Procédures modérées
Caractérisation des connexions synaptiques de deux régions du cerveau, le thalamus associatif et l’epithalamus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour prélever le cerveau, 4 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, dont 545 en souffrance sévère. Presque toutes subissent une biopsie de la queue vers six jours pour le génotypage, un groupe une chirurgie cérébrale d'environ une heure, et un sous-groupe des tests comportementaux de quinze à quatre-vingt-dix minutes. Le porteur indique exposer certains animaux à un stimulus provoquant "un état de peur inévitable", et un lot à des stimuli dont la peur persiste plusieurs jours, sans nommer aucun de ces tests. Les géniteurs sont tués quand ils ne sont plus en âge de procréer, et les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées faute d'usage.
Objectifs
L’objectif de notre étude est de mieux comprendre le fonctionnement de régions complexes du cerveau des mammifères, tel que l'(épi)thalamus. En effet, il a été montré que des défauts de fonctionnement de ces structures contribuent à plusieurs états cérébraux anormaux (anxiété, dépendance aux drogues, états de coma etc) qui pèsent lourdement sur notre société. Afin de progresser dans la connaissance de ces mécanismes, nous utiliserons le modèle murin; celui-ci est en effet idéal puisque les circuits neuronaux de la souris sont proches de ceux de l’homme. Des traceurs ou des virus permettant l'expression de protéines activables à la lumière seront injectés dans le cerveau afin de pouvoir par la suite étudier les connexions des régions d'intérêt. Des analyses sont aussi prévues pour examiner comment la manipulation des synapses détermine in vivo le comportement des souris. Notre hypothèse est que les changements dans la connectivité synaptique des circuits (épi)thalamiques sous-tendent les fonctions cérébrales anormales associées à l'anxiété, à la dépression et à la toxicomanie, et donc que la modulation spécifique de ces connexions pourrait être ciblée pour le développement de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Nous visons à comprendre des mécanismes fondamentaux de fonctionnement de régions du système nerveux central, qui sont impliquées dans plusieurs états cérébraux anormaux. Cette connaissance pourrait nous amener à comprendre aussi comment certaines pathologies se manifestent, en donnant des outils pour développer des approches thérapeutiques.
Procédures
Presque la totalité des es souris utilisées pour ce projet seront soumises à une biopsie de la queue pour le génotypage, faites vers 6 jours. Un groupe des souris utilisées pour ce projet sera soumis à une procédure chirurgicale d'une durée d'environ 1 heure par animal. Un sous-groupe sera soumis une fois à des tests comportementaux d'une durée comprise entre 15 et 90 minutes, pour étudier les états d'anxiété et de stress des animaux.
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue pour le génotypage n'entraine qu'une douleur légère et de courte durée. De plus, un groupe de souris sera soumis à une procédure chirurgicale qui pourrait engendrer une douleur d’intensité modérée. Certains animaux seront exposés à un stimulus stressant important engendrant un état de peur inévitable. Ces tests sont nécessaires au déroulement de notre projet qui vise précisément à étudier les modifications des circuits synaptiques suivant l'exposition à des conditions de stress et d'anxiété de brève durée. Un lot d'animaux sera exposé à des stimuli provoquant une peur qui persiste plusieurs jours.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement du cerveau pour des études post mortem. Les géniteurs seront mis à mort lorsqu'ils ne seront plus en âge de procréer. Également, les souris avec génotype sans intérêt seront euthanasiées parce qu'on ne pourra pas les utiliser ni pour les manipulations expérimentales ni pour la reproduction.
Remplacement
Afin de mieux comprendre le rôle de l'intégration entre l'inhibition et l'excitation dans le fonctionnement des régions du thalamus associatif et de l'épithalamus, il est indispensable d'analyser le comportement et l'activité des connexions synaptiques dans un cerveau pleinement développé. La souris adulte est donc une espèce appropriée pour ce type d'études. En effet, nos procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et est réduit au minimum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Typiquement, une souris pourra être soumise à plusieurs test comportamentaux, ainsi reduisant le nombre d'animaux. Similement, dans certains cas les tranches aiguës préparées pourront être utilisées pour des études morphologiques, ainsi réduisant le nombre d'animaux sacrifiés spécifiquement pour ça.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des cages, dans des conditions d’hébergement contrôlées. L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages et fournis ad libitum. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur de l’animal (anesthésie, analgésie, suivi post-opératoire). Des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s). Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité quotidiennement, par du personnel qualifié y compris les expérimentateurs, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce à des moyens pharmacologiques appropriés.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies pour quatre raisons : - la taille de l’animal qui permet son installation sur les postes d'injection stéréotaxiques et l'utilisation de tranches aigües du cerveau sur des postes d'éléctrophysiologie. - la disponibilité de souches de souris génétiquement modifiées nécessaires à ce projet. - nos études précedentes ont été validées sur des souris. Par soucis de reproductibilité nous souhaitons poursuivre avec la même espèce. -Finalement, il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Nous utiliserons pour nos études des souris adultes (plus de deux mois d’âge), vu notre intérêt à étudier des structures synaptiques pleinement développées.
Le rôle du transport et du métabolisme du fructose dans la sécrétion d’insuline
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour savoir si un transporteur du fructose intervient dans la sécrétion d'insuline, 192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le pancréas, l'intestin et le contenu du cæcum. Chaque animal subit trois gavages de glucose, trois coupures à l'extrémité de la queue et jusqu'à six prélèvements submandibulaires, entre six et dix-neuf semaines d'âge. Un jeûne de six heures précède chaque test de tolérance au glucose, dont le porteur écrit qu'il n'entraîne qu'une baisse modérée de la glycémie. Une perte de poids dépassant 20 %, un poil hérissé, une prostration ou une léthargie de plus de deux jours déclenchent l'arrêt du protocole et la mise à mort de l'animal.
Objectifs
La sécrétion d’insuline est fortement stimulée par le glucose et pas du tout par le fructose lequel représente pourtant 50% des sucres consommés par notre alimentation. Le fructose est structurellement proche du glucose mais est transporté, notamment au niveau de l’intestin, par un transporteur spécifique qui ne transporte que le fructose. Ce transporteur est essentiellement présent dans l'intestin et n'a pas été décrit dans le pancréas. Pourtant chez les souris génétiquement modifiées chez qui ce transporteur n'est pas présent il y a une diminution des taux circulant d'insuline. La découverte d’une nouvelle d’une voie de régulation de la sécrétion d’insuline via ce transporteur semble très importante à caractériser et c'est le but du projet proposé. Ce travail vise à déterminer chez des souris mâles et femelles adultes à quel âge cette diminution des taux circulants d'insuline apparait et quels sont les mécanismes impliqués. Parmi ces derniers, le rôle du transport de fructose sera étudié ainsi que le rôle éventuellement du métabolisme du fructose à la fois dans le pancréas et dans l'intestin, grâce à des modèles de souris spécifiques.
Bénéfices attendus
Le phénotype observé chez les souris chez qui le transporteur du fructose n'est pas présent, à savoir une baisse drastique des taux circulants d’insuline, ressemble à ce qui est observé dans le diabète de type 1 chez l’humain. Le diabète de type 1 représente environ 10% des cas de diabètes en France et dans le monde. Depuis une vingtaine d’années, le nombre de personnes atteintes de diabète de type 1 ne cesse d’augmenter (+ 3 à 4% /an). Les raisons de ces évolutions sont inexpliquées à ce jour, mais certaines modifications de l’environnement et de leurs interactions avec le génome sont suspectées telles que les facteurs nutritionnels ou la modification de la flore intestinale. Bien que le fructose soit suspecté de conduire à la mise en place d’un diabète de type 2 (mise en place progressive de l’insulino-résistance) le rôle de son transporteur dans la sécrétion de l’insuline n’a jamais été étudié. Notre projet permettra possiblement d’identifier une nouvelle voie impliquée dans la régulation de la synthèse et ou la sécrétion de l’insuline.
Procédures
Les 192 animaux vigiles recevront au cours de la totalité de la procédure 3 gavages oraux de glucose (intervention d’une durée inférieure à 5 secondes), 3 petites coupures à l’extrémité de la queue (intervention d’une durée inférieure à 1 seconde) et ils auront au maximum 6 prélèvements submandibualires (intervention d’une durée inférieure à 20 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages pour le test de tolérance au glucose (moins de 5 secondes), la contention permettant de limiter les fausses routes éventuelles, et lors de la contention pour le prélèvement de sang (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à stress lors du passage de leur salle d’élevage à la salle d’expérimentation pour les OGTT. Les animaux seront soumis à une légère douleur de l’ordre de la piqure lors du prélèvement de sang. Les souris seront soumises à un jeun de 6h avant les tests de tolérance au glucose ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (pancréas, intestin et contenu de caecum)
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro ou ex vivo permettant de simuler les interactions inter-organes impliquées dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des paramètres spécifiques à chaque souris (génétique, microbiote, alimentation) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie, insulinémie), des tissus producteurs d’hormones (pancréas) et intestinaux (tissus permettant de stimuler la sécrétion d’insuline via la production de molécules de type hormonales).
Réduction
Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives. De plus, nous avons fait le choix d’utiliser les mêmes groupes de souris ente 6 et 19 semaines et de n’effectuer les prélèvements finaux de tissus qu’à 19 semaines afin de réduire le nombre d’animaux. Des mâles et des femelles seront utilisés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour leur nid, d’un bâton à ronger, d'un abri en propylène rouge et de deux hamacs (limitation des bagarres). Les animaux seront habitués à la contention avant le démarrage des gavages pour limier le stress lors de la procédure expérimentale. Les expérimentions étant effectuées dans une salle différente de la salle d’élevage les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation 1h avant le début des procédures et maintenus dans leur cage d’élevage avec les mêmes congénères afin de réduire le stress. Les animaux seront surveillés visuellement 1 fois par semaine et leur poids mesuré 1 fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de deux jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limites entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie. Les souris seront à plusieurs par cage pour éviter l'isolement et réduire le stress.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et surtout pour décrypter le mécanisme posé ici (rôle du transporteur et du métabolisme du fructose dans la sécrétion d’insuline) nous disposons de modèles génétiques originaux disponibles uniquement chez les souris. A 6 semaines les souris n'exprimant pas le transporteur de fructose étudié ont une insulinémie normale alors qu’elle est diminuée à 16 semaines. Afin de déterminer à quel âge l’la diminution de la synthése d’insuline se produit nous proposons de suivre les animaux ente 6 et 19 semaines d’âge.
Utilisation d’oligonucléotides antisens (ASO) comme approche thérapeutique dans un modèle murin de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Entre une et quatre injections intraveineuses espacées de deux semaines, un prélèvement sanguin, et pour une partie des animaux une chirurgie de vingt minutes suivie immédiatement de la mise à mort avant tout réveil. 1 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Le projet évalue des oligonucléotides antisens contre la dystrophie myotonique de type 1, avec l'objectif déclaré d'amener un composé jusqu'à l'essai clinique. Le porteur écrit que ces souris n'ont "aucun problème à bouger, ni à s'alimenter" et sont "non discernables" des souris non modifiées, tout en en déclarant 610 dans la catégorie de souffrance modérée.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse et fonte musculaire, problème de relaxation), cardiaques (trouble du rythme) et neurologiques, particulièrement invalidantes. Actuellement il n’existe pas de traitement pour cette maladie mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et en essais cliniques chez l’homme. En particulier l’utilisation d’oligonucléotides antisens a montré des résultats très prometteurs. Néanmoins, des défis persistent pour augmenter le potentiel thérapeutique de ces molécules et l’utilisation de modèles animaux qui reproduisent des symptômes moléculaires et fonctionnels de la maladie est cruciale pour ces études. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1, l’efficacité de plusieurs composés thérapeutiques originaux. L'objectif à long terme est d'identifier un composé thérapeutique capable d'aller en essai clinique chez l’homme et à terme devenir un médicament.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 est la maladie musculaire la plus commune chez l’adulte (entre 1 personne sur 2500 et 1 personne sur 8000) et est très invalidante. Il n’existe actuellement pas de médicament spécifique à la maladie. L’attente pour un traitement ciblé est donc très forte. L’objectif principal de ce projet est l’identification d’un composé (oligonucléotide antisens) qui pourrait aller en essai clinique. À long terme, cette étude pourrait ouvrir la voie au développement d'un médicament pouvant théoriquement bénéficier à l'ensemble des patients atteints de cette maladie. Des dérivés des composés que nous allons évaluer, sont actuellement utilisées pour d’autres pathologies soit dans un essai clinique, soit dans les dernières phases d’études toxicologique avant un essai par une compagnie pharmaceutique, démontrant ainsi le fort potentiel de notre projet.
Procédures
Les animaux modèle de la dystrophie myotonique de type 1 n’ont pas de phénotype dommageable et ne montrent que des défauts moléculaires et un défaut très temporaire (de l’ordre de la seconde) de relaxation musculaire qui apparait uniquement lorsque qu’il est induit par le manipulateur. Ces souris n’ont aucun problème à bouger, ni à s’alimenter et sont ainsi non discernables des souris non génétiquement modifiées. Les animaux seront soumis à des injections par voie intraveineuse. Il y aura entre 1 et 4 injections espacées de 2 semaines. Chaque injection prend moins de 5 min par souris. Les souris feront également l'objet d'un prélèvement sanguin. Cette intervention de moins de 5 min ne se fera qu'une seule fois. Enfin, une partie des animaux fera l'objet d'un protocole de mesure de force nécessitant une intervention chirurgicale, d’environs 20 min, sous analgésie et sous anesthésie profonde et qui sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés n’ont pas de phénotype dommageable et n’ont pas de problème à se déplacer ou se nourrir. Ainsi, les seules nuisances ou effets indésirables qu’elles pourraient expérimenter seront liés aux procédures dont elles feront l’objet. Donc les souris pourraient ressentir une douleur de courte durée au point d’injection/prélèvement sanguin et une détresse légère lors des manipulations (comme la mesure du poids chaque semaine à partir du début du protocole ou la contention pour les injections). Les animaux pourraient également subir un stress thermique dû à l’anesthésie. Concernant les effets indésirables dus au traitement, des versions similaires aux composés qui seront évalués dans cette étude ont déjà été injectées dans des modèles murins d’autres pathologies musculaires et n’ont pas montré de signes évidents d’effets secondaires délétères.
Devenir
Tous les animaux qui entreront dans ce projet (soit un maximum de 1330 souris) seront euthanasiés à la fin de la procédure à laquelle ils seront associés. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutique comme celle décrite dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des organes atteints. Dans le cas du modèle murin de la maladie que nous étudions (Dystrophie myotonique de type 1), nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles (et nous devons en vérifier au moins 3 différents par souris) ce qui rend strictement nécessaire l’euthanasie en fin de procédure afin de prélever ces organes. Les marqueurs moléculaires que nous analysons, sont très spécifiques à la maladie et corrèlent très bien avec l'état de sévérité et donc également avec l'efficacité du traitement. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyses de marqueurs sanguins pour déceler une éventuelle toxicité.
Remplacement
Dans un objectif de REMPLACEMENT, une sélection in vitro des séquences dans des modèles cellulaires de la maladie sera effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Cependant les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. L’évaluation in vivo de l’efficacité des composés thérapeutiques nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation observée chez les patients et reproduisent la maladie au niveau moléculaire et surtout physiologique. Ainsi, seuls les composés thérapeutiques montrant une forte efficacité dans les cellules en culture sans effet toxique seront évalués dans les souris.
Réduction
Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaires prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Pour ce projet, nous aurons donc besoin, au maximum, de 1330 animaux. Nos études précédentes (vérifiés par des tests de puissance), nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés, assurer la distribution normale de nos données et effectuer les tests statistiques adéquats pour interpréter de manière fiable les résultats.
Raffinement
Finalement, dans le but RAFFINER le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris, la surveillance quotidienne ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu (par ex. avec des nid de lanière kraft ou des abris en carton). Les animaux sont stabulés dans des conditions optimales en accord avec la législation et l’isolement est évité au maximum. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites (spécifiques à chaque protocole mis en place) ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids importante seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Par ailleurs au cours des différentes procédures, tout acte le nécessitant sera accompagné d’une anesthésie et d’un traitement préventif de la douleur. De plus, une surveillance accrue des animaux sera effectuée pendant une à deux heures après chaque acte.
Choix des espèces
L’efficacité d’une approche thérapeutique pour la Dystrophie Myotonique de Type 1 (DM1) doit être validée sur un modèle animal de cette pathologie. A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrits pour la maladie. Cependant seuls les modèles murins montrent des symptômes robustes (physiologiques et moléculaires) similaires à ce qui est observé chez les patients. L’étude des différents modèles murins a permis la compréhension de plusieurs symptômes observés chez les patients. Aucune mortalité n’est observée. Pour le projet, les souris seront utilisées à l’âge adulte, quand tous les organes, et surtout les muscles, sont bien développés et que la croissance est terminée.
Etude de pharmacocinétique et/ou pharmacodynamie des molécules administrées chez la souris ou le rat avec ou sans utilisation d’inducteurs qui ont pour rôle d’activer un mécanisme d’action relatif au projet ou de mimer un état pathologique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1650
16 800 souris et 1 650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir la formation d'une bulle d'air sous la peau par deux injections sous anesthésie, des administrations de composés jusqu'à deux fois par jour pendant deux semaines par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intra-articulaire, intramusculaire, intranasale ou topique, jusqu'à six administrations d'un inducteur de maladie et trois prélèvements sanguins. Le porteur annonce un maximum de 48 souris ou 40 rats par étude, et 350 études sur souris et 35 sur rats en cinq ans, un compte qui laisse les 1 650 rats déclarés sans justification. Il présente ces travaux de pharmacocinétique comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie.
Objectifs
Les études pharmacocinétique/pharmacodynamie offrent plusieurs avantages dans le développement des médicaments dans les maladies inflammatoires, notamment elles permettent: 1) d’aider à élucider la relation entre la cinétique d’un composé (temps, concentration) et l’effet biologique sur un biomarqueur relié à la cible ou directement sur la cible (temps, effet) 2) de comprendre le mécanisme d’action d’un composé et aider à identifier les propriétés PK pour une amélioration ultérieure et une conception optimale du composé. La modélisation de la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie peut aider à mieux relier la puissance des composés in vitro à la prédiction de l’efficacité in vivo et ainsi réduire le nombre d’études in vivo et à améliorer la translation des résultats des espèces précliniques dans le cadre clinique.
Bénéfices attendus
La connaissance de l’effet biologique sur un biomarqueur d’un produit en fonction de sa concentration chez l’animal permet d’utiliser le meilleur traitement (composé, dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront également de mieux comprendre la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie des composés afin de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
1) Formation de bulle d’air sous la peau qui persiste maximum 8 jours, avec deux injections d’air par étude sous anesthésie. 2) Administration des composés à tester ou de leur véhicule, par voie orale ou sous-cutanée ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou intra-articulaire ou intra-musculaire ou intra-nasale ou en topique. Au maximum 2 fois par jour pour les voies orale, sous cutané et topique pendant un maximum de 2 semaines mais, exceptionnellement un composé pourra être administré 3 fois dans la même journée mais une seule fois dans l'étude. Pour les administrations intraveineuse, intrapéritonéale, intra-articulaire ou intra-musculaire, les injections pourront être effectuées maximum 1 fois par semaines soit 2 fois maximum dans l’étude. La durée de chaque traitement prend quelques secondes 3) Administration de l’inducteur, au maximum 6 fois dans l’étude ; durée de chaque induction : quelques secondes 4) Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse ou non (dépendant de la localisation du prélèvement), au maximum 3 fois dans l’étude, durée d’une minute
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus chez la souris ou le rat peuvent être dus à l’injection des inducteurs ou au traitement avec les composés. Ces effets indésirables pourraient induire une perte de poids, une diminution de l’activité ou une prostration. La manipulation des animaux plusieurs fois dans l’études ainsi que l’administration des composés ou des inducteurs peuvent également générer du stress et de l’inconfort.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude car le ou les tissus cibles sont prélevés pour analyser l’effet des composés sur la cible ainsi que la concentration des composés dans les tissus
Remplacement
Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme et aussi de le relier à un effet biologique. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et pour observer la conséquence sur un ou plusieurs biomarqueurs. L’ensemble des molécules ont préalablement été testées, validées et sélectionnées in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été initialement basé sur la littérature puis a été réduit suite aux résultats obtenus dans des projets précédents. Pour de nouvelles cibles, une analyse statistique rétrospective sera effectuée après 3 à 5 études selon une formule mathématique communément décrite, comme le d de Cohen, afin de vérifier que le nombre d’animaux par groupe est suffisant pour obtenir, pour chaque paramètre étudié, une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo. Pour ce projet, nous utiliserons un maximum de 48 souris ou 40 rats par étude. Sur 5 ans, nous pensons réaliser un maximum de 350 études utilisant des souris et 35 études utilisant des rats.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Enfin, si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l’entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée, en adéquation avec les contraintes des différentes procédures, et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton adaptées, carrés de coton et feuilles de cellulose, entre autres).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces les plus utilisées et les plus décrites dans la littérature pour les études pharmacologiques sur les maladies inflammatoires. Les études PK/PD étant des études préludes aux études pharmacologiques d’efficacité, les espèces utilisées dans les modèles de PK/PD seront les mêmes que celles utilisées dans le modèle pharmacologique afin d’éviter toute différence due à l’espèce. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes et un système immunitaire parfaitement développés.
Imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) chez la souris avec des traceurs pour un récepteur immunitaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant deux greffes de tumeur sous la peau, une de chaque côté du corps. Elles passent jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie, dont une acquisition dynamique de quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient 230 souris immunodéficientes et 230 souris à système immunitaire normal, et écrit que l'imagerie non invasive a permis de réduire les effectifs. Le projet vise un produit d'imagerie mesurant une protéine du système immunitaire dans les cancers du poumon, avec l'hypothèse plus lointaine d'un marquage au lutétium 177 pour traiter, alors que les greffes tumorales et les anesthésies, elles, sont immédiates.
Objectifs
L’immunothérapie à base d’anticorps spécifiques est un traitement qui vise à stimuler les défenses immunitaires de l’organisme contre les cellules cancéreuses. Les décisions de traitement clinique sont souvent guidées par le statut d'expression d'un récepteur applé PD-L1 dont la présence sur la tumeur est évaluée par des tests d'immunohistochimie (IHC) standardisés à partir d'un seul échantillon de biopsie tumorale avant traitement. Cependant, l'IHC présente de nombreuses limites techniques et biologiques : une biopsie unique, ou plusieurs petites biopsies, représentent mal l'hétérogénéité de l'expression de PD-L1 au sein des patients (hétérogénéité au sein même de la tumeur, ou entre la tumeur primaire et ses métastases). De plus, la biopsie de la tumeur n'est pas toujours pratique lorsque le site de la lésion est inaccessible. Ces limites soulignent qu'il est nécessaire de disposer d'outils permettant de détecter les niveaux de PD-L1 dans l'organisme entier afin d'améliorer notre compréhension de la réponse des patients aux thérapies ciblant l'axe PD-1 :PD-L1 et sélectionner au mieux les patients susceptibles de répondre à cette famille de traitements. La Tomographie par Emission de Positons (TEP) permet une évaluation quantitative, en temps réel et non invasive des niveaux d'expression de la cible et de sa dynamique dans le corps entier. Nous avons pour objectif dans ce projet de développer des sondes radioactives conçues pour ce type d'imagerie.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir un produit d'imagerie basé sur un petit peptide pour mesurer la quantité de PD-L1, une protéine importante du système immunitaire dans les cancers du poumon non à petites cellules (CPNPC), en tomographie par émission de positon (TEP). Selon les résultats obtenus, nous envisagerons des expériences de radiomarquage du même peptide avec un élément radioactif nommé lutetium 177 pour tenter de traiter le cancer par radiothérapie interne.
Procédures
Les animaux subiront une fois une greffe sous cutanées des cellules cancéreuses de chaque côté, sous anesthésie et ce pendant 10 à 20 minutes par animal. Ils réaliseront également sous anesthésie, de l'imagerie non invasive. Un même animal pourra subir au total 3 imageries successives (une dynamique d'une durée de 90 min et au maximum 2 statiques d'une durée de 24 minutes), avec au moins 2 jours d'intervalle entre les imageries). En fin de protocole et suite à la dernière session d'imagerie, les animaux seront maintenus sous anesthésie, afin de réaliser un prélèvement sanguin (durée de 1 min) puis l’euthanasie sous anesthésie sera réalisée.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un stress lors de leur manipulation. Ils peuvent subir du stress lié à l’anesthésie lors de l'injection des cellules tumorales, lors de l'injection du radiotraceur ou lors de leur réveil. Ils peuvent également souffrir de la croissance des tumeurs greffées en sous cutané. Il existe une possibilité de perte de poids et d’altération de l’état général de santé. Les animaux vont subir une anesthésie, les nuisances possibles sont une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les animaux vont subir une injection intraveineuse, il y a un risque de plaie ou d'infection, de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs.
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée selon une méthode règlementaire, afin de récupérer les tumeurs et effectuer ensuite les analyses adéquates
Remplacement
Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l'interet d'un radiotraceur. Les analyses statistiques seront effectuées via le test Mann Whitney qui est adapté au nombre d'échantillons faibles. Le nombre d'animaux (460 au total, 230 souris immunodéficientes et 230 souris normales, répartis dans 2 études successives, permettant de comparer nos nouveaux ligands aux données de la littérature) a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.
Raffinement
Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes plastiques) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous avons plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettant de suivre le bien-être de l’animal dès le 1er jour de xénogreffe tumorale : pesée 2 fois par semaine (perte de poids rapide par rapport au dernier jour de mesure du poids), apparition de comportement anormal (hypertoilettage, prostration), posture en cas de douleurs, absence d’interactions avec les congénères, consommation d’aliments et d’eau, sommeil. Si plusieurs symptômes sont présents de façon légère, nous sortirons l’animal de la procédure en cours qui sera alors sous surveillance journalière, un 3ème enrichissement (baton à ronger) sera alors proposé à l'animal isolé. Si un des symptômes est important, nous euthanasierons l’animal. Cependant d’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir de telles souffrances. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance. Pour éviter tout risque de non réveil, la quantité d'anesthésique sera maitrisée et diminuée lors des temps d'imagerie longs.
Choix des espèces
Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Nous envisageons également l'utilisation de souris immunocompétentes pour les xénogreffes de cellules tumorales murines. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.
Capacité de l’acide pentadécanoïque alimentaire à se substituer à l’acide linoléique : étude nutritionnelle préclinique sur le modèle miniporc Yucatan
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Le miniporc Yucatan est retenu pour sa proximité digestive avec l'humain, ce qui vaut à 52 cochons d'être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze truies reçoivent un régime carencé ou témoin avant la reproduction, pendant la gestation et l'allaitement, et 40 porcelets naissent puis grandissent six semaines sous ces régimes. Le porteur indique que la carence peut ralentir la croissance et provoquer des troubles de l'apprentissage, des desquamations et des problèmes de fertilité, et prévoit une injection d'ocytocine aux truies pour prélever leur lait après les avoir séparées de leurs porcelets. Neuf truies sont tuées, dont les huit carencées qui ne peuvent plus servir de reproductrices, trois rejoignent le troupeau, et tous les porcelets sont tués pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La consommation de produits laitiers réduit le risque de survenue de maladies métaboliques, comme par exemple le diabète de type 2 (DT2), sans que les mécanismes ne soient encore clairement élucidés. Les acides gras saturés impairs (dont l’acide pentadécanoïque C15:0 est le représentant majoritaire dans le lait, 1% des acides gras totaux) sont des marqueurs de la consommation des produits laitiers, ce qui en fait des acteurs potentiels de cet effet protecteur. Ils peuvent également moduler le microbiote intestinal et l’homéostasie glucidique de l’hôte. Des études récentes suggèrent de plus que l’acide pentadécanoïque pourrait être un acide gras indispensable (AGI) et pourrait potentiellement se substituer dans l’alimentation à des AGI connus comme l’acide linoléique (LA). Un nutriment indispensable est une molécule, non synthétisée chez l'homme (ou l’animal modèle), qui assure des fonctions physiologiques ou structurales essentielles. Historiquement, 3 AGI ont été décrits dans la littérature. En 1929, le caractère indispensable du LA (omega 6), a été découvert par Burr : des rats soumis à des carences alimentaires en LA ont développé un retard de croissance. Plusieurs études ont ensuite montré qu’un apport énergétique de 2% en LA était suffisant pour éviter la carence. Les 2 autres AGI actuellement connus sont l’acide alpha-linolénique (ALA) et l’acide docosahexaénoïque (DHA). Une carence en ALA entraîne notamment une diminution d’aptitude à des tests d’apprentissage. Ces études ont été réalisées sur le modèle rongeur, qui possède de nombreuses limites pour la transposition des résultats à l’homme, tandis que le modèle porcin est reconnu comme un bon modèle préclinique notamment pour les études nutritionnelles, du fait de la proximité de sa physiologie intestinale avec celle de l’homme. Le premier objectif de cette étude est d’étudier la capacité potentielle de l’acide pentadécanoïque à se substituer au LA (en situation de carence) et d’assurer certaines fonctions structurales et physiologiques similaires (croissance, fluidité membranaire…) dans le modèle miniporc Yucatan.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer le rôle de l’acide gras C15:0 en nutrition, plus particulièrement ses effets sur la croissance et le maintien de fonctions physiologiques en situation de carence en AGI. Ces effets qui seront analysés chez le miniporc nous permettront d’observer des impacts nutritionnels dans un modèle proche de l’homme, ce qui complétera et validera certains effets du C15:0 observés chez le modèle rongeur. Le métabolisme des acides gras impairs a très peu été étudié chez l’homme et jamais chez le modèle porcin. Ainsi, cette étude permettra de caractériser le métabolisme des acides gras impairs, à la fois en situation saine (avec le régime CTRL contenant du C15:0) et en situation de carence d’AGI pour étudier le potentiel caractère indispensable de cet acide gras impair. Cette étude permettra ainsi d’améliorer les connaissances concernant les AGI et l’impact de leur carence chez le modèle mini-porc. L’ensemble de ces données permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle du C15 :0 qui pourraient concourir à réévaluer les recommandations nutritionnelles en acides gras chez l’homme, et également les apports en produits laitiers, principales sources de C15 :0 chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents régimes, contrôle ou carencés en AGI, et supplémentés ou non en C15:0 et LA. Un prélèvement de lait sera réalisé à 15 jours de lactation chez les truies, nécessitant l'injection IM d'ocytocine. Ces prélèvements seront réalisés une fois sur chaque truie et le temps de prélèvement n'excédera pas 20 min. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les truies au moment du sevrage des porcelets (
Impact sur les animaux
Concernant les régimes, une légère diminution de la croissance et l'apparition de troubles cognitifs (de l’apprentissage) sont possible chez les animaux carencés. Des sécheresses cutanées (desquamations) ont également été décrites. Enfin, des problèmes de fertilité ont également été rapportés en lien avec une carence en AGI. Concernant les différents prélèvements prévus au protocole, la collecte du lait chez les truies à 15j de lactation nécessite une injection d’ocytocine, ce qui peut entraîner une douleur au point d’injection, et nécessite également la séparation préalable des porcelets de la truie, ce qui peut entraîner un stress à la fois pour la truie et les porcelets. Cependant, cette séparation est limitée à quelques minutes (
Devenir
9 truies seront euthanasiées à la fin de la procédure 1: les 8 truies ayant reçu le régime Carence ne peuvent pas être réutilisées comme reproductrices dans l'élevage expérimental. 3 truies du groupe Contrôle seront intégrées dans le troupeau comme truies reproductrices et 1 sera euthanasiée conformément au plan de renouvellement du troupeau. Tous les porcelets de la procédure 2 seront euthanasiés à la fin de la procédure pour récupérer les tissus d'intérêt.
Remplacement
L’effet recherché dans cette étude est d’ordre nutritionnel et nécessite donc l’analyse d’un organisme dans son ensemble. En effet, les nutriments diffusent dans le « corps entier » après digestion-absorption des aliments et leurs impacts physiologiques ou physiopathologiques concernent de multiples organes qui interagissent entre eux pour former un système biologique complexe. L’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale et intégrée du métabolisme du C15 :0 et pour prendre en compte le rôle du microbiote intestinal, qui sont impossible à reproduire dans leur complexité dans des modèles in vitro. Le miniporc a été choisi pour sa proximité physiologique avec l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition (10 porcelets par condition) a été calculé par analyse de la puissance statistique nécessaire pour pouvoir comparer les paramètres étudiés. Ce nombre d’animaux représente la limite basse pour laquelle les effets induits au terme du projet permettront d’observer un effet statistiquement significatif. Les truies Yucatan ayant des portées de 2 à 6 porcelets, le nombre de cochettes nécessaires pour avoir 10 animaux dans chaque groupe a été évalué à 4 pour le groupe Contrôle, pour assurer 10 porcelets, et 8 dans le groupe Carence, pour assurer 30 porcelets, qui seront répartis dans les 3 groupes Carence, enrichi en acide gras pentadécanoïque et enrichi en acide gras linoléique à raison de 10 animaux par groupe. Concernant les truies nourries par le régime Contrôle, 3 sur 4 pourront être maintenues dans l’élevage à l’issue de l’expérimentation pour le renouvellement du troupeau. L’expérimentation sera réalisée en 2 répétitions successives de 6 truies (2 sous régime Contrôle, 4 sous régime Carence), permettant statistiquement d’obtenir les 40 porcelets nécessaires. Si, par chance, le 1er lot permettait d’obtenir un nombre supérieur à 20 porcelets, le 2nd lot de truies serait réduit en conséquence.
Raffinement
Les compétences et l’expérience des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Des points limites ont été établis, entraînant la sortie de protocole ou l’euthanasie anticipée de l’animal en cas de nécessité. Les animaux seront élevés en groupes, que ce soit pour les truies en gestation ou les porcelets en post-sevrage, favorisant le bien-être et les interactions sociales. Les truies gestantes seront transférées en salle de maternité 3 semaines avant la date de mise-bas prévue, dans des loges individuelles (2,30 m2) permettant les contacts olfactifs et visuels avec leurs congénères, selon la pratique en vigueur dans l’élevage expérimental. Les porcelets resteront classiquement en portée avec leur mère pendant toute la durée de la lactation et une habituation à l’aliment solide sera réalisée quelques jours avant le sevrage pour faciliter la transition alimentaire. Les porcelets ont accès libre à un nid chauffé par une lampe et à l’écart de la truie (0,25x1,37m). Au sevrage, les 2 portées issues des mères Contrôle seront regroupées et le groupe observé pour voir si la mise en place de la hiérarchie se passe bien, comme ce qui est pratiqué en routine à l’élevage. Les portées issues des mères du groupe Carence seront réparties en 3 groupes avec idéalement, un à deux porcelets de chaque portée par groupe pour limiter l’effet portée, ce qui brassera les portées et facilitera la constitution du nouveau groupe et ses interactions sociales. Une attention particulière sera là encore apportée par le personnel de l’unité expérimentale pour s’assurer que la mise en place de la hiérarchie se passe bien. Des enrichissements de type ballon seront apportés dans les cases des animaux.
Choix des espèces
Le modèle miniporc Yucatan est un modèle avec une plus grande proximité physiologique avec l’homme que ne l’est le modèle rongeur, notamment au niveau de sa taille, de son système digestif et de son microbiote. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très recherché pour les recherches en nutrition humaine. Les cochettes prévues pour cette expérimentation auront approximativement 1 an d’âge (naissances en mai-juin 2023). Elles seront soumises au régime Contrôle ou Carence 15 jours avant la mise en reproduction, puis pendant la gestation et la période d’allaitement. Au sevrage, soit 4 semaines après leur naissance, les porcelets seront nourris avec les différents régimes expérimentaux. Ils seront nourris avec ces régimes pendant 6 semaines puis euthanasiés. L’induction de la carence doit débuter chez les truies gestantes afin d’induire une carence chez les porcelets issus de ces mères. L’âge final des porcelets correspond au temps nécessaire pour observer l’effet de la carence ou de la resupplémentation.
Validation du dosage de corticostérone dans des prélèvements non invasifs chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Prélevées dans d'autres projets pour ne pas en utiliser de nouvelles, 42 souris vont être soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le groupe stressé subit quinze contentions de trente minutes dans un tube de 50 ml réparties sur vingt et un jours, un rasage, un test d'anhédonie sur une semaine et un test de la boîte noire et blanche de cinq minutes en isolement. Le projet vise à valider un dosage de la corticostérone dans l'urine, les fèces et les poils, afin de mesurer ensuite le stress des souris de l'animalerie. Un stress chronique est donc infligé pour mettre au point un outil de mesure du bien-être des animaux non-humains, et les souris rejoignent ensuite le "stock" de formation interne si l'avis vétérinaire le permet, sinon elles sont tuées.
Objectifs
Le projet vise à valider une méthode de mesure de la corticostérone dans différents échantillons pouvant être prélevés de manière non invasive chez la souris. Cette méthode de mesure servira ensuite à évaluer l’effet de modifications de paramètres environnementaux ou de procédures spécifiques sur le bien-être et le stress des souris.
Bénéfices attendus
La souris est l'espèce la plus couramment utilisée dans la recherche biomédicale et sa sensibilité est désormais largement reconnue. La directive européenne demande de réduire autant que possible la douleur et la détresse ressenties par les animaux utilisés, et d'augmenter le bien-être des souris (Directive européenne 2010). La corticostérone est le principal glucocorticoïde chez les souris et sa concentration reflète le niveau de stress d'un individu. Cette hormone de stress est classiquement mesurée dans le sérum ce qui nécessite une méthode de prélèvement invasive et reflète la concentration de corticostérone à court terme. D'autres matrices peuvent être utilisées, comme les selles, l'urine et les poils. En plus des mesures environnementales et comportementales, les niveaux de corticostérone fournissent des informations sur le stress des souris de laboratoire. Mesurer le stress chez nos souris nous permet de nous conformer à l'accréditation de l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International qui demande de revoir le programme d'enrichissement pour garantir l’amélioration du bien-être animal.
Procédures
Chaque souris du groupe « stressé » subit 15 contentions de 30 min chacune réparties sur 21 jours. Le rasage sera d’une durée inférieure à une minute. Les prélèvements d’urines (1µL) et de fèces (0.2mg) seront réalisé une seule fois à la fin du protocole et dureront moins de 2 minutes. Les souris du groupe contrôle seront simplement manipulées pendant moins d’une minute dans les mains de l’expérimentateur. Le test d’anhédonie se déroule sur une semaine. Lors du test de la boite noire et blanche, les souris sont placées individuellement dans le dispositif durant 5 min et leurs déplacements sont automatiquement enregistrés.
Impact sur les animaux
La contention de 30min / jour dans un tube de 50ml induit un stress chronique chez les animaux du groupe stressé. Les prélèvements nécessitent une contention qui peut induire un stress ponctuel aux souris bien qu’elles soient habituées à la manipulation dans un autre projet.
Devenir
Les souris retourneront dans le stock de formation interne après la procédure si l’avis vétérinaire le permet, dans le cas contraire elles seront euthanasiées.
Remplacement
Il s’agit ici de tests comportementaux permettant d’améliorer les conditions de vie des souris de notre animalerie. Ce protocole permet d’obtenir des résultats significatifs en utilisant les individus présents dans notre établissement. Il n’est donc pas possible de remplacer l’utilisation des souris par un autre modèle pour ce projet, mais les souris seront réutilisées à partir d’autres projets, afin de pas utiliser de nouveaux animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été réduit et permet d’obtenir des résultats significatifs sur le sexe et les souches de souris qui seront utilisées ensuite pour mesurer la corticostérone. Un total de maximum 42 souris sera utilisé pour ce projet sur 1 an. Les souris seront divisées en groupes de 5 à 10 souris en fonction des tests réalisés. Plusieurs types de prélèvement seront réalisés sur chaque individu, ces effectifs permettront donc de réaliser une analyse statistique robuste. Les souris retourneront dans le stock des souris utilisées en formation après la procédure si l’avis vétérinaire le permet.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable de 2 à 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : un morceau de bois par souris, permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, un tunnel en carton et un dôme en polycarbonate rouge seront également disposés. En cas de changement de salle d’hébergement ou de congénères, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Une échelle de scores prenant en compte l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel permettra d’objectiver la présence de souffrances et pourra amener au traitement ou à l’euthanasie des souris pour raison éthique. En cas de modification des groupes sociaux pour la réalisation de l’étude, une semaine d’acclimatation sera respectée avant de démarrer le protocole expérimental.
Choix des espèces
Notre établissement utilise uniquement des souris et majoritairement des femelles, c’est pourquoi il est nécessaire de valider la mesure de la corticostérone chez cette espèce.
Compréhension des mécanismes immunitaires associés à des nanoparticules d’ARNm en fonction de leur voie d’administration chez la souris naïve
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2 055 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vaccin à ARNm par voie intranasale, par voie oro-trachéale avec introduction d'un cathéter dans la trachée, ou par voie intramusculaire, puis quatre séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et quatre prélèvements de sang au sinus submandibulaire, en contention et vigiles. Un lot pilote de 30 souris sert uniquement à entraîner les intervenants à ce geste de prélèvement. Aucune maladie n'est induite, les souris sont tuées pour prélever poumons, nez, rate, ganglions et sang, et le porteur inscrit ces travaux dans une "production souveraine" de vaccins et l'ambition française de se placer "à l'avant-garde" des biothérapies.
Objectifs
Les récents succès des vaccins à base d’ARN messager (ARNm) contre le SARS-Cov2 ont validé le potentiel thérapeutique de cette classe de médicament. Le projet RNAvac a pour objectif de produire une nouvelle génération de vaccins ARNm en développant des technologies innovantes afin de lever les limitations des vaccins à ARNm démontrées par leur courte durée de protection induite nécessitant de fréquents rappels et leur inefficacité à bloquer les infections au site d’entrée du virus chez les personnes vaccinées. Il vise à étendre leur utilisation pour le traitement d’autres pathologies, comme le cancer. Pour relever ce défi, un consortium de 11 laboratoires académiques s’est structuré pour accélérer la production de vaccins innovants afin de les déployer pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers muqueux dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. L’ambition est d’accélérer la production française de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires (virus NIPAH, West Nile …), d’épidémies récurrentes (grippe…), et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. Plus spécifiquement, ce projet vise à décrire et comparer les réponses immunitaires induites par différents vaccins à ARNm en fonction de leur voir d’administration, soit intra-pulmonaire, soit intra-nasale chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Ce projet fait partit d’un consortium de grande envergure qui vise à développer de nouvelles générations de vaccins ARN messager pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. Les éléments de rupture qui seront apportés par le projet sont : une approche de formulation originale de vaccins avec des ARNm bioproduits plus efficaces et moins couteux, une stratégie innovante de stabilisation d’ARNm, l’administration par voie mucosale de vaccins ARNm et le double ciblage ARN/antigène vers les cellules dendritiques pour favoriser la réponse immunitaire mémoire post-vaccinale. Le consortium s’appuie sur plusieurs infrastructures nationales et un réseau de start-ups et d’entreprises, des centres hospitaliers universitaires, qui vont faciliter le transfert technologique pour l’industrialisation et vers le patient. L’ambition long-terme est d’accélérer la production souveraine de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires, d’épidémies récurrentes et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. En conclusion, ce projet s’inscrit pleinement dans l’ambition de la France de se positionner à l’avant-garde des technologies de biothérapie et de bioproduction à base d’ARNm.
Procédures
1a_Administration des ARNm par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes 1b_Administration des ARNm par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min 1c_Administration des ARNm par voie intramusculaire : en contention, animal vigil, 1 fois, 1min 30secondes 2_Mesure de la bioluminescence/fluorescence émise par les nanoparticules d’ARNm: sous anesthésie générale, 1 fois/semaine (total = 4) , 5min 3_Prélèvement de sang : en contention, animal vigil, 1 fois/semaine (total = 4), 2min
Impact sur les animaux
Aucune pathologie modèle ne sera testée chez l’animal. Il s’agit ici d’évaluer l’immunogénicité de différentes formulations d’ARNm en fonction de leur voie d’administration. Des données préliminaires in vitro obtenues dans les laboratoires collaborateurs vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les différentes formulations d’ARNm, à celles présentant la plus faible toxicité minimisant ainsi les nuisances. Les nuisances associées aux administrations des formulation d’ARNm comprendront : le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus par la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée au prélèvement submandibullaire.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux aARNm en fonction de leur voie d'administration. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, nez, sang total, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Ce projet est la suite de résultats obtenus sur des modèles in vitro dans des équipes collaboratrices. Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux réponses immunitaires mucosales et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modalités d’administration de biothérapies (intranasale, intratrachéale ou intramusculaire) sont très bien décrites chez la souris et sont maitrisées par notre équipe. L’utilisation de la souris permettra de mimer les phénomènes immunitaires observés chez l’Homme. Les outils transgéniques, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans l’immunogénicité à long terme induit par les ARNm sont disponibles chez la souris. Enfin, l’étude de la mécanistique immunitaire induit par les ARNm délivrés par voie pulmonaire est possible chez la souris grâce à des outils appropriés disponibles au laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, …). Les modèles murins et les différentes modalités d’administration sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Des données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses et des temps d’analyses. L’utilisation d’imagerie non-invasive (via l’utilisation de formulations d’ANRm fluorescent/luminescent) permettra un suivi longitudinal des animaux, limitant leur nombre. 1 lot pilote de 30 animaux a été inclus afin d'entraîner les intervenant à la maîtrise du geste de prélèvement de sang par ponctions au niveau du sinus submandibulaire. Ceci permettra d’augmenter le robustesse de ce geste et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée à l’observation, au cours des expérimentations envisagées, des points suivants: (1) une perte de poids de l'animal, et/ou (2) détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal et altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir ou de boire, poil hirsutes) et/ou (3) symptômes évidents. Ces symptômes, incluant des éléments physiques, physiologiques et comportementaux permettront d'établir un score clinique permettant de déterminer objectivement la poursuite ou non de l'expérimentation sur l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes et (2) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines formulations augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études chez l’animal sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux ARNm. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec gestes techniques procédures.
Effets de la température sur la tolérance thermique du médaka
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
La montée en température s'arrête quand le poisson perd l'équilibre. 176 médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, tous tués à l'issue. 128 d'entre eux, 64 femelles et 64 mâles, subissent ce test par paires pendant quatre heures au maximum, puis sont mis à mort. Les 48 autres sont tués pour des analyses moléculaires, l'objet déclaré étant de savoir si deux semaines d'acclimatation à une eau plus chaude repoussent la limite thermique de l'espèce.
Objectifs
Les effets du changement climatique sur la biodiversité sont déjà bien visibles. Un des grands défis en écologie est donc d’identifier les effets de ce changement sur la survie des espèces et la biodiversité. Dans cette étude, nous voulons étudier si la tolérance thermique (c.-à-d. la température maximale que peut tolérer un individu) du poisson médaka peut être augmentée après une phase d’acclimatation à des températures un peu plus chaudes. Nous voulons également tester si les effets de l’acclimatation de courte durée se conservent dans le temps. Pour cela, nous voulons conduire des expériences en laboratoire pour tester la tolérance thermique de poissons Médaka provenant de populations élevées à 20°C et à 30°C et exposées à une courte (2 semaines) augmentation de la température. Ces résultats serviront à comprendre si les poissons peuvent repousser leur limite thermique dans le contexte du réchauffement climatique.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de l’adaptation des poissons à des températures plus chaudes.
Procédures
Les poissons seront soumis à des manipulations en laboratoire ou en mésocosme comme des transferts entre aquarium ou des pesés corporelles. Ces manipulations sont rapides (1 minute par poisson) et le poisson reste immergé. Les poissons subiront un stress léger avec le réchauffement en mésocosmes. La température des mésocosmes réchauffés ne devrait pas dépasser les 30°C maximum ce qui représente une température non-stressante pour cette espèce de poisson qui vit habituellement en milieu chaud en Asie du sud-est. De plus, nous élevons le médaka à 30°C depuis plusieurs années et les poissons se portent très bien à cette température. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température. L’expérience durera 4h au maximum pendant lesquelles les poissons seront exposés (par couple) à une montée rapide de la température jusqu’à la perte de l’équilibre du poisson. Les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Tout d’abord, les poissons subiront un léger stress lors des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, photographie et pesées) ou du réchauffement en mésocosme. Les poissons subiront un stress plus important lors des expériences de tolérance thermique. Néanmoins, ce type d’expérience est pratiqué sur les poissons depuis des décennies et n’entraîne pas de mortalité. Dans notre cas, l’expérience sera de courte durée (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.
Devenir
Pour cette expérience, n=176 individus seront utilisés au total pour inoculer les mésocosmes. Parmi ces 176 individus, 128 individus (64 femelles, 64 mâles) seront utilisés pour la mesure de tolérance thermique. Après la mesure de CTmax, ils seront mis à mort. Les 48 autres individus qui n’auront pas servi aux mesures de CTmax seront également mis à mort pour des analyses moléculaires. De plus, tous les individus seront stockés dans une banque de tissus pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L'écologie a pour objet l'étude des populations et des écosystèmes. Il n'est donc pas possible de substituer des cellules ou des tissus à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier les réponses comportementales et physiologiques des poissons.
Réduction
Nos lignées de poisson Médaka élevées depuis plusieurs générations à des températures contrastées représentent une opportunité unique de tester l’adaptation à la température dans le contexte du réchauffement climatique. Pour les mesures de tolérance thermique, nous prévoyons d’utiliser 128 poissons. La mesure de tolérance thermique aura lieu 2 fois, une première fois directement après le réchauffement puis une seconde fois 2 semaines après mais ce ne seront pas les mêmes individus qui seront utilisés pour les 2 sessions (pour réduire la quantité de stress infligée à un seul poisson). Puisque les mâles et les femelles ont des réponses physiologiques différentes, il est nécessaire de tester les deux sexes (mâles et femelles). Notre choix pour ce nombre de poisson est justifié par des tests statistiques qui indiquent que l’on doit tester 128 poissons pour pouvoir détecter une différence entre les traitements.
Raffinement
Les animaux sont hébergés selon les standards prévus par la règlementation, en groupes sociaux, dans un environnement adapté et enrichi. En effet, les médakas sont élevés dans des mésocosmes de grande taille (1000L de contenance par mésocosme), en groupes sociaux (11 individus par mésocosmes), et leur environnement est enrichi (bordures des mésocosmes bleues opaques pour limiter le stress, présence de substrat naturel au fond, de végétation aquatique et algue, et alimentation uniquement constituée d’organismes vivants (zooplancton naturellement présent dans les bacs et le substrat)). Pour les transferts entre aquarium (durée : 30 secondes), nous utilisons un bac de 2L avec un fond noir pour ne pas stresser les poissons. Les poissons sont également immergés pendant les pesées et celles-ci durent moins d’une minute et sont effectuées sous lumière tamisée. Les mesures de tolérance thermique seront les plus courtes possible (4 heures maximum). Les poissons seront par deux au sein d’un même aquarium et pourront observer leurs congénères dans les aquariums voisins ce qui permettra de diminuer leur niveau de stress. Nous contrôlerons les paramètres abiotiques (température et oxygène) et stopperons l’expérience si la montée en température n’est pas conforme au protocole (1°C par 10 minutes) ou si la saturation en oxygène dissout < 85%.
Choix des espèces
Nous avons choisi le médaka car il vit naturellement dans les milieux peu profond et riches en nutriments, typiquement les rizières (d'où le nom du genre, Oryzias). Ces milieux sont très chauds en été et très froids en hiver. Ils sont donc naturellement très rustiques. Nous utiliserons des poissons adultes à l’optimum physiologique (âgés de 200 jours) correspondant à un standard concernant les mesures physiologiques puisque ces dernières peuvent différer selon l’âge des poissons.
Validation d’un nouveau modèle murin de shigellose carencé en ascorbate
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour évaluer si la combinaison de deux mutations aggrave la shigellose, une infection intestinale, des lignées de souris génétiquement modifiées, dont une incapable de produire de la vitamine C, sont croisées et des souriceaux maintenus en carence de vitamine C dès la naissance. 1 921 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 384 souriceaux et 10 femelles reproductrices soumis à cette carence. Après deux jeûnes de six heures, les souris reçoivent Shigella ou une solution témoin, par voie rectale ou par la bouche, et les infectées peuvent présenter sur 48 heures une perte de poids, une diarrhée sanguinolente et une inflammation de l'anus. Les souris au génotype non attendu sont tuées, comme celles destinées aux prélèvements post mortem. Le porteur écarte les cobayes, qui à 8 semaines, durée de l'immunisation requise pour tester un vaccin, ont atteint l'âge adulte et "ne sont plus sensibles à l'infection".
Objectifs
Les diarrhées associées à des infections bactériennes se caractérisent par une gastro-entérite. Elles se transmettent par voie féco-orale, notamment dans les pays en voie de développement ou chez les voyageurs. Chaque année, elles tuent plusieurs millions de personnes, essentiellement des enfants de moins de 5 ans. La shigellose, causée par la bactérie Shigella, est responsable d’une vaste majorité de ces cas. Il n’existe à l’heure actuelle aucun vaccin commercialisé protégeant de ses infections, mais de nombreuses approches sont en cours d’étude. En effet, l’absence d’un modèle animal d’infection pertinent ne permet pas d’évaluer leur efficacité. Nous évaluons actuellement l’impact de la carence en ascorbate (plus communément appelé vitaine C) sur la sévérité de l’infection par Shigella, en utilisant des souris génétiquement modifiées ne synthétisant pas la vitamine C, à la différence des souris sauvages. Nos résultats indiquent une augmentation de l’invasion de la muqueuse colique par Shigella en carence d’ascorbate, mais les animaux récupèrent de l’infection au bout de 48h. Récemment une équipe américaine a mis en évidence qu’une mutation sur un autre gène augmentait la sensibilité des souris à l’infection par Shigella. Dans ce modèle, les infections sont plus marquées que chez les souris sauvages, toutefois, l’infection est également transitoire. Dans le cadre de ce projet, nous confirmerons ces résultats avec ce même modèle de souris génétiquement modifiées et généreront une nouvelle lignée murine combinant les deux mutations afin d’évaluer si une aggravation des symptômes de shigellose est observée. La virulence de Shigella a été étudiée depuis de nombreuses années dans divers modèles animaux qui, même imparfaits ont permis de mieux comprendre les mécanismes de la virulence de ce pathogène. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet de récapituler l’infection du colon suite à l’ingestion de Shigella. Notre nouveau modèle de souris doublement muté pourrait permettre de suivre les étapes précoces et tardives des infections par Shigella. L’objectif de ce projet est de caractériser et valider ce nouveau modèle murin dans le cadre d’une infection par Shigella via la voie intrarectale et per os et éventuellement le valider pour l'évaluation de l’efficacité de candidats vaccins actuellement en phase de développement.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucun vaccin commercialisé protégeant des infections par Shigella, responsable de la mort de plusieurs millions de personnes chaque année. Ceci s’expliquant notamment par l’absence d’un modèle animal pertinent d’infection permettant non seulement de récapituler la shigellose humaine dans son entièreté et ainsi de suivre les différentes étapes précoces et tardives de l’infection, mais de fait d’évaluer l’efficacité de vaccin candidat. Dans notre projet, la validation d’un nouveau modèle murin, doublement muté, constituerait une avancée majeure dans la compréhension des différents mécanismes mis en place de la virulence de Shigella ; mais proposerait aussi une nouvelle voie d’évaluation de candidats vaccin actuellement en phase de développement.
Procédures
384 animaux générés ainsi que les 10 femelles reproductrices subiront de leur naissance à leur mise à mort (3 ou 4 semaines d’âge selon le groupe) une carence modérée en ascorbate via une dose sous-optimale d’ascorbate (0.01% w/v) dans l’eau de boisson . Les animaux générés seront soumis à un génotypage sur une biopsie de queue. Tous les animaux subiront avant l’infection par Shigella ou le véhicule deux mises à jeun. La première durera 6h et la seconde 6h. Tous les animaux subiront les actes suivants : Contention et préhension; les gavage et injection sur animal vigile seront d'une durée inférieure à 1 minute; L'injection sous anesthésie gazeuse elle , s'executera pendant une durée de 2 minutes maximum.
Impact sur les animaux
En relation avec la phase d’induction de carence modérée, des précédentes études ont montré que celle-ci avait un impact sur le développement de l’animal au niveau phénotypique (petite taille). La biopsie de queue pour génotypage peut entrainer un stress ainsi qu'un léger inconfort chez les animaux. La mise à jeun provoquer chez ces derniers un stress et une légère perte de poids. Suite à l’infection par la bactérie Shigella, les points suivants pourraient être observés sur 48h (basé sur les précédents travaux réalisés) : - perte de poids - présence de diarrhée sanguinolente - inflammation de l’anus - présence de mucus sur l’anus - vivacité générale de l’animal altérée. Lors des procédures de gavage, il pourrait être observé une dyspnée secondaire à une fausse route induite par l'acte.
Devenir
Pour ce projet, les animaux ayant un génotype non attendu seront mis à mort ainsi que ceux à des fins de prélèvements post mortem.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo d’un nouveau modèle faisant suite à d’autres validations réalisées également in vivo mais qui jusqu’à aujourd’hui n’ont pas permis de récapituler totalement l’infection du colon suite à l’ingestion de Shigella. Il s’inscrit dans une continuité de compréhension des mécanismes de la virulence de ce pathogène et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens alternatifs que l'animal vivant. De plus, l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle de choix pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine, ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. Enfin, les modèles cellulaires d’infection de Shigella ne rendent pas compte de la modulation des mécanismes de virulence de ces pathogènes dans le contexte inflammatoire et ne sont donc pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’objectif in fine de ce projet étant d’évaluer des candidats vaccins, le recours à la souris est indispensable.
Réduction
Pour ce projet d’une durée de 5 ans, chaque procédure a été revue avec un biostatisticien afin d'établir le nombre d'animaux minimum nécessaire et suffisant pour atteindre l’objectif fixé de manière fiable statistiquement et robuste. Cet effectif repose également sur notre connaissance du modèle et basé sur les résultats de précédents travaux. Enfin, l’utilisation des deux sexes permet la genèse de moins d’animaux pour atteindre l’effectif total, participant au principe des 3R.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées de façon optimale pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Pour se faire, des critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse ont été définis, mis en place et seront pris en compte via des grilles de scoring. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées sur un cycle circadien 12h/12h (7h-19h). Ils seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (matériel de nidification à base de coton compressé et de frisure de papier, barreau à ronger, tunnel transparent de manipulation), et disposeront de nourriture et d’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Dans le cadre des infections par injection, les animaux seront préalablement anesthésiés afin de palier à tout stress. De même avant tout acte de prélèvement et de mise à mort pour collecte de tissus, une anesthésie profonde sera mise en place.
Choix des espèces
Le cobaye et la souris sont les seuls modèles animaux permettant d’étudier la virulence de Shigella. Or, le cobaye ne permet pas de tester ni des infections prolongées ni des candidats vaccin. En effet ce test nécessite une immunisation des animaux pendant 8 semaines, âge auquel les cobayes ont atteint l’âge adulte et ne sont plus sensibles à l’infection. L’objectif in fine de ce projet étant d’évaluer des candidats vaccins, le recours à la souris est indispensable. L’ensemble des données dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle de choix pour mener à bien ce projet. Etant une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine, une analyse comparative et critique des résultats obtenus pourront être faites. Pour ce projet, les animaux seront utilisés dès la naissance. En effet, une infection par Shigella est plus efficace chez des souriceaux jeunes (environ 3 semaines). Utiliser les animaux à leur naissance permet l’induction de carence modérée en ascorbate avant infection au sevrage. Utiliser les animaux à leur naissance permettra l’induction d'une carence modérée en ascorbate avant infection à l'âge de 3 semaines. De plus, d'un point de vue clinique, l'infection par Shigella touche majoritairement des enfants de moins de 5 ans. L'utilisation de souriceaux nous permettra ainsi d'être le plus représentatif possible.
Identification du rôle d’une hormone dans la progression tumorale chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, puis un irritant intestinal dans l'eau de boisson pendant trois cycles de cinq jours, et des mesures de tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. 2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Le projet cherche à établir qu'en modulant le fer des globules blancs on renforce la réponse contre les tumeurs, preuve de concept présentée comme une piste thérapeutique. Le porteur annonce des points limites entraînant une mise à mort anticipée sans en préciser aucun, et dépose ce protocole en double, deux demandes de 2 016 souris publiées le même jour.
Objectifs
A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.
Identification du rôle d’une hormone dans la progression tumorale chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Toutes mises à mort pour prélèvement d'organes, 2 016 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales ou une injection intrapéritonéale d'une substance qui favorise les tumeurs, suivie de trois cycles de cinq jours d'ingestion d'un irritant intestinal dans l'eau de boisson. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées et des risques de saignement liés à cet irritant, et mesure les tumeurs au pied à coulisse trois fois par semaine. Il conclut que le recours à l'animal est "nécessaire" parce que l'infiltration des cellules immunitaires dans la tumeur ne s'observe pas in vitro, et attend de ce travail des "traitements modulateurs du fer".
Objectifs
A ce jour, plusieurs moyens thérapeutiques existent pour lutter contre le cancer. Parmi eux, on retrouve des traitements dont le but est de stimuler notre système immunitaire afin de contrôler les cellules cancéreuses. Cette technique constitue un grand espoir pour l’amélioration de la survie des patients. Ces traitements sont essentiellement centrés sur les globules blancs, qui sont les principaux acteurs de la réponse anti-tumorale, capables d’éliminer les masses tumorales déjà formées. La fonction des les globules blancs est influencée par la composition de leur environnement, et nous proposons que le fer puisse être un de ses éléments. En effet, il est établi que le fer est un élément essentiel pour les cellules métaboliquement actives comme les globules blancs, car il est nécessaire pour un nombre important de réactions cellulaires. Notre hypothèse de travail est basée sur des données de la littérature selon lesquelles un milieu dépourvu de fer diminue la prolifération des globules blancs et la production de molécules anti-tumorales. La concentration sanguine du fer étant contrôlée par une hormone sécrétée majoritairement par le foie et qui favorise sa rétention dans les cellules, nous avons développé des modèles murins génétiquement modifiés afin d’induire une sur-expression ou une délétion de cette hormone spécifiquement dans les globules blancs. Grâce à ce projet, nous voulons apporter la preuve de concept qu’une modulation des niveaux de fer intracellulaire des globules blancs, médiée par l’hormone du fer, impacte leur prolifération et activation, et in fine leur réponse anti-tumorale. Ainsi, de nouveaux traitements centrés autour du fer pourraient voir le jour et garantir une meilleure qualité de vie aux patients, avec des traitements de faible toxicité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une hormone contrôlant les taux de fer de cellules immunitaires. Cela permettra de proposer des traitements modulateurs du fer qui pourront avoir un effet anti-tumoral ou d' améliorer l’efficacité des traitements déjà existants.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et être responsable de diarrhées et de risque de saignement et donc une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux. Le tatouage et biopsies de queue engendreront un stress et une douleur légère. Le transport entre les 2 animaleries peut également engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyse.
Remplacement
Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et mises au point in vivo en se basant sur des données publiées de la littérature. Le recours aux modèles de tumeurs chez la souris nous permettra de caractériser les cellules immunitaires qui s'infiltrent et s'activent dans la tumeur . Ces paramètres ne peuvent pas être observés in vitro et le recours à l'animal est donc nécessaire dans le cadre de cette étude. Les souris sont âgées de 8 semaines au minimum car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les injections sous-cutanée et les imageries seront faites sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet. Lors du transfert, les souris seront mises dans des boites de transport avec de l'enrichissement et de la nourriture.
Choix des espèces
La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certains mécanismes dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.