Procédures modérées

L'introduction d'un filament dans la carotide pour provoquer un accident vasculaire cérébral tue moins de dix pour cent des animaux opérés dans les soixante-douze heures, par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne. 126 souris et 84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux gardés en vie jusqu'à six semaines avant une imagerie terminale. Les chirurgies d'une heure sous anesthésie générale injectent dans le cerveau soit un lipopolysaccharide bactérien pour déclencher une neuroinflammation, soit un peptide vasoconstricteur pour rétrécir les vaisseaux, et certains animaux subissent une seconde opération deux semaines plus tard. Le choix des espèces tient à la résolution d'imagerie pour les rats, dont le cerveau est plus gros, et pour les souris au coût des nanoparticules d'oxyde de fer et des anticorps.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. L’AVC induit une réaction inflammatoire qui contribue de manière importante aux lésions cérébrales. Le suivi par imagerie in vivo de cette réaction inflammatoire permettrait de mieux comprendre sa dynamique spatio-temporelle et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à la moduler. Pour cela, nous proposons de développer une approche en imagerie cellulaire et moléculaire in-vivo. L’objectif de l’imagerie cellulaire est de pouvoir suivre des cellules d’intérêt dans le cerveau : soit des cellules ayant des propriétés thérapeutiques visant à moduler l’inflammation (telles que les cellules souches issues du tissu adipeux) soit des cellules du système immunitaire (telles que les macrophages). L’imagerie moléculaire vise à suivre l’expression de récepteurs impliqués dans la réponse inflammatoire à un AVC, telles que les molécules d’adhésion qui permettent l’entrée de cellules immunitaires dans le cerveau. Les modalités d’imagerie utilisées pour ces développement méthodologiques seront les mêmes que celles qui peuvent être utilisées chez l’humain : imagerie par résonance magnétique (IRM) et scanner X. Le développement de telles techniques d’imagerie ouvrirait la voie à un suivi non-invasif des cellules et des récepteurs de l’inflammation, qui pourrait être répété dans le temps. Le but à plus long terme est de transférer ces méthodes chez l’humain, pour une meilleure prise en charge des patients présentant un AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la réaction inflammatoire associée ainsi que le devenir des cellules thérapeutiques, dans des modèles rongeurs (rats et souris) plus simples à mettre en oeuvre et à standardiser que le modèle classique qui procède via une occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer les approches thérapeutiques visant à moduler l’inflammation. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’humain puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

L’infusion locale du LPS (solution de lipopolysaccharide, molécule d’origine bactérienne provoquant une inflammation) induisant la neuroinflammation ou du peptide vasoconstricteur spécifique (rétrécissant le diamètre des vaisseaux sanguins) mimant l’ischémie cérébrale nécessite une injection stéréotaxique. Le modèle d’AVC transitoire nécessite l’introduction d’un filament par la carotide. Ces chirurgies, permettant de réaliser ces différents modèles d'AVC, sont réalisées sous anesthésie générale et dure au maximum une heure. Chaque animal subit une seule chirurgie de durée maximale d'une heure. Certains animaux recevront les cellules thérapeutiques par voie intracérébrale et subiront pour cela une deuxième chirurgie sous anesthésie générale deux semaines après la réalisation du modèle. Cette seconde chirurgie dure au maximum une heure.

Impact sur les animaux

Suite à cette chirurgie permettant de réaliser ces différents modèles, une perte de poids minime (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser des analyses post-mortem (imagerie ex vivo, microscopie).

Remplacement

Les agents de contraste seront d’abord testés dans des modèles in-vitro : les cellules thérapeutiques sont marquées avec les nanoparticules par incubation puis placée dans un tube Eppendorf et imagées en IRM et en imagerie X. Cela permettra de réaliser une première sélection des agents de contraste d’intérêt. Néanmoins le contraste va dépendre également du microenvironnement (inflammatoire) et de la métabolisation des agents de contraste in-vivo : il nous apparaît donc indispensable de tester les cellules marquées avec les meilleurs agents de contraste (4 au maximum) chez l’animal vivant. Les cerveaux des animaux des cinq procédures seront prélevés pour l’imagerie post-mortem à l’aide de techniques innovantes basées sur les rayons X (scanner spectral à comptage de photon, imagerie de contraste de phase, de champ sombre et du k-edge avec le rayonnement synchrotron). Ces imageries ex-vivo viendront apporter des informations précieuses avant le développement in-vivo de ces nouvelles approches. Par ailleurs, les images issues de ces expérimentations seront mises en ligne à disposition de la communauté de manière anonyme sur une plateforme collaborative, afin de pouvoir être exploitées plus largement.

Réduction

L’avantage de l’imagerie in-vivo est qu’elle permet des études sur l’animal vivant plutôt que d’avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographique de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) seront typiquement utilisés pour ce projet à caractère exploratoire. Si certaines conditions expérimentales ne fournissent pas un signal suffisant pour être détecté (problème de sensibilité), alors l’inclusion sera stoppée. Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus que les cerveaux pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Le modèle animal d’inflammation cérébrale focale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que le modèle d’AVC et il est bien approprié pour les études d’imagerie. Il crée une lésion cortico-striatale qui occasionne des troubles sensori-moteurs mineurs et transitoires du côté contralatéral à la lésion (faiblesse des pattes, perte de sensibilité des vibrisses). Néanmoins les animaux continuent de s’alimenter normalement (récupération du poids pré-opératoire dans les 3 jours qui suivent la chirurgie, pas de perte de poids en comparaison avec les animaux sains à plus long terme) et à avoir une activité normale. Dans un second temps, nous allons évaluer si les modèles d’injection intracérébrale de peptide vasoconstricteur et de LPS peuvent nous fournir des informations pertinentes du point de vue de l’imagerie et donc se substituer aux modèles d’AVC, car ils ont l’avantage de limiter le handicap et la mortalité des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), une thermorégulation continue, et une hydratation sous-cutanée. Une grille dédiée au codage des expressions faciales spécifique à un modèle animal (souris ou rat) permet d’identifier les signes de la souffrance post-opératoire afin de la traiter. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal pour faciliter leur hydratation, en plus de la nourriture et boisson habituelles. Les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’agressivité constatée). L’évaluation de l’état des animaux est réalisé une heure après la chirurgie et pendant une semaine suivant la chirurgie. Un score de l’état de l’animal est déterminé à l’aide d’une grille de score inspirée des études de raffinement de la procédure post-opératoire d’une chirurgie stéréotaxique, qui permet une évaluation de l’état de l’animal et l’identification des points limites.

Choix des espèces

Les rats sont utilisés car l’imagerie cérébrale de cette espèce a une meilleure résolution en comparaison avec celui de la souris, en raison de la plus grosse taille de cerveau. Nous allons travailler avec des rats Sprague Dawley chez qui le modèle de LPS est bien maîtrisé par notre équipe. Les souris sont utilisées en raison en raison du coût des certaines particules d'oxyde de fer (marquées à la rhodamine fluorescente) et du coût des anticorps (pour la fonctionnalisation des particules d’oxyde de Fer). Les souris utilisées pour cette étude seront des souris C57Bl6 car notre équipe a une expérience extensive de l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVC. Des souris Swiss pourront être utilisées afin de faciliter la pose d'un cathéter veineux. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte et le poids sera suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste. Rats : 250-300 g à T0 et souris : 25-30 g à T0.

552 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 504 femelles gestantes tuées pour que leurs embryons soient prélevés à treize jours et demi puis seize jours et demi de gestation, tandis que 24 mâles et 24 femelles reproducteurs sont gardés vivants et réutilisés jusqu'à la fin du projet. Le geste infligé aux mères tient en trente secondes, un gavage unique. Les souriceaux, eux, sont anesthésiés par le froid pendant dix minutes puis décapités. Le laboratoire développe en parallèle des organoïdes cardiaques humains en trois dimensions qui reproduisent déjà le début de la trabéculation, et le bénéfice annoncé pour les patients tient en une ligne, comprendre le mécanisme "permettra d'agir pharmacologiquement".

Objectifs

Le syndrome de non compaction cardiaque est une malformation congénitale d’origine diverse. La non compaction s’observe souvent dans les maladies métaboliques. Le cœur en développement forme à partir des parois ventriculaires et auriculaires des trabécules se projetant dans les chambres afin d’augmenter la surface d’échange entre les cardiomyocytes et le sang avant que le système coronaire ne soit mis en place. On parle alors de trabéculation Vers le stade embryonnaire E13.5 (milieu de la gestation) chez la souris, les trabécules régressent et les parois ventriculaires s’épaississent. On parle alors de compaction. Nous connaissons assez bien les mécanismes cellulaires de la trabéculation mais très mal l’origine incluant le signal de la compaction. Nous avons déjà des nombreuses données incluant des données d 'expression génique montrant que la régression des trabécules est due à une sénescence des cellules cardiaques bordant le trabécules puis par leur élimination par des macrophages. De plus, le changement du métabolisme cardiaque au mileu de la gestation semble impliqué dans le processus de sénéscence. Pour valider ces données, nous délèterons un gène essentiel pour la sortie des cellules du cycle prolifératif et un gène impliqué dans le changement métabolique preferentiellement dans les cardiomyocytes embryonnaires et étudierons le phenotype des cœurs à différentes étapes du développement cardiaque.

Bénéfices attendus

La non compaction impacte l’hémodynamique cardiaque et est à l’origine de défaillance cardiaque. Elle ne peut pas contrairement aux autres malformations cardiaques être réparée par chirurgie. Comprendre ce mécanisme permettra d’agir pharmacologiquement

Procédures

gavage 30 s une seule fois dans leur vie. Anesthésie par le froid pour les souriceaux (10 min) avant mise à mort par décapitation

Impact sur les animaux

Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Il permet la diffusion de la molécule à chaque embryon et sera appliqué qu’une seule fois pour chaque souris.

Devenir

504 animaux femelles utilisés dans le projet seront mis à mort au moment de la collection d 'embryons à E13.5 et E16.5 . Les mâles (24) et les femelles (24) ayant donné naissance aux souriceaux seront conservés et pouront être réutiilisés juque la fin du projet .

Remplacement

Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro. Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle humain montre des trabecules naissant mais requiert encore une optimisation pour mimer la trabéculation et la compaction.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d un phénotype lié à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique. il existe une variabilité inter-portée c'est pourquoi il nous faut 6 portées par condition expérimentale. Nous effectuerons un test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes . Les données acquises sur le modèle cellulaire d'organoides cardiaques humains en 3D in vitro validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum , cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle de développement cardiaque reflétant les étapes du développement cardiaque humain y compris les phénomènes étudiés dans ce projet ( trabéculaton et compaction). Les stades de développement E13.5, E16.5 et nouveau-nés ont été choisis de part les phenomènes biologiques se déroulant à ces stades (trabéculation versus compaction et changement de métabolisme cardiaque, respiration de l 'O2...)

Quatre injections dans le péritoine, une injection dans la veine rétro-orbitale, une injection directement dans le foie, cinq anesthésies gazeuses suivies de séances d'imagerie et deux anesthésies générales profondes: 2 138 souris génétiquement immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris reçoivent des cellules souches ou des progéniteurs sanguins humains, corrigés ou non, pour vérifier que ces cellules se développent dans un organisme vivant. Le porteur indique que cette étape est exigée par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant toute demande d'essai clinique chez l'être humain. L'effectif de 2 138 animaux n'est adossé à aucun calcul de puissance statistique, il a été dimensionné "en fonction de notre expérience du modèle" et de la variabilité observée lors de projets antérieurs.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester in vivo dans un modèle murin l’innocuité et l’efficacité de nouveaux protocoles thérapeutiques pour des déficits immunitaires sévères. Ces déficits sont des pathologies très graves qui touchent les cellules sanguines et immunitaires, indispensables à la lutte contre les agents infectieux. Ils sont dûs, soit à une mutation dans un gène indispensable au développement ou à la fonction des cellules sanguines, soit à des traitements contre le cancer du sang, dans le cas de leucémie par exemple. Pour toutes ces pathologies, la greffe de moelle osseuse provenant d’un donneur sain est une option thérapeutique largement utilisée, mais la survie après greffe est très hétérogène et peut être inférieure à 30%. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être absolument développées pour augmenter la survie de patients greffés. Notre objectif est d’explorer l’efficacité de trois nouveaux traitements de thérapie cellulaire (injection de progéniteurs des cellules sanguines), et de thérapie génique (injection de progéniteurs des cellules sanguines ou cellules souches, génétiquement modifiés). L’efficacité de ces approches innovantes doit absolument être validée dans un modèle animal car cette étape est exigée par l’Agence Nationale de la Santé et du Médicament avant tout essai clinique chez l’homme. Il existe un modèle de souris génétiquement modifiée pour être atteinte de déficience immunitaire et qui peut recevoir des cellules sanguines humaines pour qu'elles se développent sans effet délétère. Selon l’âge des souris receveuses, les cellules humaines seront injectées en intraveineuse ou en intrahépatique et la reconstitution immunitaire sera suivie par des prélèvements d’organes lymphoïdes après la mise à mort.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place de nouvelles thérapies dans le cas de déficits immunitaires sévères. Plus spécifiquement, les différentes études sur les progéniteurs de cellules sanguines nous permettront de choisir le protocole de production le plus optimisé pour leur capacité à se développer dans le corps. Par ailleurs, les protocoles impliquant la modification génétique des progéniteurs ou cellules souches visent à évaluer l’efficacité de telles stratégies de remplacement de gènes défectueux et notamment en vérifiant la bonne évolution des cellules génétiquement corrigées chez la souris, et ce durant leur développement. A terme, l’ensemble de ce projet permettra la mise au point jusqu’au stade clinique de protocoles thérapeutiques personnalisés avec une survie améliorée pour tous les patients atteints de déficits immunitaires.

Procédures

Les animaux subiront selon leur utilisation, soit 1 ou 2 : Injection intrapéritonéale (4X), 10s par intervention. Injection intraveineuse rétro-orbitale (1X), 30s par intervention. Anesthésie générale profonde (2X), 2min par intervention. Injection intrapéritonéale (1X), 10s par intervention. Injection intrahépatique (1X), 10s par intervention. Anesthésie gazeuse (5X), 10min à 30min. Imagerie optique (5X), 10min à 30min par intervention. Anesthésie générale profonde (1X), 2min par intervention.

Impact sur les animaux

Les altérations génétiques des animaux provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. A la dose utilisée, l'agent de conditionnement n'induit pas d'effet indésirable majeur mais une douleur transitoire durant les heures post-injectio. L’anesthésie légère gazeuse ou profonde générale par injection de produits anesthésiants peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les cellules souches et progéniteurs lymphoïdes ne provoquent pas d'effets indésirables et sont très bien tolérés chez les animaux. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée légère et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

La mise en place d’essais précliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés sur les cellules seront testés chez l’animal. Notre protocole de production de progéniteurs de cellules sanguines est déjà une méthode de remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches pour produire et expandre des cellules qui normalement se différencient en plusieurs mois dans la moelle osseuse. Nous utilisons un système de culture cellulaire, en évitant la maturation des cellules humaines chez la souris sur plusieurs stades. De même, la modification génétique des cellules sera faite dans la culture puis validée (efficacité de l’incorporation du gène sain, expression protéique du gène sain…) avant l’injection chez les animaux. En outre, la capacité des progéniteurs ou cellules souches, corrigées ou non, à se développer correctement, notamment en certains sous-type de cellules sanguines, sera également évaluée dans une culture cellulaire grâce à des tests déjà validés dans la littérature. Ils serviront à statuer sur la fonctionnalité potentielle des cellules avant leur injection chez les souris. Les expériences chez l’animal interviendront au terme d’un long développement et d’une caractérisation des produits cellulaires qui seront utilisés afin de ne traiter les animaux qu’avec les cellules dont les résultats sur les cellules seront suffisamment satisfaisants pour poursuivre chez l’animal. Ces expérimentations s’inscrivent dans le cadre d’une validation de la capacité de ces cellules, dans un organisme complet, à se développer. En effet, les expériences sur les cellules ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, la capacité à migrer et la persistance de nos cellules therapeutique.

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé en fonction de notre expérience du modèle en question, en prenant en compte la variabilité observée lors de précédents projets du laboratoire. De par la faible taille de nos groupes, nous nous attendons à ne pas pouvoir valider une distribution gaussienne de nos données et donc à privilégier des tests non paramétriques. Cependant, nous raisonnerons de manière méthodique en testant la possibilité d’une répartition en loi normale de nos jeux de données. Un premier test sera utilisé pour évaluer la répartition gaussienne de chaque groupe, suivi d'un test pour comparer les variances. Pour la comparaison entre deux groupes, si les données suivent une distribution gaussienne, nous aurons recours aux tests paramétriques. En cas de répartition non gaussienne, un test non paramétrique sera utilisé. Pour les comparaisons entre plus de 2 groupes, nous utiliserons soit un test d'analyse de la variance pour les données normales avec comparaisons multiples ou son équivalent non paramétrique en cas de répartition non gaussienne. Par ailleurs, afin de réduire au maximum la production de notre élevage de souris immunodéficientes, nous aurons recours à la synchronisation des trios en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Raffinement

Les animaux immunodéficients seront hébergés au sein d'un établissement dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité permettant d’éviter toute souffrance dues à leur phénotype immunodéficient. Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson à leur volonté, la nourriture et l’eau sont stériles. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnels de polycarbonate rouge translucide (pour les activités journalières) destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Des gels riches en nutriments pourront être ajoutés dans la cage si le besoin s'en fait sentir (animal chétif ou faible). La souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score définissant des points limites spécifiques. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Chaque procédure invasive sera précédée d’une anesthésie générale profonde accompagnée d’une analgésie. Lors des anesthésies gazeuses, les animaux seront placés sur un plateau thermostaté permettant de maintenir leur température corporelle. La mise à mort de l'animal sera faite sous anesthésie générale afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente que nous avons choisie constitue le modèle de référence pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ces souris immunodéficientes sont capables de soutenir le développement des différentes cellules sanguines humaines à partir de cellules souches. Nous utiliserons soit des souris femelles ou mâles de 4 à 8 semaines soit des souris nouveau-nés (moins de 4 jours). Les souris de 4 à 8 semaines supportent bien le traitement permettant de les “vider” de leur globules blanc les 2 jours précédant la greffe. Ce traitement à la dose choisie est sans toxicité majeure et permet d’une part de mimer la situation clinique de greffe, et d’autre part de « vider » la moelle des animaux afin de faire de la place pour les cellules humaines et faciliter leur différenciation dans toutes les lignées sanguines. La prise de greffe des cellules humaines est bonne chez les animaux âgés de 4 à 8 semaines. Les souris nouveau-nées (

840 souris et 630 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des gestes techniques répétés jusqu'à deux fois par jour pendant six à huit semaines, gavages, injections dans le péritoine, sous la peau et dans la veine caudale, prélèvements au sinus rétro-orbital, à la veine submandibulaire, à l'aorte abdominale et par ponction intracardiaque, avec les incidents que le porteur énumère lui-même, fausse route, perçage de l'œsophage, injection dans le cæcum ou la vessie, hémorragie nasopharyngée, lésion de la cornée. Ces séances ne produisent aucune connaissance et répondent à l'exigence réglementaire de formation continue du personnel d'une société de recherche préclinique. Le porteur indique que les premières séances d'apprentissage peuvent se faire sur des animaux morts, puis conclut que l'animal vivant est "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques, la force et les réactions de celui qui est manipulé.

Objectifs

L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures faiblement invasives et invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Dans notre société, chaque technicien doit maitriser les techniques d’administration et de prélèvement utilisées, chez le rat et la souris. L’objectif de ce projet est de répondre à l’exigence règlementaire concernant la formation continue et le maintien des compétences du personnel. Ce projet vise à améliorer les pratiques expérimentales, à assurer la qualité scientifique et le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les gestes techniques de type administration et prélèvement, chez le rat et la souris. L’apprentissage et le maintien des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal.

Procédures

Les gestes techniques traités dans ce projet se pratiquent sur rats et /ou souris, vigiles ou anesthésiés, avec une solution physiologique ou neutre n’engendrant pas d’effet indésirable. • Les administrations par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée sont réalisées sur animaux vigiles, une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines, au maximum. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 10 sec de contention. • Les administrations par voie intraveineuse sont réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés, en contention dans un tube, après désinfection de l’organe caudale, une à deux fois par semaine, pendant 3 à 4 semaines, au maximum. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 30 sec de contention. • Les prélèvements au sinus rétro orbital ou à la veine submandibulaire sont réalisés sur animaux anesthésiés, en respectant les limites de volume, de nombre (trois maximum) et de temps de récupération ; soit 7,5% du volume sanguin circulant maximum une fois par semaine ou 10% du volume sanguin circulant maximum une fois toutes les deux semaines ou 15% du volume sanguin circulant maximum une fois toutes les quatre semaines ou 20% du volume sanguin circulant pour un prélèvement terminal. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 20 sec de contention. • Les prélèvements sanguins à l’aorte abdominale sont réalisés uniquement chez le rat sous anesthésie générale, avec une couverture analgésique de type buprénorphine. Ce geste technique dure environ 1 minute. • Les prélèvements par ponction intracardiaque sont réalisés chez le rat et la souris sous anesthésie générale et nécessite environ 20 sec de contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances décrites ci-dessous représentent des cas extrêmes et rares qui sont évités par la réalisation d’un bon tutorat et d’un apprentissage progressif. • Administrations par voie orale : fausse-route, perçage de l’œsophage • Administrations par voie intrapéritonéale : passage dans la vessie, injection dans le caecum • Administrations par voie intraveineuse : lésions cutanées possibles en cas d‘injection en dehors de la veine. • Prélèvements sanguins au sinus rétro orbitaire ou à la veine submandibulaire : hémorragie dans les voies naso/oropharyngée si réalisés à trop grande profondeur, lésion de la cornée en cas de frottement avec la pipette. Afin de limiter le nombre d’animaux inclus, ils pourront être utilisés à plusieurs reprises, au maximum 2 gestes par jour pendant 6 à 8 semaines sous réserve de ne pas présenter d’altération de leur bien-être. Ces manipulations répétées peuvent engendrer un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures.

Remplacement

Avant toute manipulation des animaux, le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Si nécessaire, les premières séances d’apprentissage et d’entraînement sont réalisées sur des animaux morts. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci.

Réduction

Nous utilisons en priorité des animaux surnuméraires des études, des animaux issus de nos élevages non entrés en expérimentation plutôt que des animaux achetés à cette fin, chez des fournisseurs agréés. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus, les gestes techniques décrits ci-dessous sont réalisés plusieurs fois sur les mêmes animaux dans le respect des limites maximales recommandées par le GIRCOR et des temps de récupération adaptés entre chaque geste. • Administrations par voie orale et intrapéritonéales: maximum 2 par jour pendant 8 semaines • Administrations par voie intraveineuse : maximum 2 par semaine pendant 8 semaines • Prélèvements sanguins : maximum 1 par semaine pendant 4 semaines

Raffinement

Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée avant toutes manipulations des animaux. La majorité des gestes techniques sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress liés à la réalisation de ces gestes. Certains types de prélèvements sanguins sont réalisés sous couverture analgésique. L’état clinique des animaux est évalué quotidiennement par les personnes impliquées dans ces formations ou maintien des compétences (tuteurs, soignant, etc.). Un carnet de santé, traçant précisément tous les gestes réalisés, le cas échéant les signes cliniques observés ainsi que les soins apportés, est mis en place. L’atteinte des points limites conduit à la mise en place de complément au bien-être ou à la mise à mort des animaux concernés. La taille des aiguilles et des cathéters et sondes est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces utilisées pour mener à bien nos programmes de recherche précliniques. A ce jour, de par leurs similarités physiologiques avec l’homme, ces deux espèces de rongeurs sont les plus adaptées pour évaluer les propriétés pharmacologiques de molécules d’intérêt et d’en connaître les risques de toxicité avant les premiers essais chez l'homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car les études réalisées au sein de notre établissement le sont sur des individus adultes.

Sous anesthésie générale, 360 souris reçoivent une inflammation de la patte ou une opération témoin et 360 autres une lésion nerveuse, 100 recevant en plus quatre injections de tamoxifène. Au total, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes anesthésiées puis tuées pour prélever leur moelle épinière. Le but est de comprendre comment le toucher devient douleur, en suivant l'activité des neurones de la corne dorsale chez des souris génétiquement modifiées porteuses d'un capteur calcique. Le porteur annonce deux jours de tests comportementaux avant l'induction du modèle puis trois semaines de tests après, sans préciser lesquels, et écrit qu'aucune procédure du projet n'entraîne d'effet indésirable majeur en dehors de la douleur qu'il provoque.

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les autres neurones ? Comment l’information tactile se propage-t-elle à travers ce circuit ? En combinant des techniques de pointe – imagerie calcique en microscopie multiphotonique, enregistrements électrophysiologiques ciblés – chez des souris exprimant génétiquement un marqueur d’activité neuronale, nous visualiserons en temps réel la dynamique de l’activation de ce circuit et identifierons les neurones impliqués. Nous étudierons le rôle de neurotransmeteurs dans ces mécanismes de plasticité, notamment la sérotonine et l'ocytocine.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle des neuromodulateurs dans la plasticité des réseaux neuronaux spinaux en conditions physiologiques et pathologiques.

Procédures

Les animaux subiront entre 4 et 5 interventions au total (cf description annexe schématique du projet). Le groupe de souris CFA est composé de 180 Sham + 180 CFA = 360 animaux. Le groupe de souris neuropathiques est composé de 360 animaux. L'ensemble de ces animaux seront testés pendant 2 jours pour étudier leur comportement avant tout modèle de douleur, puis pendant 3 semaines une fois le modèle établi. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des pocédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeures. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio-dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistentes.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'excitabilité neuronale de la corne dorsale. L'objectif du projet est d'étudier l'activité neuronale de la moelle épinière et les contraintes techniques de cette approche nécessitent de réaliser l'étude ex vivo.

Remplacement

Pour ce projet, l'utilisation de souris transgéniques permettant la visualisation de l'activité neuronale de la moëlle épinière est nécessaire. Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les procédures expérimentales impliquant une anesthésie et une analgésie se feront à l'aide de mélanges de Kétamine et de Xylasine. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites atteints, après consultation de la SBEA et selon le fascicule « la douleur de l’animal au cours d’une expérimentation », élaborée par le service communication de l’école Vétérinaire de Lyon.

Choix des espèces

Les souris transgéniques GCamp sont les seules espéces animales dotées d'un senseur calcique exprimé au sein de leurs cellules neuronales. L'utilisation d'autres marqueurs calciques exogènes est toxique pour les neurones qui y sont exposés et est donc peu recommendé pour l'étude de réseaux neuronaux physiologiques et physiopathologiques. Par ailleurs, seules les souris permettent à l'heure actuelle de cibler l'expression du senseur calciques dans des populations spécifiques de neurones spinaux. Adultes (P21-35) pour comparaison avec les autres données de la littérature

4 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six échocardiographies sous anesthésie gazeuse, six injections intrapéritonéales, des tests de force et de course sur tapis roulant, et une biopsie pour génotypage. Le projet fabrique deux lignées de maladies mitochondriales : dans la première, un quart des souriceaux de chaque portée développe une cardiomyopathie avec perte de poids et posture anormale, dans la seconde, un quart développe une maladie neurologique et est tué le jour de sa naissance. Le porteur justifie l'effectif par ses travaux antérieurs et des méthodes statistiques, sans détailler le calcul qui mène à 4 420 souris pour produire et décrire deux modèles.

Objectifs

Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le coeur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.

Procédures

-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie..À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et seront mis à mort le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse moléculaire, histologique et biochimique des tissus

Remplacement

L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (embryons, nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.

Vingt-cinq souris dites "inconnues", utilisées comme partenaires sociales dans un test de sociabilité, sont gardées vivantes et remises en circulation dans l'animalerie. Les 264 autres sont tuées, dans un projet où 289 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Gavées trois fois par semaine de vésicules issues du microbiote intestinal de personnes autistes, elles passent trois jours de tests de locomotion, d'interactions sociales, de gestes répétés et d'anxiété, puis une sonde introduite dans le rectum mesure leur sensibilité colique. Le porteur affirme que le lien entre intestin et cerveau ne peut s'étudier aujourd'hui que sur un modèle animal, alors qu'il décrit par ailleurs des travaux préalables menés sur cultures de neurones intestinaux et sur intestins isolés.

Objectifs

L’autisme regroupe un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans les interactions sociales et des centres d’intérêts restreints et répétitifs. Outre ces symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes autistes (environ 70%) souffrent de symptômes digestifs, diarrhée, constipation, ballonnement, douleur abdominale. La corrélation entre la sévérite des symptômes digestifs et des troubles comportementaux souligne l'importance de l'intestin dans l’autisme. Ceci suggère également des mécanismes communs dans les dysfonctions des neurones de l'intestin (système nerveux entérique) qui régulent les fonctions digestives et ceux du cerveau. Un cofacteur important dans l’autisme est le microbiote intestinal. En effet, des modifications de la composition du microbiote intestinal ont été décrites chez les patients autistes par rapport à des sujets témoins. Des études fonctionnelles visant à déterminer l’impact de ces modifications ont montré que le transfert de microbiote humain provenant de sujets autistes chez la souris induisait des symptômes digestifs et comportementaux de l’autisme. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ces effets sont encore inconnus, mais pourraient impliquer des vésicules extracellulaires. Les vésicules extracellulaires sont produites et libérées par tous types cellulaires, incluant les bactéries, et transportent des molécules signalétiques pouvant agir à la fois sur l’intestin et le cerveau. L’hypothèse du projet est que les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal altéré des autistes contribuent aux dysfonctions digestives et cérébrales. Le premier objectif est donc d’étudier la capacité des vésicules extracellulaires produites par le microbiote à induire chez la souris des symptômes digestifs et comportementaux pertinents de l’autisme. Nos données préliminaires obtenues in vitro montrent que les vésicules extracellulaires isolées à partir de selles de patients autistes augmentent l'expression d’une enzyme neuronale responsable de la libération du nitric oxide, un neurotransmetteur clé du système nerveux entérique et du cerveau, dont les voies de signalisation sont perturbées dans l’autisme. Ainsi, le 2e objectif sera d'explorer la contribution de cette voie de signalisation dans les effets induits chez la souris par les vésicules extracellulaires. Ce projet apportera des éléments novateurs dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de l’autisme.

Bénéfices attendus

L’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et est en constante augmentation. Un frein pour le développement d’approche thérapeutique résulte d’un manque de connaissances des mécanismes physiopathologiques impliqués dans les troubles digestifs dans l’autisme. Bien que plusieurs éléments récents indiquent que des altérations du microbiote intestinal représentent un facteur important pouvant contribuer à l’autisme, les médiateurs impliqués dans les interactions entre le microbiote intestinal et les organes cibles de l’autisme, l’intestin et le cerveau, sont encore largement inconnus. En ciblant les vésicules extracellulaires, ce projet vise à mieux comprendre dans l’autisme les mécanismes d’interaction entre le microbiote intestinal d’une part, et l’intestin et le cerveau d’autre part. De plus, ce projet permettra d’identifier la voie nitrergique (neurotransmetteur nitric oxide) de l’hôte comme une cible potentielle des vésicules extracellulaires dérivées du microbiote de patients autiste. La voie nitrergique ayant été précédemment identifiée comme altérée dans l’autisme, ce projet permettra de proposer un mécanisme reliant l’altération du microbiote intestinal de patients autiste avec les dysfonctions digestives et cérébrales. Cette étude présente un intérêt non seulement pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’autisme, mais également dans la perspective d’un traitement thérapeutique basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques.

Procédures

Pour chaque procédure, lors des études comportementales et fonctionnelles digestives, nous réaliserons : - Un gavage sera réalisé 3 fois par semaine (un jour sur deux) avec une solution de vésicules extracellulaires (2min). - Injection d'un traitement visant à inhiber la signalisation nitrergique, une fois par jours pendant 7 jours (2min). - Des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : Jour 1: un test mesurant la locomotion des souris de 15min et un test mesurant les interactions sociales de 35min. Jour 2: un test mesurant les gestes répétés de 15min et un test mesurant l’anxiété de 15min. Jour 3: un prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue - un prélèvement des selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures. - un test permettant de mesurer la sensibilité colique par une petite sonde introduite dans le rectum (30min).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Par ailleurs, l’administration de vésicules extracellulaires et de métabolites bactériens de patients avec troubles digestifs sont susceptibles d’induire chez la souris des douleurs abdominales et des troubles gastro-intestinaux. Tous ces signes seront observés quotidiennement au cours du traitement.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort, sauf les 25 souris dites « inconnues » utilisées pour le test des 3 chambres seront gardées en vie et réutilisées au sein de l'animalerie. Pour les souris mise à mort, les intestins et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires de biochimie (protéines, tissus et ADN pour mesurer des marqueurs de neurones) et des marquages immunohistochimiques

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de neurodéveloppement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, notre étude sur l’autisme mettant en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, microbiote intestinal...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée seulement par une approche in vitro, justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer la complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin et ex vivo sur des intestins isolés nous ont permis de mettre en évidence que les vésicules extracellulaires provenant de selles humaines ont une bioactivité sur les neurones entériques et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement sur le système nerveux entérique. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souriceaux une semaine avant le début du traitement. Les animaux seront hébergés collectivement (max 5) dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place

Choix des espèces

Une de nos études préliminaires a montré que l’administration du microbiote intestinal des patients autistes de cette même cohorte induisait des troubles gastro-intestinaux chez la souris. Le but ici est de déterminer si les effets observés impliquent les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal dans ce même modèle. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie juste après le sevrage (21/22 jours) et gardées une semaine en acclimatation avant le début des gavages. Ce stade correspond à un stage enfant/adolescent cohérant avec le fait que l’autisme est une pathologie du neurodéveloppement. Par ailleurs, le système nerveux entérique étant encore plastique pendant la période de l’enfance et adolescence, étudier l’impact des vésicules extracellulaires sur le remodelage du système nerveux entérique est plus pertinent à ce stade du développement.