Procédures modérées

Pour tester un candidat médicament avant l'apparition des symptômes, 792 souris porteuses d'une maladie neurodégénérative génétique sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le traitement est injecté sous la peau des souriceaux une à deux fois par jour pendant sept ou vingt-huit jours, avec un risque de rejet par la mère, puis neuf prélèvements sanguins sont faits à l'extrémité de la queue au fil de leur vie. Le porteur ne nomme ni la maladie ni la molécule, et annonce que les premiers symptômes, stress, angoisse et troubles moteurs, peuvent apparaître vers huit à neuf mois. Il écrit qu'un traitement efficace dès les stades précoces constituerait une "révolution" dans la prise en charge, alors que le projet en reste au stade préclinique.

Objectifs

Le projet de recherche vise à développer un médicament dont le traitement serait démarré précocement afin de stopper l’évolution d’une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié. En effet, il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de cette maladie à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet démontrer qu’en intervenant très tôt dans le développement, bien en amont de l’apparition des symptômes, nous pouvons retarder voire bloquer l’apparition de la maladie.

Bénéfices attendus

Il a été démontré que notre candidat médicament peut améliorer les troubles du mouvement et psychiatriques dans des modèles souris de la maladie à des stades symptomatiques. Il s’agit d’une maladie familiale dont le diagnostic génétique peut être connu bien avant l’apparition des symptômes mais pour lequel aucun traitement curatif n’existe. Disposer d’un médicament efficace dès les stades précoces de la maladie permettrait de bloquer le développement de cette dernière et consistuerait une révolution dans la prise en charge de cette maladie.

Procédures

Le traitement sera réalisé par voie sous cutanée une ou deux fois par jour pendant 7 ou 28 jours (

Impact sur les animaux

Le traitement sera réalisé chez des souriceaux dont le principal effet indésirable est un éventuel rejet par la mère (exclusion du nid). Une toxicité liée à l’excipient est possible. Un léger stress et une fatigue liés à la réalisation de tests comportementaux sont possibles, ainsi qu’un léger stress lié au prélèvement sanguin chez l’animal adulte. Les premiers symptômes de la maladie peuvent apparaitre en fin de vie autour de 8-9 mois d’âge (stress, angoisse et/ou symptômes moteurs).

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux sur lesquels seront réalisées des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement précoce avec notre molécule sur l’apparition des symptômes de la maladie à long terme. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 4 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisé que si l’expérience 2 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2, 3 et 4 ne seront pas réalisées.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.

Choix des espèces

Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement à un âge précoce peut retarder voire bloquer l’apparition de la maladie, notre étude sera réalisée sur des souriceaux et des souris adultes.

Pour mesurer les effets du réchauffement climatique sur le vieillissement, 80 diamants mandarins adultes sont exposés quatre heures à 30 puis 40 °C, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque oiseau, qui pèse entre 14 et 20 grammes, subit quatre prises de sang de 75 microlitres, l'implantation d'une puce RFID sous la peau et des prélèvements de plumes. Aucun ne sera tué à l'issue, tous restent en élevage et pourront être réutilisés dans d'autres expériences. Le porteur écrit que le stress provoqué "n'est pas un effet indésirable mais l'effet désiré", et justifie le classement en gravité modérée par les 45 °C que l'espèce subit en Australie, alors que les oiseaux du projet vivent en captivité.

Objectifs

Le réchauffement climatique actuel entraîne un stress thermique chez les organismes vivants. L’augmentation future de la température va encore exacerber ce phénomène. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de ce stress thermique sur la reproduction et la physiologie chez une espèce d’oiseau qui est le diamant mandarin. En particulier, nous allons analyser le métabolisme, le vieillissement cellulaire et des régulateurs endocriniens comme la corticostérone qui est une hormone métabolique et marqueur de stress. Nous allons mimer en laboratoire les conditions du réchauffement climatique en provoquant un stress thermique. Le milieu sera enrichi grâce à un enrichissement structurel (balançoire, perchoirs, piscines) et un enrichissement alimentaire (millet, os de seiche) dans les volières. Étudier ces effets sur les mécanismes clés du vieillissement, ainsi que leurs conséquences sur la reproduction et la survie des individus pourrait nous aider à mieux prédire la dynamique des populations en réponse aux changements globaux.

Bénéfices attendus

Tester les conséquences du stress thermique sur la condition physique et les mécanismes physiologiques sous-jacents pourra permettre une meilleure modélisation des effets futurs du changement climatique sur la réponse adaptative des organismes vivants.

Procédures

#procédure 1 (abandonnée) : sur poussins La bioimpédance est mesurée de façon non-invasive en créant une tension aux bornes des électrodes placées sur le corps, ce qui permet de quantifier la quantité d’eau corporelle et la quantité de graisses. Ces mesures sont effectuées pour les poussins à J10, J30 et J100 et pour les adultes au moment de la mise en couple et quand les poussins ont 30 jours. Le suivi de la température interne se fera à l’aide pit-tags RFID sous-cutané (après désinfection à l’alcool dilué à 70%, injection à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille stérile de 3,17 mm en sous-cutané interscapulaire). Cette opération est la même que le puçage des chats et chiens. Voici les durées de chaque geste cité qui seront réalisés sur animal vigile: prélèvement sang et insertion du pitTAG (30 s chacun), prélèvement de plumes (1s), analyse métabolique dans la chambre calorimétrique et mesure de la bioimpédance (20 mn chacun). Chez les poussins, des prélèvements sanguins seront effectués en cours de croissance (J7, 20 μl), en fin de croissance (J30, 100 μl), à moyen terme (J100, 100 μL), puis annuellement jusqu'à leur mort, pour mesurer les bio-marqueurs présentés ci-dessus ; le taux métabolique au repos mesuré sur une durée de 30 mn et la déshydratation seront également mesurés à ces moments-là. Les animaux adultes seront soumis à 4 prélèvements sanguins d’une durée de 30 secondes chacun réalisés sur animaux vigiles. #Avenant (procédure 2) : sur 80 adultes. Les individus seront exposés pendant 4h à 30°C et 40°C avec 30 jours de délais entre chaque exposition. Nous effectuerons 4 prises de sang (systématiquement 75µL prélevés) sur ces individus : une immédiatement après exposition à 30 et 40°C, et une 48h post-exposition, afin d'évaluer la capacité de récupération à un stress.

Impact sur les animaux

Les protocoles de stress thermique sont conçus pour engendrer une perturbation de l’homéostasie des animaux pouvant créer un inconfort, mais pas de douleur physique. Ils ont déjà été employés avec succès chez le modèle aviaire choisi, et ce à des stades équivalents. L’induction d’un ‘stress‘ modéré chez les animaux n’est pas un effet indésirable mais l’effet désiré dans le cadre de la question scientifique de ce projet. Nous considérons que le stress thermique est modéré car ce sont des animaux qui dans leur milieu naturel en Australie subissent des températures beaucoup plus élevées (jusqu’à 45 °C). C’est pour cette raison que nous avons classé cette procédure dans la catégorie «modéré». Si l’animal s’avère présenter un comportement particulier (inactivité), un aspect général modifié (plumes ébouriffées), une diarrhée ou une perte de 20% de son poids, il sera remis en conditions d’élevage contrôle (23°C) et ils seront soumis à un traitement en fonction des symptômes en accord avec une prescription du vétérinaire de référence.

Devenir

Les 80 adultes seront gardés en élevage et éventuellement réutilisés pour d’autres expériences.

Remplacement

Le projet vise à comprendre l’effet du stress thermique sur le vieillissement cellulaire et les mécanismes physiologiques/cellulaires sous-jacent. L’exposition à un environnement stressant engendre une multitude de bouleversements physiologiques qui implique différentes cellules et différents organes, mais également les communications inter-cellulaires et inter-organes, ce qui ne peut pas être reproduit via des approches substitutives disponibles à ce jour.

Réduction

Le nombre d’individus utilisé a été réduit au minimum nécessaire (20 nids/groupe) à l’obtention de résultats statistiquement appropriés aux objectifs. Cela est possible grâce à l’utilisation partielle d’un suivi longitudinal où chaque individu sera échantillonné (sang et plumes) avant d’entrer en procédure, ce qui permettra de corriger les données similaires obtenues post-traitement par la variabilité interindividuelle initiale.

Raffinement

Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux expérimentaux aussi bien avant l’entrée en protocole, que pendant les procédures : - phase d’habituation dans de grandes volières extérieures. - enrichissement structurel (balançoire, perchoirs) et enrichissement alimentaire (millet, os de seiche) - Attention particulière portée à l’état du plumage et à la posture des oiseaux lors des visites quotidiennes (indicateurs majeurs du bien-être) - Écartement de la procédure d’un animal si signe de souffrance et/ou gain de masse < 20% du gain de masse du groupe contrôle (= points limites). A la sortie du traitement (exposition à 30 ou 40 °C), les individus seront directement placés dans leur cage avec eau à disposition ainsi qu’une piscine. Un suivi pendant 1h sera mis en place avec un observateur dans la pièce. Quelques gouttes d'eau seront immédiatement placées au bec des individus en cas de signes de détresse.

Choix des espèces

1) Espèce largement utilisée en laboratoire dans des études en écologie et évolution, notamment sur le vieillissement cellulaire et la physiologie, l’étude des compromis d’histoire de vie, le comportement social, la sélection sexuelle et les effets maternels. 2) Facilité de manipulation et de maintien en élevage de ces oiseaux. Les prises de sang de 100 µl peuvent être prélevées puisque les individus font 14-20g. Les animaux seront utilisés au stade adulte pour identifier les effets du stress thermique pendant la reproduction des parents des nids suivis, ainsi qu’au stade poussin pendant toute la croissance (jusqu’au J100) afin d’identifier les effets de ce stress pendant ce stade de vie.

Pour entretenir une lignée de souris porteuses d'une mutation qui affaiblit leur système immunitaire et enflamme leurs poumons, 545 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent un prélèvement au bout de la queue pour le génotypage, et chaque adulte destiné aux expériences une prise de sang sans anesthésie, juste avant sa mise à mort pour le prélèvement des organes. Les souris mutantes grandissent moins et meurent davantage à partir de six mois, et une grille de score hebdomadaire fixe le point limite qui déclenche leur mise à mort. Le porteur juge la règle du remplacement "pas applicable ici", faute de pouvoir étudier in vitro les coopérations entre cellules immunitaires. Les souris gardées pour l'entretien de la lignée et les croisements restent en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions des lymphocytes (cellules incluses dans les globules blancs et impliquées dans la réponse du système immunitaire) ce qui conduit à induire un déficit immunitaire (baisse de la fonction d’une partie au moins des cellules du système immunitaire) chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris portant cette mutation ainsi que l’identification de la mutation par analyse génétique pour identifier les animaux.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire. Un prélèvement tissulaire et un prélèvement sanguin seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire à phénotype dommageable avec une croissance moins importante et une mortalité accrue à partir de l’âge de 6 mois. Les souriceaux seront prélevés à la queue pour le génotypage, et un prélèvement sanguin sera réalisé sur chaque animal adulte utilisé dans les expériences, juste avant la mise à mort. Ces gestes peuvent générer de la douleur, cependant les gestes réalisés sont des gestes de base, rapides (moins de 2 minute par geste), pour lesquels nous sommes expérimentés, donc ils ne nécessitent pas d'anesthésie. De plus les animaux sont habitués à la contention réalisés pendant ces gestes, ce qui réduit leur stress.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.

Section du réseau lymphatique de la peau et ablation des ganglions de l'aisselle et du bras : 256 souris femelles sont opérées sous anesthésie pour provoquer un lymphœdème, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite, éveillées, une injection quotidienne d'une substance non nommée, cinq jours par semaine, pendant deux à huit semaines selon les groupes, puis une lymphographie sous anesthésie générale. Le porteur décrit le lymphœdème comme "une pathologie douloureuse et handicapante", puis annonce chez ces souris un seul effet indésirable, un gonflement de la patte opérée de 10 à 15 %. À l'issue de la lymphographie, elles sont tuées sans réveil pour récolter leurs tissus.

Objectifs

La principale fonction du système lymphatique est de collecter la lymphe, ce fluide riche en protéines et en lipides, afin de le ramener à la circulation sanguine par le biais de la veine sous-clavière. Ces deux systèmes travaillent en étroite collaboration afin de maintenir l’équilibre homéostasique de l’organisme. En cas de perturbation de ce système, lors du traitement du cancer (ablation des ganglions lymphatiques, radiothérapies, chimiothérapies), on observe la formation d’oedèmes massifs qui peuvent, à long terme, devenir douloureux et handicapants: les lymphoedèmes. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Pour ce projet, nous allons utiliser un modèle murin de lymphoedème secondaire induit pas une section cutanée du réseau lymphatique associé à un curage ganglionnaire axillaire et brachial chez la souris. Les vaisseaux lymphatiques interagissent étroitement avec la matrice extracellulaire les environnant. Des changements dans la composition ou les propriétés biomécaniques de cette matrice sont donc susceptibles d’inhiber leurs fonctions. Nous étudierons dans ce modèle le développement de la fibrose (accumulation et remodelage pathologique de matrice), les régulations moléculaires des facteurs de croissance lymphangiogéniques et des protéines impliquées dans le remodelage de la matrice ainsi que les propriétés bio mécaniques de cette matrice afin d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction endothéliale lymphatique en normalisant la matrice extracellulaire et ainsi de pouvoir proposer un traitement pour le lymphoedème

Bénéfices attendus

Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal.. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.

Pour étudier les neurones qui commandent la paralysie musculaire du sommeil paradoxal, 60 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Chacune subit une ou deux chirurgies de quatre-vingt-dix minutes pour l'infusion de substances dans le cerveau et la pose d'un dispositif d'enregistrement, puis vit isolée dans un baril individuel pendant les quatre semaines d'expérimentation. Le porteur compte parmi les nuisances le stress de cet isolement et le dérèglement provoqué du sommeil, l'objectif étant de reproduire chez la souris les mouvements violents du trouble comportemental humain. Il écarte la mouche, le poisson zèbre et le ver C. elegans faute de sommeil paradoxal, et juge que les organoïdes cérébraux ne constituent "pas encore" une alternative crédible.

Objectifs

Le sommeil paradoxal (SP) pendant lequel nous rêvons se caractérise au niveau physiologique par une forte activité cérébrale et une paralysie musculaire. Plusieurs pathologies sont associées à une défaillance de cette paralysie comme les apnées/ronflement, la narcolepsie-cataplexie et les troubles comportementaux en SP (TCSP). Le patient souffrant de TCSP extériorise ses rêves sous la forme de mouvements involontaires violents (bagarres, coups, cris, paroles). Le TCSP est un trouble neurologique annonciateur de maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et serait dû à la mort des cellules nerveuses contrôlant la paralysie du SP. Nos travaux antérieurs chez le rat ont permis d’identifier ces neurones et de montrer expérimentalement que lorsqu’on les lèse, on est capable de reproduire un tableau symptomatique proche du TCSP humain alors que le SP lui-même est par ailleurs normal. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cérébraux responsables du SP qui sont largement inconnues. Pour aborder cette question, nous proposons d’affiner les connaissances physiologiques et fonctionnelles des cellules nerveuses contrôlant la paralysie du SP chez la souris par l’utilisation d’un éventail d’approches génétiques et moléculaires et ainsi mieux comprendre les causes neurologiques du TCSP. Si nos modèles d’étude nous permettent d’induire des signes de TCSP, nous aurons réussi à créer un nouveau modèle animal de cette pathologie qui nous permettra ensuite de comprendre l’origine des mouvements anormaux du TCSP et d’élaborer des traitements ciblés efficaces.

Bénéfices attendus

Malgré le nombre croissant d’études tentant de comprendre le sommeil paradoxal et ses fonctions physiologiques et cognitives, de nombreuses zones d’ombre persistent. A ce jour, une seule aire cérébrale a été définie comme directement impliquée dans le SP sans que son rôle exact soit clairement établi. Ce présent projet de recherche expérimentale vise donc à approfondir nos connaissances fondamentales sur le SP et préciser sa contribution fonctionnelle. Notre objectif translationel est également de développer de nouveaux modèles de souris mimant au plus près le tableau symptomatique du TCSP humain, plus pertinents pour la recherche de traitements que ceux actuellement disponibles. Le TCSP étant un biomarqueur avant courreur de la maladie de Parkinson, la compréhension de ses mécanismes neuro-pathologiques est un réel enjeu de santé publique pour tenter d’intervenir précocement chez les patients et empêcher ou à défaut retarder l’apparition de la maladie de Parkinson.

Procédures

Selon la procédure considérée, les souris seront soumises à 1 ou 2 intervention(s) chirurgicale(s) d’une durée moyenne de 90 minutes chacune, sous anesthésie réversible, pour l’infusion intracérébrale de substances pharmacologiques et la pose du dispositif d’enregistrement chronique du sommeil. Pendant toute la durée des procédures (4 semaines consécutives), les souris seront hébergées individuellement avec enrichissements. A la fin d’un protocole permettant la visualisation des neurones actifs pendant le SP (2 jours), toutes les souris seront euthanasiées sous anesthésie létale et leur cerveau prélevé pour des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les 3 procédures peuvent être classifiées de sévérité modérée. Les nuisances et effets indésirables envisagés sont : - Stress lié à l’isolement - Stress léger lié aux manipulations par l’expérimentateur - Dérèglement du SP sous la forme de TCSP - Inconfort au réveil à la suite des différentes chirurgies - Gêne dans les premiers jours lié au dispositif d’enregistrement des états de vigilence - Inconfort transitoire due au protocole permettant de marquer les neurones actifs lors du SP - Gêne transitoire liées à l’administration des molécules permettant de moduler l’activité des neurones

Devenir

Toutes les souris incluses dans chacune des 3 procédures seront euthanasiées afin de collecter les biopsies cérébrales pour analyses post-mortem.

Remplacement

Des animaux comme la mouche, le poisson rouge ou le vers C. elegans sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal spécifique aux mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour étudier des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques liées à des pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson. Il s’agit de recherche fondamentale supposant l’utilisation d’animaux vivants et en bonne santé. La dissection fine des réseaux neuronaux ne peut être réalisée chez l’homme par les techniques globale mises en œuvre en recherche clinique (imagerie cérébrale et polysomnographie). Dans ce contexte, l’utilisation de la souris reste essentielle car elle est adaptée aux études physiologiques et comportementales longitudinales.

Réduction

La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Sur la base de nos nombreux travaux précédents publiés, nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe, avec 6 groupes expérimentaux, pour un total de 60 souris mâles et femelles. Ce nombre d’animaux tient compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données, des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales, de la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés et de la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps pouvant rendre leur interprétation aléatoire. De facto, le retrait de ces animaux sera requis pour garantir la validité de l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Pour minimiser le stress et maintenir les interactions sociales, les souris seront autant que possible hébergées groupées. Durant chacune des procédures, des enrichissements seront systématiquement ajoutés pour contribuer à leur bien-être. Après chaque chirurgie, elles seront hébergées en cage double pour faciliter le suivi post-opératoire (traitements médicamenteux et analgésiques si besoin) avant de les isoler dans un baril individuel pour toute la durée des expérimentations. Les produits chimiques testés seront utilisés aux plus faibles doses en se basant sur la littérature et notre expertise. Notre préoccupation quotidienne sera de détecter si l’état de santé général se dégrade subitement au cours des expérimentations. Ceci sera facilité par l’utilisation d’une grille de score de bien-être établie sur la base de critères classiques comme le poids, la mobilité, l’aspect du nid et le toilettage. Si un point limite est atteint, l’animal sera retiré des expérimentations et euthanasiés sans délai.

Choix des espèces

Le SP est une caractéristique commune aux mammifères incluant la souris, le rat et l’homme, avec une organisation anatomique cérébrale globalement très similaire. Les modèles animaux alternatifs (drosophile, poisson zèbre, Caenorhabditis elegans) de plus en plus utilisés dans ce domaine de recherche sont cependant dépourvus de SP et donc sans pertinence pour nos travaux. Le rat a été largement utilisé dans la recherche sur le SP en raison de sa capacité à imiter les caractéristiques clés des pathologies humaines mais avec des limitations en particulier pour l’utilisation des nouveaux outils de biologie moléculaires et cellulaires. La souris permet de contourner ces limites et est de fait un modèle de choix pour la mise en œuvre d’approches génétiques et moléculaires afin de confirmer et d’approfondir nos connaissances sur le SP et ses pathologies. Des souris C57bl6 jeunes adultes de 10-12 semaines au début des procédures seront utilisées. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale, possédant un système locomoteur mature, un cycle circadien veille-sommeil jour/nuit consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et dans la littérature chez la souris. Enfin, l’efficacité de la transfection neuronale par AAVs est maximale chez les souris jeunes adultes. Il s’agira de souris sauvages, mâles, jeunes adultes âgées 10-12 semaines au début des procédures. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale, possédant un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris. De plus, l’efficacité de la transfection neuronales par AAVs est maximale chez les souris juvéniles et jeunes adultes et décroit rapidement avec l’âge.

16 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À trois semaines, les souriceaux reçoivent une bague métallique dans l'oreille et se font couper deux millimètres de queue sur animal éveillé, puis une partie est rendue anémique par injection, une autre irradiée avant une greffe de moelle osseuse, avec prélèvement de sang chaque semaine. Le porteur indique que les lignées génétiquement modifiées présentent un risque accru de caillots et de cancer du sang, et que l'irradiation provoque diarrhées et infections. Le nombre déclaré tient à l'élevage requis pour obtenir les génotypes voulus, le porteur justifiant la réduction par le seul recours à des tests statistiques.

Objectifs

La maladie de Vaquez est une maladie qui se caractérise principalement par ses complications de caillots sanguins liées à une production excessive de globules rouges et de plaquettes. Elle survient vers 55-60 ans en moyenne chez l'homme et peut se compliquer dans environ 20% des cas en cancer du sang impactant directement le pronostic vital. Les approches thérapeutiques actuelles demeurent palliatives pour la plupart. Depuis plusieurs années, les travaux de recherche ont permis d'identifier une modification au niveau d'un gène présente chez environ 85 % des maladies de Vaquez. Un modèle souris exprimant cette modification génétique permet de disposer d'un modèle d'étude reproduisant la pathologie humaine. Notre projet aura pour but de comprendre les mécanismes qui entrainent l'apparition d'un cancer et de tester de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

L'analyse fine des mécanismes impliqués dans l'apparition d'un cancer du sang dans la maladie de Vasquez et le développement d'un nouveau modèle de souris doit permettre d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes qui pourront être testées dans des essais cliniques chez l’Homme afin d’espérer éradiquer les cellules initiatrices de cette maladie. Ces nouvelles approches thérapeutiques permettront d’améliorer l’espérance de vie et la qualité de vie des patients atteints de ce type de cancer du sang.

Procédures

Pour réaliser ce projet, nous réaliserons dans un premier temps l'élevage de plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Cela nous permettra d'avoir à disposition un modèle reproduisant la pathologie humaine. Cet élevage consiste à mettre en accouplement des souris mâles et femelles et lorsque les souriceaux seront âgés de 3 semaines, nous réaliserons une identification (pose d'une bague métallique numérotée au niveau d'une oreille, réalisée sur souris éveillée; durée: 30 secondes) et le prélèvement de 2 mm de l'extrémité de la queue (sur souris éveillée; durée: 5 secondes). Ce fragment de tissu permettra d identifier les animaux qui présentent la ou les mutations génétiques d'intérêt. Nous utiliserons ensuite une partie de ces souris pour créer une anémie. Pour cela les souris seront injectées dans l'abdomen avec une substance induisant la destruction des globules rouges (durée de l'injection: 10 secondes sur souris éveillées). 29 jours après cette injection, les souris recevront (injection dans l'abdomen sur souris éveillées) une injection d'une molécule permettant de mesurer la prolifération des cellules sanguines. 24h plus tard, les souris seront euthanasiées. Une autre partie des souris produites seront irradiées (étape réalisée sur souris éveillées permettant d'éliminer les cellules de la moelle osseuse avant de réaliser une greffe; durée: 15 minutes). Ces souris recevront ensuite la greffe (injection par voie intraveineuse; durée 1 min) de cellules de la moelle osseuse de souris non génétiquement modifiées. Chaque semaine, un prélèvement de sang (durée 20 sec) sera réalisé afin de suivre la prolifération et le développement des cellules greffées. Un partie de ces souris recevront un traitement médicamenteux minant ce qui est fait chez l'homme lors de protocole de thérapie.

Impact sur les animaux

Une partie des souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet présenteront des altérations affectant leur bien-être (modification de la composition sanguine entrainant de risque de coagulation et de formation de caillots, risque accrue de développer un cancer du sang). Les autres nuisances sont directement liées au protocoles expérimentaux mise en place: destruction des globules rouges (= anémie) entrainant un affaiblissement de l'état général de la souris; irradiation provoquant des troubles digestifs (diarrhées) et une plus forte susceptibilité aux infections; la répétition des prélèvements sanguins entrainant une douleur passagère (piqure) et un stress à l’animal; injection des drogues associés à des effets secondaires d’ordre digestifs en général (diarrhées, nausées…); injections répétées des traitements pouvant entrainer des lésions au site d’injection et une irritation du tube digestif dans le cas du gavage.

Devenir

L’évaluation de l’efficacité du traitement nécessite la mise à mort de l’animal, notamment en point final. Ils seront donc tous euthanasiés. La moelle osseuse, la rate et le sang seront récupérés en post-mortem pour l’évaluation en point final à l’issue des expériences menées (mesure de l’efficacité d’un traitement, récupération et étude des cellules du système sanguin).

Remplacement

Le remplacement sera proposé à chaque fois que cela sera possible (évaluation en première intention des nouvelles thérapies par des tests en milieu artificiel dans des plaques de culture cellulaire). Cependant, certaines questions nécessitent d’avoir recours à des approches utilisant un organisme vivant entier. L'évaluation des nouvelles stratégies thérapeutiques nécessitent en effet d'avoir une vision d'ensemble (biodisponibilité du médicament, rôle de l'environnement à proximité des cellules sanguines, interaction entre les différentes populations de cellules sanguines).

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à ce projet, nous nous sommes appuyés sur l'utilisation de tests statistiques, afin d'obtenir des données interprétables statistiquement tout en utilisant le nombre minimum de souris.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En cas de signes de souffrance, une administration d'anti-douleur sera réalisée. Si aucune amélioration n'apparaît, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement et la génétique est bien connu et proche de l’humain. En effet, il existe des souris génétiquement modifiées pour le gène trouvé comme étant anomal chez les patients atteints de la maladie de Vasquez. De plus, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. Dans la partie élevage, les souris sont mises en accouplement à l'âge de 8 semaines (maturité sexuelle) et l'identification des souriceaux se fera à l'âge de 4 semaines (âge où il est facile d'identifier les souris mâles des souris femelles et de les séparer de leurs parents). Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (modèle de greffe ou injection de traitement), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.

Nourris quotidiennement à la cuprizone pour provoquer une dégénérescence du cerveau, puis injectés dans le cerveau sous anesthésie, 1 125 souris et 1 125 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue pour un donneur d'ordre extérieur des cellules thérapeutiques dont la nature n'est pas précisée, avec mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires et autopsie systématique. Interrogé sur le remplacement, le porteur ne mentionne aucune alternative sans animaux et recopie mot pour mot son paragraphe sur la surveillance des effets indésirables. Il justifie le choix du rongeur par la transposition des doses aux "premiers patients", et présente l'injection intracérébrale comme porteuse de "grands espoirs thérapeutiques sur le long terme".

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)

Procédures

L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.

Remplacement

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Dans le cas ou leur hébergement ne pourra se faire en groupes, un enrichissement adapté sera fourni et un suivi renforcé sera effectué. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.