les différentes procédures envisagées ne nécessitent qu'une simple contention de l'animal car elles sont peu douloureuses, elles ne nécessitent donc pas d'anesthésie locale ou générale. Des éléments d’enrichissement du milieu seront mis à la disposition des souris: coton, litière papier pour la confection de nids. Les traitements seront administrés per os avec les croquettes pour éviter la souffrance liée au gavage. En sus des points de surveillance habituels, dans le cadre de ce projet, seront surveillés une fois par semaine dès le début du projet: les points d'injection, les points de ponction, le bilan sanguin. Des points limites spécifiques à cette expérience ont été définis afin d’éviter toute souffrance chez les animaux.

Choix des espèces

La connaissance approfondie du modèle de souris fait de cette espèce, une espèce de choix dans la réalisation d’une étude préclinique et permet d’obtenir des données reflétant les interactions physiologiques de l’organisme vis à vis des molécules candidates testées dans ce projet. Ce projet a été initié dans le respect de l’éthique et de la sensibilité de l’animal. De nombreux modèles de souris immunodéprimées peuvent accepter les greffes de cellules humaines. Le modèle souris immunodéprimée que nous avons choisi représente le modèle le plus adapté aux transplantations de cellules leucémiques humaines car la greffe ne nécessite pas d'irradiation préalable de l'animal et elle représente le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine. Ces animaux ne présenteront pas d’atteintes physiques et/ou comportementales sévères dans le cadre de ce projet car, et bien que ne présentant pas de système immunitaire fonctionnel, ils seront élevés en portoirs ventilés et changés sous hotte. Les animaux utilisés seront des souris adultes entre 6 et 10 semaines en conformité avec les données de la littérature pour ce type de modèle.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections sous-cutanées et trois injections rétro-orbitales sous anesthésie déclenchent chez elles une maladie qui reproduit la sclérose en plaques, avec une paralysie qui commence par la queue et gagne les membres postérieurs, et des douleurs neuropathiques possibles. Les animaux sont pesés et notés trois fois par semaine jusqu'à la perfusion intracardiaque terminale qui permet de prélever leur système nerveux central. Le porteur indique que de nouvelles cibles thérapeutiques pourraient en sortir, et affirme que les interactions entre cellules immunitaires et leur microenvironnement ne peuvent pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux central. Une dysfonction du système immunitaire y entraine des lésions qui provoquent des perturbations motrices et sensitives. La prise en charge thérapeutique des patients est à ce jour imparfaite. La maladie est médiée par une population de globules blancs spécifique, et il a été proposé que deux nouvelles protéines d’intérêt sont nécessaires au fonctionnement de ces cellules et donc au développement de la maladie. L’objectif de ce projet est de comprendre à l’échelle cellulaire et moléculaire comment ces protéines interviennent dans la biologie de cette population de cellules pathogéniques. Cette étude se fera en utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes et les mécanismes de la maladie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre non seulement de mieux comprendre les mécanismes contribuant au développement de la sclérose en plaques, mais aussi de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutique pour le traitement de cette maladie.

Procédures

-3 injections par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse isofluorane (2*5 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -3 injections par voie intra-veineuse rétro-orbitale sous anesthésie isofluorane (2*2 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -1 perfusion intra-cardiaque terminale sous analgésie et anesthésie médicamenteuse (3 minutes/souris)

Impact sur les animaux

Les injections permettant l’induction de la maladie peuvent induire une douleur légère (traitée par analgésiques). Les symptômes de la maladie se manifestent par une paralysie progressive, commençant par la queue, puis les membres postérieurs et enfin les membres antérieurs. Dans notre animalerie, la sévérité se limite à la paralysie des membre postérieurs. Comme chez l’homme, la maladie peut être associée à des douleurs neuropathiques. Après avoir atteint le score maximum, les animaux entrent dans une phase de rémission (variable, de partielle à complète). Les scores cliniques et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever le système nerveux central et les ganglions lymphatiques pour analyses.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats.

Raffinement

Certaines procédures peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un antalgique (buprénorphine). Un suivi adapté et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée et des injections de glucose, pourront être utilisés.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de sclérose en plaques, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle pathogénique des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire et reflète la maladie humaine qui se déclare généralement chez de jeunes adultes. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

Nourries douze semaines avec un régime riche en graisse additionné de poudre de baies de goji ou de lentilles, 72 souris mâles subissent une prise de sang sous contention à la sixième semaine, un test de tolérance à l'insuline à la neuvième, un gavage de glucose à la dixième et un gavage de mesure de perméabilité intestinale à la onzième. Trois recueils de fèces les isolent chacun une trentaine de minutes, les tests de tolérance deux heures. Le porteur reconnaît un stress social lié à ces isolements et des douleurs possibles lors des prises de sang, du marquage, du gavage et de l'injection intrapéritonéale, puis écrit qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole. Toutes sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'effet de la supplémentation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré.

Objectifs

L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact des conditions de production et des traitements post-récolte sur la qualité nutritionnelle des fruits ou des légumineuses et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Plusieurs travaux rapportent un effet protecteur des fruits ou des légumineuses vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. Pour évaluer les effets santé des fruits ou légumineuses et l'impact des conditions de cultures et de traitements post-récolte, nous comparerons des baies de goji cultivées en plein champ ou en serre (effet des condition de productions), consommées fraiches ou séchées (effet du traitement post-récolte). L'effet des conditions de cultures sera également étudié sur des lentilles (légumineuses) cultivées soit en sol riche en bactéries soit en sol pauvre (effet des conditions de culture). Les différentes modalités de fruits ou légumineuses seront lyophilisés puis administrés à des souris males durant 12 semaines, dans le cadre d'une alimentation riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé. Les données obtenues permettront d'avancer dans la connaissance et l'objectivation de la contruction de la qualité nutritionnelle des productions végétales et de leurs effets sur la santé métabolique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’impact des conditions de culture (plein champ vs serre, et impact du microbiote du sol) et des traitements post-récolte (frais vs séchés) sur la baie de goji et la lentille et leurs effets sur la santé métabolique des souris et de leur microbiote. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer et de mieux caractériser les effets santé de ces aliment dans le cadre de pratiques agricoles plus responsables.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérence au glucose, et une injection intrapéritonéale lors du test de tolerance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'hébergement individuel de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au gloucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors des prises de sang, pour l'identification des animaux, lors du gavage et lors de l'injection intrapéritonéale. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Deux protocoles indépendants ont été regroupés en un meme protocole afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.