Procédures modérées

Une ligature de l'uretère sous anesthésie, ou l'injection sans anesthésie d'une molécule qui provoque une insuffisance rénale, sert à induire une fibrose du rein chez 1 224 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit ensuite l'une des trois molécules testées en une injection trois jours avant l'induction, une autre une injection tous les deux jours pendant une durée encore à déterminer, et toutes subissent des recueils d'urine deux fois par semaine sous contention. Toutes sont anesthésiées pour une dernière prise de sang puis tuées sans réveil, afin de savoir si ces inhibiteurs, étudiés jusqu'ici contre la fibrose du poumon, ralentissent la maladie rénale. Le porteur justifie le choix de la souris par l'expérience du personnel et l'abondance des données publiées, ce qui en fait selon lui un choix "particulièrement pertinent".

Objectifs

La fibrose est une maladie qui s’aggrave progressivement. Elle se caractérise par une accumulation excessive de tissu cicatriciel dans les organes, ce qui finit par perturber leur fonctionnement. Elle est souvent liée aux maladies rénales chroniques, qui touchent environ une personne sur dix dans le monde. Ces maladies peuvent être causées par des problèmes fréquents comme le diabète ou l’hypertension. Ces maladies évoluent lentement et les traitements actuels permettent surtout de ralentir leur progression, mais pas de les guérir. C’est un vrai défi pour la santé publique. Les chercheurs ont découvert que, dans certaines formes de fibrose (comme celle des poumons), des protéines spécifiques jouent un rôle clé. Parmi elles, on trouve : Une protéine qui favorise la formation de cicatrices. Une famille de protéines qui empêchent la mort naturelle des cellules néfastes et qui peuvent aggraver la fibrose. Des médicaments inhibiteurs capables de bloquer cette famille de protéine sont actuellement testés avec pour objectif de délimiter la progression de la maladie et préserver le fonctionnement des organes. Nos objectifs sont : 1. Comprendre comment la famille de protéines évolue au fil du temps, quand la fibrose se développe. 2. Tester ces médicaments qui bloque son effet dans deux modèles de fibrose rénale différents (mécanique et toxique) afin de déterminer s’ils peuvent ralentir la maladie ou même améliorer l’état des reins. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement pour guérir la fibrose rénale. En comprenant mieux ses mécanismes, nous espérons ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et offrir un meilleur avenir aux patients.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n’existe aucun traitement efficace contre la fibrose rénale, une maladie grave qui touche de nombreuses personnes. C’est pourquoi il est urgent de trouver de nouvelles solutions pour mieux la combattre. Des recherches précédentes ont montré que des médicaments bloquant des protéines impliquées dans la formation de cicatrices internes néfastes au bon fonctionnement pourraient protéger les poumons contre la fibrose. Mais leur effet sur les reins n’a jamais été étudié. À long terme, ce projet pourrait conduire à des essais cliniques chez l’homme, offrant ainsi un espoir de traitement pour les patients atteints de fibrose rénale.

Procédures

(1) Modèles expérimentaux : Les souris recevront soit une injection d’une molécule induisant une insuffisance rénale (1 minute par animal) (modèle toxique) et une seconde injection pour favoriser la réhydratation (30 seconde par animal), à l’état vigile, soit une ligature de l’uretère rénale (modèle mécanique /chirurgical) sous anesthesie générale accompagnée d’un protocole antalgique complet, sur un plateau chauffé à 37 degrés. La chirurgie dure environ 10 minutes. (2) Traitements : 3 molécules seront testées soit en préventif, soit en curatif. Une partie des souris recevra une injection à l’état vigile 3 jours avant l’induction du modèle experimental. Une autre partie recevra une injection tous les deux jours à l’état vigile, pendant une durée qui sera déterminée dans la première partie du projet ( 1 minute par injection) (3) Recueil des urines : à l’état vigile, 2 fois par semaine (1 minute par animal). (4) Euthanasie associée à un prélèvement sanguin: tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés ; nous effectuerons un unique prélèvement sanguin immédiatement suivi de l’euthanasie par une méthode réglementaire (sans réveil des animaux).

Impact sur les animaux

(1) Modèles expérimentaux : pour le modèle toxique, les animaux peuvent perdre du poids en raison d’une réponse inflammatoire et métabolique secondaire à une insuffisance rénale aiguë. Pour le modèle chirurgical, une douleur post-opératoire modérée peut survenir dans les 48 premières heures. L’obstruction entraîne une altération progressive du rein ligaturé, sans insuffisance rénale systémique grâce au rein controlatéral. Les animaux peuvent montrer une baisse transitoire d’activité et une perte de poids modérée. (2) Injections : Les injections peuvent provoquer une douleur brève, une inflammation locale ou un stress lié à la contention. (3) Recueil urinaire : les recueils urinaires peuvent générer du stress lors de la contention. (4) Aucun effet secondaire des médicaments testés ne peut être exclu en l’absence de données de tolérance propres au protocole expérimental. La surveillance du poids et de l’état général permettra de détecter d’éventuelles nuisances. (5) Complications liées à l’euthanasie : Risque de détresse respiratoire, d’arrêt cardiorespiratoire ou de stress thermique sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux (1224) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée. Des experiences complémentaires in vitro seront réalisées en parallèle sur des cellules rénales en culture pour approfondir certains mécanismes associés aux molécules étudiées dans ce projet.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 ou 8 animaux selon le modèle sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 1224 souris. De plus, nous utiliserons des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les nuisances pour les animaux, des mesures de raffinement adaptées seront systématiquement appliquées tout au long de l’étude. (1) Raffinement des injections : après chaque injection , une manipulation douce sera effectuée au niveau du site d’injection pour favoriser la diffusion du produit. Les animaux feront ensuite l’objet d’une observation attentive afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de réaction anormale. Pour limiter la douleur, des aiguilles très fines seront utilisées. (2) Réhydratation post-induction : le soir même de l’induction d’un modèle, les souris bénéficieront d’une injection de sérum physiologique avec une aiguille très fine. (3) Prise en charge périopératoire (modèle mécanique ) : pour les interventions chirurgicales, une prise en charge complète de la douleur et une anesthésie adaptée seront mises en place. Par ailleurs, tous les instruments chirurgicaux utilisés seront stérilisés afin de prévenir toute infection. (4) Raffinement de l’anesthésie : pendant les procédures nécessitant une anesthésie, les animaux seront systématiquement placés sur un plateau chauffant pour maintenir leur température corporelle et améliorer leur confort. (5) Raffinement de l’hébergement et du bien-être : avant le début des procédures, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine pour s’adapter à leur environnement. Leur bien-être sera optimisé grâce à : une litière en cellulose composée d’éléments de tailles variées, initialement compacte mais que les animaux pourront décompacter eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose dans chaque cage, offrant des possibilités d’exploration et de cachette. Une nourriture humide déposée au fond de la cage après l’induction des modèles pour favoriser leur récupération. Une surveillance quotidienne de leur aspect physique et de leur poids sera assurée par le personnel qualifié de l’animalerie ou les responsables du projet. Des points limites ont été définis pour garantir une surveillance stricte de leur bien-être tout au long de l’expérience. Enfin, les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Les modèles utilisés dans cette étude sont bien maîtrisés par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte (9 semaines) . À cet âge, ils possèdent un système rénal mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

120 souris vont être utilisées, chacune passant jusqu'à cinq examens d'IRM sous anesthésie générale, de trois heures au plus chacun, avant et après une chirurgie qui lui implante une membrane sous la peau. Dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, des souris immunocompétentes et immunodéficientes reçoivent une membrane fabriquée à partir de cordon ombilical, dont l'équipe évalue la tolérance et la dégradation. Le porteur cite comme complications possibles le stress des manipulations et une défaillance cardiorespiratoire liée à l'anesthésie. Toutes sont tuées sans réveil après le dernier examen, pour des analyses post-mortem, alors que l'usage en clinique des dispositifs médicaux "innovants" visés n'est attendu qu'"à long terme".

Objectifs

Notre objectif principal est de développer des membranes pour la médecine régénérative à partir de cordon ombilical, considéré comme un déchet opératoire. Les études in vitro préalablement effectuées ont permis de sélectionner des membranes avec un potentiel thérapeutique important (biodégradation et antimicrobien). Leur biocompatibilité a été évaluée in vitro, mais ces études ne peuvent modéliser la complexité des systèmes physiologiques mis en place lors de la réponse inflammatoire et lors de la cicatrisation in vivo. Pour cette raison, nous souhaitons par ce projet évaluer la biocompatibilité et la biodégradation par un modèle d’implantation sous-cutanée chez la souris par un suivi longitudinal par imagerie par résonance magnétique (IRM). En effet, l’IRM est un outil d’exploration non invasive et non irradiant permettant pour cette étude d’observation la présence de l’inflammation et suivre l’évolution de la membrane implantée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court terme sont : i) La vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire de ces membranes innovantes ; ii) Le développement de biomatériaux à dégradation tissulaire contrôlée pour une utilisation en médecine régénérative. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer en clinique chez l’Homme, des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, antibactériennes et biomécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles sur le marché dans le but de répondre à des impératifs cliniques élargis et adaptés à des situations pathologiques spécifiques (médecine régénératrice personnalisée).

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée maximum : 15 min). Chaque souris sera suivie dans le temps (une semaine avant la chirurgie puis à 48h, 1, 2 et 3 semaines après la chirurgie) par IRM, méthode d’imagerie biomédicale non invasive et non irradiante, sous anesthésie générale avec un monitorage en temps réelle (durée max. d’un examen IRM : 3h).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont liés à la réaction inflammatoire post-chirurgicale. Les possibles complications auxquelles nos animaux pourront être exposés, sont les suivantes : stress lors des manipulations et une défaillance cardiorespiratoire suite à l’anesthésie.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort sans réveil après le dernier examen en imagerie effectué sous anesthésie pour des examens complémentaires post-mortem.

Remplacement

En amont de l’étude in-vivo, différents tests ont été effectués in-vitro sur les membranes seules afin de sélectionner les deux plus prometteuses. Ces tests ont permis une première phase d’ajustement des paramètres de l’IRM qui seront à affiner dans les conditions in-vivo limitant ainsi au maximum le nombre d’animaux dans la procédure 1. Afin d’étudier la biodégradation et biocompatibilité des membranes en prenant en compte les phénomènes annexes telle que l’inflammation, nous ne pouvons pas à l’heure actuelle éviter l’usage de modèle animal.

Réduction

Dans l’optique de réduire autant que possible le nombre d’animaux nous avons effectué en amont de ce projet in-vivo, une étude in-vitro des membranes afin de sélectionner les deux plus prometteuses. L’intégration dans le temps chez un même animal de ces membranes sera suivie par IRM. Cette technique d’imagerie biomédicale permet de réduire le nombre d’animaux par le suivi longitudinal d’un même animale.

Raffinement

L’IRM est une méthode d’imagerie biomédicale non invasive et non irradiante, nécessitant uniquement une anesthésie gazeuse dans ce projet. Durant les examens, les animaux seront monitorés en temps réel et positionnés dans une enceinte chauffée. Une période d’acclimatation de deux semaines sera respectée avant le démarrage du projet. L’hébergement se fera en groupe sociaux en présence d’enrichissements (tunnel, éléments pour la nidification, bâton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation et un playpen pourrait être utilisé lors des changes. Les souris immunodéprimées seront hébergées dans une armoire ventilée dédiée et le change des cages se fera sous hotte. Les animaux auront une anesthésie adaptée lors des différentes étapes (chirurgie et imagerie). Des points limites adaptés aux procédures ont été définis.

Choix des espèces

Le modèle d’implantation sous-cutanée est considéré comme une référence pour évaluer la réponse biologique vis-à-vis d’un biomatériau. Nous avons choisi de travailler sur la souris pour laquelle notre IRM est la mieux équipée pour permettre une optimisation du raffinement en réduisant le temps d’anesthésie nécessaire pour une résolution spatiale donnée. Nous travaillerons avec deux souches de souris, une immuno-compétente et une immuno-déficiente afin d’établir la réaction immunitaire induite par l’implantations des membranes. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes âgées de 8 semaines présentant la surface optimum pour implanter une membrane et un système immunitaire mature.

Issues d'un élevage existant d'une lignée génétiquement modifiée plus sujette à l'épilepsie, 146 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Elles passent trois tests sur la mémoire et l'orientation dans l'espace, de vingt minutes au plus, que le porteur qualifie de "passifs" sans les nommer, puis sont transportées vers un second établissement pour une IRM d'environ deux heures trente sous anesthésie gazeuse. Une partie subit enfin une chirurgie terminale de vingt minutes, sous anesthésie profonde et sans réveil. Sur le remplacement, le porteur affirme que cultures cellulaires, organoïdes et simulations informatiques ne reproduisent pas "toute la complexité du cerveau adulte", et revendique un "modèle génétique reproduisant fidèlement la pathologie humaine".

Objectifs

Le syndrome de déficience intellectuelle étudiée est une maladie génétique rare qui affecte le développement du cerveau. Les personnes atteintes présentent souvent une déficience intellectuelle, une tête plus petite, un retard de croissance, des troubles du spectre de l’autisme et une susceptibilité accrue à l'épilepsie. Cette maladie est causée par des anomalies d'un gène qui joue un rôle essentiel dans la formation et le fonctionnement du cerveau. Des recherches récentes ont montré que lorsque ce gène ne fonctionne pas correctement, certaines cellules nerveuses importantes migrent mal au cours du développement. Cela perturbe l'équilibre entre les signaux qui stimulent et ceux qui freinent l'activité cérébrale. L’objectif de ce projet est donc de caractériser les altérations cérébrales associées à la déficience intellectuelle étudiée , chez un modèle de souris, (portant la même anomalie génétique et présentant des caractéristiques proches de celles observées chez les patient) par plusieurs techniques d'imagerie par résonance magnétique (IRM) ainsi que des tests comportementaux. Cette approche fournira des biomarqueurs d'imagerie utilisables comme critères de jugement intermédiaires pour les futures évaluations thérapeutiques précliniques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Sur le plan fondamental, ce projet qui se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs permettra de mieux comprendre comment la perte partielle du gène d'intérêt affecte le fonctionnement du cerveau, ainsi que d'autres troubles du développement neurologique liés à un déséquilibre entre les signaux excitateurs et inhibiteurs des neurones. Grâce à une technique d'imagerie appelée GluCEST, il sera possible de mesurer le glutamate qui est la principale molécule excitatrice dans l'ensemble du cerveau de souris porteuses de cette anomalie génétique et de vérifier si ce déséquilibre, déjà observé au niveau des cellules, est également présent à l'échelle de l'organisme entier. Ce projet pourrait aussi avoir des retombées pour les patients. En effet, l'identification de marqueurs visibles à l'IRM pourrait faciliter le diagnostic et le suivi de la maladie chez l'Homme, mais aussi servir à évaluer l'efficacité de futurs traitements lors d'essais précliniques. Enfin, ce travail contribuera à développer et standardiser l'utilisation de la méthode GluCEST chez la souris pour l'étude des maladies neurodéveloppementales, le système glutamatergique étant impacté dans un grand nombre de ces pathologies.

Procédures

Les souris ne reçoivent aucun traitement pharmacologique dans le cadre de ce projet (en dehors des anesthésiques et de l'analgésie locale liés aux procédures elles-mêmes). Les interventions sont les suivantes : Dans le premier établissement utilisateur: 3 tests comportementaux passifs permettant d’évaluer la mémoire à court terme, les souvenirs d'événements vécus et l'orientation dans l'espace: 1 fois par animal et par test, durée maximale 20 min/test. • Transfert entre les établissements utilisateurs (1 fois). Dans le deuxième établissement utilisateur: • Anesthésie gazeuse pour l'IRM : Durée totale environ 2h30. • pour une partie des animaux : une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil d’une durée de 20 minutes et résulte en la mort.

Impact sur les animaux

Nuisances liées au phénotype dommageable : la lignée génétiquement modifiée présente une susceptibilité accrue à l'épilepsie, congénitales et stables. Une surveillance dédiée est mise en place. Nuisances liées aux procédures : • L'IRM sous anesthésie entraîne une diminution de la température corporelle et un risque de dépression respiratoire, gérés par le chauffage et le monitorage en continu. • Le transfert entre sites engendre un stress, atténué par les cages sécurisées et l’acclimatation de 2 semaines. • La chirurgie terminale est réalisée sous anesthésie profonde sans réveil. Elle induit un stress et une douleur de courte durée au moment de l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie et une dépression cardiorespiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêt (cerveaux).

Remplacement

La compréhension des mécanismes physiopathologiques et des altérations cérébrales associées au syndrome de déficience intellectuelle étudié nécessite l'étude d'un organisme entier. La caractérisation in vivo de la connectivité cérébrale, de la microstructure tissulaire et des mécanismes chimiques impliquant le glutamate nécessite l’utilisation d’animaux vivants et de techniques d’imagerie comme l’IRM. De même, l’évaluation comportementale ne peut être réalisée que sur un organisme entier. À l’heure actuelle, les méthodes alternatives telles que les cultures de cellules, les organoïdes ou les simulations informatiques ne sont pas capables de reproduire toute la complexité du cerveau adulte et de son fonctionnement. La souris est l'espèce mammifère la plus proche de l'Homme dans laquelle nous disposons d'un modèle génétique reproduisant fidèlement la pathologie humaine.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été dimensionnés sur la base de nos études IRM antérieures permettant de déterminer le minimum d'animaux pour une analyse statistique de puissance suffisante. L'utilisation des animaux issus de l'élevage existant et la mutualisation des animaux entre modalités (comportement → IRM → prélèvements terminaux sur le même animal) permettent de réduire le nombre à 130 animaux expérimentaux (146 total).

Raffinement

Compte tenu du phénotype dommageable de la lignée étudiée, une surveillance dédiée est mise en place, intégrant la grille faciale de douleur de la souris et un suivi spécifique des crises épileptiques spontanées. Les conditions d'élevage sont enrichies (nidification doublée, tunnel) et l'hébergement en groupes assure une vie sociale, particulièrement importante pour cette lignée présentant des phénotypes de type Trouble du Spectre Autistique. Une semaine avant les tests de comportement les animaux sont habitués à être manipulées par l’expérimentateur. Le transport entre les 2 établissements utilisateurs se fait dans des cages spécialisées avec nourriture et eau gélifiée. Une période d’acclimatation de 2 semaines est respectée avant les examens IRM. L'anesthésie IRM est optimisée sur des animaux indépendants ; le monitorage continu (respiration, température) et le maintien thermique limitent les complications anesthésiques. Les yeux des animaux sont protégés à l’aide d’un gel ophtalmique et ils sont réhydratés à l’issue des IRM. Les prélèvements terminaux sont réalisés lors de la chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies génétiques humaines : sa physiologie et sa génétique sont bien connues, et les méthodes de manipulation génétique y sont les plus développées. La nécessité d'utiliser une lignée transgénique est liée à l'absence de modèle spontané de la lignée génétiquement modifiée. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 2 mois). À cet âge, le développement cérébral est complet, le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont stables, et les phénotypes neuroanatomiques de la lignée génétiquement modifiée (microcéphalie, microstructure tissulaire) sont pleinement exprimés.

Infectées par une bactérie injectée dans les deux cuisses, puis traitées jusqu'à 23 fois dans les études les plus longues, qui peuvent durer 84 jours, 6 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'infection peut provoquer inflammation, œdème, douleur locale et boiterie, et certaines souris reçoivent au préalable un immunosuppresseur. Le projet doit évaluer de nouveaux antibactériens, leur dose, leur fréquence et leur voie d'administration, en partie par un cathéter veineux "préalablement implanté" dont le résumé ne dit ni quand ni comment il est posé. Le porteur présente cette mise à mort systématique comme une garantie du "respect des exigences en matière de bien être animal".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les infections bactériennes localisées des tissus mous. Ces infections peuvent entraîner une inflammation importante, une destruction des tissus musculaires et, dans certains cas, une propagation de l’infection vers des formes plus graves. Elles représentent un enjeu important de santé publique, en particulier en raison de l’augmentation des résistances aux antibiotiques. Pour cela, des études sont réalisées chez la souris afin d’observer comment l’infection se développe au niveau musculaire et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antibactériens. Ces modèles permettent notamment de mesurer la capacité des médicaments à réduire la charge bactérienne dans les tissus infectés, à limiter l’inflammation locale et à améliorer l’évolution de l’infection. Ils permettent également d’étudier le comportement des traitements dans l’organisme afin d’optimiser leur utilisation. Avant d’être testés chez l’animal, les composés font l’objet d’études préalables en laboratoire (en dehors de l’organisme) afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs. Les expérimentations animales ne sont réalisées que lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues par des méthodes alternatives. Ces travaux permettront de mieux identifier les traitements les plus efficaces et de mieux comprendre les relations entre l’exposition des médicaments et leur activité anti-infectieuse. À terme, ce projet vise à contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les infections bactériennes des tissus mous, notamment dans les situations où les traitements actuellement disponibles sont insuffisants ou moins efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des infections bactériennes localisées des tissus intramusculaires de la cuisse. Ces infections peuvent entraîner une inflammation importante, une destruction des tissus musculaires et, dans certains cas, évoluer vers des formes plus graves difficiles à traiter. Elles représentent un enjeu important de santé publique, en particulier dans le contexte de l’augmentation des résistances aux antibiotiques. Les principaux bénéfices attendus concernent le développement de nouveaux traitements antibactériens plus efficaces. Les études permettront d’identifier des composés capables de réduire la charge bactérienne dans les tissus infectés et de déterminer les conditions optimales de leur utilisation (dose, fréquence et voie d’administration). Ces travaux contribueront également à mieux comprendre l’évolution des infections musculaires localisées, la réponse inflammatoire associée et les mécanismes d’action des traitements au sein d’un organisme entier. Ils permettront ainsi d’améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des infections bactériennes des tissus mous. À terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients, en particulier dans les situations où les traitements actuellement disponibles sont insuffisants ou moins efficaces en raison de phénomènes de résistance aux antibiotiques. Enfin, en optimisant les modèles expérimentaux et les approches utilisées, ce projet participe à une utilisation raisonnée et limitée des animaux en recherche, en évitant la répétition d’études inutiles et en permettant d’obtenir des résultats fiables avec le nombre minimal d’animaux nécessaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types de gestes expérimentaux, incluant des administrations de substances, des infections expérimentales, des prélèvements sanguins et un suivi clinique régulier. Aucune procédure chirurgicale lourde n’est prévue. Les principales étapes sont les suivantes : • Acclimatation : minimum 5 jours avant toute procédure, sans intervention. • Utilisation d’un cathéter veineux préalablement implanté : Manipulation du cathéter (connexion, administration en perfusion, rinçage, vérification de la perméabilité) réalisée en conditions aseptiques par du personnel formé. • Pré-conditionnement (si nécessaire) : administration d’agent immunosuppresseur (voie sous cutanée, J 4 et J 1 avant infection) ou d’antihistaminiques. • Infection expérimentale : administration intramusculaire unique dans les 2 cuisses, réalisée sous anesthésie générale et en quelques minutes. • Traitement : administration prophylactique ou thérapeutique par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou orale jusqu’à 63 jours avant le début de l’infection en 2 ou 3 fois. Les volumes et fréquences respectent les recommandations. Le nombre maximal d’injections est généralement de 2 à 6 sur modèles courts (~25 h) et peut atteindre 20 à 23 sur modèles prolongés. • Prélèvements sanguins : o soit réalisés une fois en phase terminale o soit en cours d’étude (PK), jusqu’à 7 prélèvements sur 24 h, de faible volume, sur animal vigile ou anesthésié selon la technique o utilisation possible de cathéters pour limiter les ponctions répétées • Suivi clinique : réalisé 6 à 8 fois par jour selon le modèle (évaluation du score clinique, signes d’infection), avec une mesure du poids corporel réalisée 1 à 2 fois par jour. • Mise à mort : en fin d’étude ou dès atteinte des critères d’arrêt, avec réalisation de prélèvements terminaux. La durée des études est généralement d’environ 25 heures pour les modèles d’efficacité ou PK/PD, et peut atteindre jusqu’à 21 jours post infection. Soit un total maximal de 84 jours pour les études de survies si la thérapie est utilisée en prophylactique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce modèle d’infection intramusculaire sont principalement liés à l’établissement d’une infection localisée dans le tissu musculaire et aux manipulations expérimentales associées. Le développement de l’infection peut entraîner une altération légère à modérée de l’état général des animaux, se traduisant par une diminution de l’activité, une posture voûtée, un pelage ébouriffé, une perte de poids modérée et une baisse de la prise alimentaire. Des signes locaux spécifiques au modèle sont également attendus au niveau du site d’injection intramusculaire, incluant une inflammation, un œdème, une douleur locale et une possible boiterie ou diminution de l’appui sur le membre affecté. Ces manifestations reflètent la réponse inflammatoire et l’évolution locale de l’infection dans le muscle. Selon l’agent infectieux et la progression du modèle, une dissémination bactérienne peut survenir et conduire dans de rares cas à des signes systémiques (hypothermie, déshydratation), bien que le modèle soit principalement localisé. Ces effets sont considérés comme de sévérité légère à modérée, mais peuvent devenir modérés en raison de leur cumul au cours du protocole expérimental. Un suivi clinique régulier basé sur une grille de score est mis en place afin de détecter précocement toute dégradation de l’état des animaux. Des mesures de soutien sont instaurées dès l’apparition des premiers signes cliniques et des critères d’arrêt prédéfinis sont appliqués de manière stricte afin de limiter toute douleur ou souffrance excessive.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux sont systématiquement mis à mort. Aucune réutilisation, remise en liberté ou maintien en vie après la procédure n’est envisageable. En effet, les animaux ont été exposés à des agents infectieux potentiellement pathogènes et les procédures impliquent généralement des atteintes physiologiques incompatibles avec une récupération complète dans des conditions garantissant leur bien être. Le recours à la mise à mort permet également la réalisation de prélèvements terminales indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Cette approche garantit à la fois la qualité des données générées et le respect des exigences en matière de bien être animal, en évitant toute utilisation ultérieure inappropriée des animaux.

Remplacement

Avant de recourir à l’utilisation d’animaux, des méthodes alternatives sont systématiquement mises en œuvre afin de limiter leur utilisation. Les molécules testées sont d’abord étudiées en laboratoire, en dehors de l’organisme, grâce à des tests réalisés sur des micro organismes (bactéries) et des cellules. Ces approches permettent de vérifier si les candidats traitements sont susceptibles d’être efficaces et d’éliminer ceux qui ne présentent pas d’intérêt. Des modèles informatiques et des analyses de données existantes sont également utilisés pour mieux comprendre le comportement des médicaments et sélectionner les doses appropriées avant toute expérimentation animale. Ces méthodes permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés en ne testant que les molécules les plus prometteuses. Elles sont systématiquement privilégiées dès que cela est possible. Cependant, certaines questions scientifiques ne peuvent pas être étudiées sans recourir à un organisme entier. Les infections étudiées impliquent des interactions complexes entre l’agent infectieux et l’ensemble de l’organisme, notamment la circulation du pathogène dans différents organes et la réponse globale de l’organisme. À ce jour, ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal reste donc nécessaire dans certaines situations, mais il est limité au strict nécessaire, et uniquement lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est limité au strict nécessaire grâce à plusieurs mesures mises en place dès la conception des études. Avant toute expérimentation, les chercheurs s’appuient sur les données déjà disponibles (littérature scientifique, résultats internes) afin d’éviter de répéter des études déjà réalisées. Des tests préalables en laboratoire permettent également d’identifier les conditions les plus adaptées avant d’utiliser des animaux. Les modèles sont d’abord optimisés avec un nombre réduit d’animaux afin de définir précisément les paramètres expérimentaux (dose d’infection, durée de l’étude). Ces informations permettent ensuite de concevoir les études de manière plus efficace et d’éviter d’avoir à les répéter. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. Par ailleurs, les études sont organisées de manière à limiter le nombre de manipulations réalisées sur chaque animal. Lorsque les besoins expérimentaux sont importants, des groupes distincts d’animaux (appelés cohortes) sont utilisés afin d’éviter d’imposer un trop grand nombre de prélèvements ou d’injections à un même animal. Enfin, plusieurs types de données (par exemple observations cliniques et mesures biologiques) sont recueillis chez un même animal lorsque cela est possible, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. L’ensemble de ces approches permet de concilier la qualité scientifique des résultats avec une utilisation raisonnée et limitée des animaux.

Raffinement

Le projet met en œuvre différentes mesures afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long des études. Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées et contrôlées, avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification, abris, tunnels) qui favorise leur bien être et leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils sont acclimatés avant toute expérimentation afin de réduire le stress lié au changement d’environnement. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques adaptées pour limiter l’inconfort et la durée de contention. Lorsque cela est nécessaire, une anesthésie est utilisée pour certaines procédures. Des traitements contre la douleur peuvent également être administrés si des signes de gêne apparaissent. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière (plusieurs fois par jour si nécessaire) afin de détecter rapidement toute dégradation de leur état de santé. Une grille de suivi permet d’évaluer leur état de manière objective. Des mesures de soutien sont mises en place en cas de besoin, comme l’apport d’eau ou de nourriture facile d’accès, ou un environnement chauffé si les animaux présentent des signes de fragilité. Des critères d’arrêt précoces sont définis : dès qu’un animal présente des signes importants de souffrance, il est pris en charge ou euthanasié afin d’éviter toute dégradation de son état. Enfin, l’organisation des études permet de limiter le nombre de manipulations par animal, notamment grâce à l’utilisation de groupes distincts lorsque nécessaire. L’ensemble de ces mesures permet de réduire autant que possible l’impact des procédures sur les animaux tout en garantissant la qualité des résultats scientifiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie pour ce projet car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche médicale. Elle permet d’étudier de manière fiable le développement des infections et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme entier. De nombreuses connaissances scientifiques existent déjà sur ce modèle, ce qui facilite l’interprétation des résultats et permet de limiter la répétition d’expériences. L’organisme de la souris présente des similitudes importantes avec celui de l’Homme pour l’étude des infections, notamment en ce qui concerne la manière dont les agents infectieux se propagent dans le corps et la façon dont l’organisme réagit. Cela en fait un outil pertinent pour améliorer les connaissances et développer de nouveaux traitements. Les animaux utilisés sont des adultes. Ce choix permet de travailler sur un organisme dont les fonctions sont totalement développées et stables, ce qui garantit des résultats plus fiables et reproductibles. Chez les adultes, le système immunitaire et les caractéristiques physiologiques sont mieux établis, ce qui est essentiel pour étudier correctement les infections. Selon les besoins de l’étude, des animaux avec un système immunitaire normal ou temporairement affaibli peuvent être utilisés. Cela permet d’explorer différentes situations, notamment celles où les défenses de l’organisme sont diminuées, comme cela peut être le cas chez certains patients. Ce choix d’espèce et de stade de développement permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en utilisant le modèle le plus adapté et le mieux caractérisé.

3 612 souris vont être utilisées, chacune recevant deux ou trois injections de vaccin, par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale, et jusqu'à sept prises de sang. Selon les procédures, une injection d'acétate de médroxyprogestérone, une hormone, précède la vaccination de cinq jours. Ces souris, dont des lignées génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, sont utilisées pour tester 18 vaccins, leurs adjuvants et leurs voies d'administration dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélever moelle osseuse, rate et ganglions. Face à ces atteintes, le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouveaux vaccins", contre six agents infectieux allant du SARS-CoV-2 à la tuberculose.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les vaccins que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront : une injection sous-cutanée d'acétate de médroxyprogestérone 5 jours avant la vaccination selon les procédures, des injections de vaccins (durée: 30 secondes) par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang (durée 30 secondes) pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour, et le jour de la mise à mort) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 injections de vaccin et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. Les effets indésirables pourraient être une infection après l'utilisation d'aiguilles au moment de l'injection des vaccins ou des prélèvements de sang. Les aiguilles sont changées entre chaque animal pour limiter cet effet indésirable.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les vaccins utilisés dans ce projet ont déjà été évalués dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agit ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre est estimé à 3612 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).