Procédures modérées

Pour savoir si le tramadol améliore les performances physiques, 96 souris d'une lignée au phénotype anxieux sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever muscles, plasma et cerveau. Elles courent sur tapis roulant cinq jours par semaine pendant six semaines, la moitié recevant du tramadol, avant des mesures de capacité physique et un test d'activité spontanée. Le porteur ne signale comme effet indésirable possible que des "dommages physiques pendant l'entrainement". Les bénéfices annoncés relèvent de la lutte antidopage et de la "compétition loyale" dans le sport, et le porteur affirme que la réponse du tissu musculaire à l'effort ne peut être appréhendée qu'au sein d'un "organisme vivant entier".

Objectifs

Mettre en évidence les effets périphériques musculaires ergogeniques et centraux du traitement tramadol en analysant les performances physiques, les paramètres métaboliques musculaires et la modulation des systèmes opiodergic et non opiodergiques, chez la souris BALB/cJ de phénotype anxieux. Cette première expérimentation doit montrer un éventuel effet musculaire ergogène du tramadol. Il s’agira ensuite de préciser l’origine centrale ou périphérique de cet effet.

Bénéfices attendus

Santé et sécurité des athlètes: Le tramadol est connu pour avoir divers effets secondaires, y compris des étourdissements, des nausées et une altération de la fonction cognitive. Comprendre ses effets dopants pourrait aider à identifier les risques potentiels associés à son utilisation abusive dans le sport. En sensibilisant aux risques pour la santé, les athlètes peuvent prendre des décisions éclairées sur l’utilisation du tramadol comme médicament améliorant la performance. Compétition loyale et l’intégrité de sports : Le tramadol a été interdit par plusieurs organisations sportives, dont l’Agence mondiale antidopage (AMA), en raison de ses propriétés potentielles d’amélioration de la performance. L’étude de ses effets peut aider à faire respecter les règlements antidopage, garantissant ainsi une compétition équitable entre les athlètes. En détectant et en dissuadant l’abus de tramadol, l’étude peut contribuer à maintenir l’intégrité des sports. Politique et réglementation : Une étude approfondie sur les effets du dopage du tramadol peut fournir des données précieuses pour éclairer les décisions politiques concernant son utilisation dans le sport.Les résultats peuvent contribuer à la mise à jour et à l’amélioration des politiques et des règlements antidopage, en renforçant le cadre des contrôles antidopage et des sanctions. Ceci, à son tour, peut aider à maintenir la crédibilité et la fiabilité des instances dirigeantes du sport. Perception du public et efforts antidopage : En étudiant les effets dopants du tramadol, l’étude peut contribuer à sensibiliser le grand public à l’utilisation abusive des médicaments d’ordonnance dans le sport. Cela peut aider à combattre la perception selon laquelle le dopage se limite aux substances illicites et à souligner l’importance de mesures antidopage strictes dans divers domaines.

Procédures

1- Habituation au tapis roulant : 84 souris au total, pendant une semaine avant les premiers tests, 2- Mesures des capacités physiques avant entrainement: 84 souris au total, durée entre 20 min et 35 min. 3- Entrainement sur tapis roulant : 6 semaines, durée 5 jours par semaine. 4- Traitements : 42 souris Tramadol, 42 souris sans aucun traitement. 5- Mesure des capacités physiques après entrainement: 84 souris au total, durée entre 20 min et 35 min. 6- Test d'activité spontanée, 84 souris au total, durée 30 min. 7- Mise à mort et prélèvements des animaux.

Impact sur les animaux

Effets indesirables possibles : dommages physiques pendant l'entrainement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. La réponse globale du tissu musculaire, incluant la quantification de paramètres liés à l'effort musculaire, ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un organisme vivant entier.

Réduction

L'objectif principal est d'observer l’effet ergogénique musculaire du tramadol chez des souris qui subissent un exercice physique sur tapis roulant. Pour observer les changements biochimiques induits par l'exercice au niveau musculaire, nous envisageons des groupes de 21 animaux. L'objectif de réduction est atteint grâce à la réalisation de prélèvements multiples (plasma, tissu musculaire, cerveau) pour chaque animal et à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées pour limiter la souffrance animale. Une habituation au tapis roulant est réalisée au départ pour limiter le stress. L’isolement des animaux est évité. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne est effectuée pour verifier le comportement et l'état général des animaux. Des soins locaux sont prévus en cas d'irritation des pattes. Les animaux pour lesquels une habituation est impossible sont retirés de l'expérimentation, afin que l'exercice ne soit pas associé à un stress important.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans nos procédures appartiennent aux espèces dont la liste est fixée réglementairement et ils proviennent d’éleveurs ou de fournisseurs agréés. Ces animaux sont de petite taille pour faciliter la manipulation pendant l’exercice physique sur tapis roulant et les tests neurocomportementaux. De plus de nombreux outils sont disponibles chez la souris pour les études moléculaires. Les souris sont souvent considérées comme un choix plus acceptable sur le plan éthique pour la recherche que les animaux plus gros. Leur petite taille et leur capacité à être logées en groupe facilitent la prestation de soins appropriés et minimisent les souffrances. Animaux jeunes adultes de 8 semaines, age pour lequel l'entrainement physique en aérobie aura le plus d'effet sur le système musculaire.

Pour savoir si l'alimentation modifie l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses, 1 602 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous la peau des cellules tumorales alors qu'elles sont éveillées, développent une tumeur mesurée régulièrement, puis trois injections intrapéritonéales de traitement. Le porteur écrit que les groupes comptent dix-huit souris "sans recours à un test statistique pour définir ce nombre", en se fondant sur son expérience antérieure. Il indique que l'hypothèse testée, le rôle de nutriments végétaux dans la réponse immunitaire anti-tumorale, a d'abord été formulée en culture cellulaire, et affirme que le recours à la souris reste "indispensable" pour envisager une application clinique.

Objectifs

Ces dernières années, l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur, a ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques. Cependant, seule une partie des patients répondent au traitement par immunothérapie, et de nombreux paramètres peuvent impacter l’efficacité du traitement. En particulier, les aliments peuvent avoir un impact important, en fournissant des nutriments qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire et en modifiant les bactéries de la flore intestinale. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’effet de la nutrition dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester des traitements permettant d’augmenter l’efficacité de l’immunothérapie via des interventions nutritionnelles.

Bénéfices attendus

Des études suggèrent que des modifications de l’alimentation pourraient apporter un bénéfice aux patients traités par immunothérapie. Cependant, l'effet sur les cellules immunitaires des tumeurs des produits dérivés de la nourriture demeure mal connu. Ce projet permettra donc d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour mieux comprendre l’interaction entre nourriture et cellules immunitaires, et plus particulièrement dans les réponses immunitaires anti-tumorales au cours des immunothérapies. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des immunothérapies par point de contrôle immunitaire.

Procédures

Les expériences visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience, durée du geste inférieur à 20 sec). Les animaux seront ensuite traités à 3 reprises à raison d’1 fois par jour (administration des traitements par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles, durée du geste inférieur à 10 sec), tous les 2-3 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. Nos résultats précédents montrent que le régime spécial utilisé n’affecte pas l’état général des animaux et ne modifie pas leur poids.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que des nutriments présents dans certains végétaux jouent un rôle dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo. Le projet doit étudier l’influence de ces nutriments sur la croissance tumorale et les réponses immunitaires anti-tumorales dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent être représentatifs, sans recours à un test statistique pour définir ce nombre. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Nous limiterons le nombre de souris utilisées en restreignant le nombre de lignées tumorales étudiées et en étudiant un seul type de thérapie pour l’analyse des mécanismes moléculaires. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, y compris le week-end lorsque cela est nécessaire. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux sont mis à mort dès l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

40 000 animaux non-humains, 20 000 souris et 20 000 rats, vont être utilisés et tous tués pour analyse histopathologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament, un vaccin ou un produit chimique par voie orale ou par injection, chaque jour ou chaque semaine, sur des études pouvant durer un, trois ou douze mois, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine, des prises de sang en tube de contention sur animal vigile, une mise à jeun et jusqu'à seize heures en cage à diurèse. Le porteur retient comme effets attendus l'inconfort, le stress, la douleur transitoire et la perte de poids, et parle de "sacrifices" pour désigner les mises à mort intermédiaires. Il indique que ces essais répondent à une exigence réglementaire et affirme qu'il n'existe pas encore de méthode in vitro pour certains effets, en raison de la complexité des organismes vivants.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent lors de plusieurs phases du développement (précocément pour les études préliminaires, en prérequis avant tout essai clinique chez l’Homme pour les études subchroniques, ou dans les dernières étapes du développement d’un médicament avant sa mise sur le marché pour les études chroniques). Ces études permettent l’évaluation du risque pour l’Homme ou l’animal, en fournissant des informations sur les organes cibles et sur les effets toxiques majeurs, en déterminant notamment une dose sans effet adverse intégrée dans les critères de marge de sécurité pour l’utilisation ou l’exposition humaine ou pour un usage vétérinaire.

Bénéfices attendus

Le nombre minimal d’animaux par groupe et ou/sexe suit les recommandations des lignes directrices dans le but de garantir suffisamment d’animaux pour permettre la détection des signes de toxicité au début des premiers essais chez l’Homme ou l’animal). Ces effectifs minimums sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques [tests de normalité variance , comparaison de moyennes par exemple] afin d'interpréter les résultats. L'ensemble des études du projet vise à identifier la tolérance locale des produits, une toxicité d'organe, un potentiel clastogène et aneugène d'une substance, un profil métabolique et pharmacocinétique, et/ou des seuils de toxicité (dose maximale tolérée, dose sans effet...) permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique), la sécurité d’utilisateurs (industrie chimique) ou le bénéfice pour l’animal (industrie vétérinaire).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3, ou 12 mois pour les études règlementaires]. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments/produits chimiques selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène...) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout isolement d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects pratiques (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent cité car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou connue pour plus de sensibilité à certaines molécules) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’Homme (exemple paramètres immunologiques), le Hamster pour son métabolisme, le cobaye pour la voie dermale ou pour paramètres immunologiques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

Rasées puis injectées sous la peau avec des cellules de cancer colorectal, 140 souris développent une tumeur et sont toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont contenues trois fois par semaine pour la mesure de la tumeur au pied à coulisse et anesthésiées une fois par semaine pour une imagerie par bioluminescence, soit quatre séances d'anesthésie par animal. Le projet vise à caractériser une lignée cellulaire "maison" destinée à servir de ressource aux équipes de l'établissement, sans évaluer de traitement. Le porteur affirme qu'aucun point limite ne sera atteint, ni sur la taille de la tumeur ni sur une nécrose de la peau, parce qu'il maîtrise le modèle et arrêtera les analyses avant ce stade.

Objectifs

L'immunothérapie ou les agents bispécifiques sont les voies les plus prometteuses de la recherche sur le cancer. Ces thérapies innovantes visent à réactiver le système immunitaire pour qu'il lutte contre les cellules tumorales qui, autrement, développent des stratégies d'évasion pour échapper à son contrôle. Les molécules ciblées dans ces stratégies pourraient être des molécules de point de contrôle inhibant les fonctions effectrices des cellules immunitaires. Déjà utilisés en clinique, le mode d'action précis de ces traitements innovants et leur effet sur le micro-environnement tumoral restent largement inconnus ou sont parcellaires, les modalités d'analyse développées étant limitées à l'expertise du laboratoire menant l'étude. Ce manque de caractérisation approfondie des modèles précliniques constitue un obstacle majeur à l'élaboration de stratégies expérimentales optimales pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle classe de produits thérapeutiques. Parallèlement, il n'existe actuellement aucun modèle de tumeur syngénique qui permettrait de surveiller efficacement la croissance tumorale et d'étudier le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Ce promet va nous permettre de générer un ensemble de données de ressources qui répondrait à ce défi en concevant un nouveau modèle de tumeur syngénique de "nouvelle génération" de cancer colorectal, la lignée CT26 permettant le suivi in vivo de la croissance tumorale par bioluminescence et couplé à la caractérisation phénotypique et fonctionnelle approfondie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) au cours de la progression tumorale et du microbiome.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est de caractériser in vivo une nouvelle lignée CT26 maison qui sera une ressource pour les membres scientifiques. Cette lignée à double rapporteur permettra un suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale par bioluminescence et introduira de l'ovalbumine (OVA) dans la tumeur qui permettra d'étudier le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral utilisé et nous pouvons nous assurer de la bonne mise en place de modèles tumoraux. Cette approche est rare et pourtant elle apporte un énorme bénéfice dans l'analyse longitudinale des projets de recherche fondamentale et appliquée dans le domaine de l'oncologie.

Procédures

Avant la procédure, afin de garantir des meilleurs résultats en imagerie et éviter l’auto fluorescence des poils, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. Les animaux seront ensuite soumis à une injection de cellules unique le jour même au niveau du flanc gauche avec maintien en contention de la souris, cela peut durer 2 minutes par souris. Tous les animaux seront soumis à une contention 3 fois par semaine pour la mesure de tumeur par calliper et pour l'imagerie par Bioluminescence une fois par semaine. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale (durée 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette procédure, nous allons injecter par voie sous-cutanées des cellules tumorales à des souris. L'injection dure quelques secondes et peut entrainer un stress léger de courte durée pour l’animal. Nous n’attendons pas d’effet additionnel lié aux injections des cellules tumorales. Les effets indésirables liés à la présence de tumeurs ou métastases peut provoquer un léger inconfort en fonction de la taille de la tumeur comme une gêne dans le déplacement. Si un problème de respiration suite à des métastases pulmonaires est observé. L’animal sera ainsi surveillé de très près. Notre bonne maitrise du modèle tumoral nous assure de l'absence d'atteinte de points limites liés à la taille de la tumeur, métastases ou à une éventuelle nécrose de la surface de la peau, car nous effectuerons les analyses avant cette période de la croissance tumorale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélévements sanguins et de la tumeur pour le suivi de marqueurs sériques et la caractérisation histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à développer un nouveau modèle tumoral qui va nous permettre d'utiliser nos compétences en imagerie pour la recherche en oncologie et à la fois de caractériser le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Après avoir valider nos modèles tumoraux in vitro, nous avons besoin de valider que ses cellules injectées dans un organisme vivant peuvent formés une tumeur solide sur lequel on peut effectuer des traitements et suivre ainsi le volume de la tumeur. Seul le modèle animal vivant permet cet usage et la souris est le modèle de référence pour les recherches en oncologie.

Réduction

Nous prévoyons dans ce protocole d'injecter 20 animaux par clone de cellules et par concentration et 20 animaux pour la lignée contrôles pour un total de 140 animaux afin de permettre de bien caractériser le suivie de la tumorale. Sachant que statistiquement prêt de 5% des animaux peuvent ne pas avoir des tumeurs ou avoir des poussées tardives. Le but du projet vise à réduire le nombre d'animaux employés en recherche préclinique en oncologie plus tard. En effet, l'approche longitudinale remplace les mises à morts à des stades étagés et permet donc une réduction globale dans ces projets

Raffinement

Les animaux seront injectés par voie sous-cutanée, soit un geste de quelques secondes. Ils seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine pour s'assurer de leur bien-être. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral injecté et nous connaissons notamment sa croissance et les éventuelles conséquences sur la santé de l'animal. Nous pouvons affirmer qu'aucun point limite ne sera atteint pour ces animaux en lien avec le modèle tumoral, que ce soit en lien avec la taille de la tumeur ou son état (nécrose par exemple).

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en recherche préclinique en oncologie pour le développement des nouveaux modèles et tester des nouvelles cibles thérapeutiques Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines lors de l'injection, cela correspond à l'âge auquel nous avons généré le plus grand nombre de données sur ce modèle.

Pour mesurer l'effet de pesticides alimentaires sur le métabolisme, 256 souris sont utilisées pendant vingt-six semaines dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les organes. Nourries avec un régime riche en graisse contenant des pesticides seuls ou en mélange, elles développent une obésité, un diabète et une accumulation de graisse dans le foie. Le porteur décrit ces perturbations comme survenant "sans souffrance visible des animaux", et retient parmi les nuisances le stress de contention, les piqûres, les gavages et l'isolement de vingt-quatre heures en cage à urines. Le lien entre pesticides et troubles métaboliques a déjà été rapporté chez l'humain par la cohorte NutriNet-Santé, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit le dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux.

Objectifs

L’incidence des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2 et stéatose hépatique) a augmenté ces 30 dernières années et constitue un enjeu majeur de santé publique. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation riche en lipides), de nombreuses études appuient l’hypothèse que l’exposition à des contaminants environnementaux, tels que les pesticides, est un facteur de risque au développement de ces pathologies. Dans ce projet nous travaillerons sur un modèle murin d’exposition alimentaire aux pesticides pour mimer l’exposition des consommateurs. Les animaux seront exposés à des pesticides seuls ou en mélange à des doses non toxiques telles qu’elles sont définies par les agences réglementaires, dans des conditions d’alimentation équilibrée ou déséquilibrée (riche en graisse). Nous suivrons les marqueurs caractéristiques des pathologies hépatiques non alcooliques, du diabète et de l'obésité tout au long de l’expérience qui durera 26 semaines.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire aux pesticides seuls ou en cocktail dans un contexte d’alimentation équilibrée ou d’alimentation déséquilibrée source de troubles métaboliques. Ce projet apportera des arguments en faveur ou non du lien entre exposition aux pesticides et le risque de développer des pathologies métaboliques rapporté dans des études récentes réalisées dans la cohorte Française Nutrinet santé.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime contrôle ou un régime riche en graisse contenant les pesticides. Au cours des 26 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests pour évaluer la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour ces tests, le glucose et l’insuline seront administrés après 6h de jeûne. Les gestes de contention et de gavage dureront moins de 30 secondes par animal. Pour les mesures de taux de glucose sanguin (glycémie), le prélèvement d’une seule goutte de sang sera réalisé à la queue. Ces tests seront réalisés en alternance et espacés au minimum d'une semaine, et réalisé seulement 2 fois au cours des 26 semaines. Des prélèvements intermédiaires de sang qui prennent environ 15 secondes, pourront aussi être réalisés. Les animaux seront placés individuellement pendant 24h dans des cages adaptées à la récolte des urines. Avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la joue.

Impact sur les animaux

Le régime utilisé dans cette expérience est riche en graisse. Il induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées comme un diabète, une accumulation de graisse dans le foie, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le prélèvement sanguin et l’administration de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, à la piqûre, bien que légère, au gavage, bien que très rapide, ainsi qu’une légère douleur (piqûre). L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine peut entraîner un stress de l’animal.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires). En effet, la stéatose hépatique non alcoolique est caractérisée par une accumulation de lipides dans le foie qui viennent majoritairement du tissu adipeux ; de plus le microbiote intestinal joue un rôle prépondérant dans son développement et sa progression.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur des études similaires précédentes et en respectant la règle des 3R. Le nombre idéal d’animaux par groupe est donc de 16, et avec un total de 256 animaux.

Raffinement

Comme il est convenu réglementairement, les animaux seront hébergés dans des cages de 4 à 5 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. En ce qui concerne les cages à métabolisme, les souris disposeront également d'un abri en inox. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme respiratoire) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal, une absence totale et pérenne des 5 signes indiqués, ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition de la MASLD. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques.

Réutilisés pour 2 000 d'entre eux dans d'autres projets, tués pour les autres afin de prélever leurs organes, 3 000 souris et 3 000 rats sont soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des substances jusqu'à trois fois par jour pendant cinq jours, subissent l'insertion d'une bille dans la partie terminale du colon, une privation de nourriture jusqu'à vingt-quatre heures sur grille et un hébergement individuel sur sol grillagé pour que soient comptés et pesés leurs excréments. Une partie reçoit une substance qui provoque artificiellement une diarrhée ou une constipation, afin de tester si un candidat médicament la corrige. Le porteur qualifie ces atteintes de gêne ou d'inconfort, et affirme que les modèles animaux "restent plus adaptés" que les tests in vitro pour évaluer la motilité intestinale humaine.

Objectifs

Les troubles gastrointestinaux constituent un large éventail de pathologies qui affectent l’appareil digestif depuis la cavité buccale jusqu’au rectum affectant plus de 40 % de personnes dans le monde. La diarrhée et la constipation sont les principaux symptômes des troubles de la motilité intestinale. Ils sont associés à un certain nombre de maladies chroniques (tel le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l’intestin) ou à la médication. La constipation est définie par une diminution de la fréquence des selles associée à une difficulté pour les évacuer et se caractérise par un ralentissement du transit et une déshydratation des selles. A l’inverse, la diarrhée est une émission de selles fréquentes, abondantes et de consistance très molle à liquide. Ces troubles sont associés à une morbidité accrue, à un inconfort, à la perte de productivité au travail et à la consommation de ressources médicales. Le présent projet consiste à évaluer d’une part l’effet des substances sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces) et d’autre part le potentiel effet à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives lors de l’évaluation clinique de nouveaux candidats médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament.

Bénéfices attendus

Ces études ont pour objectifs d’évaluer l’efficacité de potentiel nouveaux candidats médicaments à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives et d’autre part évaluer leurs potentiels effets indésirables sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces).

Procédures

Les substances d'essais sont administrées par bolus durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées ( 3 fois par jours au maximum) pendant plusieurs jours (maximum 5 jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont mis à jeun sur grille pour une période n’excédant pas 24h (test compris). L’effet des substances sur le transit du colon est évalué soit après insertion d’une bille dans la partie distale du colon (durée de quelques minutes) ou après évaluation du nombre et de la consistance des fèces récupérées aprés hébergement inviduel des animaux sur sol grillagé (6 h maximum). Dans certains cas, les animaux peuvent recevoir une substance réactive ralentissant artificiellement le transit clonique (administration unique , durant quelques secondes). L’effet reverse des substances sur la diarrhée ou la constipation est évaluée après administration unique ou répétée (2 fois par jours au maximum / durée de quelque seconde) d’une substance réactive induisant la diarrhée ou constipation. Pour les modèles de constipation la prise de poids et la consommation d'eau et de nourriture sont monitorées au cours de l'étude nécessitant un hébergement individuel des animaux pendant au maximum 24h. Enfin, des prélèvements de sang (8 maximum) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire : un stress lié à la privation de nourriture temporaire (pour une durée n’excédant 24 h),à un hébergement individuel (pour une durée n’excédant 24 h), à une gêne ou un inconfort lié à l’induction des modèles symptomatiques de diarrhée ou de constipation, ou à une incommodité lors de l’insertion de la bille dans la partie distale du colon. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, des points limites clairement établis permettraient de sortir l'animal de l'étude.

Devenir

Dans le cas où des prélèvements terminaux d'organes (estomac, intestin...) sont obligatoires, les animaux ne pourront pas être maintenus en vie à la fin de l'étude et seront donc euthanasiés. Dans le cas contraire, (i.e; prélèvements terminaux d'organes non nécessaires pour atteindre les objetifs de l'étude) les animaux seront réutilisés dans un autre projet pour évaluer l'impact de la substance sur le transit intestinal par exemple.

Remplacement

De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne représentent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central et le système endocrinien. Ainsi, les modèles animaux, restent plus adaptés pour évaluer l'effet global des médicaments sur la motilité intestinale pour le développement de nouvelle thérapie et pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) présentent une motilité intestinale similaire à celle de l'Homme et réagissent de la même manière aux substances dont les effets prokinetique ou ralentisseur du transit sont connus. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage, car les substances testées dans ce projet sont principalement destinées pour l'Homme adulte).