Procédures modérées

Pour étudier le rôle d'une cytokine dans le vitiligo, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements. Elles reçoivent sous la peau du flanc des cellules de mélanome qui déclenchent une réaction auto-immune, puis des injections d'anticorps neutralisants, une résection chirurgicale de la greffe au douzième jour, et des séances répétées d'anesthésie gazeuse pour être pesées, mesurées et photographiées pendant plusieurs mois. Le porteur écrit que le protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris, chiffre supérieur aux 400 déclarées dans les gravités attendues. Sur le remplacement, il indique que les cibles ont été identifiées par des travaux in vitro et in silico, et affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend "nécessaire" le recours aux expériences in vivo.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.

Gavés deux fois par jour pendant cinq jours avec un candidat médicament déjà reconnu cardiotoxique, 8 chiens beagles sont tués à l'issue pour l'examen de leur cœur, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit quatorze prises de sang, une surveillance télémétrique continue et des interventions de nuit, le porteur annonçant une accélération du rythme cardiaque, une prostration possible, des vomissements et une hypersalivation. La cardiotoxicité avait déjà été observée chez le chien lors d'une étude précédente, ce projet servant à la confirmer et à tester un agent censé l'atténuer. Le porteur indique que les résultats décideront de la poursuite du développement du candidat médicament.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur le cœur d’une dose d'un candidat médicament ayant montré dans une précédente étude une cardiotoxicité, et en parallèle d’investiguer un possible mécanisme d’action et de mitigation pour le futur développement du candidat médicament. Pour cela, 2 groupes d’animaux recevront la même dose de candidat médicament avec ou sans un traitement préalable avec un agent mitigateur. Les résultats de ce projet permettront de décider la poursuite du développement du candidat médicament et le cas échéant les modalités de ce développement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de permettre de confirmer ou non la cardiotoxicité d’un candidat médicament et, dans le cas de cardiotoxicité, de potentiellement identifier un mécanisme d’action avec un moyen pharmacologique de mitigation, afin d'en poursuivre le développement. A plus long terme, le bénéfice pour la santé humaine serait le possible développement d’un candidat médicament. Il est à noter qu'il est attendu que ce futur produit (antibiotique) combatte un problème infectieux et de santé publique mondial pour lequel aucun médicament actuellement disponible n'est efficace sans générer de résistance.

Procédures

Pour chaque animal inclus dans le projet, une administration biquotidienne par voie orale (environ 30 secondes par administration) sera réalisée sur animal vigile pendant 5 jours consécutifs pour le candidat médicament avec une administration quotidienne par voie orale pour l’agent mitigateur ou son contrôle négatif. Également chaque animal subira des prélèvements de sang vigile (quelques secondes par prélèvement) tout au long du projet (14 prélèvements au total répartis sur 5 journées). Enfin chaque animal sera anesthésié une fois avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets ou effets indésirables prévus sur les animaux sont : - Stress, inconfort ou douleur brève, lors des procédures d’administration par voie orale (gavage), de prélèvement de sang - stress, inconfort lors d’intervention ponctuelle pendant la phase nuit pour surveillance des animaux, administration et/ou prélèvements sanguins - effets indésirables potentiellement attendus et liés à l’administration candidat médicament (liste non exhaustive) : inconfort liée à l’augmentation de la fréquence cardiaque, activité diminuée à prostration/abattement, vomissements et/ou hypersalivation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de permettre l’évaluation histopathologique du tissu cardiaque.

Remplacement

Le projet visant à évaluer une possible cardiotoxicité chez le chien après administration répétée sur 5 jours consécutifs par voie orale et d’investiguer un possible mécanisme d’action pour la cardiotoxicité par l’ajout d’un possible agent mitigateur, il ne peut pas être réalisé in vitro ou ex vivo car les interactions complexes et la régulation du système cardiovasculaire ne peuvent s’exprimer que chez un animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé comme étant le minimum nécessaire (4 par groupe ; total de 8) pour obtenir une puissance statistique satisfaisante et une pertinence biologique des résultats en limitant l’effet des variations individuelles afin de permettre de conclure sur la cardiotoxicité de manière fiable.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés dans des conditions environnementales adaptés à l’espèce (groupes sociaux, jouets, période d’exercice quotidienne, …). Pour les actes contraignants pour l’animal (administration par voie orale, prélèvements de sang) une habituation des animaux à la manipulation est mise en place avec distribution de récompense. En relation avec les signes cliniques potentiellement attendus et liés à l’administration candidat médicament, un suivi clinique continu (observations cliniques, suivi en temps réel de la fréquence cardiaque) avec un monitoring vidéo pendant toute la durée de la période de traitement sera mis en place afin d’identifier au plus tôt l’apparition des signes cliniques liés à la cardiotoxicité. Ce suivi permettra de prévenir le vétérinaire au plus tôt. De plus des points limites spécifiques sont définis pour décider de l’euthanasie des animaux afin de réduire au minimum les nuisances sur leur bien-être.

Choix des espèces

Le chien beagle a été choisi pour ce projet car c’est une des espèces acceptées par les instances réglementaires pour l’évaluation préclinique des médicaments. De plus le candidat médicament a été associé à des lésions histologiques au niveau du myocarde et des vaisseaux sanguins dans une étude précédente réalisée sur le chien. Cette étude est à l’origine de la conduite du projet. Jeunes adultes afin de reproduire les conditions de l’étude précédente dans laquelle la cardiotoxicité a été observée

Réutilisés ensuite dans d'autres projets, 90 souris, 90 rats et six macaques subissent des IRM répétées sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut passer jusqu'à 120 examens de deux heures sur cinq ans, avec prises de sang et administrations de molécules le jour de l'examen. Le porteur reconnaît que le stress de la contention et les anesthésies répétées entraînent une perte de poids, et que la stimulation des pattes des rongeurs provoque des douleurs les jours suivants. Quand les rongeurs deviennent trop lourds pour le scanner, il annonce leur transfert vers des projets de formation, ce qui prolonge leur utilisation dans un autre cadre.

Objectifs

Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire (RMN) à travers le développement et la validation d’outils dédiés à la résonance magnétique nucléaire à haut champ, notamment les antennes radiofréquences servant à l’excitation des spins nucléaires et la détection des signaux RMN, et les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux non-proton observables in vivo. Nous mènerons d’une part des expériences chez le rongeur (rat et souris) et le primate non humain sain anesthésié pour développer et valider nos nouveaux outils d’imagerie cérébrale. Nous attendons de ces expériences qu’elles nous permettent d’acquérir des données de référence qui seront comparées aux données de la littérature afin d’apporter la « preuve de concept » que nos outils sont performants et précis. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal sain.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour préfigurer les études de recherche biomédicale et de neurosciences à venir chez le rongeur, le primate non-humain et ultimement chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique.

Procédures

Des prélèvements sanguins (de quelques secondes) seront éventuellement réalisées chez l’animal anesthésié (juste avant, juste après ou pendant l’examen IRM) pour la détermination de certains paramètres physiologiques). Des molécules à dose thérapeutique seront administrés occasionnellement (réalisée typiquement en quelques minutes) le jour de l’examen IRM. Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM sur 5 ans pour les macaques et moins d’une dizaine pour les rongeurs. Un nombre maximal de 5 expériences de stimulations somato-sensorielle (quelques minutes) seront menées par animal durant certains examens IRM.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie répétée peuvent être délétères entrainant typiquement une perte de poids. A noter également que la stimulation somato-sensorielle des pattes chez le rongeur implique le plus souvent des douleurs les jours suivants nécessitant un traitement analgésique.

Devenir

Pour les rongeurs, les dispositifs expérimentaux présupposent un poids maximum au-delà desquels les souris ou les rats (ne peuvent plus être positionnés correctement et de façon stable dans le scanner IRM préclinique. Dans ce cas de figure, nous chercherons à transférer les animaux vers d’autres projets de formation en particulier. Après avis favorable du vétérinaire, les PNH pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.

Remplacement

Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de souris, de rat ou de macaque adulte. Toutefois, la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau ne peut être appréciée à l’aide d’objets-test aussi évolués soient-ils. Le passage par l’expérimentation animale (rongeur ou primate) est donc une nécessité.

Réduction

Nous comptons utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaires à la mise au point et à l’affinement de nos méthodes. Aucun test statistique précis n’est envisagé à ce stade mais les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Pour chaque espèce, les effectifs suffisant pour acquérir des données de références ont été évalué sur la base de nos études précédentes. Chaque animal sera réexaminé à plusieurs reprises avec un intervalle minimum de 15 jours (soit un nombre maximum de 120 examens par animal sur une période de 5 ans). Concernant la détection des variations locales de signal liée à l’activation cérébrale, nous considérons empiriquement que les effectifs prévus seront suffisants pour atteindre une significativité statistique. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de primate nécessaires en recherche biomédicale.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continus afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveiller de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Un contrôle minutieux des points-limites est également mené tout le long du projet afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux . Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces ubiquitaires en recherche biomédicale. L’organisation, la physiologie et le métabolisme du cerveau des rongeurs sont bien connues dans le monde scientifique. Par ailleurs, de très nombreux modèles de souris transgéniques permettent aujourd’hui de valider la pertinence de nos biomarqueurs vers une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques en jeu chez la maladie humaine. Chacune de ces deux espèces de rongeur propose des challenges techniques spécifiques en terme de dimensionnement des dispositifs expérimentaux mais aussi en terme de quantité ou de stabilité des signaux RMN. Ainsi certaines méthodes ne seront pas réalisables pratiquement chez l’une ou l’autre espèce. Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'homme notamment en termes de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (conceptions des équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour les rats, les individus devront être pesés de 200 à 450g. Pour les souris, leur poids devra être compris entre 20 et 40g. Des groupes homogènes en âge seront constitués. Pour le macaque, dans le souci de réduire, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.

255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une molécule par gavage chaque jour de la gestation, jusqu'à 21 fois, le porteur reconnaissant que la répétition accentue la douleur liée à la canule. Leur descendance subit trois tests de mémoire, une électrorétinographie sous anesthésie de 30 à 45 minutes, une IRM et un prélèvement de sang, les mères étant tuées au sevrage des petits. Le porteur espère déplacer "de quelques dizaines de points" le quotient intellectuel de personnes trisomiques, promesse adossée à un modèle murin dont le taux de transmission de la trisomie atteint à peine 30 %.

Objectifs

La trisomie 21 (T21), est due à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental qui touche environ 1 nouveau-né pour 2000 naissances. Elle représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. Plusieurs traitements visant à améliorer le retard mental ont déjà été investigués. Parmi ceux-ci, on trouve une molécule qui a montré des effets bénéfiques dans des modèles animaux mais aussi chez l’Homme à l’âge adulte. Pour autant, peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications importantes se mettent en place très tôt au cours du développement dans la T21. Pour palier a ce manque, une molécule sera administré aux souris femelles gestantes. Suite à ce traitement au cours de la gestation, 4 domaines seront évalués. 1) Le domaine de la mémoire à l’origine du retard mental. 2) Le domaine ophtalmologique qui servira à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces défauts chez les patients. 3) Le domaine de du cerveau pour évaluer par Imagerie par Résonance Magnétique son fonctionnement avec ou sans le traitement. 4) Le domaine de fonctionnement du foie qui comporte des défauts chez les porteurs de T21. Ici nous voulons tester l’hypothèse que ces problèmes commence au cours de la gestation. Ce projet sera réalisé sur 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer, de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée. Cela constituerait un progrès très important pour leur qualité de vie et celle de leur entourage. Peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications structurales de l’hippocampe et du cervelet se mettent en place très tôt au cours du développement embryonnaire dans la T21 et donc au cours de la période gestationnelle. Dans 2 études précédentes, nous avons montré que le traitement in utero chez la souris avec des inhibiteurs ciblant l’activité d'une proteine cible, améliore les déficits observés en lien avec la T21 chez plusieurs modèles murins. Ceci montre que le traitement au cours de la gestation entraîne des modifications qui perdurent sur le long terme. Nous attendons pour cette étude, les mêmes effets bénéfiques mais en utilisant une molécule de dernière génération, soluble, permettant une administration per os, indispensable pour une transposition chez l’Homme. Nous espérons que ce traitement sera suffisant pour permettre de ne plus avoir besoin de traitement chronique chez l’adulte. Une amélioration significative des performances cognitives est attendue, notamment pour la mémoire de travail et la mémoire explicite dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ce test. L’imagerie rétinienne révélera si le traitement a un impact sur les phénotypes rétiniens, ça n’a jamais été investigué. De plus, les potentielles améliorations seront également caractérisées par de l’imagerie fonctionnelle. L’étude des marqueurs sanguins permettra de savoir si le défaut du métabolisme hépatique à une origine développementale. D’une façon plus générale, pour une recherche fondamentale, les résultats obtenus devraient également permettre d’approfondir les connaissances sur le rôle de cette protéine cible au cours du développement et son impact sur les défauts cognitifs des patients.

Procédures

Les femelles gestantes seront traitées avec la molécule par gavage tous les jours pendant la durée de la gestation. Le traitement sera administré 1 fois par jour, tous les jours durant la gestation (21 jours maximum) per os par gavage. Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement qui permettent d'évaluer leur mémoire. Ces tests se déroulerons sur 4 jours, avec 1 session unique par jour. Chaque session dure de 8 à 15min suivant le test. Les souris recevront 3 anesthesies, -1 gazeuse pendant toute la durée de l’imagerie ophtalmique, 15 minutes maximum. -1 anesthésie gaseuse complementée par une analgesie pour l'imagerie par resonnance magnétique (IRM) - 1 anesthesie pour effectuer une fixation du cerveau ou une anesthésie de quelques minutes par inhalation pour un prelevement sanguin. La production des animaux traités in utero ainsi que les tests de comportement et les analyses ophtalmologiques seront fait dans l'EU235. L'IRM, les prelevements de sang et les fixations des cerveaux au PFA seront fait dans l'EU466.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules par voie orale. Cette douleur sera accentuée à cause de la répétition des gavages, au maximum 21 fois, soit 1 gavage par jour de gestation. L’électrorétinographie implique une anesthésie longue (30-45 minutes) obtenue par injection d'anesthesique. L'IRM se fait sous une anesthésie gazeuse avec analgésie, necessitant une injection. Le prélèvement de sang se fait sous anesthésie gazeuse, pouvant induire une angoisse chez l'animal. Les test de comportement nécessite de placer les souris dans des sytèmes quelles ne connaissent pas, ce qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis a mort. Des organes seront prelevés pour études.

Remplacement

La compréhension des mécanismes ainsi que les origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines.

Réduction

Le taux de transmission de la trisomie dans ce modèles souris et d’à peine 30%. 1 portée compte en moyenne 6 petits dont 2 trisomiques. Pour assurer la production des animaux, il faut accoupler 40 animaux femelles au total pour le traitement au cours de la gestation. Il faut multiplier ce chiffre par 2 pour avoir des mâles et des femelles, car l’analyse IRM montre des différences significatives en fonction du sexe. En effet, il nous intéresse de connaître la différence d’action que peut avoir la molécule inhibitrice sur des souris de sexes différents. Les effets du genre sur l’action de la molécule pourront ainsi être étudiés. La taille des groupes a été déterminée grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testeront 4 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Dans notre étude précédente, l’administration répétée pendant 19J par gavage chez l’adulte de cette molécule n’a pas montré d’effets délétères chez les animaux traités. Un suivi des femelles sera cependant réalisé sur la totalité de l’expérience, notamment durant la période gestationnelle où aura lieu le traitement. Un arbre décisionnel basé sur le reflet de la douleur chez la souris sera utilisé pour ne pas prolonger des souffrances éventuellement constatées. Les conditions d’élevage seront améliorées pour les femelles gestantes pour leur permettant de faire un nid plus complexe et ainsi de mieux gérer leur exposition à la lumière et aux menaces perçues. De plus, un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience. Les animaux seront ensuite sevrés de leur mère à 4 semaines et hébergés par groupe de 4 ou 5 pour leur assurer une vie sociale. Lors des tests ophtalmiques, du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout dessèchement cornéen. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil. Durant l’examen d’IRM une anesthésie est utilisée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. La température et la respiration des animaux sont en permanence surveillées par un système de monitorage et les animaux sont maintenus à une température optimale grâce au système de chauffe berceau de l’IRM. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l’acquisition en cours est immédiatement interrompue et l’animal est sorti de l’IRM. Il est alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu’à son réveil, sous surveillance. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées et sera pris en charge par un transporteur. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d’utiliser des transgéniques est liée à l’absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Les femelles qui seront traitées durant leur gestation, utilisées pour générer les groupes d’animaux, seront accouplées à partir de 8 semaines, dès la maturation sexuelle atteinte. Les animaux issus de ces croisements, seront utilisés dès le début de la gestation. Le but de l’expérience étant de réduire les deficits qui ont lieu in utero, pendant la gestation chez les souris trisomiques. Après la naissance, les animaux sont sevrés à 4 semaines. Les femelles porteuses seront mises à mort à ce stade. Les nouveaux nés seront gardés jusqu’à 3 mois, âge adulte, auquel ils seront évalués dans différents paradigmes. C’est aussi l’âge où le développement cérébral est complet et où le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présentes.

1 704 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen espacées de 48 heures, vivent seuls pendant cinq à seize semaines et subissent un prélèvement de sang dans l'artère mésentérique avant la mise à mort. Le porteur indique que l'irradiation peut toucher l'intestin grêle et provoquer des signes cliniques irréversibles, amaigrissement et gonflement de l'abdomen, et que le régime cétogène testé entraîne une forte perte de poids puis de fortes carences. L'hébergement individuel imposé à des animaux sociaux pendant plusieurs mois figure parmi les procédures, quand la rubrique raffinement met en avant un tunnel et une étagère.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le bénéfice thérapeutique de différents régimes alimentaires sur la toxicité digestive radio-induite. Plus précisément, ce projet visera à démontrer, via l’utilisation de régimes alimentaires renforçant ou fragilisant l’homéostasie au sein de l’écosystème colique, qu’après irradiation, la dégradation des relations de symbiose entre le système immunitaire de l’hôte et le microbiote, joue un rôle important dans les lésions digestives et notamment dans celles de l’épithélium colique. Ce travail revêt un intérêt majeur pour réduire la prévalence de patients souffrant de « Pelvic Radiation Disease » (PRD) ou améliorer leur prise en charge. La PRD est une maladie de certains patients bénéficiant d’une radiothérapie pelvienne et souffrent de complications gastrointestinales.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche scientifique vise à apporter des bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites du côlon dans un contexte de complications gastrointestinales après une radiothérapie pelvienne. Cela passe en premier lieu par une meilleur compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites. Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites de l’épithélium colique. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, et son évolution, ici interactions entre microbiote et système inflammatoire de l’hôte au sein de l’écosystème colique. Cette étude pourrait permettre d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques personnalisées basées sur l’alimentation (facilement applicable en clinique, prescrit par un nutritionniste), qui en renforçant de façon préventive l’intégrité de la barrière épithéliale colique permettraient de réduire la toxicité digestive au cours de la radiothérapie pelvienne, d’augmenter la tolérance au traitement antitumoral et ainsi d’optimiser son efficacité tout en préservant la qualité de vie des patients. D’un point de vue fondamental, la partie mécanistique de cette étude viserait à proposer une signature du microbiote, comme prédictifs des lésions radio-induites du côlon (i.e., « biomarqueur »), mais aussi de nouvelles cibles thérapeutiques sur la base d’une modulation des interactions hôte/microbiote et enfin pourrait appuyer le passage de l’étude expérimentale vers un transfert clinique éventuel.

Procédures

- Hébergement individuel pendant toute la durée de l’étude (min 5 semaines, i.e., pour la majorité des protocoles et max 12 à 16 semaines (dépendant de la longueur du régime alimentaire) pour 3 expériences potentielles et impliquant 432 rats maximum au total - Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Prélèvement de fèces de façon hebdomadaire pendant tout le temps de l’expérimentation. Ce prélèvement sera effectué au moment de la pesée de l’animal (réduction de la fréquence de manipulation des animaux et de leur stress). - Prélèvement de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les deux modèles d’irradiation localisée du côlon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. Les régimes alimentaires pourraient favoriser des modifications de la masse graisseuse des animaux entraînant une variation de leur métabolisme. Le régime alimentaire dit « occidental » sera celui qui pourrait le plus induire d’effets néfastes (prise de poids, réduction de la mobilité, troubles métaboliques). Une attention particulière sera également portée à la suite du régime cétogène et notamment durant les 3 premières semaines de prise (perte de poids importante pendant cette période et période latence de l’efficacité de ce régime sur la santé). A long terme ce régime nécessitera des compléments alimentaires car il induit de fortes carences. Il est possible que les animaux sous ces deux régimes alimentaires présentent des signes cliniques et comportementaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Dans le but d’évaluer les bénéfices thérapeutiques de certains régimes alimentaires sur la sphère digestive après exposition aux rayonnements et particulièrement pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo. Il n'existe pas de test in vitro substitutif permettant de répondre aux questions soulevées dans ce projet. Le bénéfice thérapeutique d’un traitement passe par une action multiple au sein de l’organe d’intérêt, en agissant sur différents systèmes de cet organe, ici écosystème colique i.e., microbiote et hôte (système immunitaire, la barrière épithéliale mais aussi le micro-environnement, le système nerveux…). Seul un modèle animal intégré permet de façon pertinente de tester une telle efficacité, ici celle de différents régimes alimentaires sur la fonction de barrière du côlon.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 8 à 12 individus selon le paramètre analysé. Pour certaines parties de l’étude, 2 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de reproduire un effet observé (2x6 animaux par expérience et par groupe). A minima, une analyse statistique sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). Les animaux seront pesés toutes les semaines. De plus, des dispositifs d'enrichissement (tunnel rouge et cage haute avec étagère) seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.

Choix des espèces

Le modèle rat est approprié dans notre étude et a été validé au laboratoire dans le cadre de l’étude des complications gastro-intestinales radio-induites. Nous utilisons au laboratoire, le modèle d’irradiation localisée au niveau colorectal sur une fenêtre de 2cm/3cm La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. Les lésions obtenues au cours du temps sont histologiquement proches de celles qui ont pu être observées chez des patients ayant bénéficié d’une radiothérapie pour le traitement de tumeurs abdomino-pelvienne. D’autre part, nous avons choisi le rat qui possède l’intégralité de son patrimoine immunitaire nécessaire à la réparation tissulaire. De plus, le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique mais aussi dans le cas plus précis de cette étude pour l’étude des variations fonctionnelles du microbiote, en raison de sa similitude avec l'être humain (par rapport à la souris). Les animaux seront reçus à l’âge de 13 semaines, ceci correspondant au stade adulte qui a été choisi afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Ils seront irradiés à l’âge de 17 semaines minimum soit 4 semaines minimum après leur arrivée et leur accessibilité aux différents régimes alimentaires testés et ce, afin de permettre la modification et la stabilisation du microbiote à la suite du changement alimentaire.

Soumis à une restriction alimentaire pendant 120 jours, puis à des chocs électriques ou à des injections provoquant des troubles digestifs, 288 rats sont tués à l'issue pour analyse du cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingt-seize d'entre eux reçoivent une récompense associée à un stimulus électrique pendant six semaines, les 192 autres une injection de chlorure de lithium censée rendre cette récompense écœurante. Le porteur qualifie ces atteintes de légères et transitoires, stress et sensation désagréable de moins d'une seconde, contractions abdominales de quelques dizaines de secondes. L'objectif annoncé reste de savoir si des rats devenus habitués deviennent aussi compulsifs, transposition aux addictions comportementales humaines qui reste une hypothèse de travail.

Objectifs

Les addictions comportementales (avec ou sans consommation de produit) représentent un coût élevé d’un point de vue médical, social et économique pour nos sociétés. La compréhension des mécanismes cognitifs et comportementaux impliqués dans ces désordres pourrait aider à une meilleure prise en charge de ces pathologies. Les habitudes de consommation peuvent participer au maintien de l’addiction et contribuer à la difficulté à changer son comportement de consommation, lorsque celui-ci n’est plus adapté. Dans un contexte d’addiction, il a été suggéré que le développement d’habitudes peut conduire à une consommation compulsive, c’est-à-dire, une consommation de produits malgré les conséquences négatives. Cependant le lien entre habitude et compulsion n’a pas été clairement établie. Ce projet a pour but principal de déterminer si des rats ayant une tendance à développer un comportement habituel sont également plus vulnérable à développer un comportement compulsif. Ce projet comprend deux procédures qui utilisent deux méthodes différentes pour évaluer les comportements habituels et compulsifs : la première procédure associe une récompense a une conséquence négative, la deuxième, rend la récompense aversive. Ces deux procédures seront complémentaires car elles évaluent deux composantes différentes d’un comportement compulsif : la persistance du comportement malgré les conséquences négatives ou la persistance à consommer malgré le dégout.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le lien entre habitudes de consommation et compulsion afin de pouvoir déterminer dans quelle mesure de mauvaises habitudes peuvent conduire aux comportements inadaptés caractéristiques des addictions comportementales. A terme, ces connaissances nous permettrons de développer des stratégies thérapeutiques ciblées sur les habitudes de consommation pour aider les patients à regagner le contrôle sur leur comportement. Par exemple, si ce projet permet de démontrer un lien entre habitudes de consommation et compulsion, des thérapies cognitives et comportementales peuvent consister à casser les habitudes pour prévenir le développement d’un comportement compulsif.

Procédures

Toutes interventions se feront sur animaux vigiles. Tous les rats (288) seront sous alimentation restreinte pendant 120 jours maximum et seront pesés 5 fois par semaine. Tous auront accès à des récompenses appétentes après avoir exécutés et appris des tâches simples. Les sessions d'apprentissage et de détection des habitudes s'étaleront sur 8 semaines à raison de 5 séances par semaine, 1 séance par jour, 1 h par séance. Pour 96 rats, les séances d'apprentissage seront suivies de séances de détection de l'habitude en absence de récompense (2 séances, 1 séance par jour, 1h par séance) puis de séances où la récompense sera associée à un stimulus électrique en basse tension d'une durée maximale d'1 seconde. Les séances avec le stimulus éléctrique basse tension auront lieu pendant 6 semaines, 1 séance par semaine, 1h par séance (soit 6 séances de 1h). Les 192 rats restants auront des séances d'apprentissage selon les modalités décrites ci-dessus. Puis les animaux suivront à 3 séances de 10 min en présence de la récompense suivi d'un stimulus aversif (injection intrapéritonéale d'une solution provoquant des troubles gastro-intestinaux pendant quelques dizaines de secondes) à raison d'une séance par jour pendant 3 jours consécutifs. Ces mêmes animaux suivront ensuite 10 séances d'accès à la récompense réparties sur 2 semaines, à raison de 1 séance par jour, 1 h par séance. Toutes les séances indiquées ont lieu dans des cages spécifiques dites opérantes.

Impact sur les animaux

- Stimulus électriques : légers stress et sensation désagréable transitoire pendant moins d’une seconde. - Injection intra-péritonéale de chlorure de lithium : induit des contractions abdominales transitoires pendant quelques dizaines de secondes. - Léger stress transitoire due à la contention de l’animal lors des injections intrapéritonéale (douleur légère à l’injection pendant moins de 10 secondes). - Léger stress due à la restriction alimentaire pendant toute la durée de l’expérience pour maintien du poids constant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier. Les connaissances acquises dans ce projet devraient permettre dans le futur d’apporter des connaissances pour développer des algorithmes permettant de modéliser le comportement. Ces algorithmes pourraient à terme constituer des outils de remplacement.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles. Sur la base d’études scientifiques publiées, nous nous attendons à observer de la variabilité inter-individuelle dans l’émergence de comportement compulsif. Le nombre d'animaux par lot a été calculé en tenant compte de cette variabilité et afin d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique. Ainsi, 32 animaux par lot seront nécessaires à notre étude avec 9 lots au total soit 288 animaux maximum.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 5 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, ainsi que les récompenses sucrées, de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus, qui s’approche de celle rencontrée chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Tous tués au terme de l'étude pour analyse de leur œil, 104 rats aveugles et immunodéprimés reçoivent une greffe de cellules rétiniennes humaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sept anesthésies en trois mois pour la chirurgie intraoculaire, l'imagerie et l'enregistrement de l'activité électrique de la rétine. Le porteur signale des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires possibles après injection, une perte de poils liée à la lignée qui s'accumule sous les paupières, et une mise à mort immédiate en cas d'inflammation ou d'infection de l'œil. Il retient un taux d'échec de 20 à 30 % lié à la chirurgie, au rejet de greffe ou à l'opacification du cristallin, chiffre intégré au calcul des effectifs.

Objectifs

Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire visant à remplacer l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dysfonctionnel ou perdu constitue une piste déjà très avancée avec l’incroyable potentiel thérapeutique des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS). le projet consiste à greffer des cellules de patients RP modifiées génétiquement pour corriger la mutation à l'origine de la pathologie. Ainsi, cela permettra de démontrer que les cellules de patients sont devenues fonctionnelles.

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à partir de cellules souches pluripotentes humaines différenciées en cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) pour préserver la vision dans ces maladies.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette opération consistera en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) de trois types de cellules de la rétine différentes assemblée en un feuillet de cellules. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Cette opération sera rapide et durera 15 à 20 minutes. Elle ne sera réalisée qu’une seule fois par rat. Tous les animaux seront examinés par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (15 minutes par rat) et feront également l'objet d’un examen de l'activité électrique de la rétine (30 minutes par rat) qui permettra l’étude de la fonction de ce tissu. Ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront également évalués avec un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière. Ce test de la fonction visuelle est rapide (5 à 10 minutes environ). Tous ces examens seront réalisés une fois par mois (pendant 3 mois). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'oeil.

Impact sur les animaux

-Anesthésies : 7 fois par animal au cours de l’étude qui dure 3 mois (risque cardio-respiratoire et d’hypothermie) -Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. -Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). -Le phénotype nude entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d'évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n'est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d'un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul oeil ; l’oeil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..)) lors de nos précédentes études aux approches similaires. Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés aux petits effectifs. Au total, 104 animaux sont prévus pour cette étude.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l'accès à l'eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d'analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’ inflammation ou d’infection de l’œil entraînera l’euthanasie.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques permettent une comparaison des résultats avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront opérés à 4 ou 5 semaines (début de la dégénérescence des photorécepteurs). L'ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation : à 2, 3 et 4 mois, le stade le plus tardif prévu par l’étude.

1 680 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'étude histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à deux chirurgies cérébrales, des administrations répétées de nanoparticules et, en option, cinq à six heures d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie. Le porteur décrit une récupération difficile après chirurgie, mobilité réduite, attitude de repli et poil terne, et affirme par ailleurs que le modèle de maladie neurodégénérative "n'entraîne pas de symptôme marqué". La description des procédures tient en quatre lignes pour 4 800 animaux, et les tests comportementaux annoncés au titre de la réduction ne sont jamais précisés.

Objectifs

Actuellement, Les maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de « nettoyage » des neurones en permettant ainsi l’élimination de protéines qui s’agrègent et tuent les neurones. Les lysosomes sont des organites cellulaires impliqués dans la survie des cellules, en dégradant certaines molécules anormales qui s’accumulent provoquant ainsi des pathologies neurodégénératives. Or chez les patients atteints de certaines formes de ces pathologies, la fonction lysosomale est perturbée et ne permet donc plus le nettoyage cellulaire dans les neurones, entrainant leur mort. La stratégie de ce projet est donc de développer et tester via différents modes d’administration des nanoparticules contenant des molécules permettant de refonctionnaliser la voie de « nettoyage » des neurones dans différents modèles animaux de la Maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Les synucléinopathies comme la maladie de Parkinson touchent plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans, au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif utilisant des nanoparticules est un des grands axes de notre recherche. Ce projet s’inscrit dans une optique à long terme avec à terme une application clinique du composé utilisé.

Procédures

Chirurgie : au maximum deux chirurgie de 30 minutes. Traitements avec les différents modes d'administration. Récolte d'urine excrétée. Enregistrements électrophysiologiques (optionnels) durée 5 à 6h sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Effets liés à la chirurgie, mais bien encadrés au niveau analgésie et avec un suivi postopératoire sur 3 jours minimum. Effets liés à la chirurgie pour les enregistrements électrophysiologiques (optionnels). Le modèle neurodégénératif chez la souris ou le rat n'entraine pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé par une approche statistique afin d'obtenir des résultats significatifs en réalisant une cohorte par groupe. Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Les organes étudiés en fin de procédure représenteront une banque de tissus utilisable pour d'autres analyses ultérieures au sein de notre Institut (cerveau en général et pour ce projet particulièrement reins, foie).

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines d'acclimatation permet aux animaux de se familiariser avec leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes placées sur portoirs ventilés et maintenues à 21°C et 55% d’humidité. L'enrichissement de leur milieu est représenté par des maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher ou ronger. Des batonnets de bois sont aussi intégrés dans les cages pour permettre aux animaux de ronger. Anesthésie et analgésie : la douleur et l’inconfort générés par la chirurgie et les méthodes d’administration sont maitrisés par un recours à l’anesthésie (gazeuse) et l’utilisation d’analgésiques. Des points limites adaptés pour les deux espèces sont uivis : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé (difficulté à récupérer le poids initial) dans les jours suivant la chirurgie. Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, ces espèces permettent d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Les animaux sont utilisés à l'age adulte, de jeune adulte afin d'induire les modèles jusqu'a un age avancé afin de tester l'effet curatif des traitements.

Soumis à sept anesthésies générales en dix semaines, dont une pour leur retirer les deux tiers de l'estomac, 45 jeunes porcs femelles sont tués au terme du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit cinq fibroscopies, cinq mesures de pH œsophagien, cinq transits radiologiques et sept prises de sang, avant le prélèvement de l'œsophage, de l'estomac et du foie. Le porteur annonce des douleurs abdominales, des vomissements, un arrêt du transit, une mobilité réduite après la chirurgie, une ration réduite de moitié la première semaine, et la mise à mort en cas de douleur persistante ou de perte de poids de 30 %. L'objet du projet reste la comparaison de deux variantes de chirurgie de l'obésité, dont l'une n'a jamais été pratiquée ni chez l'humain ni chez le porc.

Objectifs

La chirurgie bariatrique a démontré une efficacité en termes de perte de poids, d’amélioration des comorbidités liées à l’obésité mais aussi en termes de mortalité. Cette chirurgie connaît un très grand essor en France. La sleeve gastrectomie (SG) ou gastrectomie en manchon est une intervention qui consiste à retirer environ 2/3 du volume de l’estomac afin de laisser en place un manchon gastrique tout en conservant sa continuité. Cette procédure peut potentiellement favoriser l'apparition ou l’aggravation en postopératoire d'un reflux gastro-oesophagien (RGO). Une technique de SG au cours de laquelle la tubulisation de l'estomac est effectuée le long de la grande courbure a récemment été décrite afin de potentiellement diminuer l'incidence du RGO en postopératoire. Le but de ce projet est d’étudier l’effet de la procédure de Sleeve Gastrectomie par tubulisation de l'estomac le long de la Grande Courbure (SGGC) chez le porc. L'objectif principal de cette étude est de montrer que cette technique permet une diminution de l'incidence et de la sévérité du RGO en comparaison à la technique classique de SG.

Bénéfices attendus

La sleeeve gastrectomie (SG) est l’intervention la plus fréquemment réalisée en chirurgie bariatrique. Il existe cependant un vrai questionnement autour de cette procédure sur un possible risque d’aggravation postopératoire du reflux gastro-oesophagien (RGO). Bien que cette chirurgie soit salvatrice pour les patients concernés, il y à un risque de développer ou d'agraver un RGO après SG (environ 20%) ainsi que de développer sur le long terme un oesophagite ou un endobrachyoesophage (respectivement de 28% et 8%). Le but de ce projet est de développer une nouvelle technique de chirurgie bariatrique ayant les avantages de la SG (technique relativement peu invasive qui garde la continuité du tube digestif) mais permettant de mieux contrôler le risque d’aggravation du RGO en postopératoire, et ainsi de prévenir l’oesophagite, l’endobrachyoesophage et une éventuelle dégénérescence de l’œsophage. Les bénéfices attendus pour les patients et la société sont donc potentiellement majeurs étant donné qu’en France environ 40 000 patients sont opérés d’une SG tous les ans et que plusieurs centaines de milliers de patients sont potentiellement candidats à cette chirurgie.

Procédures

Chaque porc recevra 7 anesthésies générales aux jours suivants : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63. Ces anesthésies nous permettrons de réaliser les différents gestes. Aucun geste n'est effectué sans anesthésie. Sept prélèvements sanguins auront lieu comme suit pour chaque animal : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63. Cinq fibroscopie auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Cinq mesures de phmétrie auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Cinq TOGD (Transit oesogastroduodénal) auront lieu pour chaque animal comme suit : J-7, J14, J28, J42 et J56. Sept prélèvements de selles auront lieu comme suit pour chaque animal : J-7, J0, J14, J28, J42, J56 et J63 pour l'analyse du microbiote. Ces prélèvements seront prélevés de la cage directement au moment du nettoyage de cette dernière, en l'occurence sans contact direct avec l'animal. Tous les animaux seront mis à mort à J63 de la première procédure afin de réaliser des mesures du volume de l'estomac, des prélèvements du bas oesophage, de l'estomac (fundus et antre) et de foie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont des effets directement liés à l’intervention chirurgicale : douleur abdominale, vomissements, reprise tardive du transit (iléus paralytique), asthénie, mobilité réduite et devraient s’amender progressivement au bout d’une semaine après l’intervention chirurgicale. L'estimation de la souffrance des différentes interventions chirurgicales de la procédure est estimée à ''modérée'' mais gérée par l'anesthésie, l'analgésie et un monitoring spécifique. Des analgésiques seront administrés en per et post opératoire pour réduire les douleurs post opératoires des animaux. Des antiémétiques seront aussi administrés pour réduire les nausées et les vomissements post opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J63 de la première procédure afin de réaliser des mesures du volume de l'estomac, des prélèvements du bas oesophage, de l'estomac (fundus et antre) et de foie.

Remplacement

Il n’existe aucun modèle alternatif non animal permettant d’étudier l’impact d’une nouvelle technique de chirurgie bariatrique telle que celle que nous souhaitons développer. L’étude faite sur les chiens est une étude de faisabilité de la technique. La comparaison entre la sleeve le long de la grande courbure et la sleeve classique a été basée uniquement sur la perte pondérale à 2 mois et sur les complications chirurgicales uniquement. Aucune mesure de ph oesophagien ou d’étude de reflux gastrooesophagien n’a été faite. Aucun Transit oesogastroduodénal évaluant la vidange gastrique n’a été réalisé. Aucune fibroscopie gastrique n’a été faite. La SGGC est toujours une technique en phase expérimentale et n’a jamais été réalisée ni chez l’homme, ni chez le porc. La seule étude qui rapporte cette technique est celle sur les chiens sus cité. L’utilisation d’un animal vivant (porc) est indispensable afin d’évaluer : la tolérance de la procédure (alimentation, vomissement), l’efficacité de la procédure en termes de perte pondérale, et l’impact de la procédure sur : le RGO (mesure du PH oesophagien et biopsie du bas œsophage), la vidange gastrique, le microbiote et au niveau métabolique et endocrinien. Le but de notre étude étant d’évaluer scientifiquement avec des critères objectifs la physiopathologie du reflux gastrooesophagien après les différentes techniques chirurgicales de Sleeve Gastrectomie, ce qui est non reproductible en dehors d'un organisme vivant complexe avec une anatomie proche de l'homme. Cela nous permettra d’avancer des résultats qui pourront favoriser une technique sur l’autre.

Réduction

L’analyse de la littérature permet d’estimer à environ 70% le taux d'acidité anormal (pH < 4 pendant au moins 4% du temps mesuré) après SG classique. Grace à la technique de SGGC, nous espérons obtenir un taux d'acidité anormal de 20%. Ces données nous ont permis de déterminer que le nombre de sujets nécessaires dans chaque groupe était de 15. Dans un principe de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude de l’impact physiologique et métabolique de la procédure d’innovation chirurgicale, l’ensemble des explorations (pH métrie, fibroscopie, recueil d’échantillons biologiques) seront réalisées sur chaque animal inclus dans le protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux : - un traitement antalgique sera donné en per et postopératoire et un infitration de la cicatrice à l’aide d’anesthésiants locaux sera réalisée à la fin de la procédure chirurgicale. L’analgésie péri-opératoire est assurée par injection IV. En fin de procédure, une infiltration de part et d’autre de la laparotomie sera effectuée pour réduire les douleurs. L’analgésie post-opératoire sera assurée par un traitement médicamenteux adapté. - les rations alimentaires seront diminuées de moitié en postopératoire la premiere semaine qui suit la chirurgie afin de réduire le risque de douleurs abdominales et de vomissements. Notre point limite se situera à l’apparition des signes cliniques de douleur persistante malgré le traitement antalgique ou en cas de modifications évocatrices du comportement, qui sont chez le porc l’absence d’interaction avec les congénères, l’absence de recherche alimentaire (réduction du fouissage), le refus d’alimentation, la léthargie avec décubitus prolongé, la modification des vocalises. La persistance de l’atteinte du point limite une heure après nouvelle administration d’antalgiques entraînera la mise à mort de l’animal. Une perte de poids ≥ 30% entraînera aussi la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir une approche chirurgicale et anatomique suffisamment proche de l'Homme et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux. Le choix du modèle porcin est justifié par le fait qu'il a été largement utilisé comme modèle anatomique de validation dans de nombreux protocoles de chirurgie bariatrique. Par ailleurs, plusieurs chirurgiens de notre équipe enseignent dans des sessions de formation chirurgicale sur modèle porcin et ont donc l’expérience de la réalisation de SG dans ce modèle. Les animaux seront de jeunes porcs dits « à croissance lente » femelles, âgés de 2 à 3 mois. Ces porcs sont caractérisés par une évolution pondérale spontanée relativement stable en comparaison aux porcs classiquement utilisés pour l’expérimentation animale. Cette stabilité pondérale spontanée sera nécessaire pour évaluer l'impact direct des procédures sur le poids des animaux. Enfin, le choix du genre féminin se justifie par une meilleure stabilité pondérale spontanée et d’un comportement plus adapté à l’hébergement en groupe.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis allaitantes reçoivent des nanoparticules directement dans la trachée, une fois par semaine pendant six semaines, et leur descendance subit des mesures de fonction pulmonaire d'une heure à plusieurs stades de sa vie. Le porteur reconnaît que ces expositions répétées pourraient perturber le comportement maternel et provoquer des anomalies de développement chez les souriceaux. Il affirme dans le même temps que les femelles "tolèrent" l'exposition sans nuisance particulière, et présente le projet comme une contribution à l'évaluation des risques pour les femmes enceintes et allaitantes.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Les propriétés exceptionnelles des nanoparticules, acquises par leur taille nanométrique, les rendent intéressantes dans de nombreux secteurs industriels (agroalimentaire, cosmétique, pharmaceutique etc.). Cependant, leur utilisation exponentielle suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Dans un premier temps, nous effectuerons des tests qui nous permettront de mettre au point un protocole d'exposition optimal, permettant une exposition post natale la plus précoce possible, avec un minimum de dommages pour la descendance. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, système digestif) ait été bien décrit ces dernières années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu étudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences à l’âge adulte d’expositions périnatales à ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicité des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère à la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer à l’évaluation des risques liés à des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises à des expositions pulmonaires nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) aux sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique réalisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasive de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

Les souris femelles tolèrent l’exposition aux nanoparticules pendant la gestation sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. La mesure de la fonction pulmonaire, non invasive, n’induit pas d’effets indésirables. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à des troubles du comportement maternel. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée à leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son système sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible à modéliser de manière bio-informatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque cela est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, notamment en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère à la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réalisées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaire jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé à 2 stades : 1) au stade juvénile (jeune non sevré) afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et 2) à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences à long terme.