Procédures modérées

Privées de deux gènes de l'immunité par édition du génome, des truites arc-en-ciel doivent fournir à la filière truiticole des lignées cellulaires capables de multiplier des virus pour fabriquer des vaccins. 1 504 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur admet que cette perte d'immunité peut les faire souffrir si une infection se déclare. Quatre femelles matures subissent trois séances de pression abdominale, une par jour, pour en extraire les œufs, puis sont tuées parce que l'élevage de grandes truites coûte cher et que les installations ne permettent pas de les garder ensuite. Mille cinq cents alevins subissent un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour génotypage, ceux qui ne portent pas la mutation invalidante sont tués, et 125 homozygotes sont envoyés dans un autre laboratoire où des lignées cellulaires seront établies à partir de leurs cellules.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre, en les invalidant par modification structurelle ciblée, le rôle de deux gènes de l'immunité dans la réponse antivirale innée des poissons. Ce projet cherche à constituer un savoir théorique dont nous voulons qu’il conduise à des pratiques innovantes au service de la production piscicole. Un des objectifs pratiques de ce projet est d’isoler, à partir d’animaux n'ayant plus ces deux gènes, des lignées cellulaires tolérantes aux virus, ce qui permettrait leur réplication massive in vitro en vue de la production de vaccins antiviraux dont bénéficierait le cheptel truiticole.

Bénéfices attendus

Notre projet à pour finalité pratique de contribuer à l'éléboration de vaccins antiviraux en créant des lignées cellulaires génétiquement modifiées capables de propager des virus et donc les antigènes viraux nécessaires à la réponse vaccinale. Il conribuera aussi au dévelopement de méthode de diagnostic viral.

Procédures

Les femelles sexuellement matures (4 au total) subiront sous anesthésie des pressions abdominales afin d'extraire des oeufs qui seront injectés avec des ARNs guide et cas9. Chaque femelle subira 3 séances de pressions abdominales : une séance par jour pendant trois jours consécutifs. Une séance de pression abdominales ne dure jamais plus de trente secondes. Pour déterminer le génotype de chaque alevin (primo injectés, de premère et de seconde génération) un seul prélèvement mineur de la nageoire caudale sera effectué sous anesthésie.Cette opération classiquement réalisée lors d'un génotypage dure quelques secondes et l'alevin est immédiatement remis dans un bac de réveil et son comportement est observé.

Impact sur les animaux

Nous ne pouvons pas exclure que des mutations se produisent hors des deux gènes cibles et provoquent un phénotype dommageable sans rapport avec l'immunité. Ce risque est très limité car les sites potentiels de mutagénèse ont été choisis en raison de leur unicité dans le génome lequel est complètement séquencé chez la truite. Par ailleurs, il est possible que la privation des gènes cibles par génie génétique s’accompagne d’une altération de l’immunité qui conduise à une souffrance indésirable des poissons si une pathologie infectieuse se développe, malgré les mesures prophylactiques prises. En ce qui concerne l'anesthésie, elle est très courte : lorsque l'animal manifeste une perte totale d'équilibre et de réaction au toucher, il est rincé à l'eau d'élevage pour limiter la diffusion du produit et le stress physiologique qui pourrait l'accompagner. Le prélèvement d'un fragment de nageoire, qu'implique le génotypage, est réalisé sur un tissu non innervé, il n'y a donc pas de douleur directement liée à ce prélèvement. Enfin, l'isolement transitoire des alevins lors du génotypage peut être aussi un facteur de stress pour ces derniers. Nous limitons sa durée et mettons deux alevins dans un bac qu'une cloison transparente divise en deux compartiments ; de cette manière la perception visuelle d'un congénère est maintenue.

Devenir

les truites femelles sexuellement matures subissant le prélèvement des oeufs pour les fécondations in vitro seront euthanasiées. Ces truites seront euthanasiées parce que le coût d'élévage de truites de grande taille (adulte) est élevé et parce que nos structures d'élevage sont trop modestes pour permettre une stabulation des animaux post-expérimentation. Les alevins issus des oeufs injectés et qui ne présentent pas de mutation invalidante seront également euthanasiés selon les procédures en vigueur. Les animaux F0 et les 4 lignées ( première et deuxième génération) sont gardés seulement le temps prévu pour ce projet ; après quoi ils seront également euthanasiées sauf ~ 125 animaux (homozygotes pour une mutation invalidante) qui seront envoyés dans un autre laboratoire pour l'établissement de lignées cellulaires.

Remplacement

L'étude fonctionnelle "systémique" d'un gène par invalidation ou modification ciblée de celui-ci ne peut se faire que sur des organismes entiers . Un modèle cellulaire ferait par trop abstraction des régulations supracellulaires (interactions cellulaires multiples) et supratissulaires (regulations endocrines...)

Réduction

Réduire : les effectifs (femelles sexuellement matures, embryons injectés et alevins génotypés) sont réduits au maximum pour obtenir 2X 2 lignés F2 distinctes (i.e. présentant des mutations différentes) pour les deux gènes étudiés. Ainsi nous utiliserons seulement 4 femelles ovulantes dont chacune servira à l'obtention de trois pontes successives. De plus nous comptons limiter le pool de sauvegarde des F0 mutants à partir duquel seront générées les lignés F2 à seulement10 individus.

Raffinement

Les animaux seront toujours élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité et alimentation). Le prélèvement des oeufs se fera sous anesthésie selon une procédure établie et approuvée. Si des animaux (F0, F1 ou F2) devaient présenter une anomalie morphologique ou comportementale alors ils seraient immédiatement mis à mort selon les procédures d’euthanasie en vigueur. Par ailleurs les animaux modifiés par édition du génome (F0, F1 et F2) sont placés dans un milieu enrichi artificiellement qui mime l'environnement naturel notamment en plaçant des leurres végétaux.

Choix des espèces

La truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l'élevage et la reproduction sont bien maitrisés en pisciculture. L'espèce est grégaire et supporte des densités d'élevage importantes. Il s'agit en outre d'une espèce d'intérêt agronomique représentant 95 % de la production piscicole française. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). Plus spécifiquement notre intention est de produire des antigènes viraux dans des lignées cellulaire en vue de la fabrication de préparations vaccinales. Il va de soi que cette entreprise n'est possible que dans des cellules specifiquement permissives à l'infectivité, donc des cellules de truites. La production des oeufs se fera à partir de femelles (4) sexuellement matures et ovulantes. ces oeufs après fécondation, seront injectés avec les outils moléculaires réalisant les modifications génétiques désirées. Le génotypage se fera sur des alevins dérivant d'oeufs injectés (500), de première génération (500) et de seconde génération (500).

Deux injections intraveineuses à sept jours d'intervalle, huit mesures de pression artérielle de dix minutes, six gouttes de sang prélevées, un capteur de télémétrie implanté sous la peau en vingt minutes, une fibrillation atriale déclenchée, une analyse de composition corporelle, deux prélèvements de tissus sur animal vivant. 288 souris Swiss vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, 72 d'entre elles vivant seules en cage depuis l'implantation du capteur jusqu'à la fin de l'étude, soit vingt et un jours. Le porteur leur injecte des vésicules extracellulaires prélevées chez des patients diabétiques, pour voir si elles provoquent chez l'animal la résistance à l'insuline qu'elles provoquent en culture cellulaire. Toutes sont tuées pour prélever des tissus.

Objectifs

Les patients souffrant d’obésité sont confrontés à un risque plus accru de développer des maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2. Ce risque est d’autant plus élevé que la majorité de ces patients développent une résistance à l’insuline, une hormone qui permet l’absorption et le stockage du glucose dans les organes tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Outre le développement du diabète de type 2, la résistance à l’insuline est, à long terme, responsable de plusieurs complications métaboliques telles qu’une dyslipidémie, une athérosclérose ou une hypertension artérielle. La résistance à l’insuline étant un état pathologique silencieux, il devient nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses. Dans ce contexte, nous nous intéressons aux vésicules extracellulaires (VEs) libérées par les cellules de l’organisme. Ces VEs, impliquées dans la communication entre les cellules, sont considérées comme de nouveaux biomarqueurs de différentes maladies. Des travaux préalablement réalisés in vitro au sein de notre laboratoire ont démontré que les VEs circulantes de patients diabétiques induisent une résistance à l’insuline dans les cellules du foie et du tissu adipeux par des mécanismes bien distincts, ainsi qu’une accumulation de graisse. Ces effets ne sont pas observés avec les VEs circulantes de sujets sans diabète. La question posée ici est de vérifier si les VEs de patients diabétiques induisent également la résistance à l’insuline in vivo. L’objectif de ce projet est d’évaluer l‘implication des VEs de patients non diabétiques ou diabétiques, dans le développement in vivo du diabète chez la souris et les mécanismes mis en jeu.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les VEs participent aux altérations métaboliques associées au diabète. A long terme, ces résultats permettront de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses et d’aborder de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires associées.

Procédures

SEPT INTERVENTIONS : (i) Injections intraveineuses : 2 injections (une injection tous les 7 jours dans toutes les procédures), durée de chaque injection < 5 min. (ii) Mesure pression artérielle : 8 mesures (8 jours), durée : 10 min/mesure (iii) Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime, durée de chaque prélèvement < 1 min. (iv) Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 min (v) Induction d’une fibrillation atriale : une fois, durée 20 min/animal. (vi) Analyse composition corporelle : une fois, durée 20 min/animal. (vii) Prélèvement tissulaire sur animal vivant : deux fois, durée 10 min/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Stress associé aux manipulations (échographie, IRM, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de poids, prise de la température avec une caméra thermographique, et injection de vésicules extracellulaires). Concerne tous les animaux ; 2) Stress et douleur (prise en charge avec une analgésie) associés à la chirurgie après l’implantation du capteur pour la télémétrie (concerne 72 animaux) ; 3) Douleur (prise en charge avec une analgésie) associés au prélèvement des tissus concerne 72 souris ; 4) Stress associé à l’isolement des souris après l’implantation du capteur pour la télémétrie et jusqu’à la fin de la procédure (concerne 72 animaux).

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissues qui permettront compléter les objectives initiales de l’étude.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide d'un logiciel statistique. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Pour favoriser la sociabilisation des animaux, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Les animaux concernés par l’analyse des paramètres cardiaques par télémétrie seront placés dans des cages individuelles à partir de l’implantation du capteur télémétrique et seront maintenues dans ces conditions nécessaires pour permettre l’analyse individuelle dans les plateformes d’enregistrement jusqu’à la fin de l'étude, c’est-à-dire 21 jours. Pendant cette période, l’isolement des animaux sera compensé par de l’enrichissement. Ainsi, dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. La mise en place de pointes limites adaptées aux différentes manipulations décrites dans chaque procédure permettra d’assurer que les animaux soient dans les meilleures conditions pendant la durée de l’étude.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour cette étude est la souris Swiss. Comme en témoignent les résultats publiés par notre laboratoire, ces souris sont un bon modèle pour l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme jeunes adultes. A partir des 8 semaines d’âge, les rongeurs montrent une fonction métabolique du glucose optimale pour évaluer une possible altération avec le traitement de l’étude. En effet, le déclin de la fonction métabolique est décrit à partir de 10 semaines d’âge chez la souris.

Une fausse route lors du gavage, et la souris est observée quelques heures puis tuée si elle ne récupère pas : c'est l'un des points limites de ce projet. 260 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries en permanence au régime riche en graisse pour développer une fibrose du foie, elles reçoivent un anticorps injecté deux fois par semaine pendant huit semaines et un médicament administré chaque jour par la bouche ou par piqûre, avec des prises de sang avant, pendant et à la fin. Le porteur attend des ulcérations aux points d'injection et une irritation de l'œsophage qui gêne l'alimentation, quand le bénéfice annoncé se limite à savoir si son anticorps ajoute quelque chose à deux médicaments dont l'un est déjà sur le point d'être approuvé.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'efficacité d’une combinaison associant des traitements prometteurs et prochainement approuvés pour la fibrose dans la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) et un anticorps pour une meilleure prise en charge de la NASH. Cette dernière, également connue sous le nom de maladie du foie gras, est la conséquence d’une alimentation trop riche en sucre et en graisse. Ce type d’alimentation va entrainer le stockage et l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui va conduire à une inflammation locale au sein de l’organe. Cette inflammation chronique va entraîner avec le temps le développement d’une fibrose dans 20% des cas. Au stade précoce, la NASH est souvent asymptomatique et est généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, pouvant évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie dans les cas les plus graves. Un premier médicament sera prochainement approuvé (résultat positive dans un essai clinique de phase III) pour le traitement de la fibrose dans la NASH. Cependant, il permet de retarder l’échéance en réduisant la fibrose dans seulement 24% des patients. Un second médicament très prometteur, le Sémaglutide montre une diminution de la fibrose hépatique mais seulement partielle. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser ces traitements. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie et du processus de fibrose hépatique. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et ces traitements prometteurs pourrait améliorer l’efficacité du traitement des fibroses hépatiques. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre des traitements prometteurs et prochainement approuvé et notre anticorps sur la progression de la fibrose hépatique dans la NASH.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à étudier l’efficacité d’une combinaison thérapeutique associant, des traitements prometteurs et prochainement approuvé pour le traitement de la fibrose hépatique dans la NASH et un anticorps. Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité de cette combinaison afin d’envisager l’utilisation de cet anticorps en combinaison avec l’un de ces traitements prochainement approuvés. Cela permettra une meilleure optimisation thérapeutique chez les patients atteints de NASH et de fibrose hépatique et contribuera à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Procédures

Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation. Les animaux recevront un traitement par un anticorps 2 fois par semaine pendant 8 semaines par injection. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un traitement oral ou par injection (en fonction du médicament administré) par un médicament, quotidiennement pendant 8 semaines. Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Un prélèvement de sang sera réalisé avant et pendant le traitement afin d’évaluer l’évolution de la fibrose hépatique. Avant d’effectuer ces prélèvements de sang, les souris recevront un anesthésiant local puis ces dernières auront une anesthésie générale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ. Les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute. Lors de la 15ème semaine de régime riche en graisse, des prélèvements seront réalisés sur 5 souris. Ces prélèvements seront faits à 0, 6h, 24h, 72h et 7 jours après l’injection de l’anticorps. Cela permettra de mesurer la concentration de l’anticorps dans le plasma et de déterminer sa demi-vie plasmatique. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux sous anesthésie locale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Le traitement oral peut entrainer principalement une irritation/inflammation de l’œsophage avec pour conséquence un inconfort de la souris pour se nourrir et donc une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections et au traitement oral. Il sera également prévu une habituation au traitement oral à l’aide d’une sonde trempée dans une solution de glucose. Des points limites spécifique au projet ont également été établis faisant référence aux injections : apparition d’une induration au niveau des sites d’injection du traitement et au traitement oral : fausse route, animal observé dans les heures qui suivent et sacrifié si état satisfaisant non recouvré.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).

Injectées dans la glande mammaire ou dans la veine de la queue avec des cellules de cancer du sein humain, 320 souris Nude sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine et transportées dans un autre établissement pour jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever tumeurs et organes. Leur système immunitaire déficient, qui permet à la tumeur humaine de prendre, les rend aussi vulnérables aux infections, et la croissance tumorale peut entraîner nécrose des tissus, difficultés à se déplacer et perte de poids. Le porteur juge la nécrose "peu probable d'après notre expérience sur le modèle" tout en la citant parmi les cas les plus sérieux attendus, et affirme avoir "besoin d'un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités".

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer en termes d’incidence et en termes de mortalité chez les femmes. Dans le contexte du cancer du sein, le constituant majoritaire de l’environnement entourant la tumeur est le tissu adipeux, dont les adipocytes constituent une majeure partie. Le développement tumoral s’accompagne de besoins énergétiques important et les cellules tumorales disposent de plusieurs sources d’énergie, dont les lipides. Il a été montré une expression importante d’un transporteur d’acides gras par les cellules tumorales mammaires les plus agressives entraînant une captation élevée d’acides gras et augmentant leur agressivité. En exprimant ce transporteur, les cellules tumorales pourraient potentialiser leur capacité à former des métastases en favorisant leur captation d’acides gras apportant une source d’énergie importante permettant à ces cellules tumorales de migrer et survivre à distance de la tumeur mammaire. Cette participation au processus métastatique semble être une caractéristique commune à plusieurs types de cancers et, cliniquement, les chercheurs ont observé que la présence de cellules exprimant ce transporteur d’acides gras était corrélée avec des tumeurs très agressives et un mauvais pronostic. Ces résultats suggèrent donc que ce transporteur d’acides gras est une « signature » des cellules qui ont le potentiel de former des métastases. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette protéine dans la progression du cancer du sein. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de l’indisponibilité de certains équipements d’imagerie dans l’établissement principale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier le rôle d’un transporteur d’acides gras dans la progression tumorale et métastatique mammaire. A travers la compréhension de son rôle et des conséquences de son inhibition sur le développement du cancer du sein nous pourrons mettre en évidence que cette protéine est une cible thérapeutique intéressante dans le cancer du sein, particulièrement dans les cancers les plus agressifs et notamment au stade métastatique. Cela ouvrira de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement du cancer du sein triple négatif. De plus, ce transporteur se retrouve surexprimé non seulement dans le cancer du sein mais dans d’autres cancers également, la compréhension de son rôle dans la progression cancéreuse et comme potentielle nouvelle cible thérapeutique est donc également intéressante et potentiellement applicable dans le cadre d’autres types de cancer.

Procédures

Le modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Injections unique orthotopiques (15 seconde/animal) dans la glande mammaire après traitement hormonale dans l’eau de boisson (15 jours) ou ii) intraveineuse de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine sur animal vigile (2 minutes/animal) iv) Injection intrapéritonéale des traitements sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Transport vers un autre établissement et imagerie sur animal anesthésié (12 séance maximum, 30 min) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : 1) L’immunodéficience du modèle animal réduisant sa capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. 2) Le stress de la nouveauté (néophobie) lors des changements de conditions (traitement dans l’eau de boisson, nouveau régime alimentaire, ou encore lors du transport vers un autre site pour l’imagerie) 3) Le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la glande mammaire suite aux injections des cellules tumorales. 4) Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. 5) Les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) durant l’imagerie.

Devenir

A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=320) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.

Remplacement

Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cultures cellulaires ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe ou d’injection en intraveineux chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.

Réduction

Le projet impliquera un total de 320 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, formation, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, suivi, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce et les cellules injectées pourront proliférer sans être rejetées. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans la veine de la queue et une sonde de température implantée sous la peau, 48 subissent une prise de sang sous anesthésie et 133 une prise de sang terminale. Le traitement doit déclencher une inflammation générale et de la fièvre, pour tester si des dérivés d'hormones sexuelles provoquent les crises de la fièvre méditerranéenne familiale, dont les mécanismes restent inconnus. Le porteur écrit que l'analyse in vivo est "indispensable" et que la réponse aux hormones sexuelles n'est modélisable ni en culture cellulaire ni en organoïde, d'où son intérêt pour un "organisme entier".

Objectifs

La pyrine est un composant de l’immunité. Des mutations sur la protéine pyrine causent des maladies inflammatoires, dont la fièvre méditerranéenne familiale. La fièvre Méditerranéenne familiale se caractérise par des épisodes qui se répètent dans le temps de douleur abdominale intense liée à des phénomènes d’inflammation. A ce jour, les mécanismes responsables de ces flambées inflammatoires chez les patients demeurent inconnus. Certaines hormones sexuelles seraient capables de déclencher les crises inflammatoires. Le but de ce projet est de tester cette hypothèse dans un modèle murin où l'inflammation sera suivie dans le temps.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de l'immunité) et cliniques (thérapies pour lutter contre les flambées inflammatoires des patients).

Procédures

Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse, qui durera 30 secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée, qui durera 30 secondes d'une sonde de température. 48 animaux subiront une prise de sang sous anesthésie, l'intervention durera 2minutes environ. 133 animaux subiront une prise de sang terminale sous anesthésie sans réveil, l'intervention durera 5minutes environ.

Impact sur les animaux

Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles ; prélèvements de sang sous anesthésie ; mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Les traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires (baisse de température, anesthésie) et une inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre.

Devenir

Procédure 1 : réutilisation des animaux lors de la procédure 2. Procédure 2 : Euthanasie des animaux pour réaliser une deuxième prise de sang (terminale) chez les même animaux (réduction du nombre d’animaux utilisés) Procédure 3 : euthanasie des animaux (prise de sang terminale)

Remplacement

L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle pertinence clinique. La réponse physiologique aux hormones sexuelles n’est pas modélisable in vitro, ni dans de systèmes plus évolués tels que les cultures tridimensionnelles ou organoïdes. D’où l’intérêt de travailler sur un organisme entier, sur lequel il est possible d’étudier la réponse inflammatoire globale de l'organisme.

Réduction

De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Une réutilisation des animaux est prévue suite à la première procédure pour réduire le nombre d'animaux du projet. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Utilisation d'implants avec une transmission du signal pour prendre la température à distance sans introduction anale répétée 4) Minimisation de la fréquence de manipulation 5) Les animaux dont la température diminue seront placés dans des cages sur portoirs chauffants. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.

Choix des espèces

Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo), avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain (vertébré Mammifère). La souris en est un modèle idéal du fait des outils disponibles pour suivre l'inflammation et de la possibilité de manipulation génétique qui permet de mieux comprendre les mécanismes. Les expériences débuteront à l’âge de 6-8 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature. L’âge des animaux sera de 8-10 semaines maximum en fin de procédure expérimentale.

Génétiquement privées du récepteur TREM-1, des souris mâles reçoivent un antibiotique injecté deux jours après leur naissance puis un régime riche en graisse qui les fait passer du foie gras à la cirrhose puis au cancer du foie. 104 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit selon son groupe de 4 à 40 injections dans le ventre sur animal éveillé, trois anesthésies gazeuses et deux aller-retours entre l'animalerie et un service d'imagerie situé à cinq cents mètres. La mise à mort intervient entre la vingtième et la vingt-deuxième semaine de vie, une fois le cancer installé, et le porteur qualifie d'indolore cette évolution provoquée par l'alimentation.

Objectifs

Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.

Impact sur les animaux

- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.

Remplacement

A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.

Réduction

Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.

Raffinement

Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.

Choix des espèces

Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.

2 480 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, une injection radioactive dans la veine de la queue, jusqu'à six anesthésies chacune et des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage à partir de l'injection radioactive. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel provoque un sentiment d'isolement et une absence de liberté d'expression, et attend aussi des lésions au point d'injection, de la fatigue et des troubles digestifs. L'objectif immédiat reste de compter la radioactivité organe par organe sur les cadavres, la phase I chez l'être humain étant renvoyée à la fin de l'étude, et le porteur conclut que l'expérimentation animale est "requise" parce que les données précliniques sont "imposées par les autorités".

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un élément radioactif à une molécule, ou vecteur, capable de se lier de manière spécifique à une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que le vecteur puisse diriger et concentrer l’élément radioactif dans les cellules cancéreuses. En fonction de l’élément radioactif choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur par imagerie nucléaire ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Ces rayonnements détruisent l’ADN des cellules cancéreuses, ce qui mène à la destruction de la tumeur. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Plusieurs types de vecteurs capables de se lier spécifiquement à la protéine N ont été développés. A la différence de nombreuses autres protéines exprimées par les cellules cancéreuses, la protéine N est capable de transporter les vecteurs qui s’y lient jusqu’à son noyau cellulaire qui contient l’ADN. En rapprochant l’élément radioactif de l’ADN, il est possible de potentialiser l’effet de la thérapie, tout en diminuant sa toxicité pour les cellules saines. Nous avons sélectionné deux vecteurs se liant à la protéine N de manière différente afin de maximiser les chances d’identifier un système efficace. Comme il existe plusieurs types d’élément radioactif avec des propriétés très différentes, il est nécessaire de comparer l’efficacité de plusieurs combinaisons vecteur-élément radioactif afin d’identifier le couple le plus efficace. Alors que certains de ces éléments radioactifs émettent des rayonnements ionisants capables de détruire les cellules cancéreuses, d’autres peuvent être utilisés pour détecter les tumeurs par imagerie, ce qui permettra dans un premier temps de vérifier que les vecteurs s’accumulent bien dans la tumeur chez la souris. Dans un second temps, l’imagerie permettra de sélectionner les patients dont les tumeurs expriment la protéine N et qui seront donc éligibles à la thérapie. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels par radiothérapie interne vectorisée sont presque systématiquement accompagnés d’effets secondaires graves dus aux dommages provoqués aux cellules non-cancéreuses. En dirigeant les éléments radioactifs de manière spécifique au noyau des cellules cancéreuses, la stratégie de ce projet a pour but d’augmenter l’efficacité de ces thérapies tout en diminuant leur toxicité. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l’Homme à la fin de l’étude

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - 1 Injection en sous-cutané au moment de la greffe de cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum). - 1 injection de produit en intraveineuse dans la veine de la queue lors des expérimentations d'imagerie ou de traitement (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum). - Anesthésie à l'isoflurane réalisée lors de la greffe des cellules tumorales (réalisée dans l'établissement 1, 5 min maximum), lors de l’injection intraveineuse des produits (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ou au moment de la mise à mort (réalisée dans l'établissement 2, 5 min maximum) ainsi que pendant l’acquisition des images (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). Il y aura au total 6 anesthésies au maximum pour chaque animal. - Imagerie à l’aide d’un scanner dans les procédures d’imagerie (réalisées dans l'établissement 2, 45 min maximum). - Mesures du poids et de la taille des tumeurs dans les procédures d’imageries et d’évaluation de l’efficacité des traitements (réalisée dans l'établissement 2, 1 min maximum).

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : - douleurs générées lors de la greffe des cellules tumorales, lors de l’injection des agents d’imagerie ou de thérapie. - lésions locales au site d’injection dû à la rétention du composé radiomarqué. - gêne ou douleur provoquée par la croissance des tumeurs - fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines ou troubles digestifs dans les jours suivant l'injection du traitement radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. - stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. - sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie et de biodistribution.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris incluse dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. La procédure d’imagerie permet d’observer la localisation du vecteur au cours du temps sans avoir mettre l’animal à mort (suivi longitudinal), ce qui permet de maximiser les informations recueillies en minimisant le nombre d’animaux mis à mort. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : Raffinement des conditions d'hébergement : - Dans les procédures 1 et 2, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection du vecteur radiomarqué et de permettre un contact visuel des animaux. Chaque boite sera également enrichie d'un igloo et d'une roue en polycarbonate. - Dans toutes les procédures, des croquettes mouillées seront rajoutées dans les cages des souris souffrant de fatigue ou de faiblesse. Dans les procédures 3 et 4, des croquettes mouillées seront ajoutées systématiquement la première semaine suivant l’injection des vecteurs radiomarqués. - De la litière de cellulose sera utilisée pour limiter l’apparition de plaie chez les souris porteuses de tumeurs. - Le transport des animaux de l’EU1 à l’EU2 sera réalisée à l’aide de cages opaques à couvercle filtrant. Anesthésie : les animaux seront anesthésiés lors de la greffe des tumeurs (5 min maximum), lors de l'injection intraveineuse des composés (5 min maximum), lors des acquisitions d'image (45 min maximum) et lors de leur mise à mort (5 min maximum). Analgésie: en cas d'apparition de douleur, des analgésiques seront administrés aux animaux. Des points limites spécifiques à ce projet ont été mis en place pour limiter la souffrance des animaux au minimum. Ces points limites seront appliqués de manière stricte.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux humains est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de tumeurs humaines car celles-ci se caractérisent par l'absence d’un organe (le thymus), ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge, et ils sont plus résistants aux radiations.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'âge de deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie d'oreille entre douze et quinze jours, puis une injection quotidienne pendant cinq jours, le porteur indiquant que le produit injecté peut provoquer une inflammation et que les points d'injection sont changés d'un jour sur l'autre. À deux mois, elles sont profondément anesthésiées pour une perfusion intracardiaque, tuées, puis leur cerveau est prélevé et leur corps disséqué pour repérer les effets secondaires aux sites d'injection. Comparer trois voies d'administration afin de retenir la moins traumatisante est présenté comme un raffinement, et le porteur écrit que l'usage d'animaux vivants y est "incontournable".

Objectifs

Les lignées de souris génétiquement modifiées constituent des modèles précieux pour comprendre le fonctionnement du cerveau chez les mammifères. Dans certaines de ces lignées, il est possible de choisir le stade de développement à partir duquel une modification génétique sera exprimée dans le cerveau. Ces modèles inductibles sont très utiles, par exemple pour modéliser des pathologies qui surviennent chez l'adulte, alors que le cerveau n'a pas eu de problème particulier au cours du développement. En pratique, l'induction de l'expression d'une mutation à un moment donné est souvent réalisée par injection d'un produit dans le ventre des souris. Plusieurs études ont montré que cette voie d'administration pouvait occasionner des dommages dans l'abdomen des souris. Récemment, plusieurs équipes ont testé l'administration de la même molécule par la voie sous-cutanée, a priori moins invasive. Des résultats très probants ont été obtenus pour induire l'expression de modifications génétiques dans divers organes tels que le foie, le rein et l'intestin. De plus, une équipe a également rapporté l'efficacité de l'administration de la même molécule par voie orale (ingestion spontanée par la souris d'un liquide présenté goutte à goutte). Dans un objectif de raffinement de nos pratiques expérimentales, nous souhaiterions tester les voies orale et sous-cutanée sur nos modèles. Cependant, il n'est pas démontré si ces voies administration sont efficaces pour induire l'expression de modifications génétiques spécifiquement dans le cerveau. Le cerveau est un organe très protégé de la circulation sanguine. Cette protection est utile contre les agressions (maladies notamment), mais elle pose souvent problème quand il s'agit de faire entrer des médicaments dans le cerveau. De fait, l'induction de l'expression de modifications génétiques à partir d'un moment choisi est beaucoup moins efficace dans le cerveau que dans les autres organes. Pour cette raison, il est primordial de vérifier que le choix de la voie sous-cutanée ou de la voie orale ne réduira pas l'efficacité de l'induction. Notre projet est donc de tester l'efficacité de ces deux voies d'administration pour induire l'expression d'une modification génétique dans le cerveau chez la souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal attendu concerne le raffinement des méthodes expérimentales : si les injections sous-cutanées ou l'administration par voie orale s'avèrent aussi efficaces et moins traumatisantes que les injections dans l'abdomen pour induire l'expression de mutations conditionnelles dans le cerveau, la méthode la moins traumatisante sera adoptée immédiatement par notre équipe. Les résultats seront divulgués à toute la communauté scientifique utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées pour étudier le cerveau.

Procédures

Une biopsie d'oreille sera réalisée entre 12 et 15 jours d'âge dans le but de réaliser des analyses génétiques. Entre 21 et 25 jours d'âge, certaines souris recevront une injection chaque jour (durée de chaque injection < 10 secondes). A l'âge de deux mois, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

La biopsie d'oreille induit une douleur temporaire. La contention des animaux pour l'administration des traitements entraîne un stress temporaire. Les injections répétées quotidiennement pendant 5 jours induisent une douleur temporaire au point d'injection. De plus, le produit injecté est susceptible d'induire une inflammation.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les souris de ce projet, car nous devrons prélever le cerveau pour pouvoir évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression de la modification génétique souhaitée. De plus, les corps des souris ayant reçu des injections seront disséqués pour évaluer les effets secondaires potentiels au niveau des sites d'injection (sous la peau et dans l'abdomen).

Remplacement

L'objectif de cette étude étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection, il n'est pas envisageable d'utiliser une méthode alternative. L'utilisation d'animaux vivants est incontournable pour répondre à la question.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en fonction de notre connaissance du modèle, en tenant compte de la probabilité de transmission d'un transgène d'une génération à la suivante, ainsi que du risque de perte de matériel biologique pendant l'expérience (mort inexpliquée d'un animal avant la fin de l'expérience ou problème lors des analyses post mortem). De plus, nous avons choisi la lignée de souris de manière à ce qu'une partie du matériel biologique collecté dans ce projet puisse être utilisé pour compléter une étude en cours dans le cadre d'un projet précédemment autorisé. Cette mutualisation des animaux permettra de réduire le nombre total d'animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée de l'étude. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. La formulation du produit injecté aux souris a été récemment améliorée pour éviter tout dommage sur les souris. Afin de limiter la douleur, les points d'injection seront changés d'un jour sur l'autre, pour la série de 5 injections quotidiennes. A la fin de l'étude, les souris recevront un antalgique et seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée à la perfusion intracardiaque du produit permettant une bonne conservation du cerveau.

Choix des espèces

L'objectif du projet étant de comparer l'impact sur la souris de trois méthodes d'injection d'un produit, il ne serait pas pertinent de réaliser cette étude sur une autre espèce. Les souris seront incluses dans ce protocole dès l'âge de 7 jours, car il sera nécessaire de connaître leur génotype précocément. Le produit permettant d'induire l'expression d'une modification génétique sera administré pendant la 4ème semaine d'âge et les souris seront mises à mort à l'âge de 2 mois, lorsque le cerveau aura acquis ses caractéristiques adultes, car les travaux que nous menons actuellement portent sur le développement du cerveau après la 3ème semaine de vie.