Procédures modérées

440 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, 250 d'entre elles subissent une lésion d'une zone du cerveau qui commande les mouvements, 190 reçoivent une semaine plus tard une greffe de neurones issus de cellules souches humaines, et toutes passent par une chirurgie de marquage cérébral, parfois avec la pose d'un dispositif d'enregistrement. 180 souris, soumises à une restriction alimentaire, enchaînent 25 séances d'une heure de tests de motricité et d'apprentissage récompensés par des pastilles sucrées, sans que ces tests soient nommés. La lésion peut réduire l'usage d'une patte, alors que les greffes pourraient seulement, à plus long terme, aider à préparer des essais chez l'humain après un traumatisme crânien. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'est "pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère" in vitro ou in silico.

Objectifs

Chaque année, environ 155 000 personnes en France subissent un traumatisme crânien, qui peut provoquer des séquelles neurologiques importantes. Le cerveau a une certaine capacité à se réparer, mais celle-ci reste limitée, notamment pour créer de nouveaux neurones ou reconnecter les circuits abîmés. Aujourd’hui, les traitements disponibles ne suffisent pas à restaurer complètement les fonctions perdues après une lésion cérébrale. Notre projet propose une approche innovante : utiliser des greffes de neurones pour remplacer les cellules détruites et aider le cerveau à récupérer. Pour cela, nous utilisons des neurones moteurs dérivés de cellules souches humaines, capables de s’intégrer dans le tissu cérébral endommagé. Le projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs (EU), chacun spécialisé dans un aspect clé de la recherche : EU1 – Lésion et transplantation : Étudier comment les neurones greffés survivent et s’intègrent dans le cerveau endommagé. EU2 – Analyse des synapses : Observer la formation de nouvelles connexions entre les neurones greffés et les circuits existants pour comprendre comment ils communiquent. EU3 – Analyse fonctionnelle par tests de comportement : Évaluer l’impact de la greffe sur les mouvements et les comportements, afin de mesurer la récupération fonctionnelle. En réunissant ces expertises complémentaires, ce projet vise à faire progresser la recherche préclinique et à ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients ayant subi un traumatisme crânien.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre si des neurones greffés peuvent réparer un cerveau lésé après un traumatisme. En étudiant comment ces cellules s’intègrent et fonctionnent dans le cerveau, il permettra d’évaluer leur capacité à restaurer certaines fonctions, notamment motrices. Les résultats attendus pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients souffrant de lésions cérébrales. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à préparer de futurs essais cliniques chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : EU1 : - Création d’une lésion au niveau d’une région du cerveau impliquée dans le contrôle des mouvements, sous anesthésie générale (durée : environ 15 minutes). Cette intervention concernera 250 animaux. -Greffe de neurones dérivés de cellules souches dans la zone cérébrale lésée, réalisée une semaine après la lésion sous anesthésie générale (durée : environ 20 minutes). Cette intervention concernera 190 animaux. EU2 : -Intervention chirurgicale sous anesthésie générale permettant de marquer certaines cellules du cerveau ou de suivre leur activité (durée : environ 30 minutes). Cette intervention concernera l’ensemble des 440 animaux. -Chez une partie des animaux, mise en place au cours de la même intervention d’un dispositif permettant de mesurer l’activité cérébrale (durée supplémentaire : environ 20 minutes). Cette intervention concernera 180 animaux. EU3 : -Tests de motricité et d’apprentissage réalisés sur animaux éveillés, avec utilisation de récompenses alimentaires (pastilles sucrées). Les sessions dureront environ 60 minutes, à raison de 25 sessions par animal. Cette phase concernera 180 animaux.

Impact sur les animaux

Après l’anesthésie et les interventions chirurgicales, les animaux peuvent présenter un inconfort temporaire au réveil, une légère perte de poids, ainsi que des effets liés à la chirurgie, comme un risque de saignement et de douleur après l’opération, pris en charge par des traitements adaptés. La lésion réalisée dans le cerveau peut entraîner une diminution modérée de la capacité à utiliser une patte. Lors des tests de comportement, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire afin de les motiver à réaliser les tâches. Cette restriction est encadrée et surveillée, mais peut entraîner une perte de poids modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumas crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in- silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.

Réduction

Une première étape correspond à une étude pilote visant à valider les différents protocoles, en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire. La poursuite du projet dépendra de la validation de cette étape : si les protocoles ne sont pas validés, les étapes suivantes ne seront pas réalisées. Pour les phases suivantes, le nombre d’animaux a été défini de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Les animaux seront répartis de manière équilibrée entre mâles et femelles. Les résultats obtenus seront analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin de comparer les différents groupes et d’identifier les effets de la lésion et de la greffe. Au total, le projet nécessitera au maximum 440 souris.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les souris ont un phénotype dommageable (immunodéficience), mais ce phénotype ne s'exprime pas dans nos conditions d'hébergement en portoirs ventilés. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle à l'aide d'un tapis chauffant. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire durant 48h. Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé, équipé pour assurer des conditions optimales de température, ventilation et réduction du bruit. Des cages de transport agréées, adaptées à l'espèce et conformes à la réglementation, seront utilisées. Le transport et les cages seront soumis aux exigences liée au statut sanitaire des animaux. À l’arrivée sur le site d’accueil, une période d’acclimatation de 7 à 14 jours sera observée. Durant cette phase, aucun acte expérimental ne sera réalisé. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin d’assurer leur adaptation et prévenir tout signe de stress ou de pathologie. Avant le début des tests de comportement, une habituation à l'expérimentateur sera réalisée (3 fois/semaines sur 2 semaines). Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, AVC...) Le modèle de lésion du cerveau chez le rongeur est très référencé dans la littérature et nous le maitrisons au sein du laboratoire. Nous utiliserons des souris immunodéficientes, car ce modèle est nécessaire pour permettre l’implantation de cellules d’origine humaine sans risque de rejet du greffon. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois lors du début de l'étude. Nous souhaitons travailler sur des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par la sénescence.

3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant un anticorps anticancéreux couplé à un marqueur fluorescent, puis des prises de sang répétées sans anesthésie et des anesthésies à l'isoflurane pour des séances d'imagerie de cinq minutes à une heure. Une partie peut porter des tumeurs humaines greffées sous la peau ou dans l'organe d'origine, sur des souches immunodéprimées comme les souris nude ou NSG. Le porteur chiffre à 90 % la réduction permise par l'imagerie, 20 souris au lieu de 200 pour une étude de quatre candidats, sans expliquer comment il arrive à un effectif total de 3 000. Il déclare 500 souris réutilisées et précise que les souris non entrées en protocole serviront à entraîner le personnel aux gestes techniques avant d'être mises à mort, comme toutes les autres en fin de procédure.

Objectifs

En France le cancer est la deuxième cause de mortalité. Le développement de nouvelle thérapie ciblée est essentiel pour guérir des patients atteints de cancers résistants aux thérapies conventionnelles comme les chimiothérapies. Ce projet s’inscrit dans une démarche de criblage et de sélection de candidats thérapeutiques de nature protéique, tels que des anticorps ou des anticorps conjugués, afin d’identifier les molécules présentant le profil le plus pertinent pour une progression en développement préclinique. Pour ce type de biomolécules, la caractérisation de la biodistribution dans les tissus sains et tumoraux constitue un paramètre déterminant, car elle permet d’anticiper à la fois le potentiel d’efficacité, la sélectivité de ciblage et les risques de toxicité associés. L’objectif du projet est d’évaluer, chez la souris, la biodistribution et la pharmacocinétique de protéines thérapeutiques couplés à des fluorophores. Concernant la biodistribution, la stratégie expérimentale repose sur l’utilisation de l’imagerie optique non invasive par IVIS Spectrum, permettant de suivre de manière longitudinale la distribution tissulaire des molécules après administration. Concernant la pharmacocinétique, la stratégie expérimentale repose sur l’analyse d’échantillon sanguin, permettant d’obtenir la demi-vie (t₁/₂), la clairance (Cl), le volume de distribution (Vd), la concentration maximale (Cmax), le temps pour atteindre cette concentration (Tmax) et l’aire sous la courbe (AUC). Le projet pourra être décliné dans plusieurs contextes expérimentaux complémentaires, incluant la biodistribution et/ou pharmacocinétique en tissus sains, des modèles de xénogreffes tumorales sous-cutanées ou orthotopiques établies à partir de lignées humaines chez des souris immunodéficientes, ainsi que des modèles syngéniques chez des souris immunocompétentes. Ces deux méthodes complémentaires (biodistribution et pharmacocinétique) permettront de déterminer les modalités d’administration du médicaments (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer, ensemble ou indépendamment, des données précliniques de biodistribution tissulaire et de pharmacocinétique, de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse. Ce projet générera des données essentielles pour guider la sélection et l’optimisation de candidats médicaments en oncologie, en évaluant leur spécificité de ciblage tumoral ainsi que les éventuels sites d’accumulation on-target ou off-target. L’imagerie IVIS non invasive permettra d’obtenir des informations cinétiques clés, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires par rapport aux approches classiques impliquant de sacrifier les animaux pour prélever les organes pour analyser leur contenu en candidats médicaments. En intégrant des approches de réduction du nombre d’animaux (via le suivi longitudinal sur un même individu), ce projet s’inscrit pleinement dans une démarche éthique et scientifique rigoureuse. À terme, les données générées contribueront à accélérer le développement de thérapies ciblées innovantes contre le cancer, avec un fort potentiel de transposition vers l’Homme grâce à la pertinence translationnelle du modèle utilisé.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : #Lors de l’injection des candidats médicaments (t-0). # Lors de chacun des prélèvements sanguins. (maximum 1 min) 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, ou surdosage d’anesthésique (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont limitées et transitoires (1 à 5min) : stress lié aux manipulations (pesage, contention, injection), inconfort lié aux prélèvements sanguins (volumes préférentiellement inférieurs à 7,5% du volume sanguin circulant (VSC) sur une semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes pourront ainsi être prélevé en toute sécurité pour l‘animal), anesthésie répétée à l’isoflurane pour les sessions d’imagerie (5-min à 1h par session), et croissance tumorale contrôlée (sous points limites stricts) pour les modèles tumoraux. Aucune souffrance prolongée ni douleur chronique n’est anticipée.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques avant d’être mises à mort.

Remplacement

Chaque composé fera l’objet d’une caractérisation approfondie in vitro avant toute étude in vivo, incluant notamment l’évaluation de l’affinité, de l’internalisation, et caractérisation physico-chimique. Cette étape préalable permettra de sélectionner les candidats les plus pertinents et de concevoir les études in vivo de manière optimisée, en définissant les doses, les points cinétiques et les contrôles les plus informatifs. La biodistribution systémique et pharmacocinétique d’une protéine dépend d’interactions dynamiques entre la molécule, la vascularisation, les différents organes exprimant la cible, le microenvironnement tumoral, et les systèmes de clairance et de distribution qui ne peuvent pas être reproduits par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

L’imagerie IVIS constitue la principale stratégie de réduction du projet, car elle permet un suivi longitudinal des mêmes animaux au cours du temps et limite ainsi le recours à des groupes satellites dédiés. Dans les modèles de souris porteuses de tumeurs, cette approche permet d’évaluer simultanément la biodistribution du composé et son activité antitumorale, sans nécessiter une étude d’efficacité distincte menée en parallèle. Cette stratégie peut permettre une réduction substantielle du nombre d’animaux utilisés, en regroupant au sein d’un même groupe expérimental les évaluations de pharmacocinétique, de biodistribution tumorale et d’efficacité (jusqu’à 85% de réduction). Par exemple, une étude classique de biodistribution prévoit sans utilisation de l’IVIS, 10 points de mesures totales sur 28 jours avec mise à mort (MAM) des animaux systématiquement pour prélèvement des organes, afin de mesurer la biodistribution. A raison de 5 animaux par groupes et 4 différents candidats médicaments, il peut être utilisé :10*5*4 = 200 animaux. Grâce à l’utilisation de l’IVIS, pour cette étude il n’y aurait pas besoin de MAM les animaux ceci permettra une diminution très significative du nombre d’animaux – suivi via IVIS : 5*4 = 20 animaux, une réduction de 90% (180 animaux). Également, les animaux nous inclus dans l’étude pourront être réutilisé si nécessité pour formation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 2 à 5 dans des cages transparentes, aux dimensions adaptées, avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, graines de tournesol…). Les conditions sanitaires permettent que leur phénotype ne soit pas dommageable. Un système de surveillance 7/7 est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux. Les animaux inclus dans la grille de score n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés dès que nécessaire (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Également, il sera privilégié des techniques de microsampling pour collecter le sang, méthode moins invasive.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces études pour les raisons suivantes : (1) Disponibilité de souches immunocompétentes, immunodéprimées et humanisées ainsi que de modèles tumoraux humains (xénogreffe) et murins (syngénique) bien établis ; (2) imagerie IVIS calibrée et optimisée pour le petit animal. La souche CD-1 (immunocompétente), et la souche CB17-SCID (immunodéprimée) seront principalement utilisées. Cependant, les souches Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32…(immunocompétentes) et Balb/c nude, Tg32 SCID, NXG, NSG... (immunodéprimées) pourront également être utilisées selon les besoins définis au préalable par les études de tumorogénèse, ainsi que du profil des candidats médicament qui seront testés. Les souris pourront être livrées à partir de 4 semaines. Les souris seront toutefois utilisées préférentiellement à partir de 7 semaines, comme considérées adultes permettant l’établissement de xénogreffes reproductibles, pharmacologie représentative des candidats médicaments (organes de clairance mature), comparabilité avec les données pharmacologiques existantes et pour les souris immunocompétentes, un système immunitaire mature.

Des souris femelles subissent une ablation des deux ovaires sous anesthésie, et la moitié des souris du projet reçoit pendant 52 semaines un régime riche en graisses et en sucres, avec six prises de sang à la joue après six heures de jeûne, quatre échographies cardiaques sous anesthésie et 44 heures en cage individuelle. 4 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue. Après un gavage ou une injection, une incision de la queue sert à prélever une goutte de sang toutes les quinze minutes pendant deux heures, dans un projet qui cherche à comprendre pourquoi les œstrogènes protégeraient les femmes de maladies du foie liées au syndrome métabolique. Le porteur annonce dix souris par groupe, fixées par un calcul de puissance, sans dire combien de groupes mènent au total de 4 480.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 38% de la population mondiale. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans cet organe. Ce stade précoce et bénin peut évoluer vers des stades plus graves, caractérisés par une inflammation et une fibrose conduisant à une dysfonction de l’organe. L’ensemble de ces atteintes hépatiques chroniques, nommées hépatopathies métaboliques (HM), représentent la première cause de transplantation de foie et sont associées à des complications cardiaques. Comprendre les mécanismes contrôlant la progression des HM est crucial pour identifier les patient(e)s à risque et développer des traitements préventifs et/ou curatifs actuellement inexistants. Les données cliniques et scientifiques montrent que les femmes sont protégées de la survenue et de la progression de ces HM et de leurs complications grâce aux hormones sexuelles féminines, les œstrogènes. Dans ce projet nous souhaitons déterminer le rôle de 2 protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie dans la progression des HM. Ce projet permettra de comprendre la fonction des hormones sexuelles à l’origine des différences liées au sexe dans la susceptibilité aux HM. Il nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire, car, à l'heure actuelle, les modèles et lignées cellulaires disponibles ne permettent pas de reproduire la complexité du système hormonal et ne conservent pas leurs caractéristiques sexuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera donc des connaissances essentielles permettant de comprendre les mécanismes protégeant les femmes du développement de ces maladies. Il permettra l’élaboration de stratégies thérapeutiques préventives et /ou curatives adaptées au sexe contre ces atteintes hépatiques qui représentent aujourd'hui la première cause de transplantation de foie dans le monde.

Procédures

Les animaux anesthésiés subiront une opération chirurgicale de 15 minutes avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire – La moitié des animaux auront une alimentation riche en graisse et en sucre pendant 52 semaines et seront hébergés à thermoneutralité - les animaux vigiles seront placés en isolement pendant 90 à 120 secondes, à trois reprises - A 6 reprises nous serons amenés à effectuer des prises de sang à la joue des souris vigiles après 6 heures de jeûne (1 minute par animal) – A 4 reprises, les animaux anesthésiés auront une échographie cardiaque d’environ 10 minutes pour chaque animal - Les animaux vigiles recevront soit un gavage soit une injection d’une durée de 20 secondes par animal suivi par une incision au niveau de la queue et le prélèvement d’une goute de sang toutes les 15 minutes sur une durée totale de 2h - A 2 reprises les animaux seront transportés dans leurs cages d’origine dans un autre établissement (durée inférieure à 10 minutes) - Les animaux seront mis dans des cages individuelles pour une durée totale de 44 heures. « A la fin de l'expérimentation une prise de sang sur chaque animal vigile sera effectuée et, directement après, il sera mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour l’ovariectomie, c'est-à-dire l'ablation des 2 ovaires, comme pour tout autre acte de chirurgie, les risques attendus sont majoritairement des complications post-opératoires comme des infections, hémorragies, des adhérences internes et des problèmes de cicatrisation (fils cassés). De plus, même si la prise en charge de la douleur est totale lors de cette procédure, l’animal peut ressentir une gêne temporaire lors du réveil dont les signes sont le poil hérissé, l’isolement des congénères et/ou une perte de poids supérieure à 10%. Enfin, des fils de suture peuvent être arrachés les jours suivant l’opération. De plus, les animaux pourraient subir plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourrait survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min) lors des 52 semaines de régime western diet (régime enrichi en graisse, sucres et cholestérol) ou encore lors de la détermination de leur composition corporelle et des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 10 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors des prises de sang ou lors des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline ou encore lors des injections intrapéritonéales. Également, un stress pourrait être subit par les animaux liés à l’isolation de leurs congénères lors des mesures de la composition corporelle ou des mises en cage à métabolisme.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation des cervicales.

Remplacement

Les effets sur tout l'organisme des hormones sexuelles dont les œstrogènes, synthétisés majoritairement par les ovaires, font intervenir des dialogues inter-organes, notamment centraux, et inter-cellulaires à l’échelle de l’organisme qui restent encore non modélisables par des approches cellulaires. Des modèles alternatifs ont été décrits pour l’étude des HM, notamment des modèles de lignées cellulaires d'hépatocytes incubés avec des cocktails de graisses et de sucres permettant de mimer le stockage de graisses dans les cellules qui est caractéristique des HM. Cependant ces modèles ne permettent pas encore d’étudier l’effet des hormones sexuelles et leur rôle dans le développement de l'inflammation et de la fibrose hépatique, qui sont des éléments majeurs dans le développement des complications liées aux HM. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre l'impact physiologique des hormones sexuelles à l'échelle de l'organisme.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour, à la fois, répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs, c'est-à-dire 10 animaux par groupe expérimental. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive européenne. Du papier et du carton sont fournis pour permettre aux souris de fabriquer des nids et exprimer des comportements naturels. Des tunnels en carton favorisent leur activité physique et leurs interactions sociales. La préhension des animaux se fera grâce à un tube en plastique pour soulever les animaux. Une grille de scoring, en collaboration avec les zootechniciens, permet de surveiller en temps réel l'état de santé et de confort des animaux et d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Lors de l'ablation des ovaires, la diminution de la température corporelle sera limitée par un tapis chauffant. Un gel occuloprotecteur préviendra le dessèchement des yeux. La douleur et la sédation seront contrôlées par des injections d'analgésiques et l'inhalation d'anesthésiants. Les complications post-opératoires potentielles incluent le développement d’infections, d’hémorragies, d’adhérences internes et des problèmes de cicatrisation. Une injection supplémentaire d'analgésique sera réalisée 6h après l'opération pour éviter toute gêne au réveil. Une surveillance quotidienne sera assurée pendant 7 jours. En cas de signes de douleur (poils hérissés, isolement, perte de poids >10%), une intervention analgésique sera initiée en concertation avec le vétérinaire. Si les symptômes persistent, l’animal sera mis à mort par dislocation des cervicales. En cas de déchirure des fils de suture le lendemain, une réintervention sous anesthésiants et analgésiants sera effectuée sous surveillance stricte. Pour les prélèvements de sang sur animal vigile, les animaux seront laissés au maximum libres de leurs mouvements. Les animaux sont transportés suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont gardés dans leur cage d’origine pour le transport d’une durée de moins de 10 minutes avant l'euthanasie. Pour les mâles aussi bien que pour les femelles, la répartition des animaux dans les cages n’est pas modifiée par rapport à leur arrivée en zootechnie d’expérimentation.

Choix des espèces

Dans ce projet nous souhaitons étudier le rôle de deux protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie et impliquées dans la progression des HM. Donc la souris est le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels ces protéines ont été supprimées dans le foie spécifiquement. Aussi, dans les études publiées par différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup bien décrits chez la souris, avec une transposabilité à l'Homme élevée. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour ce projet de recherche basé sur les effets des hormones sexuelles sur la progression des HM et leurs conséquences cardiaques. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d’âge, correspondant à la phase de fin de croissance et de maturité sexuelle et hépatique.

Sous anesthésie générale, de jeunes porcs de deux mois et demi reçoivent une injection d'alcool dans une artère coronaire qui provoque un infarctus étendu, puis passent des échocardiographies sous sédation, certains pendant quatre-vingt-dix jours de suivi. 20 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur juge "probable" que plusieurs meurent d'un arrêt cardio-respiratoire malgré la réanimation. Il reconnaît que l'infarctus peut être douloureux chez l'humain, mais affirme ne pas avoir observé de douleur chez les porcs, faute de "différences comportementales" avant et après, sans dire comment il les a évaluées. Une seconde chirurgie d'environ deux heures se termine par leur mise à mort, pour prélever le cœur.

Objectifs

L'infarctus du myocarde (crise cardiaque) est une destruction d’une partie du cœur due à un manque de sang et d’oxygène (ischémie). Cela se produit lorsqu’une artère coronaire (vaisseau sanguin apportant le sang et l’oxygène au cœur) s’obstrue. Les lésions forment une zone tissulaire morte dite infarcie qui ne permet plus une bonne contraction du cœur. Il faut savoir qu’il y a environ 100000 infarctus du myocarde en France tous les ans, et que ceux-ci entraînent des séquelles amenant d’importantes hospitalisations pour insuffisance cardiaque chez les patients survivants. Le développement de cette insuffisance cardiaque est lié à un remodelage cardiaque, c’est-à-dire à une modification profonde de la morphologie du cœur. Dans ce contexte, l’objectif principal du projet est de développer et caractériser un modèle porcin reproduisant le remodelage cardiaque consécutif à l’infarctus. L’acte principal est d’injecter directement dans une artère coronaire de l’alcool qui provoque la création d’un thrombus massif induisant ainsi l’infarctus. Ce modèle avec une zone de mort cellulaire étendue et stable et avec une faible variation de lésions est conçu comme un support préclinique pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques protégeant le cœur contre le remodelage post-infarctus. Actuellement, par leur caractère préclinique, les modèles animaux sont une étape indispensable pour tester des stratégies cardioprotectrices permettant de réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de réaliser un infarctus induit par une alcoolisation et de le caractériser par des échocardiographies et une analyse tissulaire après prélèvement de la totalité du cœur. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique humaine pour rester scientifiquement valable, et l’anesthésie/analgésie seront adaptées afin de n’induire aucune souffrance inutile. Nous pensons obtenir des résultats démontrant la pertinence de cette nouvelle procédure et l’utiliser ensuite dans des projets utilisant des stratégies permettant de lutter contre l’insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer une nouvelle procédure d’induction d’infarctus du myocarde liée à un fort remodelage. Cela permettra ensuite de tester de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 2 fois à une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’environ 2 heures, dont une sera suivie de la mise à mort. Il est aussi prévu 2 échocardiographies totalement indolore sous sédation d’environ 30 minutes (+2 autres échocardiographies pour les porcs suivi 90 jours). Un total de 60mL de sang sera prélevé pendant les 2 anesthésies.

Impact sur les animaux

Il est probable qu’un certain nombre d’animaux fassent des arrêts cardio-respiratoires, qui malgré toutes les tentatives de réanimation, ne se résoudront pas par une reprise du bon fonctionnement du cœur : ces animaux seront déclarés décédés et exclus du projet. Les nuisances ou effets indésirables per-chirurgicaux sont classiques à toute chirurgie : douleur, hypothermie, saignement, hypercoagulation, infection. Aucun effet indésirable n’est attendu après la mise en place de l’infarctus du myocarde, hormis lorsque les animaux sont suivis sur une longue période, pendant laquelle peuvent subvenir : baisse du poids et de l’appétit, apparition d’œdème, modification du comportement et de la respiration. Les différentes manipulations post-chirurgicales (soins et échocardiographies) n’engendrent aucune nuisance ou effet indésirable, hormis un stress possible de l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie d’induction d’infarctus cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale, et par leur caractère préclinique, les modèles animaux restent une étape indispensable. Seule l’utilisation d’animaux permet d’atteindre l’objectif du projet, qui doit rester proche de la réalité clinique pour rester scientifiquement acceptable.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque lot testé, en contrôlant leur nombre par des méthodes statistiques et en restant en accord avec les études publiées similaires.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées. Il est à noter que chez l’Humain, l’infarctus en lui-même peut entrainer de la douleur, mais dans nos conditions expérimentales, elle n’a pas été constatée (pas de différences comportementales entre avant et après l’infarctus). L’hébergement est conforme à la législation et est adapté au mieux (température, lumière, ventilation) pour assurer le bien-être des animaux. Ils bénéficient quotidiennement de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Des points-limites ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (30kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité. Ce sont donc de jeunes animaux sevrés prépubères.

Une injection intracérébrale d'un vecteur viral, avec incision du scalp et pose d'agrafes, doit provoquer chez des souris l'accumulation d'une protéine Tau humaine mutée, dans les neurones ou dans les astrocytes. 408 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'étude histologique de leur cerveau. L'objectif déclaré est de reproduire chez la souris la paralysie supranucléaire progressive, et le porteur annonce des troubles de la coordination motrice et de la mémoire, peut-être des mouvements répétitifs. Les souris destinées aux tests vivront avec un enrichissement de cage réduit au minimum, pour ne pas biaiser les résultats, et passeront cinq tests comportementaux qu'il ne nomme pas, d'une durée de trente secondes à vingt-trois heures par jour.

Objectifs

La paralysie supranucléaire progressive (PSP) est une maladie neurodégénérative rare mais sévère. Débutant entre 40 et 60 ans, elle évolue rapidement et se caractérise par une instabilité posturale, des troubles des muscles oculaires, des troubles moteurs progressifs et des déficits cognitifs et comportementaux marqués. À un stade avancé, la marche, la vision, le langage et la déglutition sont fortement altérés, entraînant une perte majeure d’autonomie. Sur le plan neuropathologique, la PSP est définie par l’accumulation anormale de la protéine Tau dans les neurones et les cellules gliales (cellules non neuronales du système nerveux), notamment les astrocytes. Longtemps considérée comme une maladie principalement neuronale, la PSP est désormais reconnue comme impliquant les astrocytes, dont les altérations sont associées à la gravité des symptômes. Cependant, l’absence de modèles animaux fidèles, reproduisant à la fois les lésions neuronales et astrocytaires ainsi que les symptômes cliniques, constitue un frein majeur au développement de thérapies, alors qu’aucun traitement efficace n’existe à ce jour. Ce projet a pour objectif de développer de nouveaux modèles chez la souris de la PSP grâce à des vecteurs viraux exprimant une forme mutée de la protéine Tau, ciblant initialement soit les neurones, soit les astrocytes. Ces modèles permettront de reproduire les lésions clés de la PSP, d’évaluer les déficits comportementaux associés et de déterminer la contribution propre des astrocytes à la pathologie. À terme, ils constitueront des outils précieux pour mieux comprendre la maladie et accélérer le développement de stratégies thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

La PSP est la deuxième tauopathie la plus fréquente, après la maladie d’Alzheimer, avec une prévalence estimée entre 1 et 18 personnes pour 100 000, soit environ 5000 à 10 000 patients en France. Cette maladie agressive débute entre 40 et 60 ans et progresse rapidement sur 5 à 10 ans. Mieux comprendre comment les astrocytes participent à la maladie est une question essentielle à poser pour développer de nouvelles pistes thérapeutiques. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement efficace pour traiter cette maladie mortelle. Un obstacle majeur au développement de nouvelles thérapies est le manque de modèles animaux reproduisant à la fois les lésions neuronales et astrocytaires, mais aussi des symptômes typiques de la pathologie. Les modèles transgéniques murins surexprimant des formes de la protéine Tau développent très peu de lésions astrocytaires et présentent des déficits comportementaux modestes. Le transfert de gène, via l’utilisation de virus génétiquement modifiés codant pour la protéine Tau humaine est un recours intéressant, car il permet de cibler spécifiquement les neurones ou les astrocytes, dans des régions choisies du cerveau en réalisant des injections stéréotaxiques chez l’animal adulte. Cette approche est donc très prometteuse pour modéliser les lésions typiques de la PSP. Elle pourrait permettre de mieux comprendre comment l’accumulation de Tau dans les astrocytes contribue à la pathologie. A terme, ces nouveaux modèles de PSP pourraient être des outils essentiels pour le criblage rapide de molécules thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions : - L’ensemble des animaux inclus recevront une injection d’un vecteur viral (durée : 20 à 30 minutes) pour apporter le gène Tau muté ou un placebo. Les animaux récupèrent généralement en quelques heures. - Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités motrices et cognitives. Chacun de ces tests dure entre 30 sec et 23h par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué 2 fois sur une période de 6 semaines, effectué à 2 stades de la pathologie (1 mois et 4 mois après injection du vecteur viral).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront des effets indésirables différents : - Les effets secondaires liés à l’injection intracérébrale se limitent à une douleur transitoire au niveau de l’injection (incision du scalp et pose d’agrafes). - La pathologie induite par la surexpression de Tau peut générer une altération de la coordination motrice et de la mémoire. Des troubles du comportement de type mouvements répétitifs pourraient apparaitre. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Le stress ponctuel dû au test sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. La diminution de l’enrichissement dans les cages d’hébergement peut engendre un léger stress des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont destinés à une étude histologique des tissus au niveau des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie.

Remplacement

Ce projet fait appel à des modèles de souris de la PSP. A l’heure actuelle, ce projet ne peut, ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des modèles informatiques. En effet les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles murins. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est à dire possédant un cerveau complexe doté d’un système moteur et mnésique permettant d’exprimer des comportements sophistiqués à l’instar de l’être humain.

Réduction

Une étude statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe nécessaire pour observer des effets significatifs. Cette étude est basée sur des données obtenues dans la littérature scientifique et sur les valeurs que nous avons observées lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 408 animaux lors des expériences qui seront menées pendant l’étude. Ce nombre maximum, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous avons prévu les procédures au fur et à mesure avec une réduction du nombre de groupes possible si les premiers lots de vecteurs viraux produits permettent d’effectuer l’ensemble de l’étude.

Raffinement

En cas d’atteinte des points limite, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Afin d’éviter tout biais dans les résultats des tests comportementaux destinés à évaluer la motricité et la mémoire des souris, les animaux destinés à ces tests seront hébergés en conditions minimales d’enrichissement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience, notamment lors des tests de comportement. Les protocoles d’anesthésie et de diminution de la douleur des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.

Choix des espèces

Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la paralysie supranucléaire progressive (PSP) afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. La région initialement et la plus gravement atteinte dans la forme commune de PSP est située dans des noyaux sous-corticaux. La pathologie se propage ensuite aux régions corticales du cerveau. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas ces régions cérébrales. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent des systèmes moteur et limbique très proches de celui de l’êtrehumain. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de la PSP. Elles devraient également présenter des altérations motrices et cognitives qui sont caractéristiques de la PSP. Ces déficits peuvent être quantifiés par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : Les animaux seront d’abord évalués au stade jeune adulte (3 mois) puis au stade adulte (6 mois) afin de mimer les stades auxquels la PSP se déclare chez l’homme (entre 40 et 60 ans) et d’évaluer comment les fonctions motrices et cognitives s’altèrent au cours du temps.

100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes tuées quand leur réutilisation ne sera "plus possible ou adaptée". Chacune subit une stérilisation chirurgicale d'environ trente minutes sous anesthésie générale, reste seule jusqu'à sept jours le temps de cicatriser, puis est placée à plusieurs reprises dans la cage de souris isolées pour d'autres projets, où des comportements d'agressivité peuvent survenir. Ces "souris visiteuses" doivent atténuer le stress d'un isolement que d'autres protocoles imposent, selon le porteur, afin de "garantir la qualité des résultats scientifiques". Elles proviendront surtout de surplus d'élevage, ce qu'il présente comme un moyen de "valoriser" des souris qui auraient sinon été tuées.

Objectifs

Les souris sont des animaux sociaux qui vivent naturellement en groupe. Cependant, certains projets de recherche nécessitent que des animaux soient hébergés seuls pendant une période plus ou moins longue afin de garantir la qualité des résultats scientifiques. Cet isolement peut avoir des conséquences négatives sur leur bien-être en augmentant notamment le stress et en modifiant leur comportement. L'objectif de ce projet est de créer un groupe de « souris visiteuses » qui pourront être hébergées avec ces animaux isolés afin de maintenir des interactions sociales tout en respectant les contraintes des études scientifiques. Pour éviter toute reproduction, ces souris seront stérilisées avant leur utilisation. Elles seront principalement issues de surplus d'élevage, ce qui permet également de limiter le nombre d'animaux produits spécifiquement pour ce projet. Ce projet s'inscrit dans la démarche des 3R, et plus particulièrement du raffinement, en cherchant à améliorer les conditions de vie des animaux utilisés en recherche tout en préservant la qualité scientifique des études.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu est l'amélioration du bien-être des souris qui doivent être hébergées seules dans le cadre de certains projets de recherche. La présence d'une « souris visiteuse » permet de réduire le stress lié à l'isolement, de favoriser l'expression de comportements sociaux naturels et d'améliorer les conditions de vie de ces animaux. Ce projet contribue également à développer une méthode de raffinement qui pourra être utilisée dans différentes études nécessitant un hébergement individuel. Enfin, l'utilisation de souris issues de surplus d'élevage permet de valoriser des animaux qui auraient autrement été euthanasiés, limitant ainsi le nombre d'animaux produits spécifiquement pour la recherche.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet subiront une seule intervention chirurgicale de stérilisation, réalisée sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur. Cette intervention durera environ 30 minutes. Après une période de récupération complète (hébergement individuel jusqu'à cicatrisation de maximum 7jours), les animaux seront hébergés avec des souris maintenues seules afin de leur apporter une présence sociale. Les « souris visiteuses » pourront être utilisées à plusieurs reprises au cours de leur vie avec différents congénères (de même souches), sous surveillance afin de vérifier leur bonne compatibilité. Elles feront l'objet d'un suivi de façon hebdomadaire tout au long de leur participation au projet. À l'issue du projet, lorsque leur réutilisation ne sera plus possible ou adaptée, les animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La chirurgie de stérilisation peut entraîner une douleur et une gêne temporaires après l'intervention, ainsi qu'une période de récupération de quelques jours. Comme pour toute intervention chirurgicale, un faible risque de complications (par exemple une mauvaise cicatrisation ou une infection) existe, mais il sera limité grâce à une prise en charge adaptée et à une surveillance renforcée. Lors de la mise en contact avec d'autres souris, de rares comportements d'agressivité ou d'incompatibilité peuvent être observés. Les animaux seront alors immédiatement séparés afin d'éviter toute blessure. Les souris bénéficieront d'un suivi de façon hebdomadaire tout au long du projet afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou de détresse et d'adapter leur prise en charge si nécessaire.

Devenir

Les animaux visiteurs pourront être réutilisés plusieurs fois au cours de leur vie sous réserve du maintien de leur bon état sanitaire et comportemental et lorsque leur réutilisation ne sera plus possible ou adaptée, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Le projet a pour objectif l'amélioration du bien-être de souris hébergées dans un contexte expérimental. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer l'utilisation d'animaux vivants puisque les interactions sociales recherchées nécessitent la présence d'un congénère. L'objectif du projet ne peut donc être atteint sans recours à des animaux vivants.

Réduction

Les animaux visiteurs seront principalement issus de surplus d'élevage de l'établissement. Leur réutilisation au cours de plusieurs périodes d'hébergement permettra de limiter le nombre total d'animaux nécessaires au projet.

Raffinement

Le projet constitue lui-même une mesure de raffinement visant à limiter les effets délétères de l'isolement social chez la souris. Les interventions chirurgicales de stérilisation seront réalisées sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique adaptée avant, pendant et après l'intervention. Les animaux feront l'objet d'une surveillance post-opératoire jusqu'à récupération complète. Les mises en contact seront réalisées sous surveillance afin de détecter rapidement tout signe d'incompatibilité. Les animaux présentant des signes de stress, d'agressivité ou de souffrance seront immédiatement séparés et pris en charge conformément aux recommandations du vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est choisie car elle est l'espèce concernée par les protocoles expérimentaux dans lesquels un hébergement individuel peut être nécessaire. Il est donc pertinent d'utiliser un congénère de la même espèce afin de maintenir des interactions sociales adaptées à ses besoins naturels. Les animaux visiteurs seront des souris à phénotype non dommageable (mâle et femelle), principalement issues de surplus d'élevage. Elles seront utilisées au stade jeune adulte ou adulte, après sevrage et maturité sexuelle, afin de pouvoir réaliser la stérilisation et permettre ensuite leur utilisation comme compagnons sociaux. Le choix d'animaux jeunes adultes ou adultes permet également de les intégrer au groupe de souris visiteuses suffisamment tôt et de favoriser leur utilisation sur une période prolongée, sous réserve du maintien de leur état sanitaire et comportemental.

L'objet de ce projet est d'enseigner les gestes de base de l'expérimentation animale, contention, identification, injections, prises de sang et mise à mort, dans le cadre des formations réglementaires agréées par le ministère de l'agriculture. 750 souris dites "de réforme", pour la plupart surnuméraires d'élevage ou témoins sortis d'autres projets, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles sont marquées par boucle d'oreille, poinçon ou puce, puis reçoivent sous anesthésie les injections et les prises de sang pratiquées par des apprenants, une souris par binôme. Le porteur donne deux raisons à leur mise à mort, elles ne peuvent pas réintégrer l'animalerie et "la mise à mort des animaux et la vérification de la mort de l'animal font partie de l'enseignement".

Objectifs

Dans le cadre des formations réglementaires à l’expérimentation animale agrées par le ministère de l’agriculture , l’objectif du projet est de mettre en place un enseignement pratique afin de sensibiliser aux gestes de base en terme de contention, anesthésie, prélèvements, injections et mise à mort. Tout au long de cet apprentissage, un dialogue sera instauré sur la gestion de l’anesthésie, de l’analgésie, de la douleur et sur l’adéquation des volumes injectés ou prélevés selon le mode de prélèvement ou la voie d’injection.

Bénéfices attendus

Les apprenants doivent observer pour apprendre les gestes réalisés selon de bonnes pratique. Ils doivent être confronter à la réalisation du geste pour savoir s'ils sont capables de le réaliser selon ces bonnes pratiques. Le cas échéant, ils devront demander à être former au geste par tutorat dans leur structure d'accueil.

Procédures

Contention de courte durée, identification (boucle d'oreille, poinçon, puce), injections (sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intraveineuse) de courte durée, prélévements sanguins (submandibulaire, à la veine de la queue) de courte durée

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention. Stress et douleur de courte durée liés aux différentes injections. Stress et douleur légère et de courte durée liés aux techniques d'identifications (biopsie à l'oreille, boucle d'oreille...). Stress et douleur légère et de courte durée liés aux prélèvements sanguins.

Devenir

Toutes les souris (qui sont des souris de réforme, surnuméraires issues d'élevage ou souris contrôles sorties de procédures) sont mises à mort à la suite de la procédure car les animaux ne peuvent pas réintégrer l'animalerie et parce que la mise à mort des animaux et la vérification de la mort de l'animal font partie de l'enseignement.

Remplacement

Les gestes seront dans un premier temps montrés sur des vidéos. Mise à disposition de peluches pour travailler la contension et la répétition de différents gestes.

Réduction

Plutôt que l'utilisation d'une souris par étudiant, il sera utilisé une souris par binôme sans que cela ne nuise à la qualité de l'enseignement. Les souris utilisées seront des souris de réforme qui auraient dû être mises à mort car issues d'élevage et non utilisées ou arrivées en fin de projet (témoins ...). Des souris, également de réforme, seront commandées chez l'éleveur que s'il n'y a pas du tout ou pas suffisamment de souris de réforme disponibles sur site. Pour les démonstrations, l'utilisation d'une visionneuse reliée à un vidéoprojecteur permet de réduire le nombre d'animaux de démonstration.

Raffinement

Une anesthésie par voie injectable sera effectuée avant la réalisation des gestes d'injections et de prélèvement par les apprenants. Un gel ophtalmique de type Ocrygel sera appliqué sur les yeux des souris pendant l'anesthésie pour éviter toute lésion liée à un potentiel dessèchement de la cornée. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant pour limiter l'hypothermie liée à l'anesthésie. La réalisation des gestes est supervisée par un encadrant expérimenté.

Choix des espèces

La souris est le rongeur le plus utilisé en expérimentation animale Les souris seront des souris adultes de 20 g minimum, des deux sexes, avec des ages extrêmement variés car ce sont des souris de réforme.

4 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le mâle subit à lui seul jusqu'à six anesthésies générales pour des prélèvements de sperme par sonde urétrale, avant d'être castré. Les trois chattes, porteuses saines d'une mutation liée à une myasthénie congénitale, subissent chacune une ponction d'ovocytes guidée par échographie puis une ablation des ovaires, après un protocole d'induction des chaleurs que le résumé ne décrit pas mais dont il cite le risque d'infection utérine. Le projet doit mettre au point la fécondation in vitro chez la chatte, au bénéfice annoncé des éleveurs et de la préservation de petits félins sauvages, et congeler des embryons de cette lignée "dans l'éventualité d'un besoin" pour un futur projet. Les quatre chats, stérilisés, doivent ensuite être proposés à l'adoption.

Objectifs

La reproduction assistée a fait d’importantes avancées chez certains grands félins sauvages, constituant un outil précieux dans la préservation de ces espèces. Cependant elle reste très peu explorée chez nos chats domestiques, et chez les petits félins sauvages. Chez ces derniers, elle pourrait représenter un apport à la préservation des espèces. Chez les chats domestiques, elle permettrait aux éleveurs de faciliter les croisements entre individus distants géographiquement ou dans le temps, et de préserver des gamètes ou embryons provenant d’individus d’intérêt. En effet actuellement, contrairement à ce qui a pu être développé dans l’espèce canine, la reproduction chez le chat domestique est très majoritairement réalisée sans assistance. Ce projet a pour objectif premier d’évaluer la transposition de méthodes mises au point chez les grands félins, avec une expérience récemment publiée chez un chat domestique, à consolider. L’approche nouvelle inclut le prélèvement échoguidé d’ovocytes (« ovum pick-up ») chez la chatte, la maturation de ces ovocytes en culture (ex vivo), la fécondation in vitro et la congélation des embryons obtenus. Ce projet permettra également de préserver des embryons issus de chattes porteuses saines d’une maladie de la jonction entre le nerf et le muscle (myasthénie congénitale), liée au gène le plus impliqué dans ces pathologies chez l’Homme (ColQ) et de cryopréserver ce modèle d’intérêt biomédical, qui pourra ainsi être utilisé dans l’éventualité d’un besoin pour un projet sur cette maladie. Les 3 chattes porteuses seront stérilisées à la fin du projet et mises à l’adoption, ainsi que le mâle donneur de sperme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'optimiser un protocole de prélèvement d’ovocytes, maturation ex vivo et fécondation in vitro chez la chatte domestique, et ainsi d’élargir les outils de reproduction assistée disponibles dans cette espèce. Les adaptations qui auront été nécessaires par rapport aux protocoles existants chez les grands félins sauvages pourront constituer une base de travail pour appliquer ces méthodes à des espèces de petits félins sauvages, et ainsi contribuer à la sauvegarde de ces espèces. Enfin, ce projet sera mené sur des chats porteurs d’une anomalie génétique de potentiel intérêt en recherche biomédicale, et les cryopréservations effectuées dans le cadre de ce projet permettront de préserver un possible modèle animal d’intérêt pour la pathologie humaine.

Procédures

- Prélèvements d'ovocytes guidés par échographie, sous anesthésie générale, 1 fois pour chacune des trois chattes. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 1 heure - Ovariectomie (stérilisation par retrait chirurgical des ovaires) sous anesthésie générale, 1 fois pour chacune des trois chattes. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 1 heure - Prélèvements de sperme sous anesthésie générale par cathétérisme urétral (équivalent à un sondage urinaire), 6 fois maximum sur le chat mâle. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 30 minutes - Orchidectomie (castration) sous anesthésie générale 1 fois sur le chat mâle. Durée prévisionnelle de la procédure complète (anesthésie => réveil) : 30 minutes

Impact sur les animaux

Sur les chattes, les effets indésirables possibles incluent : - La survenue d'infections utérines induites par le protocole d’induction de chaleurs (complication rare). - D'éventuelles complications chirurgicales de la procédure de ponction d’ovocyte incluant hémorragie, douleur post-opératoire. - Le stress lié aux anesthésies. Sur le chat : - Le stress lié aux anesthésies. - L'éventuelle survenue d’une pathologie du bas appareil urinaire suite aux cathétérismes urétraux répétés.

Devenir

Nous n'attendons pas de séquelles suite à la mise en oeuvre des différentes procédures prévues sur les 4 chats inclus dans le projet. S'agissant par ailleurs de chats en bonne santé et très sociables, qui seront stérilisés en fin de projet, ils seront mis à l'adoption.

Remplacement

La problématique du projet portant sur la reproduction assistée chez le chat domestique, et le projet nécessitant de travailler sur des gamètes provenant d’individus de cette espèce, il n’est pas techniquement possible d’obtenir ce type de cellules sans avoir recours à un prélèvement sur l’animal (chat domestique). Néanmoins, des phases de mise au point de la technique de prélèvement d’ovocytes ont été réalisées ex vivo au préalable, permettant d’optimiser certaines conditions de prélèvement, notamment la dépression à appliquer pour prélever les ovocytes.

Réduction

Il n’est pas prévu de réaliser de test statistique, s’agissant d’un protocole de validation méthodologique. Le nombre de 3 femelles nous permettra de garantir l’obtention d’un nombre suffisant d’ovocytes pour tester différentes conditions de culture. Un seul chat mâle sera suffisant pour produire la semence nécessaire aux essais de fécondation in vitro. Enfin, ce projet, de par son objectif secondaire qui est de cryopréserver une lignée de chats actuellement hébergés au sein d’un établissement utilisateur pour stopper cet hébergement et placer les chats présents, s’inscrit également dans une démarche de réduction.

Raffinement

Les chats seront hébergés dans un espace de surface supérieure aux exigences réglementaires, aménagé avec des enrichissements permettant aux animaux d’exploiter la verticalité (tablettes en hauteur, arbres à chats), plusieurs zones de confort disponibles (coussins, paniers), des jouets variés à disposition. La nourriture (croquettes) est distribuée dans des « pipolinos », permettant aux chats d’augmenter leur budget-temps alimentation. Les bacs de litière sont changés quotidiennement 7j/7 et des visites tri-quotidiennes 7j/7 sont réalisées par l’équipe de zootechniciens. Dans le cadre du projet, toutes les procédures chirurgicales ou celles impliquant un stress ou nécessitant l’immobilité des chats seront réalisées sous anesthésie générale, et une analgésie adaptée à l’intervention mise en œuvre sera implémentée. Sur le projet lui-même, la mise au point de la technique d’« ovum pick-up » s’inscrit également dans une démarche de raffinement, puisqu’elle a vocation à remplacer le prélèvement plus invasif par laparotomie, y compris sur des espèces de félins sauvage dans le cadre de leur préservation. Enfin, des points limites précoces et adaptés ont été définis, permettant une intervention rapide en réponse à tout signe précurseur de douleur ou de stress.

Choix des espèces

S’agissant de mettre au point une méthodologie de cryopréservation d’embryons dans l’espèce féline, le choix de l’espèce s’est porté sur le chat domestique. Animaux adultes en âge de reproduire, en lien avec la problématique du projet.