Procédures modérées

Une pompe micro-osmotique implantée sous la peau diffuse en continu la substance qui provoque l'hypertrophie du cœur, et une souris sur cinq meurt subitement avant la fin du protocole. 3 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec deux échocardiographies sous anesthésie et des injections quotidiennes pendant quatorze jours. Le porteur indique que ces souris ne présentent pas de signes liés à l'hypertrophie, tout en reconnaissant un taux de mortalité élevé par mort subite qu'il déclare impossible à anticiper ou à empêcher. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever le cœur et le sang.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie qui affecte plus d’un million de personnes en France avec un taux de mortalité élevé. Quelle que soit l’origine de l’insuffisance cardiaque (hypertension, vieillissement…), cette dernière est associée à une altération du muscle cardiaque nottamment à cause du développement d'une fibrose cardiaque. Dans le contexte du vieillissement et de l’hypertension artérielle, il existe une augmentation de la masse cardiaque, nommée hypertrophie cardiaque. Ce remodelage hypertrophique est à la source de différentes formes d’insuffisance cardiaque très prévalentes chez les sujets les plus âgés et pourtant sans aucun traitement spécifique. En effet, il n’existe actuellement aucune stratégie thérapeutique anti-fibrotique efficace qui pourrait compléter les traitements actuels pour l’insuffisance cardiaque. Il a été démontré q'une nouvelle population de cellules résidant dans le coeur serait capable de participer à la fibrose en réponse à un stress hypertrophique. Ces cellules expriment à leur surface des récepteurs impliqués dans la fibrose, il y aurait donc interet à les cibler. Les enjeux scientifiques sont donc maintenant d'obtenir des inhibiteurs de ces récepteurs et de tester leur capacité à empecher le developpement de la fibrose cardiaque. Ce projet sera considéré comme un début de programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une nouvelle approche thérapeutique qui pourrait empecher le développement de la fibrose cardiaque. A terme, ceci conduira à développer des nouveaux traitements pour lutter contre le développement de l’insuffisance cardiaque, une pathologie qui touchent des millions de patients et qui impacte fortement leur qualité de vie au quotidien.

Procédures

Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale durant 10 minutes sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base. Dans un second temps, implanter une pompe micro-osmotique en sous cutanée pour tous les animaux et sous anesthésie générale, cette intervention dure environ 5 minutes. Injecter le traitement quotidiennement en intrapéritonéal ou bien l'administrer par voie orale pendant 14 jours. A la fin de l'expérience, réaliser une deuxième échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux sous anesthésie générale. Le coeur sera prélevé après mise à mort sous anesthésie profonde pour une étude histologique et moléculaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur au point d’injection. Il y a également les effets indérisables liés à la chirurgie (pompes micro-osmotiques) et au stress lié à l’induction de la fibrose. De meme, les souris ne présentent pas des signes liés à l'hypertrophie mais le taux de mortalité est elevé. il s'agit d'une mort subite, qui est impossible à anticiper ou à empecher cette mortalité. L’échocardiographie est un examen non invasive et indolore, cependant, l'isoflurane pourrait induire un stress.

Devenir

A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal sous anesthésie générale et sous couverture analgésique (imagerie échocardiographie, implantation des pompes micro-osmotiques, injection du traitement en intrapéritonéal) tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde dans le but de prélever le coeur et le sang pour différents types d'analyse.

Remplacement

Les molécules à étudier ont fait l’objet de tests prélimaires in vitro qui nous ont permis d’identifier les cibles thérapeutiques impliquées dans l’hypertrophie et d’évaluer la puissance des inhibiteurs dans des tests d’activation cellulaire. Notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques

Réduction

La physiopathologie ainsi que la cinétique du modèle (hypertrophie) sont bien connues et ont été bien étudiées ce qui permet de mieux définir la durée des expériences et éviter la mise à mort des animaux à différents temps après la chirurgie. Le nombre d'animaux nécessaire a été défini en fonction du type d’analyses nécessaires pour tester l’efficacité des traitements et nous avons pris en compte la mortalité des souris hypertrophiées (20%) durant le protocole de telle sorte que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur l'efficacité de nos approches thérapeutiques. Les données seront analysées avec des tests statistiques non paramétriques. Les analyses sont généralement réalisées avec un nombre minimal de 6 animaux survivants par groupe. Les méthodes d'imagerie qui seront utilisées étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours du temps (J0 et J+14) et les paramètres étudiés seront mesurés chez le même animal.

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. L'ensemble des chirurgies de ce projet sera réalisé sous anesthésie générale associée à une analgésie péri-opératoire.

Choix des espèces

La recherche clinique sur l’hypertrophie chez l’homme est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est devenu indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un modèle de choix, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Les mêmes populations de cellules souches sont présentes. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 12 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 220 après vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses et en sucre. Chacune subit trois à cinq jeûnes de quatre heures, autant de gavages, et six prélèvements de sang en deux heures obtenus en coupant le bout de la queue puis en grattant la croûte à mesure qu'elle se reforme. Le porteur décrit le gavage comme "désagréable mais pas douloureux" et affirme que le régime gras et sucré "n'engendre aucune contrainte" pour les animaux. Le projet promet un dosage prédictif qui "permettrait" un meilleur suivi des patients atteints de stéatopathie métabolique, quand les vingt-quatre semaines de régime et les gavages sont, eux, programmés.

Objectifs

L’obésité peut entraîner des complications hépatiques nécessitant une prise en charge thérapeutique des patients. Ces complications sont regroupées sous le terme de NAFLD pour maladie du foie non alcoolique ou plus récemment MASLD pour dysfonction métabolique associées aux maladies du foie gras. La MASLD s’étend de la stéatose isolée et réversible (accumulation de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes) à l’inflammation hépatique ou stéatohépatite (MASH), la fibrose, la cirrhose et le cancer du foie. Si une stéatose qui reste bénigne est observée chez quasiment toutes les personnes obèses, l’évolution de la maladie vers des formes plus sévères n’est observée que chez certains patients. A l’heure actuelle, il n’y a pas de critères fiables permettant de prédire l’évolution de la pathologie chez les patients présentant des lésions précoces. L’impact de l’alimentation dans la MASLD et en particulier des lipides est clairement démontré. Toutefois, là encore tous les patients ayant des dyslipidémies ne développent pas des formes sévères de MASLD. Or, un des biais dans toutes ces analyses est le fait qu’elles soient toujours faites chez l’individu à jeun. Or après un repas, le métabolisme des lipides peut varier transitoirement en fonction de la sensibilité des patients. Basé sur ce concept, une étude clinique a été faite chez l’homme et à prouvé que les lipides modifiés juste après la prise d’un repas et appelés lipides post-prandiaux sont plus délétères chez des patients avec une MASLD avancée qu’avec une simple stéatose. Notre projet consiste à comprendre dans notre modèle murin, l’effet de ces lipides post-prandiaux sur les différentes cellules et organes métaboliques. La compréhension de ces mécanismes à des stades précoces de la maladie est essentielle pour disposer de marqueurs prédictifs de l’évolution des lésions hépatiques et améliorer le suivi des patients.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à documenter le rôle des lipides post prandiaux et leur impact sur les différents organes métaboliques au cours du développement de la MASLD. Cette compréhension permettrait de proposer ces dosages de lipides post-prandiaux, ou leurs cibles identifiées par notre étude, pour améliorer la prédiction de l’évolution des lésions hépatiques au cours de la MASLD et assurer un meilleur suivi des patients.

Procédures

220 souris seront soumises à un régime enrichi en graisses et sucre pendant 24 semaines. 360 souris seront soumises à un jeun imposé de 4h. Ce jeun sera effectué 3 fois pour 280 souris et 5 fois pour 80 souris. 280 souris auront 3 gavages par voie orale et 80 souris auront 5 gavages. Le temps de gavage tient entre 20 et 30 secondes. Les 360 souris auront un prélèvement de 6 gouttes de sang en l’espace de 2 heures représentant une quantité inférieure à 100 microlitres de sang.

Impact sur les animaux

Les régimes enrichis en graisses et sucre n’engendrent aucune contrainte pour les animaux. Le jeun imposé de 4h, le matin, correspond à une période digestive. Aucun effet indésirable n’est attendu. Le prélèvement de 6 gouttes de sang en 2 heures au niveau de la queue va engendrer pour les animaux un inconfort modéré pendant et après le prélèvement. On évalue la gêne et la douleur à ce qui se passe lors d’une piqure puis lors « d’un grattage d’une croutte ». Le gavage des animaux vigiles pour éviter une fausse route avec des canules souples minimise les lésions mécaniques. Le geste est désagréable mais pas douloureux. Les injections intra-péritonéales correspondent à la nuisance d’une piqure, le produit injecté n’étant pas agressif.

Devenir

A l’issu des procédures, les souris sont euthanasiés, différents tissus sont prélevés (vésicule biliaire, foie, tissu adipeux, muscle, intestins) afin de réaliser des analyses biochimiques, des analyses de sous types cellulaires ou de l'histologie.

Remplacement

Nous étudions dans notre modèle d’obésité l’impact d’un repas et des conséquences métaboliques qu’il engendre. Les approches expérimentales in vivo permettent d’intégrer les interactions entre alimentation, métabolisme et réponse des organes impliqués dans le métabolisme y compris l’absorption intestinale. L’ensemble de ces mécanismes ne sont pas actuellement accessibles par des techniques in vitro ou par des études in silico. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours pour étudier les effets sur ces différents organes est donc l’animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux euthanasiés, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base des quelques données disponibles sur les lipides post-prandiaux. Afin d’observer des différences significatives parmi ces lipides nous avons estimé que 8 souris par groupe d’étude étaient nécessaires pour obtenir des résultats significatifs lorsque l’on suit ces lipides 5 fois après le repas et que ce nombre était de 10 souris par groupe si on limitait à l’étude à 3 temps d’étude après le repas.

Raffinement

Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées par 4 ou par 5. L’enrichissement sera constitué d’un tunnel en plastique et une quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée. Les souris seront pesées toutes les semaines. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux, si nécessaire. Tout au long des procédures, les souris seront examinées régulièrement pour détecter des signes de de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Le jeûne imposé de 4h sera le matin, en période digestive avec un libre à un biberon d’eau. Lors du prélèvement des gouttes de sang, la coupure initiale au niveau de la queue sera réduite au minimum (de l’ordre du mm) puis comprimée par une compresse qui arrête le saignement. La récupération des 5 autres gouttes de sang se fera en ‘grattant la croûte’ nouvellement formée. Une compresse sera réappliquée en pression après chaque prélèvement. La surveillance de la bonne cicatrisation au point de prélèvement sera faite dans le cadre de la surveillance quotidienne des animaux. L’injection en intra-péritonéale est réalisée sans application préalable de lidocaïne afin d’éviter le stress de 2 contentions successives.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie sont proches de ceux observés chez l’Homme même si le stade n’évolue pas vers les formes les plus sévères. Le modèle de MASLD chez la souris est bien décrit dans la littérature et c’est un modèle largement utilisé par la communauté scientifique pour étudier cette pathologie. Ce projet vise à étudier le rôle des lipides post-prandiaux au cours de l’obésité chez l’adulte. Des souris adulte, agées de 6 semaines seront utilisées.

Chaque poisson zèbre reçoit une lésion du télencéphale, la moitié des individus ayant d'abord été mis en surnutrition pour reproduire le surpoids et l'hyperglycémie. 160 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués un, deux ou trois jours après la lésion pour analyse des tissus. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance notable, ni douleur ni stress, en s'appuyant sur des travaux antérieurs où, écrit-il, ces informations n'ont pas été rapportées. Il prévoit malgré tout des points limites, dont les mouvements circulaires, l'incapacité à se nourrir et une flottabilité anormale, qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Les maladies métaboliques (ex: diabète/obésité) constituent un enjeu majeur de Santé Publique à l’échelle mondiale car leurs prévalences augmentent depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, il a été démontré que ces pathologies étaient associées à des perturbations de l’homéostasie cérébrale (troubles de la mémoire, perte de substance grise) favorisant entre autres les accidents vasculaires cérébraux et aggravant leurs conséquences neurologiques. Plus largement, ces perturbations métaboliques semblent être délétères pour le fonctionnement du cerveau. De façon intéressante, lors des dommages cérébraux, ces pathologies ont un impact négatif sur la taille des lésions et la récupération fonctionnelle (élocution, locomotion, sensibilité, ...). Cependant, les impacts réels de lces perturbations métaboliques sur les mécanismes propres à la réparation cérébrale ne sont pas bien connus. Les objectifs du projet sont de comprendre l'impact du surpoids sur les mécanismes de réparation cérébrale en utilisant le poisson zèbre. Cet animal est un modèle reconnu de plasticité et de réparation cérébrales. C'est aussi un modèle permettant de mimer des situations de surpoids associés à une hyperglycémie. Dans ce contexte, nos sous-objectifs sont de déterminer l'impact de ce surpoids sur la mort cellulaire à la suite d'une lésion cérébrale, (2) sur l'angiogenèse régénérative (création de nouveaux vaisseaux), (3) sur le recrutement de la microglie au site de la lésion, et enfin (4) la neurogenèse régénérative permettant de générer de nouveaux neurones pour remplacer ceux qui sont morts à la suite de la lésion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et affectés par des désordres métaboliques et la surnutrition lors d'un dommage cérébral. Il pourrait permettre d'identifier des problèmes de réparation induite lors de ces maladies métaboliques (ex: suractivation microgliale, problème d'activation des cellules souches). Ainsi, cette meilleure compréhension du fonctionnement régénératif en condition de perturbations métaboliques pourrait permettre de mettre en œuvre des thérapies favorisant ou limitant ces processus (ex: limiter la mort cellulaire, limiter la neuroinflammation, favoriser la neurogenèse). A terme, ce projet a pour but de favoriser la réparation cérébrale dans des conditions qui lui sont délétères (ex: hyperglycémie) afin de limiter les conséquences de dommages cérébraux.

Procédures

La moitié des animaux seront surnutris de façon volontaire (non forcée). L'ensemble des animaux contrôles et surnutris sera lésé au niveau du télencéphale puis euthanasié 1,2 ou 3 jours après la lésion (à la fin du protocole de nutrition) afin de déterminer l'impact de la surnutrition sur les différentes phases de la réparation cérébrale.

Impact sur les animaux

Des expériences précédentes sur les modèles de lésions chez le poisson zèbre n'ont pas révélé de nuisances notables (ex: surmortalité, troubles du comportement, stress, douleur). Il en est de même sur les modèles de surnutrition chez le poisson zèbre. Aussi, même si des lésions cérébrales chez le poisson zèbre en condition de désordres métaboliques (entre autres surpoids) pourraient impacter certains processus régénératifs, nous n'attendons pas de nuisances et/ou effets indésirables entrainant des douleurs ou stress par rapport aux données précédentes de la littérature pour lesquelles ces informations importantes n’ont pas été rapportées, ni même observées au laboratoire. Nous hypothésons que les cinétiques de réparation vont être ralenties par rapport à une situation contrôle. Les nuisances associées aux lésions peuvent être du stress, des modifications du comportement et une mortalité. Ces nuisances sont exceptionnelles et n'ont que rarement été rapportées dans la littérature.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie.

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.

Réduction

Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. Des analyses statistiques et une étude bibliographique ont été réalisées pour déterminer le nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur aquarium. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). Les données bibliographiques et notre expérience du modèle ne rapporte pas de comportements de souffrance anormale, de modification de la prise alimentaire, du comportement locomoteur notable, et de stress que ce soit à la suite d'une lésion ou d'une surnutrition.

Choix des espèces

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. La situation de surpoids/obésité associé à une hyperglycémie peut être mimée en mettant les animaux en surnutrition. Ceci permet de mimer les conditions pathologiques du surpoids/obésité humaine. De plus, c’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Des animaux sexuellement matures du même âge entre les groupes (âge entre 3 et 18 mois)

320 souris Nude, dépourvues des défenses immunitaires qui leur permettraient de rejeter des cellules humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales mammaires dans la glande ou dans la veine de la queue, quatre injections de traitement, une mesure de tumeur trois fois par semaine, et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie dans un second établissement. La question posée porte sur le rôle d'un transporteur d'acides gras dans la progression du cancer du sein triple négatif. Le porteur présente la souris Nude comme "l'un des rares modèles" permettant de greffer des tumeurs humaines sans rejet, et justifie l'âge retenu, six semaines, par la comparabilité avec les données déjà publiées.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer en termes d’incidence et en termes de mortalité chez les femmes. Dans le contexte du cancer du sein, le constituant majoritaire de l’environnement entourant la tumeur est le tissu adipeux, dont les adipocytes constituent une majeure partie. Le développement tumoral s’accompagne de besoins énergétiques important et les cellules tumorales disposent de plusieurs sources d’énergie, dont les lipides. Il a été montré une expression importante d’un transporteur d’acides gras par les cellules tumorales mammaires les plus agressives entraînant une captation élevée d’acides gras et augmentant leur agressivité. En exprimant ce transporteur, les cellules tumorales pourraient potentialiser leur capacité à former des métastases en favorisant leur captation d’acides gras apportant une source d’énergie importante permettant à ces cellules tumorales de migrer et survivre à distance de la tumeur mammaire. Cette participation au processus métastatique semble être une caractéristique commune à plusieurs types de cancers et, cliniquement, les chercheurs ont observé que la présence de cellules exprimant ce transporteur d’acides gras était corrélée avec des tumeurs très agressives et un mauvais pronostic. Ces résultats suggèrent donc que ce transporteur d’acides gras est une « signature » des cellules qui ont le potentiel de former des métastases. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette protéine dans la progression du cancer du sein. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de l’indisponibilité de certains équipements d’imagerie dans l’établissement principale. Cette demande complémentaire concerne un projet préalablement autorisé dans lequel une étape nécéssite une expertise spécifique non disponible en interne, aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté par rapport au projet principal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier le rôle d’un transporteur d’acides gras dans la progression tumorale et métastatique mammaire. A travers la compréhension de son rôle et des conséquences de son inhibition sur le développement du cancer du sein nous pourrons mettre en évidence que cette protéine est une cible thérapeutique intéressante dans le cancer du sein, particulièrement dans les cancers les plus agressifs et notamment au stade métastatique. Cela ouvrira de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement du cancer du sein triple négatif. De plus, ce transporteur se retrouve surexprimé non seulement dans le cancer du sein mais dans d’autres cancers également, la compréhension de son rôle dans la progression cancéreuse et comme potentielle nouvelle cible thérapeutique est donc également intéressante et potentiellement applicable dans le cadre d’autres types de cancer.

Procédures

Le modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Injections unique orthotopiques (15 seconde/animal) dans la glande mammaire après traitement hormonale dans l’eau de boisson (15 jours) ou ii) intraveineuse de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine sur animal vigile (2 minutes/animal) iv) Injection intrapéritonéale des traitements sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Transport vers un autre établissement et imagerie sur animal anesthésié (12 séance maximum, 30 min) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : 1) L’immunodéficience du modèle animal réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. 2) Le stress de la nouveauté (néophobie) lors des changements de conditions (traitement dans l’eau de boisson, nouveau régime alimentaire, ou encore lors du transport vers un autre site pour l’imagerie) 3) Le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la glande mammaire suite aux injections des cellules tumorales. 4) Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. 5) Les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) durant l’imagerie.

Devenir

A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=320) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements au sein du dernier établissement où ils seront hébergés. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.

Remplacement

Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cultures cellulaires ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe ou d’injection en intraveineux chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.

Réduction

Le projet impliquera un total de 320 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, formation, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, suivi, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce et les cellules injectées pourront proliférer sans être rejetées. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.

Le criblage d'anticorps et de cellules immunitaires modifiées détenus par le laboratoire tient lieu d'objectif, avec l'évaluation un à un de "candidats médicaments" anticancéreux puis de leurs combinaisons. 2 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de la tumeur et du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est pucée, reçoit une greffe de tumeur humaine ou murine sous la peau ou dans le cerveau, puis jusqu'à trois injections sur trois mois, le suivi pouvant durer neuf mois. Les greffes sous-cutanées peuvent se développer jusqu'à l'inflammation, la nécrose ou l'ulcération, et le porteur conclut que le recours aux modèles animaux est "indispensable" tout en revendiquant un engagement à minimiser leur nombre.

Objectifs

Il est essentiel de rechercher de nouvelles thérapies contre le cancer pour améliorer les chances de survie des patients et réduire les effets secondaires des traitements actuels. Dans cette perspective, notre projet se concentre sur l'évaluation de divers médicaments potentiels pour le traitement du cancer Dans le domaine des traitements médicaux contre le cancer, il existe une approche qui consiste à exploiter le potentiel du système immunitaire pour combattre le cancer. Cette méthode comprend l'utilisation d'anticorps, qui sont essentiellement des protéines conçues pour cibler et neutraliser des substances spécifiques dans le corps, y compris les cellules cancéreuses. En outre, il est possible de manipuler génétiquement certaines cellules du système immunitaire pour qu'elles soient équipées d'un récepteur spécial, appelé récepteur antigénique chimérique (CAR), qui leur permet de reconnaître et d'attaquer spécifiquement les cellules cancéreuses. En somme, ces approches thérapeutiques visent à armer l'organisme pour qu'il puisse mieux lutter contre le cancer. Nous évaluerons également des thérapies combinées, en associant les traitements les plus prometteurs, sur des modèles murins portant différentes formes de cancer. Le projet se divise en trois phases : (1) Évaluation de l'efficacité des médicaments candidats, y compris les anticorps traditionnels et les formulations modifiées, ainsi que les approches innovantes avec les cellules immunitaires modifiées. (2) Évaluation des médicaments candidats en combinaison, pour maximiser leur efficacité en utilisant différents types d'anticorps et/ou en y ajoutant les cellules immunitaires modifiées. (3) Si nécessaire, création de nouveaux modèles animaux pour approfondir la recherche sur les thérapies anti-cancéreuses

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et promettent de contribuer de manière significative à la recherche et au traitement du cancer : 1- Compréhension des capacités thérapeutiques de chaque « candidats médicaments » : Ce projet permettra une évaluation complète des différents formats d'anticorps en notre possession, , ainsi que des cellules du système immunitaire modifiées. Cette compréhension approfondie des avantages et des limites de ces « candidats médicaments » guidera le développement de thérapies plus efficaces contre le cancer. 2- Optimisation des traitements anticancéreux : En identifiant les « candidats médicaments » les plus prometteurs pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, ce projet contribuera à l'optimisation des traitements anticancéreux. 3- Diversité des approches thérapeutiques : L'évaluation de diverses approches élargira le champ des options thérapeutiques disponibles pour les patients atteints de cancer. Cela ouvre la porte à des traitements plus personnalisés et adaptés aux caractéristiques spécifiques de chaque tumeur. 4- Amélioration de la recherche en cancérologie : Les données générées par ce projet enrichiront la base de connaissances en cancérologie. Elles serviront de référence pour d'autres chercheurs. 5- Réduction de la toxicité des traitements : En développant des thérapies plus ciblées, ce projet vise à réduire la toxicité des traitements anticancéreux, ce qui améliorera la qualité de vie des patients. Les résultats de ce projet pourraient déboucher sur des traitements anticancéreux innovants et prometteurs qui devront être évalués dans des essais cliniques ultérieurs. En fin de compte, ce projet contribuera à faire progresser la lutte contre le cancer en élargissant notre compréhension des stratégies thérapeutiques et en ouvrant la voie à des traitements plus efficaces, mieux tolérés et plus adaptés aux besoins individuels des patients.

Procédures

Les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une série d'interventions destinées à évaluer l'efficacité de divers "candidats médicaments" dans le traitement du cancer : - Pose de puce en souscutané pour l’identification des animaux (moins de 1 minutes - 1 fois) -Xénogreffes sous-cutanées et intracérébrales (moins de 1minutes - 1 fois par animal) : Les animaux seront implantés avec des xénogreffes portant des lignées tumorales humaines ou murines. Les xénogreffes peuvent être sous-cutanées ou intracérébrales, en fonction des modèles expérimentaux. - Administrations des candidats médicaments : Les candidats médicaments seront administrés aux animaux, et la manière dont cela se fait dépendra de leur formulation. Jusque 3 injections sur une période de 3 mois seront réalisées (durée injection moins de 1 minutes). - Suivi de l'efficacité thérapeutique (au cours de l’étude – durée environ 2 minutes par animal) : L'efficacité thérapeutique sera évaluée en mesurant la régression tumorale dans le cas des xénogreffes sous-cutanées, la survie des animaux pour les xénogreffes intracérébrales, ou une combinaison de ces deux indicateurs. Un maximum de 2380 animaux seront engagés dans cette procédure pour une durée maximal de 9 mois par expérimentation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus comprennent des réactions comportementales telles que l'agitation ou l'apathie en réponse aux procédures ou aux traitements, ainsi que la possibilité de douleur et de détresse causées par des interventions chirurgicales ou autres procédures expérimentales. Les animaux ayant reçu une xénogreffe intracérébrale peuvent présenter une perte de poids et des déséquilibres lors de l'évolution de la tumeur. Les xénogreffes sous-cutanées peuvent se développer de manière significative, entraînant des problèmes tels que des inflammations, des nécroses ou des ulcérations au site de la greffe. De plus, les traitements expérimentaux peuvent influencer négativement l'alimentation et la croissance des animaux, certains pouvant perdre l'appétit ou subir une perte de poids, ce qui affecte leur santé générale.

Devenir

A la fin des procédures les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem de la tumeur et du cerveau.

Remplacement

Dans un premier temps, nous effectuons des analyses in vitro des "candidats médicaments" sur des modèles cellulaires tumoraux pour évaluer leur impact sur différentes lignées tumorales. Cette étape est cruciale pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Nous soumettons toutes nos stratégies thérapeutiques à une évaluation in vitro visant à confirmer l’efficacité des « candidats médicaments » in-vitro Cette approche permet de réduire considérablement le recours aux tests sur animaux. Cependant, il est important de noter que les modèles in vitro ne peuvent pas totalement reproduire l'interaction complexe entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Pour approfondir nos recherches, l'utilisation de modèles animaux est indispensable, tout en respectant notre engagement de minimiser leur nombre. Notre objectif principal est de contribuer de manière significative à la compréhension des mécanismes tumoraux et au développement de nouvelles thérapies, en tenant compte du bien-être des animaux de laboratoire.

Réduction

Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs.

Raffinement

La surveillance quotidienne des souris logées en groupe dans un environnement enrichi, qui offre une variété de stimulations cognitives et motrices, ainsi que l'application de critères d'arrêt à la fois en phase d'élevage et lors des expérimentations, sont essentiels pour garantir leur bien-être. En cas de manifestations inattendues, le vétérinaire de l'installation sera immédiatement informé afin de mettre en place des traitements appropriés, qu'il s'agisse de soutien nutritionnel ou de l'administration de médicaments. L'état de santé des animaux sera étroitement surveillé tout au long de l'expérience. Le protocole d'anesthésie et d'analgésie lors des procédures chirurgicales a été élaboré de manière précise afin d’assurer que les animaux ne souffrent pas. Les animaux bénéficieront d'une période d'adaptation lors de leur arrivée à l'animalerie, de temps de récupération après une intervention chirurgicale, et d'une familiarisation progressive avec les manipulations nécessaires pour leur traitement quotidien. Tout cela vise à maintenir des conditions physiologiques optimales et à minimiser le stress et la souffrance pendant le déroulement du protocole.

Choix des espèces

Les souris sont des espèces fréquemment utilisées en recherche translationnelle, notamment dans le domaine de l'évaluation de traitements anti-cancéreux. Notre laboratoire possède une expertise avancée dans la mise en place de protocoles de xénogreffe des cellules tumorales in vivo, qu'il s'agisse d'implantations orthotopiques ou hétérotopiques, et nous maîtrisons pleinement ces modèles animaux. Les souris, en raison de leur petite taille, de leur développement rapide et de leurs similitudes marquées en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme, offrent une plateforme idéale pour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Le présent projet a pour but d'étudier les effets d’un traitement anticancéreux sur des sujets pleinement matures. Les animaux étudiés seront donc des adultes (2-4 mois) au moment des expérimentations.

36 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie et remis à disposition d'une autre procédure expérimentale après un repos. Les 18 chats de la première phase reçoivent jusqu'à cinq injections de xylazine ou de dexmédétomidine pour provoquer nausées et vomissements, qui peuvent durer jusqu'à quatre heures, et les 18 autres reçoivent la molécule retenue après un antivomitif, une fois puis jusqu'à cinq fois. Ces molécules peuvent aussi entraîner hypersalivation, dépression respiratoire, ralentissement du cœur et baisse de température, et les chats ne reçoivent qu'un tiers de leur ration avant les injections, pour réduire le volume vomi. Le porteur décrit l'antivomitif comme un produit vétérinaire longue durée en développement, et nomme le maropitant, substance active déjà présente dans un médicament vétérinaire autorisé. Les 18 mêmes chats, répartis en deux groupes de 9, forment selon lui le "nombre d'animaux maximum pour avoir des résultats interprétables" en phase 2, puis le "nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables" en phase 3.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : - Mise en place d’un modèle de nausées/vomissements en sélectionnant entre deux molécules chez le chat. - Validation du modèle chez le chat afin de provoquer des signes cliniques mesurables, répétables et homogènes entre les animaux et pouvant être inhibés par l’utilisation d’antiémétiques. - D’évaluer l’efficacité chez le chat d’un antiémétique vétérinaire longue durée en cours de développement sur ce modèle induit et de réaliser une pharmacocinétique et une évaluation de la tolérance du site d'injection.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de contribuer au développement de nouveaux médicaments vétérinaires antiémétiques suite au modèle de nausées et vomissements mis en place chez le chat. Le développement de ces nouveaux médicaments permettra de prévenir les nausées et vomissements à moyen terme et de pallier aux effets secondaires de certains médicaments. Le vomissement est l’effet secondaire le plus fréquent de différents médicaments en pratique vétérinaire. Ce signe clinique peut limiter l’efficacité des doses administrées et causer une gêne considérable qui diminue le confort et la qualité de vie chez le chat.

Procédures

Toutes les administrations et les prélèvements se feront avec une contention manuelle légère. Phase 1 : Injections intra-musculaires des éléments testés d'une durée inférieur à 10 secondes maximum avec une fréquence d'au moins 7 jours et répétées au maximum 5 fois sur animaux vigiles. Possibles injections de produit réversant les effets des éléments tests en intra-musculaire si besoin. Phase 2 : Injection sous-cutanée de l'anti-vomitif d'une durée de 10 secondes maximum une fois, suivie d'une injection intra-musculaire 22h d'une durée de moins de 10 secondes après de l'élément test sélectionné (en Phase 1) sur animaux vigiles. S'en suivra une période de wash-out d'au moins 15 jours. Phase 3 : Injection sous-cutanée de l'anti-vomitif à tester d'une durée de 10 secondes maximum une fois, suivie d'une injection intra-musculaire d'une durée de moins de 10 secondes de l'élément test sélectionné (en Phase 1) sur animaux vigiles et répétées au maximum 5 fois en respectant une période de wash-out d'au moins 7 jours. Des prélèvements sanguins seront réalisés au niveau des veines jugulaires sur animal vigile, par un personnel expérimenté. Un nombre maximal de 10 prélèvements sur les 24 premières heures puis 1 maximum/jour sur 5 jours. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Durée d'un prélèvement inférieur à la minute et de maximum 0.8 mL par prélèvement.

Impact sur les animaux

Un des objectifs de ce projet est l’induction de nausées et vomissements chez le chat. Il est démontré que ces effets sont à durée doses-dépendantes et pouvant aller jusqu’à 4h post-administration. Les effets indésirables pouvant également être observés en fonction de différents éléments tests sont les suivants : - Les deux éléments tests utilisés pour induire ces signes cliniques (Xylazine et la Dexmedetomidine) sont deux agonistes des récepteurs alpha-2 adrénergiques utilisés en première intention pour induire la sédation à doses plus importantes. Ces molécules peuvent inhiber la motilité intestinale normale, une hypersalivation, irritation au site d’injection et provoquer une sédation dose-dépendante pouvant amener à une dépression respiratoire, une bradycardie et une diminution de la température corporelle. - L’anti-émétique, le Maropitant, est une substance active présente dans un produit vétérinaire ayant une AMM. Il a été démontré que les animaux traités peuvent fréquemment présenter une douleur au site d’injection si le produit est stocké à température ambiante qui n’est pas observé s’il est stocké au frigo.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de vérifier l’efficacité d’un traitement antivomitif. Ici, le chat représente l’espèce cible pour le développement de cette nouvelle molécule.

Réduction

Pour la phase 1: 18 animaux sont prévus pour choisir la molécule et son bon dosage afin d’induire un modèle nausées/vomissements fiable et répétable. C'est le nombre maximal d'animaux pour choisir la molécule. Pour la phase 2: 18 autres animaux seront prévus. Les 18 animaux seront répartis en 2 groupes de 9. C'est le nombre d'animaux maximum pour avoir des résultats interprétables. Pas d'approche statistique réalisé pour ce projet. Pour la phase 3 : les mêmes 18 animaux de la phase 2 seront inclus. Les 18 chats seront répartis en 2 groupes de 9. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables. Pas d'approche statistique réalisé pour ce projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets suspendus, griffoirs, plateformes et coussins). Pour limiter les quantités de vomissement en volume et l’acidité gastrique, les animaux auront été nourris 30min à dose réduite (1/3 de la ration journalière) avant l’administration des molécules vomitives. Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués au minimum 2h et au maximum quatre heures après l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Un suivi soutenu (plusieurs fois les premières heures) sera mis en place permettant l'observation générale des animaux et la détection précoce d'éventuels effets du produit sur l'animal. Des mesures adaptées seront mises en place pour assurer son bien-être et/ou limiter sa souffrance. Les tests s’arrêteront lorsque les points limites standards seront atteints : - signes de douleur ou de détresse sévères, incompatibles avec la poursuite du test (ex : vomissements très intenses à répétition, douleur abdominale, difficultés respiratoires…) - signe de déshydratation qui nécessite une fluidothérapie. - perte de poids supérieure à 20% du poids total du chat sur une période de 2-4 jours avec dégradation importante de l’état général sans amélioration rapide malgré une supplémentation en aliment humide plus riche. - toute situation qui rend l'animal incapable de se déplacer, de s'alimenter ou de s'abreuver de manière autonome. - choc anaphylactique à une molécule utilisée et associé à des symptômes tels que : dépression, hypothermie (< 37°C) et/ou dyspnée, gonflements. Dans tous les cas, le vétérinaire sera informé dans les plus brefs délais et prendra en charge l’animal concerné avec des soins appropriés et l’animal sera exclu de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le chat est l’espèce cible pour la mise en place du modèle de nausées et vomissements et pour le développement d’un traitement antivomitif longue durée. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chats adultes (>1 an et

Maintenues à plus de 85 % de leur poids normal par une restriction alimentaire, et isolées en cage individuelle de deux à cinq semaines, les souris de ce projet doivent rester motivées par la récompense alimentaire des tâches de mémoire. 400 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant cérébral posé au cours d'une chirurgie de quatre à six heures, puis son activité cérébrale est enregistrée environ deux semaines, jusqu'à quatre heures par jour pendant son sommeil, pour étudier le rôle des astrocytes dans la consolidation de la mémoire. Le porteur qualifie la restriction alimentaire de légère et affirme, littérature à l'appui, que cette restriction et l'exercice dans les labyrinthes sont bénéfiques pour la santé et le vieillissement des souris.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester le rôle des astrocytes dans la théorie standard des mécanismes de formation et de consolidation de la mémoire, qui attribue un rôle critique à l'hippocampe et à ses partenaires corticaux et sous-corticaux, notamment pendant le sommeil. Notre attention sera portée sur le rôle des astrocytes dans l’émergence de certains rythmes du sommeil afin de comprendre leur rôle dans la plasticité de l’hippocampe. Nous entraînerons donc des souris à effectuer des tâches de mémoire impliquant ces systèmes, nous enregistrerons l’activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil qui précède et qui suit l’apprentissage, et nous tenterons également d'altérer les performances mnésiques en modifiant la dynamique cérébrale au moyen de mutations ciblées au niveau des cellules gliales astrocytaires. Nos expériences incluront également des groupes contrôles. Des souris seront utilisées pour toutes les étapes de ce projet. La souris est un modèle standard pour l’étude de la mémoire aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires de la formation et de la consolidation de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, nos travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.

Procédures

Ce projet utilisera au maximum 400 souris. Pour étudier les bases neurales de la mémoire, les animaux sont entraînés à effectuer des tâches de mémoire spatiale dans une cage ouverte ou dans des labyrinthes. Si l’accomplissement de ces tâches repose sur la motivation des animaux à obtenir des récompenses alimentaires, une légère restriction alimentaire est nécessaire à leur motivation. Pour permettre une restriction précise, les animaux sont maintenus dans des cages individuelles, à proximité directe de leurs congénères, dans des cages transparentes pour assurer une contiguïté visuelle, auditive et olfactive. La littérature scientifique montre que la légère restriction alimentaire (>85% du poids normal à l’âge de l’animal) et l’exercice physique dans les labyrinthes sont bénéfiques pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. Les animaux reçoivent un implant chirurgical (1 fois, typiquement 4–6 h) pour pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (typiquement pendant 2 semaines) pendant l’accomplissement de la tâche (typiquement 1h/jour d’enregistrement) ainsi que pendant le sommeil lorsque la mémoire se stabilise à long terme (typiquement 2–4h/jour d’enregistrement). Les tâches d'apprentissage peuvent inclure de phases courtes (familiarisation de 20minutes) ou longues selon la capacité de l'animal à apprendre la tâche (durée des tests : jusqu'à 2h, une fois par jour, pendant au maximum 1 mois). Dans le cas d'un apprentissage court, la phase de test dure 10 minutes et la tâche comportementale peut-être répétée 2 fois à 2 semaines d'intervalle. Les animaux concernés sont isolés de 2 à 5 semaines. Les animaux concernés par la restriction alimentaire le sont pendant 5 semaines maximum. Pour les animaux concernés, une expression intracérébrale de protéines d'intérêt sera également pratiquée (1 fois, typiquement 1–2h). Une analyse histologique permettra de vérifier les sites d’enregistrement ou d’expression.

Impact sur les animaux

Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue, peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et des douleurs post-opératoires. Certains animaux peuvent être maintenus dans des cages individuelles pendant une durée limitée et peuvent être soumis à une restriction alimentaire précise. Les animaux seront étudiés pendant leur période de repos car nous souhaitons aussi enregistrer leur sommeil. Ceci constitue un désagrément mineur puisque la tache comportementale dure relativement peu de temps et leur sommeil est naturellement fragmenté comparé à l'humain.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Dans le laboratoire, nous avons développé un modèle in vitro d’ondes hippocampiques qui a permis d’élaborer notre hypothèse de l’implication astrocytaire dans les ondes cérébrales du sommeil. Cependant, in vitro il n’est ni possible de reproduire un apprentissage comportemental ni de créer de façon satisfaisante un état comparable au sommeil. Tous deux nécessitent un réseau plus large que l’hippocampe qui n’est pas réalisable in vitro. De plus, certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico (modèles computationnels) mais les propriétés des astrocytes ne sont pas assez connues pour pouvoir en déduire des informations fiables biologiquement. In fine, l’étude des mécanismes de réseau de formation et de consolidation de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer à la fois un grand nombre d’astrocytes et des nombreux sites cérébraux (32 canaux répartis entre le circuit thalamocortical et l'hippocampe) simultanément ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. L'approche statistique tirera profit des tous derniers développements statistiques et analytiques du domaine. Ainsi, nos approches analytiques s’appuient sur de nombreux tests statistiques : tests paramétriques standards et tests non paramétriques.

Raffinement

Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour l’ajustement et l’optimisation de la position des sondes d’enregistrement, soit vigiles, libres de leurs mouvements (et non tête fixée) pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pour limiter le stress dû à l’isolement, nous utiliserons des cages transparentes placées à proximité les unes des autres, de façon que les animaux puissent rester en contact visuel, auditif et olfactif.

Choix des espèces

Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés (électrophysiologie à grande échelle, vecteurs viraux, optogénétiques). En outre, les souris peuvent porter une mutation génétique capable d’exprimer un marqueur fluorescent sensible au calcium et de marquer ainsi l’activité calcique des astrocytes, ce qui est à ce jour le seul moyen de suivre leur activité pendant la dynamique du cerveau au cours du sommeil. Nous utiliserons des souris adultes (2-8mois) pour lesquels, l'apprentissage et le sommeil sont bien caractérisés.