Procédures modérées

52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intraveineuse de cellules tumorales, puis jusqu'à seize cycles d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avant une injection d'anticorps couplé à un métal radioactif et quatre anesthésies de quarante-cinq minutes en quatre jours consécutifs. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet de générer des métastases et que seul un "organisme complexe" reproduit ce que l'on rencontre chez le patient. Les métastases pulmonaires provoquent une perte de poids et des troubles respiratoires bien réels, quand le bénéfice annoncé reste un espoir pour les malades d'un sous-type de cancer du rein qui représente 5 % des cas.

Objectifs

Le rein est un élément central dans la régulation de l'homéostasie. Ils filtrent le sang et produisent un certain nombre d’hormones capitales dans la régulation de la tension artérielle. Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique avec ~400 000 nouveaux cas par an dans le monde. Ce projet vise à cibler une protéine, initialement décrite comme participant au développement du cerveau, dans un sous-type de cancer du rein, dit chromophobe. En effet, cette protéine est spécifiquement exprimée par les cellules de la tumeur primaire et des métastases de cancer du rein chromophobe. Nous prendrons l’avantage du développement au laboratoire d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt couplé à un métal radioactif, technique appelée radiothérapie interne vectorisée. Cette technique permet soit de détecter des métastases par imagerie nucléaire ou de cibler thérapeutiquement les cellules tumorales sous l’effet des rayonnements ionisants. Ces candidats médicaments seront testés sur un modèle tumoral murin. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les cancers du rein chromophobe sont une maladie rare. Elle ne touche que 5 % des cancers du rein. Actuellement, ce sous-type de cancer du rein fait l’objet de très peu de recherche et par conséquent les perspectives thérapeutiques de ces patients sont pauvres. Par ailleurs, les patients métastatiques n’ont quant à eux aucune perspective thérapeutique, puisqu’ils reçoivent le traitement de référence des autres sous types de cancer du rein. Ce dernier n’a jamais montré d’efficacité thérapeutique dans leur pathologie. Ainsi, notre projet pourrait permettre de développer la première stratégie thérapeutique spécialement dédiée au cancer du rein chromophobe et apporter un espoir à ces patients métastatiques pour qui l’issue est aujourd’hui fatale.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront tous une injection intraveineuse des cellules tumorales (2 minutes), puis au cours du suivi longitudinal hebdomadaire, ils seront au maximum soumis à 16 cycles d’imagerie (Injection d’un traceur et une anesthésie gazeuse à l’isoflurane durant l’acquisition 10 minutes). Ces gestes seront réalisés dans l'établissement utilisateur 1. Ensuite dans l'établissement utilisateur 2, certains animaux recevront une injection intraveineuse du composé pour l’imagerie sous anesthésie gazeuse (détection des métastases). Ces derniers seront ensuite soumis à 4 anesthésies gazeuse de 45 minutes pour l’imagerie nucléaire (4 jours consécutifs). Une autre partie des animaux recevront une injection intraveineuse du composé thérapeutique sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux développeront des métastases pulmonaires. L’apparition de ces métastases peut être associé à une perte de poids et à des problèmes respiratoires.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour réaliser une analyse histologique des tumeurs.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous cherchons à voir si notre molécule pourrait être utilisable pour la détection et le ciblage thérapeutique de métastases de cancer du rein chromophobe. Afin de tester l’effet de notre molécule sur des métastases, nous utilisons des modèles animaux, car il n’existe pas d’autre solution pour générer des modèles de métastases autrement que par des expériences in vivo. Seul un organisme complexe permet de récapituler les caractéristiques physiques et biologiques que l’on retrouve chez le patient (accessibilité du traitement au cellules tumorales, notamment).

Réduction

Afin de réduire considérablement nos effectifs, nous avons choisi d’utiliser une approche de suivi longitudinal par imagerie. De plus, le nombre d’animaux a été déterminé par des approches statistiques nous permettant de répondre à notre question biologique.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : La plupart des interventions sur les animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). De plus, nous utiliserons le suivi longitudinal par imagerie pour suivre l’apparition des foyers métastatiques. De la sorte, nous serons dans la capacité d’arrêter la procédure avant l’apparition de signes cliniques. Nous avons également mis en place une grille de scoring. En fonction du score, les animaux recevront un analgésique ou ils sortiront de la procédure (mise à mort).

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Procédure 1 à 3 : 3: La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. Au début du projet, Les animaux sont âgés de 6 à 8 semaines car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

Tuées pour des prélèvements d'organes ou de fluides à un volume qui ne permet pas la survie, ou réutilisées dans un autre projet après accord du vétérinaire : sur 780 souris, 450 passeront dans d'autres protocoles. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, suspendues par la queue pendant sept minutes, le temps qu'elles passent immobiles étant retenu comme mesure du comportement dépressif. Une partie reçoit vingt-quatre heures avant un agent pro-inflammatoire qui fait baisser leur activité, leur fréquence respiratoire et leur température, puis des candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant sept jours. Le porteur qualifie le stress de la suspension de transitoire puisque le test ne dure pas plus de sept minutes, et indique que les effets indésirables des produits seront anticipés avec le sponsor avant chaque étude.

Objectifs

La dépression, ou épisode dépressif caractérisé, est un trouble psychiatrique sévère touchant jusqu'à 20% de la population générale. Cette pathologie se caractérise par l'apparition de plusieurs symptômes comme la tristesse ou la perte de plaisir et de motivation. La dépression peut entraîner le décès du patient, notamment par suicide (jusqu'à 20% des patients atteints de dépression décèdent par suicide) (INSERM, 2019). Bien que la recherche a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes causant la ce trouble psychiatrique (comme l'inflammation ou des déficits en neurotransmetteurs), la majorité des traitements se limite aujourd'hui aux antidépresseurs. Malheureusement, ces traitements manquent d'efficacité et leur consommation s'accompagne de nombreux effets secondaires. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements pour combattre la dépression. Pour ce faire, plusieurs modèles et tests comportementaux chez l'animal existent afin de mettre en lumière des effets antidépresseurs avant caractérisation chez l'homme lors des essais cliniques. C'est par exemple le cas du test de suspension par la queue chez la souris ("tail suspension test": TST). Le test de suspension par la queue chez la souris permet de mesurer un comportement dépressif. Ce test repose sur le fait que les animaux soumis au stress inéluctable et de courte durée d'être suspendus par la queue développent une posture immobile. Ce comportement peut être exacerbé par des agents chimiques pro-inflammatoires puisque l'inflammation à un rôle dans la dépression. Divers médicaments antidépresseurs inversent l'immobilité et favorisent l'apparition d'un comportement de fuite. Le but du projet est donc de tester plusieurs candidat-médicaments indiqués pour la dépression dans le test de suspension par la queue chez la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter la dépression, une pathologie humaine touchant 20% de la population globale (INSERM, 2019). Du fait de leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer l'efficacité de nouveaux traitements antidépresseur dans un modèle expérimental de dépression mais également, d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant leur passage en phases cliniques. Ainsi, ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les animauxpourront reçevoir une administration d'un agent chimique pro-inflammatoire 24h avant le test (1 administration, env. 30sec l'administration) et reçevont des administrations de candidats-médicaments (généralement 1 administration aigue jusqu'à maximum 2 administrations par jour pendant maximum 7 jours, avec environ 2 minutes par administration) et des prélèvements (environ 3 minutes par prélèvement) et éventuellement une anesthésie en fin d’expérience pour des prélèvements. Les animaux passeront dans le test où ils seront suspendu par la queue pendant 7 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances associées au test sont l'inconfort/ douleur légère et brève et le stress induits par les administrations et la suspension de l'animal par la queue lors du test, un stress qui restera transitoire puisque le test ne durera pas plus de 7 minutes. Des effets connus et transitoires de l'agent chimique pro-inflammatoire sont également attendus à la dose max de 1mg/kg utilisée dans ce projet: baisse d'activité, de la fréquence respiratoire, et de la température. Ces effets sont transitoires et ne durent pas plus de 24h. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude avec le Sponsor afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux et/ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptomes de la dépression. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe (10 animaux par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur la depression du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

720 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le composé à tester, son véhicule ou la molécule de référence, jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines au maximum, avec des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires. L'expérience se termine par une chirurgie sous anesthésie sans réveil, pendant laquelle une éjaculation est provoquée par un médicament et enregistrée trente minutes durant. Le porteur limite le stress attendu au début de l'expérience et présente cette étape préclinique comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain, pour une dysfonction sexuelle que deux médicaments traitent déjà en France.

Objectifs

L’éjaculation prématurée (ou précoce, EP) est une dysfonction sexuelle masculine caractérisée par (définition de la société internationale de médecine sexuelle): • une éjaculation qui survient toujours, ou presque toujours, avant la pénétration vaginale, ou au cours de la minute qui la suit (EP primaire), ou une diminution significative de la latence de l’éjaculation, souvent inférieur à 3 minutes (EP acquise) et • une incapacité à retarder l’éjaculation lors de toutes ou presque toutes les pénétrations vaginales, et • des conséquences personnelles négatives, telles que frustration, soucis, souffrance psychologique et l’évitement de l’intimité sexuelle. L'éjaculation prématurée, qui peut occasionner une altération significative de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple, représente la dysfonction sexuelle masculine la plus répandue, affectant entre 5 et 30% des hommes selon les études. Aux Etats-Unis, aucun médicament n’a reçu d’autorisation pour la prise en charge des patients avec une EP. En France, à l’heure actuelle, seuls deux médicaments ont reçu une autorisation de mise sur le marché dans le traitement de l’EP. Mais leur efficacité, qui se traduit par la capacité à retarder l’éjaculation lors d’un rapport sexuel, demeure modeste et l’existence d’effets indésirables et interactions médicamenteuses potentielles laissent place à une amélioration du service médical rendu. La meilleure compréhension de la neurobiologie et neurophysiologie de l’éjaculation acquise ces 20 dernières années a permis d’identifier un certain nombre de cibles pharmacologiques pour moduler plus spécifiquement le contrôle central de l’éjaculation. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de la recherche et la sélection de nouveaux traitements médicamenteux dans la prise en charge de l’EP.

Bénéfices attendus

L’EP est la dysfonction la plus commune de la sexualité masculine. Elle peut avoir des conséquences personnelles négatives (comme la détresse, la peine, la frustration et ou l’évitement de l’intimité sexuelle), mais aussi des difficultés relationnelles dans le couple. Une fois diagnostiquée selon les critères de la société internationale de médecine sexuelle, la prise en charge des patients est multiple, associant les thérapies cognitivo-comportementales centrées sur la sexualité et les pharmacothérapies. Pour cette dernière, aucun médicament n’a l’autorisation de mise sur le marché pour le traitement de l’EP aux Etats-Unis, tandis que seuls deux médicaments l’ont obtenu en France. Ce projet permettrait donc de sélectionner les candidats médicaments qui auraient un potentiel thérapeutique dans le traitement de l’EP. Cette étape d’évaluation préclinique, dans un modèle animal validé, est indispensable pour tout futur médicament avant la réalisation des essais cliniques chez l’homme.

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. Ensuite, une évaluation de la fonction éjaculatoire est réalisée chez le rat anesthésiée après le traitement, une fois, et sans réveil. L’enregistrement des réponses éjaculatories dure 30 minutes. L’ensemble de l'expérience dure environ une heure, incluant le temps de chirurgie. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

L’administration des composés et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les animaux. L’évaluation de la réponse éjaculatoire est réalisée sur des animaux anesthésiés. Un stress peut donc survenir mais seulement au début de l’expérience avant la médication.

Devenir

Tous les animaux du projet vont avoir une évaluation de leur fonction éjaculatoire à la fin de l'étude, qui est une procédure sans réveil. Tous les animaux vont donc être euthanasiés à la fin de l'expérience.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur la réponse éjaculatoire. En effet, l’éjaculation résulte de l’apparition concomitante d’une première phase d’émission, suivi de la phase d’expulsion chez l’homme.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. Le résultat du calcul est n=11 et est corrigé, en prenant en compte les pertes dues aux difficultés techniques inhérentes au modèle expérimental, à n=12. Les tests statistiques utilisés pour une petite population sont le t-test non apparié pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant un éventuel ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie. L’évaluation fonctionnelle de la réponse éjaculatoire, comprenant la chirurgie, se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. De plus, une analgésie locorégionale par l’application de lidocaïne est réalisée au cours de la chirurgie. Ensuite, un suivi de la pression artérielle permet de suivre l’état général des rats lors de l’évaluation.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et le rat est l’espèce animale la plus largement utilisée dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’éjaculation, ainsi que leurs innervations, chez le rat sont comparables à ceux de l’homme. De plus l’organisation des réseaux neuronaux du système nerveux central impliqués dans l’éjaculation chez le rat partage des similitudes avec ce qui est connu chez l’homme. Des rats mâles adultes de plus de 12 semaines sont employés, âge auquel les organes sexuels sont à maturité et des spermatozoïdes sont présents dans l’épididyme.

4 420 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie, six injections intrapéritonéales, six tests de force de préhension et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie pour génotypage. Un quart des souriceaux d'une des lignées naît privé d'un gène nécessaire à la production d'énergie et meurt le premier jour de vie. Un quart de l'autre lignée développe une cardiomyopathie, avec perte de poids, mobilité réduite et posture anormale à partir de neuf semaines. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour analyse des tissus, le bénéfice annoncé se limitant à fournir des modèles et à comprendre des maladies qui restent incurables.

Objectifs

Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.

Procédures

-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse moléculaire, histologique et biochimique des tissus.

Remplacement

L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, l'autre sans chirurgie, puis toutes passent une échographie sous anesthésie chaque semaine, certaines une IRM d'une heure et des prélèvements de sang hebdomadaires pratiqués sur animal éveillé. Le porteur range parmi les effets attendus une perte de poids supérieure à 20 %, des mutilations, de l'agressivité et les douleurs dues à l'implantation des tumeurs. Il écrit que "seule l'utilisation de modèles animaux" permet d'atteindre ses objectifs, et que la mise à mort en fin de procédure est "indispensable".

Objectifs

Le cancer du pancréas (adénocarcinome pancréatique canalaire) est la troisième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. Son très mauvais pronostic s’explique par l'absence de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et d’approches thérapeutiques efficaces lorsque la chirurgie n’est plus possible. Les chimiothérapies actuelles améliorent peu la survie des patients, et les thérapies ciblées et immunothérapies n’ont pas encore eu l’effet clinique escompté. Dans ce contexte, notre équipe de recherche conduit depuis plusieurs années, des projets de recherche fondamentaux et translationnels jusqu’à la clinique pour comprendre comment ce cancer se met en place, pour identifier les patients à risque et ceux porteurs de lésions précoces, pour vaincre la résistance aux traitements et proposer une thérapie sur mesure. Seule l'utilisation de modèles animaux peut nous permettre d'atteindre ces objectifs. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs agréés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la validation de stratégies thérapeutiques efficaces pour la prise en charge du cancer du pancréas

Procédures

Tous les animaux inclus dans les différents protocoles expérimentaux seront soumis au suivi de la progression tumorale par échographie, une fois par semaine au niveau de l'unité expérimentale EU 1/2. Cette procédure non invasive ne requiert que l'anesthésie des animaux. Sur la période, 480 souris seront soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques ne nécessitant pas de chirurgie. Sur la période, 480 souris seront soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques nécessitant une chirurgie. La transplantation cellulaire sera effectuée en une seule intervention d'une durée de 15 à 20 minutes. Dans certains cas, les souris vigiles pourront être soumises à des prélèvements sanguins au cours du développement tumoral (recherche de biomarqueurs sanguins précoces, de réponse au traitement, marqueurs métaboliques, immunophénotypage). Un prélèvement sera effectué avant l'apparition de la tumeur puis une fois par semaine pendant la durée de l'expérimentation. En IRM des images anatomiques (pondérée T2) de l’abdomen (avec synchronisation au mouvements respiratoires) seront réalisé une fois, en contrôle, avant administration de la thérapie et une fois, 1 à 2 semaines après la première. Soit 2 acquisitions pas animal, afin de déterminer le volume et la localisation de la (des) tumeur(s). La durée d'analyse par souris est d'environ 1 heure. Le suivi de la progression tumorale par imagerie optique (durée de l'analyse 5 minutes par souris) et par échographie (durée de l'analyse 10 mn par souris) sera réalisé une fois en contrôle, avant administration de la thérapie puis une fois par semaine pendant la durée du protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une dégradation de l'état général ; comportement anormal (modification de l'activité générale, léchages, mutilation, agitation, agressivité), modifications d'aspect (perte de poids supérieure à 20%), modifications motrices, modifications végétatives (pilo-érection, variation de la température cutanée), des douleurs dues à l'implantation des tumeurs.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin de procédure est indispensable à la réalisation d'études comparatives afin de mettre en évidence les mécanismes antitumoraux mis en jeux.

Remplacement

Notre projet de recherche fondamentale et translationnelle pour la découverte de biomarqueurs et pour la thérapie du cancer du pancréas nécessite l'utilisation de modèles murins de référence reproduisant fidèlement la complexité et l'hétérogénéité intra- et inter-tumorale de la pathologie humaine. Ces critères ne peuvent être apportés par les modèles cellulaires. L'utilité de ces modèles dans nos domaines de recherche est reconnue et validée internationalement. Les publications scientifiques, notre retour d'expériences et la mise en commun des informations et données expérimentales provenant de ces modèles permettent d'appliquer les principes de remplacement, de réduction et de raffinement dans nos protocoles.

Réduction

Nous avons réalisé une étude statistique qui nous a amené à réduire le nombre d'animaux par groupe à 6, afin d'obtenir des résultats exploitables

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront suivis quotidiennement et seront placés sous structure du Bien être animal (SBEA) pour les procédures classées modérées (chirurgie, prélèvement et injections). Par ailleurs, nous utiliserons deux méthodes d'imagerie non invasive pour le suivi de la croissance tumorale. Pour toutes les procédures décrites dans ce projet, les animaux hébergés en zone d'expérimentation EU 1/2 seront transférés vers les salles d'expérimentation selon une procédure adaptée qui garantit leur maintien en bonne santé, leur bien-être et respecte les exigences scientifiques. Les animaux seront transportés dans leur cage sur un chariot adapté, avec accès à la nourriture pendant le transfert. Les biberons seront retirés pour éviter l'humidification de la litière et remis en place dès l'arrivée des cages dans les laboratoires appropriés. Le retour vers la zone d'hébergement se déroulera selon les mêmes modalités. Nous utiliserons des analgésiques pour diminuer la douleur dès que nécessaire, et des croquettes seront placées dans la cage pour faciliter la récupération post-procédure. La douleur sera évaluée par observation du comportement général de l’animal (recherche de toute modification du comportement : isolement, absence de réaction lorsque l’animal est attrapé,ne s’agrippe plus aux barreaux de sa cage), de l’état du pelage (poils hérissés, mal entretenus, pelage terne). Des points limites ont été définis pour chaque procédure expérimentale. Dès que l'un d'entre eux sera atteint l'animal sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle d'étude de base le plus pertinent pour notre projet. Les allo- et xénogreffes chez la souris immuno-déficiente sont utilisées pour les tests précliniques. Les méthodologies d'investigation sont bien décrites, les protocoles expérimentaux sont disponibles et partagés. Ceci permet de réduire le nombre de souris nécessaires. Les animaux pourront être livrés à partir de 5 semaines d'âge, pour acclimatation d'une semaine avant la mise en expérimentation.

Âgés de douze jours, les ratons reçoivent une injection analgésique puis, en cinq minutes de chirurgie, quatre disques de péricarde bovin implantés sous la peau. Ils les gardent deux à trois mois, le temps que le tissu se calcifie, et sont ramenés auprès de leur mère, surveillés deux fois par semaine. 216 ratons vont être utilisés sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer des traitements censés retarder la calcification des valves cardiaques artificielles posées chez l'humain, l'âge de douze jours ayant été retenu parce que la calcification y est plus rapide et écourte l'expérimentation. Ils sont tués avant que les disques soient retirés.

Objectifs

Un cœur sain bat environ 100 000 fois par jour pour alimenter l’organisme avec un sang riche en oxygène. Le cœur se compose de quatre cavités : 2 oreillettes (droite et gauche) ; deux ventricules (droit et gauche) et de quatre valves. Lorsque les valves cardiaques fonctionnent normalement, elles assurent un écoulement efficace du sang entre les cavités du cœur. En revanche, les valves malades ne peuvent pas s’ouvrir ou se fermer correctement, et finissent par se rigidifier et se calcifier progressivement. Le traitement de choix pour les patients est le remplacement de la valve cardiaque par une valve artificielle mécanique ou par une bioprothèse valvulaire d’origine animale. Les bioprothèses valvulaires d’origine animale sont composées de péricarde bovin ou porcin. La mise au point des techniques pour leur préservation a révolutionné les indications de remplacement valvulaire en clinique humaine. De nombreuses études ont démontré les avantages significatifs des bioprothèses valvulaires par rapport aux prothèses mécaniques, en particulier la diminution du risque de maladie thromboembolique et donc l’absence d’utilisation d’anticoagulants avec une morbidité et une mortalité per-opératoire et postopératoire moindres. Néanmoins, l’une des limitations principales à l’utilisation des bioprothèses valvulaires, est la survenue plus ou moins tardive de calcifications, c’est l’inconvénient majeur nécessitant un nouveau remplacement valvulaire. L’objectif de ce projet est de modifier les traitements de la bioprothèse valvulaire, afin de diminuer les calcifications qui apparaissent après implantation chez l’homme et de prolonger la durée de leur fonctionnement. Ces nouveaux traitements seront testés et analysés après implantation de péricarde bovin en sous-cutanée chez les ratons âgés de 12 jours. Pour ce projet, 216 ratons seront nécessaires pour une durée de 3 ans. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail vont nous permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes de calcification et une meilleure sélection parmi les différents traitements chimiques proposés. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Procédures

Les ratons sont soumis à : 1) Une procédure chirurgiale qui conssiste à implanter des disques de péricardes bovins en sous-cutané pendant 2 à 3 mois. La durée de l’intervention est de 5 minutes par raton. 2) Une injection sous cutanée pour analgésie avant la chirurgie d’implantationune. 3) Une injection intrapéritonéale pour la mise à mort sous anesthésie avant la chirurgie d’explantation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le stress et les douleurs associés aux injections et potentielles douleurs post-opératoire dans la zone lombaire après la chirurgie.

Devenir

Les rats seront mis à mort avant l’explantation de péricarde. C'est pour récupérer les disques afin d'effectuer des tests, dosages et immunohistochimie.

Remplacement

L’étude de la prévention de la calcification des bioprothèses valvulaire nécessite le recours aux animaux. Il n’existe pas de modèle in vitro capable de réunir tous les facteurs biologiques, immunologiques ou mécaniques responsables de la calcification des bioprothèses.

Réduction

La diversité des traitements et des tests nécessite un grand nombre de groupes tests et chaque groupe doit contenir un grand nombre d’échantillons nécessaires pour nos études statistiques. Dans l’intention de réduire le nombre d'animaux au maximum, chaque raton recevra 4 disques de tissu péricardique. Le nombre des ratons par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique adaptée. Cela permet de comparer les moyennes de calcification de chaque groupe, tout en prenant en compte le fait qu'un même animal puisse avoir plusieurs groupes.

Raffinement

Pour réduire la douleur, souffrance ou angoisse ressenties par les ratons notre étude sera effectuée sous anesthésie générale profonde et l'injection sous cutanée d'un analgésique. Les ratons sont ramenés auprès de leur mère. Les ratons sont hébergés dans des cages avec un accès à l’eau et à la nourriture en granulé sans restriction, et dans un milieu d'enrichissement adapté. Les ratons seront surveillés 2 fois/semaine afin de détecter tout comportement clinique anormal. Des points limites ont été définis et leur atteinte entrainera la mise à mort du raton.

Choix des espèces

Les calcifications observées chez le raton correspondent à celle observées chez l’homme, ainsi le raton est le modèle préférentiel pour cette étude. Pour l’implantation sous cutanée, nous utiliserons des ratons de 12 jours, à cet âge les processus de calcification sont plus rapides que chez l’animal adulte, ce qui permet d’écourter l’expérimentation.

Une injection unique dans le muscle, puis jusqu'à dix prises de sang sous anesthésie gazeuse en quinze à soixante jours : 600 souris porteuses d'une anomalie génétique de dystrophie musculaire vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs muscles, leur foie et leur rate. Le projet compare des vecteurs de thérapie génique pour retenir celui qui reste efficace aux doses les plus faibles, le porteur rappelant que des essais cliniques récents dans la myopathie de Duchenne ont provoqué des effets indésirables allant jusqu'au décès. Il décrit pourtant toutes les atteintes comme légères et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue des traitements, tous "de nature bénéfique". Sur les 600 animaux, il écrit seulement que le nombre par groupe est optimisé, sans donner ni effectif de groupe ni calcul.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitement présentant des atteintes fonctionnelles (réduction de la force musculaire, avec parfois atteinte cardiaque ou respiratoire). Les modèles animaux de ces maladies sont des souris. Une option thérapeutique possible est la thérapie génique, qui consiste à apporter une copie normale correspondant au gène mutant à l’aide d’un véhicule appelé vecteur. Celui utilisé est dérivé d’un virus appelé virus non-pathogène associé à l’Adenovirus (AAV) dans lequel on introduit le gène médicament en lieu et place du génome viral. La thérapie génique clinique a connu un succès significatif ces dernières années avec, en particulier, l’autorisation du Zolgensma pour l’amyotrophie spinale de type I. Malgré ces récents succès, la délivrance sûre et efficace de matériel génétique continue d'être un défi majeur dans le cas des maladies neuromusculaires. En effet, le muscle squelettique représentant environ 40% de la masse corporelle est un véritable défi en termes de délivrance et de production de vecteurs, car jusqu'à présent les doses thérapeutiques prédites par les études sur de grands modèles animaux sont extrêmement élevées. Des effets adverses allant jusqu’au décès ont pu être observés dans de récents essais cliniques, en particulier dans la myopathie de Duchenne, sans compter que la perfusion de doses élevées de vecteurs est susceptible de déclencher des toxicités immunitaires indésirables. Par conséquent, il y a un grand intérêt à définir des stratégies permettant une efficacité aux doses les plus faibles possibles. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de produits portant un gène thérapeutique afin de sélectionner la forme la plus intéressantes en termes d’expression.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous proposons de définir les meilleurs produits de thérapie génique, Les résultats pourraient permettre l’établissement de traitements de thérapie génique ayant une meilleure efficacité et une plus grande tolérance pour de futures applications chez l'Homme afin de traiter ces dystrophies musculaires qui n’ont pas de traitement à l’heure actuelle et qui sont très invalidantes voire léthales.

Procédures

Le traitement par transfert de gène se fait par injection intramusculaire une seule fois en moins de 5 minutes, Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée moins de 5 minutes. Une étude peut durer entre 15 et 60 jours maximum de ce fait un animal pourra être prélevé au maximum 10 fois. Cependant pour certains transferts de gène les animaux ne seront prélevés que toutes les 2 ou 3 semaines en fonction de la nécessité de suivre la réponse immunitaire. Selon nos expériences certains gènes provoquent peu de réponse immunitaire. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères et sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour administration d’anesthésique, d’intramusculaire pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères au stade avancé de la pathologie où l’on peut observer une scoliose ou une atrophie musculaire. Cependant, dans ce projet, nous utiliserons des animaux à des âges où aucune conséquence sur le comportement n’est observée. L’ensemble des animaux n’exprime donc pas de phénotype dommageable. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements, qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes. Les muscles permettront de mesurer l’efficacité d’expression alors que, les organes tels que le foie ou la rate permettent de vérifier l’absence de toxicité.

Remplacement

Des étapes de validation de vecteurs antérieures à cette procédure ont été faites in vitro. . Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire.

Réduction

Nous utiliserons les mêmes animaux contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. L’euthanasie des animaux est programmée avant l’âge d’apparition de signes cliniques pour éviter les risques d’apparition de phénotype dommageable pour les lignées les plus sévères.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de vecteurs. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité de vecteur suffisante pour mesurer l’efficacité d’expression du gène médicament.

Pour tester des traitements contre la maladie de Berger, une atteinte rénale auto-immune, 372 souris porteuses de gènes humains qui la déclenchent vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang dans la veine de la joue et des prélèvements d'urine deux fois par mois, des injections dans la veine de la queue chaque semaine pendant un mois puis chaque mois pendant six mois, un gavage par sonde gastrique, et pour une partie d'entre elles une biopsie du rein. Le porteur écrit que la maladie de Berger n'entraîne aucune nuisance, alors qu'il décrit des souris accumulant des anticorps dans les reins, avec du sang et des protéines dans les urines dès douze semaines. Toutes sont tuées pour analyser l'inflammation rénale, et il précise que l'industrie pharmaceutique a sollicité son laboratoire pour ces études.

Objectifs

Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.

Bénéfices attendus

La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.

Procédures

Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de la contention de la souris, la miction est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7. De plus, une fois la dose et la voie optimale de traitement déterminée pour les anticorps et l'ARNm, une biopsie rénale sera faite avant traitement sur un petit groupe de souris afin de confirmer définitivement l'efficacité du traitement à la dose optimale.

Impact sur les animaux

Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées à la biopsie rénale, aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection et de quelques jours pour la biopsie. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.

Devenir

A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.

Réduction

Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft, tunnels) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. La température, l'hygrométrie , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures et de façon systématique pendant 3 jours après chirurgie. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.

357 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection de virus destinée à tracer les réseaux de neurones, puis est tué quatre jours plus tard. Juste avant, 150 mâles et 72 femelles passent un test de trente minutes : réflexe de dorsiflexion du pénis, stimulation électrique du pénis, stimulation vibratoire, stimulation mécanique des parties génitales ou injection d'une molécule provoquant une érection. Le porteur décrit la stimulation électrique du pénis comme sans douleur, retient l'irritation parmi les atteintes possibles, et affirme que l'étude de la fonction sexuelle exige un "organisme entier" faute de toute modélisation existante.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastro-intestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathophysiologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes neuronaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection de virus et seront perfusés 4 jours suivant l'injection (temps de chirurgie : 30 minutes max). 90 mâles seront testés pour l'érection juste avant perfusion : 30 seront testés pour le réflexe de dorsiflexion du pénis (réflexe qui évalue la fonction sexuelle, 30 min max), 30 seront testés pour la stimulation électrique du pénis (30 min max), et 30 seront testés pour les injections d’un composé qui induit une érection (30 min max). 60 mâles seront testés pour l'éjaculation juste avant perfusion : 30 seront testés pour l'injection d’une molécule connue pour induire une érection (30 min), et 30 seront testés pour la stimulation vibratoire (30 min max). 24 femelles seront testées pour l'érection (engorgement du clitoris) par injection d'une molécule qui provoque une érection (30 min) et 24 seront testées pour l'érection par injection d’une autre molécule qui agit différemment mais a les mêmes effets (30 min max) juste avant perfusion. 24 femelles seront testées pour l'éjaculation par stimulation mécanique génitale (30 min max) juste avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales (injections de virus) peuvent conduire à de légères douleurs. L’infection au niveau des sutures est rare mais possible. L’utilisation de l’isoflurane peut induire des anomalies cardiovasculaires et respiratoires qui seront monitorés visuellement lors des chirurgies. Les injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés sont décrits dans la littérature pour ne pas induire d’effets délétères aux doses choisies. La contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal. Enfin, la stimulation électrique du pénis est sans douleur, les paramètres de stimulation proviennent de la bibliographie. Cependant, une irritation du pénis est possible. Pour la stimulation mécanique des parties génitales de la femelle, une irritation au niveau de la stimulation est également possible.

Devenir

L'expérience que nous réalisons avec le virus nous permet de tracer les réseaux de neurones impliqués dans la fonction sexuelle. Afin de visualiser ces réseaux nous avons besoin d'euthanasier les animaux pour récupérer les tissus d'intérêt.

Remplacement

La fonction sexuelle est possible grâce à l’interaction de multiples systèmes : hormonal, sensoriel, nerveux. L’étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, Il n’existe pas de modélisation de ce système qui permettrait d'étudier les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle. S’agissant d’un nouveau projet, nous avons besoin d’apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. Nous réaliserons les premières mises au point de chirurgies sur cadavre : notamment repérer et disséquer les structures d'intérêt. Concernant la mise au point des injections de virus, nous avons besoin d'animaux vivants pour faire migrer le virus et visualiser les réseaux tracés dans les tissus d'intérêt après euthanasie de l'animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque procédure a été déterminé de manière à avoir des résultats statistiquement significatifs, avec les tests adaptés, et le moins d’animaux possible. En cas de surestimation du nombre d’animaux dans une procédure, nous n’inclurons évidemment pas d’animaux supplémentaire dans la procédure.

Raffinement

Pour une pratique plus éthique, les chirurgies ont été mise au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d’autres chercheurs. Cette formation a été faite sous la tutelle de notre vétérinaire. Les premières chirurgies seront aussi faites en sa présence pour limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. De plus, nous avons prévu une analgésie pré-opératoire, ainsi qu’une analgésie post-opératoire pendant 3 jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement et des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou douleur avec un contact du vétérinaire et de la structure du bien-être de l’animal dès le lendemain ou le jour même suivant le problème rencontré. Si l’animal présente des signes de douleurs pendant plus de 48h ou sur demande du vétérinaire, les animaux concernés seront euthanasiés. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et des matériels de nidification. Pour la contention des animaux, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place avant le début de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologie reste malgré ses différences, proche de celle de l’humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies comme l’injection de virus et les lésions de moelle épinière, que nous réaliserons plus tard dans notre étude. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l’humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (6 à 8 semaines au début des expérimentations)